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Chemistry

इन विट्रो और इन विवो फोटोकंट्रोल्ड जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों का मूल्यांकन - कैंसर फोटोफार्माकोलॉजी के लिए संभावित दवा उम्मीदवार

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/64902
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 1, 1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 4, 3, 1,2,4
1Taras Shevchenko National University of Kyiv, 2Bienta/Enamine, 3Karlsruhe Institute of Technology, 4Lumobiotics
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल फोटोस्विचेबल एंटीकैंसर पेप्टाइड्स के मूल्यांकन के लिए अपनाए गए प्रयोगों का एक सेट प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग ऐसे यौगिकों की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग में किया जा सकता है। इसमें 2 डी और 3 डी सेल संस्कृतियों में साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन, एक्स विवो (मॉडल ऊतक) फोटोइसोमेराइजेशन दक्षता का मूल्यांकन और विवो प्रभावकारिता शामिल है।

Abstract

फोटोनियंत्रित, जैविक रूप से सक्रिय यौगिक "स्मार्ट" दवा उम्मीदवारों का एक उभरता हुआ वर्ग हैं। वे रोगी के शरीर के भीतर एक विशिष्ट स्थान पर सौम्य, गैर-आयनीय प्रकाश को निर्देशित करके उनके सटीक स्थानिक सक्रियण के कारण प्रणालीगत कीमोथेरेपी में अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करते हैं। यह पेपर इन विट्रो पोटेंसी और फोटोकंट्रोल , जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों के फोटोएक्टिवेशन की पूर्व विवो दक्षता के साथ-साथ दवा के विकास के शुरुआती चरणों में विवो प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के तरीकों का एक सेट प्रस्तुत करता है। कार्यप्रणाली को एंटीकैंसर साइटोटोक्सिक पेप्टाइड्स पर लागू किया जाता है, अर्थात्, एक ज्ञात एंटीबायोटिक, ग्रामिसिडिन एस के डायरीलेथेन युक्त एनालॉग। प्रयोगों को कैंसर सेल लाइन (लुईस लंग कार्सिनोमा, एलएलसी), जीवित ऊतक सरोगेट्स (पोर्क मीट कीमा), और इम्यूनोसक्षम चूहों में एक एलोग्राफ्ट कैंसर मॉडल (चमड़े के नीचे एलएलसी) के 2 डी (अनुयायी कोशिकाओं) और 3 डी (स्फेरॉइड) सेल संस्कृतियों का उपयोग करके किया जाता है। सबसे प्रभावी यौगिकों का चयन और यथार्थवादी फोटोथेराप्यूटिक खिड़कियों का अनुमान स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया जाता है। अलग-अलग रोशनी आहार पर फोटोएक्टिवेशन दक्षता एक मॉडल ऊतक में अलग-अलग गहराई पर निर्धारित की जाती है, और विवो प्रयोग में अंतिम चिकित्सीय में इष्टतम प्रकाश खुराक लागू की जाती है।

Introduction

फोटोनियंत्रित जैविक रूप से सक्रिय यौगिक हाल के दशकों में मानव रोगों के लिए सुरक्षित केमोथेरेपी के एक आशाजनक घटक के रूप में उभरे हैं और विशेष रूप से घातक ठोस ट्यूमर1 को मिटाने के लिए। इन यौगिकों में विपरीत रूप से फोटोइसोमेरेबल टुकड़े (आणविक फोटोस्विच) होते हैं और विभिन्न तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ विकिरण पर निष्क्रिय और सक्रिय फोटोइसोमर्स के बीच टॉगल कर सकते हैं।

उनके गैर-फोटोकंट्रोलेबल एनालॉग्स की तुलना में, फोटोकंट्रोल्ड दवाएं सुरक्षित हो सकती हैं क्योंकि उन्हें कम सक्रिय और अनिवार्य रूप से नॉनटॉक्सिक रूपों में रोगी के शरीर में व्यवस्थित रूप से पेश किया जा सकता है, और फिर केवल प्रकाश द्वारा सक्रिय किया जाता है जहां आवश्यक हो, जैसे ट्यूमर, अल्सर और घावों में। यद्यपि इस तरह के आणविक दवा प्रोटोटाइप के कई रोमांचक प्रदर्शन हाल केअकादमिक पत्रों 2,3,4,5,6,7 में पाए जा सकते हैं, नैदानिक फोटोफार्माकोलॉजी का क्षेत्र - अनुमोदित दवा / चिकित्सा उपकरण / रोग संयोजनों का एक अनुप्रयोग - मौजूद नहीं है। फोटोफार्माकोलॉजी अभी तक दवा की खोज के चरण में है, और व्यवस्थित प्रीक्लिनिकल अध्ययन अज्ञात हैं।

हमने हाल ही में कुछ फोटोनियंत्रित एंटीकैंसर पेप्टाइड्स, अर्थात्, पेप्टाइड एंटीबायोटिक ग्रामिसिडिन एस8 के एनालॉग के लिए विवो सुरक्षा लाभ का प्रदर्शन किया है। इन फोटोनियंत्रित डेरिवेटिव में एक डायरीलेथेन (डीएई) फोटोस्विच होता है, जो तथाकथित लाल प्रकाश-जनित "रिंग-ओपन" और यूवी-जनित "रिंग-क्लोज्ड" फोटोफॉर्म (डेरिवेटिव में से एक, यौगिक एलएमबी 002 के लिए चित्रा 1 में सचित्र) के बीच प्रतिवर्ती फोटोप्रेरित परिवर्तनों से गुजरता है।

Figure 1
चित्र 1: फोटोनियंत्रित साइटोटोक्सिक पेप्टाइड एलएमबी 002 और इसके फोटोइसोमेराइजेशन। डायरीलेथेन का टुकड़ा लाल रंग में दिखाया गया है। संक्षिप्त नाम: डीएई = डायरीलेथेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हिट खोजने और हिट-टू-लीड अनुकूलन करने के लिए अक्सर इन विट्रो और विवो में उपयुक्त यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग 9,10 की आवश्यकता होती है। यहां, हम फोटोनियंत्रित यौगिकों के साइटोटॉक्सिसिटी की व्यवस्थित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त एक पद्धति का प्रदर्शन करते हैं। हम फोटोइसोमेराइजेशन दक्षता भी निर्धारित करते हैं, मॉडल ऊतकों में प्रकाश खुराक का अनुमान लगाते हैं, और सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले उम्मीदवारों की विवो प्रभावकारिता का मूल्यांकन करते हैं। दृष्टिकोण बायोएथिक्स और पशु देखभाल विचारों के अनुरूप है।

इस काम में, परीक्षण किए गए यौगिकों के अनियंत्रित फोटोइसोमेराइजेशन से बचने के लिए पारंपरिक प्रीक्लिनिकल विधियों को संशोधित किया जाता है। यहां इन संशोधित विधियों को लागू करने का समग्र लक्ष्य एक सामान्य रणनीति विकसित करना है जो सरल और तेज है और इन विट्रो गतिविधियों की मज़बूती से तुलना करने और लीड पहचान और आगे के विकास के लिए फोटोस्विचेबल यौगिकों के विवो प्रभावकारिता परीक्षण को तर्कसंगत बनाने के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न करता है।

रणनीति में लगातार तीन चरण शामिल हैं। पहले चरण में दो-आयामी (2 डी, मोनोलेयर) और तीन-आयामी (3 डी, स्फेरॉइड) सेल संस्कृतियों और कॉन्फोकल उच्च-थ्रूपुट स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चयनित फोटोनियंत्रित जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों के सक्रिय और निष्क्रिय फोटोफॉर्म के लिए सीरियल कमजोर पड़ने में आईसी 50 (स्पष्ट50 % सेल व्यवहार्यता) का निर्धारण शामिल है। फोटोथेराप्यूटिक खिड़कियों की तुलना दो फोटोफॉर्म के बीच आईसी50 अंतर के संबंध में की जाती है, और सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले उम्मीदवारों का चयन किया जाता है। स्वचालित माइक्रोस्कोपी और अन्य साइटोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों (परख) द्वारा विषाक्तता मूल्यांकन में कोई विशिष्ट लाभ नहीं है; अधिक जटिल सेल-आधारित ट्यूमर मॉडल12 को इस स्तर पर आसानी से लागू किया जा सकता है।

चरण 1 में चुने गए यौगिकों के लिए, दूसरा कदम विकिरणित नमूना अर्क के यूवी-पता लगाए गए उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके ऊतक सरोगेट में कम सक्रिय फोटोफॉर्म की फोटोस्विचिंग दक्षता को निर्धारित करके विकिरणित ऊतक की सतह से गहराई के कार्य के रूप में ऊतकों के अंदर उनकी फोटोस्विचिंग दक्षता का वास्तविक अनुमान लगाना है। विवो में, फोटोस्विचिंग दक्षता का अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन हम एक साधारण ऊतक सरोगेट का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं - कीमा पोर्क मांस। हमने इस दृष्टिकोण की वैधता का परीक्षण किया है। हमने चूहों के कैंसर मॉडल पर विवो में हमारे फोटोस्विचेबल यौगिकों के रूपांतरण को मापा और चूहोंके साथ पिछले प्रयोगों में मापी गई गहराई पर लगभग एक ही फोटोकन्वर्जन देखा। किसी भी उपयुक्त वैकल्पिक कृत्रिम ऊतक13, 3 डी बायोप्रिंटेड ऊतक / अंग14, बायोप्सी सामग्री, या एक अन्य छूट पशु सामग्री का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह सेटअप एक अच्छा समझौता है क्योंकि यह किफायती, तेज और नैतिक है।

तीसरा कदम एक मुराइन कैंसर मॉडल में विवो एंटीकैंसर प्रभावकारिता का निर्धारण है। इन विट्रो प्रयोगों में बेहतर विशेषताओं का प्रदर्शन करने वाले यौगिकों और मॉडल ऊतकों में कम से कम 1-1.5 सेमी की गहराई पर कुशलतापूर्वक फोटोस्विचिंग को इस प्रयोग के लिए चुना जाता है।

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के फोटोस्विच रखने वाले यौगिकों पर लागू किया जा सकता है, बशर्ते उनके फोटोफॉर्म (या उनके फोटोस्टेशनरी स्टेट्स, पीएसएस) उचित समय (कुछ दिनों या उससे अधिक) के लिए स्थिर हों। उदाहरण के लिए, पहले वर्णित डीएई-व्युत्पन्न एलएमबी 002 का उपयोग15 किया जाता है। एलएमबी 002 फोटोफॉर्म थर्मल रूप से स्थिर हैं और पर्याप्त गिरावट के बिना कम से कम एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। लुईस लंग कार्सिनोमा (एलएलसी) कोशिकाओं को इन विट्रो और विवो प्रदर्शन में इसके लिए चुना जाता है, लेकिन सेल प्रकार पर कोई प्रतिबंध नहीं लगाया जाता है। एलएलसी कोशिकाएं 3 डी में अनुगामी, आसानी से खेती योग्य हैं, और ट्यूमरोइड उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाती हैं (जैसा कि संदर्भ16 में वर्णित है)। विवो में। एलएलसी कोशिकाओं का उपयोग मेटास्टैटिक प्रक्रियाओं को मॉडल करने के लिए किया जाता है और चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद इम्यूनोसक्षम चूहों में आसानी से ठोस ट्यूमर उत्पन्न कर सकते हैं। विवो पद्धति में यह सार्वभौमिक रूप से अन्य कैंसर मॉडल17,18 पर लागू किया जा सकता है। इस रणनीति का विस्तृत कार्यान्वयन नीचे वर्णित है।

Protocol

पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों से जुड़े अनुसंधान परियोजनाओं के संचालन के लिए स्थानीय और अंतर्राष्ट्रीय नियमों का पालन करते हुए किया गया था (यूक्रेन का कानून "क्रूरता से जानवरों के संरक्षण पर," प्रयोगात्मक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले कशेरुक जानवरों की सुरक्षा के लिए यूरोपीय सम्मेलन (यूरोपीय सम्मेलन, स्ट्रासबर्ग, 1986), वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर निर्देश 2010/63 / इस अध्ययन को बिएंटा कंपनी के बायोएथिक्स कमीशन द्वारा अनुमोदित किया गया है। C57BL/6NCrl चूहों (वयस्क महिलाओं का वजन लगभग 20 ग्राम है) का उपयोग इन प्रयोगों में किया गया था। विशिष्ट सामग्री, अभिकर्मक और उपकरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

1. 2 डी और 3 डी एलएलसी सेल संस्कृतियों का उपयोग करके एलएमबी 002 ("रिंग-क्लोज्ड" और "रिंग-ओपन" फॉर्म) के लिए आईसी50 मूल्यांकन।

  1. यौगिकों के बफर और स्टॉक समाधान तैयार करना
    नोट: मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर के बफर तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधानों का उपयोग करें।
    1. 14.2 ग्राम Na 2 HPO 4, 2.4 g KH 2 PO4, 80 g NaCl और2g KCl को 1 L आसुत जल में जोड़कर 10x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) तैयार करें। आटोक्लेव ने 10x PBS तैयार किया और 900 mL आसुत जल में 10x घोल के 100 मिलीलीटर को जोड़कर इसे 1x घोल में पतला किया। फिर, घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1 लीटर आसुत जल में 4.78 ग्राम डीपीबीएस पाउडर जोड़कर डलबेकको के पीबीएस (डीपीबीएस) तैयार करें। घोल को तब तक हिलाएं जब तक कि सभी ठोस घुल न जाएं, पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच की जांच करें, और इसे 1 एम एनएओएच या 1 एम एचसीएल (पीएच 7.3-7.4) जोड़कर समायोजित करें। वांछनीय पीएच स्तर तक पहुंचने के बाद, एक बाँझ कैबिनेट में 0.22 μm वैक्यूम फ़िल्टर के माध्यम से माध्यम को फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 1 लीटर आसुत जल में 238.3 ग्राम एचईपीईएस जोड़कर 1 एम 4-(2-हाइड्रॉक्सीथाइल)-1-पिपेराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) बफर समाधान तैयार करें। पीएच 7.5 तक 1 एम एनएओएच के साथ समाधान के पीएच को समायोजित करें। एक बाँझ कैबिनेट में 0.22 μm वैक्यूम फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 1x ट्रिप्सिन-EDTA (EDTA = एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड) घोल को 10x घोल को पतला करके तैयार करें। ऐसा करने के लिए, 50 एमएल बाँझ ट्यूब में 45 एमएल 1 एक्स पीबीएस समाधान में 10 x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. डलबेकको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) बेसिक को 13.4 ग्राम डीएमईएम उच्च ग्लूकोज पाउडर और 3.7 ग्राम एनए2सीओ3 से 1 लीटर आसुत जल को एक मापने वाले सिलेंडर में जोड़कर तैयार करें। घोल को तब तक हिलाएं जब तक कि सभी ठोस घुल न जाएं, पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच की जांच करें, और इसे 1 एम एनएओएच या 1 एम एचसीएल (पीएच 7.3-7.4) जोड़कर समायोजित करें। वांछनीय पीएच तक पहुंचने के बाद, एक बाँझ कैबिनेट में 0.22 μm वैक्यूम फ़िल्टर के माध्यम से माध्यम को फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 100 एमएल, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 10 एमएल, एल-ग्लूटामाइन समाधान के 10 एमएल और डीएमईएम बेसिक के 900 एमएल में 10 एमएल एचईपीईएस बफर को जोड़कर डीएमईएम पूर्ण माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. परीक्षण यौगिकों के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें।
      1. प्रत्येक यौगिक के लिए, रिंग-बंद फोटोफॉर्म में 5.12 मिलीग्राम (जैसे, एलएमबी 002) के दो बैचों को दो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (एक स्पष्ट, और अन्य काले अपारदर्शी दीवारों के साथ) में तौलें। एक अतिरिक्त-स्पष्ट दीवार ट्यूब में 2.28 मिलीग्राम सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, ग्रामिसिडिन एस) का वजन करें। प्रत्येक नमूने में शुद्ध डीएमएसओ के 100 μL जोड़ें और 30 s के लिए भंवर जोड़ें।
      2. पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए भंवर के साथ 660 एनएम लेजर (प्रकाश शक्ति घनत्व 0.6 डब्ल्यू / सेमी2) के साथ घोल को विकिरणित करके "रिंग-क्लोज्ड" से "रिंग-ओपन" रूप में स्पष्ट दीवार ट्यूब में स्टॉक समाधान (एलएमबी 002) को फोटोइसोमेराइज करें। तब तक जारी रखें जब तक कि रंग स्पष्ट रूप से गहरे बैंगनी से हल्के भूरे रंग में बदल न जाए। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्रकाश से बचाएं।
  2. 2 डी सेल कल्चर प्रयोग-कोशिकाओं को सीडिंग (दिन 1)।
    1. एलएलसी सेल कल्चर के साथ टी -75 फ्लास्क से डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 10 एमएल को 15 एमएल बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें। बचे हुए माध्यम को वैक्यूम पंप से एस्पिरेट करें।
    2. सेल कल्चर को 1x डीपीबीएस के 5 एमएल के साथ धोएं और वैक्यूम पंप के साथ घोल को एस्पिरेट करें।
    3. 1x ट्रिप्सिन-EDTA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को कवर करें और फ्लास्क को 5%CO2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 1x ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान वाले सेल कल्चर फ्लास्क में डीएमईएम माध्यम (पहले एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित) के 6 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन कार्रवाई को रोकें और सेल कल्चर फ्लास्क की दीवारों से कोशिकाओं को धोने के लिए निलंबन को कई बार पाइप करें।
    5. निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें। ट्यूब के निचले हिस्से में सेल गोली को छूने से बचें।
    6. 2 मिलीलीटर ताजा डीएमईएम पूर्ण माध्यम और पाइपिंग को कई बार जोड़कर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. 0.5 एमएल ट्यूब में निलंबन के लगभग 15 μL का नमूना लेकर कोशिकाओं की गणना करें, 0.4% ट्राइपैन ब्लू के 15 μL जोड़ें, और प्राप्त मिश्रण को सेल काउंटिंग चैंबर में स्थानांतरित करें।
    8. गिनती के बाद, प्रति समय बिंदु पर सेल निलंबन के 25 एमएल तैयार करें। स्पष्ट तल और काले अपारदर्शी दीवारों के साथ 96-वेल प्लेट के केंद्रीय 60 कुओं में डीएमईएम के 200 μL में 5,000-10,000 (औसतन 8,000) एलएलसी कोशिकाओं / शेष 36 कुओं को शुद्ध डीएमईएम से भरें।
    9. प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर रखें। नीचे की प्लेट के असमान हीटिंग को रोकने के लिए नीचे प्लास्टिक प्लेट के ढक्कन का उपयोग करें।
  3. 2 डी सेल कल्चर प्रयोग - यौगिकों को जोड़ना (दिन 2)
    1. प्लेटों में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की निगरानी करें जब तक कि कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाती हैं।
    2. एक बाँझ कैबिनेट में वैक्यूम पंप के साथ कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें। ताजा प्रीवार्म्ड डीएमईएम माध्यम के 100 μL जोड़ें और प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    3. पॉलीप्रोपाइलीन आटोक्लेव स्पष्ट प्लेटों में परीक्षण यौगिकों और सकारात्मक नियंत्रण के सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। व्यक्तिगत समय बिंदु माप के लिए निम्नलिखित समाधान बनाएं:
      नोट: डीएमएसओ में स्टॉक से शुरू करें और डीएमईएम के साथ पतला करें, लेकिन अंतिम उच्चतम एकाग्रता में डीएमएसओ के 1% वी / वी से अधिक न करें।
      1. ग्रामिसिडिन एस के 128 μM समाधान को प्राप्त करने के लिए, DMEM के 198.7 μL में 20 mM स्टॉक समाधान का 1.3 μL जोड़ें।
      2. LMB002, "रिंग-ओपन" फॉर्म का 256 μM समाधान प्राप्त करने के लिए, DMEM के 198.7 μL में 40 mM समाधान का 1.3 μL जोड़ें।
      3. LMB002, "रिंग-बंद" फॉर्म का 512 μM समाधान प्राप्त करने के लिए, DMEM के 197.4 μL में 40 mM स्टॉक समाधान का 2.6 μL जोड़ें।
    4. प्रत्येक एकाग्रता बिंदु के चार सेट प्राप्त करने के लिए तीन अतिरिक्त दोहराव करें। प्रत्येक शुरुआती कुएं से 100 μL को अलग करके, DMEM के 100 μL के साथ एक कुएं में स्थानांतरित करके और अच्छी तरह से मिश्रण करके एक डबल तनुकरण श्रृंखला तैयार करें।
      नोट: फोटोस्विचेबल यौगिकों के साथ काम करने के लिए बैक फोटोइसोमेराइजेशन को रोकने के लिए प्रकाश समायोजन की आवश्यकता होती है। बाँझ अलमारियों में प्रकाश बंद करने की सिफारिश की जाती है।
    5. पहले जोड़े गए डीएमईएम के 100 μL के साथ 56 कुओं में हर बार तैयार समाधानों के 100 μL को स्थानांतरित करके कुओं (5-150 μM) में यौगिकों की अंतिम सांद्रता प्राप्त करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए चार कुओं में हर बार डीएमईएम के 100 μL जोड़ें।
    6. अनियंत्रित फोटोस्विचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या प्लास्टिक सुरक्षात्मक अपारदर्शी कवर के साथ प्लेटों को कवर करें। चुने हुए इनक्यूबेशन समय (10 मिनट, 60 मिनट, 24 घंटे या 72 घंटे) के लिए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस (अतिरिक्त प्लास्टिक प्लेट ढक्कन के नीचे उपयोग करके) पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
  4. 2 डी सेल कल्चर प्रयोग - धुंधला और इमेजिंग (दिन 2-5)
    1. विभिन्न अवधियों के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेशन के बाद, 10 और 60 मिनट के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किए गए प्लेटों में प्रति कुएं 50 μL धुंधला घोल जोड़ें। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 20 mM Hoechst 33342 समाधान के 8 μL (अंतिम एकाग्रता 5 μM है), 1 mM प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) समाधान के 32.5 μL (अंतिम एकाग्रता 1 μM है), और 650 μL नॉनस्टेराइल FBS को 5,810 μL नॉनस्टेराइल 1x PBS में जोड़कर प्रति समय बिंदु स्टॉक स्टेनिंग समाधान तैयार करें। कोशिकाओं को तापमान के झटके का अनुभव करने से रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एफबीएस और पीबीएस को गर्म करें।
    2. 20x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके स्वचालित प्रतिदीप्ति इमेजिंग करें।
    3. 24 (दिन 3) और 72 (दिन 5) घंटे के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किए गए प्लेटों के लिए एक ही धुंधला और इमेजिंग प्रक्रिया (चरण 1.4.1 -1.4.2) दोहराएं।
      नोट: विशिष्ट 2 डी प्लेट मानचित्र चित्रा 2 में दिखाए गए हैं।
  5. 3 डी सेल कल्चर प्रयोग - कोशिकाओं को सीडिंग (दिन 1)
    नोट: इस खंड के लिए चरण सेल संस्कृति के 2 डी प्रयोग-तैयारी के लिए वर्णित हैं, परीक्षण किए गए यौगिकों के साथ इनक्यूबेशन हैं, और इमेजिंग (चरण 1.1-1.4.) हालांकि, इस मामले में, कोशिकाओं को काले, गैर-पारदर्शी दीवारों के साथ 384-अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो आसंजन यू-बॉटम प्लेट में कॉम्पैक्ट परिपक्व स्फेरॉइड के रूप में तैयार किया जाता है। इस आकार की प्लेट का उपयोग करने से एक प्रयोग में दो यौगिकों की तुलना की जा सकती है।
    1. एलएलसी सेल संस्कृति के साथ 2 डी प्रयोग प्रोटोकॉल से चरण 1.2.1-1.2.9 दोहराएं।
    2. कोशिकाओं की गिनती के बाद, सेल निलंबन के 25 एमएल तैयार करें। 384-वेल, कम-बाध्यकारी, यू-बॉटम प्लेट में डीएमईएम के 50 μL में सभी कुओं में प्रति कुएं 1,000 कोशिकाओं को बीज दें।
    3. 30 सेकंड के लिए 40 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और 1 मिनट के लिए 250 आरपीएम पर प्लेट शेकर के साथ हिलाएं ताकि कुओं की दीवारों से नीचे तक कोशिकाओं को हिलाया जा सके।
    4. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें और 48 घंटे के लिए प्लेट के तल के असमान हीटिंग को रोकने के लिए अतिरिक्त प्लास्टिक प्लेट ढक्कन के ऊपर 5% सीओ2 रखें।
  6. 3 डी सेल कल्चर प्रयोग - यौगिकों को जोड़ना (दिन 3)
    1. माइक्रोस्कोपी द्वारा प्लेटों में कोशिकाओं की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कॉम्पैक्ट परिपक्व स्फेरॉइड का गठन हुआ है।
    2. पॉलीप्रोपाइलीन आटोक्लेव स्पष्ट प्लेटों में अध्ययन किए गए यौगिकों का एक सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें। इस मामले में, एक अतिरिक्त यौगिक शामिल करें। व्यक्तिगत समय बिंदु माप के लिए निम्नलिखित समाधान बनाएं:
      1. ग्रामिसिडिन एस के 175 μM और 350 μM समाधान प्राप्त करने के लिए, DMEM के 198.2 μL में 20 mM स्टॉक समाधान का 1.8 μL जोड़ें और DMEM के 196.4 μL में 3.6 μL स्टॉक जोड़ें।
      2. LMB002 के 175 μM और 350 μM समाधान, "रिंग-ओपन" फॉर्म प्राप्त करने के लिए, DMEM के 199 μL में 40 mM स्टॉक समाधान का 1 μL जोड़ें और DMEM के 198.2 μL में 1.8 μL स्टॉक जोड़ें।
      3. LMB002, "रिंग बंद" फॉर्म के 350 μΜ और 1,750 μM समाधान प्राप्त करने के लिए, DMEM के 198.2 μL में 40 mM स्टॉक समाधान का 1.8 μL जोड़ें और DMEM के 191.2 μL में 8.8 μL स्टॉक जोड़ें।
    3. प्रत्येक एकाग्रता बिंदु के चार सेट प्राप्त करने के लिए तीन अतिरिक्त प्रतिकृतियां करें। प्रत्येक शुरुआती कुएं से 20 μL वापस लेकर, इसे 180 μL DMEM के साथ कुएं में स्थानांतरित करके, और अच्छी तरह से मिश्रण करके सीरियल कमजोर पड़ने का लाभ उठाएं।
      नोट: फोटोस्विचेबल यौगिकों के साथ काम करने के लिए बैक फोटोइसोमेराइजेशन को रोकने के लिए प्रकाश समायोजन की आवश्यकता होती है। बाँझ अलमारियों में रोशनी बंद करने की सिफारिश की जाती है।
    4. डीएमईएम के 50 μL वाले 128 कुओं में हर बार तैयार समाधानों के 20 μL को स्थानांतरित करके कुओं में यौगिकों की अंतिम सांद्रता प्राप्त करें। नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए तीन कुओं में हर बार डीएमईएम के 20 μL जोड़ें। फोटोस्विचिंग या वाष्पीकरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या प्लास्टिक सुरक्षात्मक कवरेज के साथ प्लेटों को कवर करें।
    5. चुने हुए इनक्यूबेशन समय के लिए प्लास्टिक प्लेट के ढक्कन पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेटों को रखें।
  7. 3 डी सेल कल्चर प्रयोग - धुंधला और इमेजिंग (दिन 3-6)
    1. 1 mM कैल्सीन AM समाधान के 13 μL (अंतिम सांद्रता 1 μM है), 20 mM Hoechst 33342 समाधान के 22 μL (अंतिम एकाग्रता 33 μM है), 1 mM PI समाधान के 40 μL (अंतिम एकाग्रता 3 μM है), 300 μL नॉनस्टेराइल FBS को 2,625 μL नॉनस्टेराइल 1x PBS जोड़कर प्रति समय बिंदु धुंधला समाधान तैयार करें। कोशिकाओं को तापमान के झटके का अनुभव करने से रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एफबीएस और पीबीएस को गर्म करें।
    2. यौगिकों के साथ अलग-अलग अवधि के लिए इनक्यूबेशन के बाद, 10 मिनट के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किए गए कुओं में प्रति कुएं 20 μL धुंधला घोल जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 20x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल इमेजिंग करें।
    4. कुओं के लिए एक ही धुंधला और इमेजिंग प्रक्रिया दोहराएं जिन्हें 24 (दिन 4) और 72 (दिन 6) घंटे के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किया गया था।
      नोट: इस प्रयोग में, कैल्सीन एएम का उपयोग मल्टीकलर स्टेनिंग समाधान के तीसरे घटक के रूप में किया जाता है। 2 डी और 3 डी प्रयोगों से प्राप्त छवियों का विश्लेषण उपकरण के स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। होचस्ट और प्रोपिडियम आयोडाइड रंगों के साथ सह-दाग वाली कोशिकाओं को नेक्रोटिक रूप से मृत माना जाता है, और एकाग्रता के कार्य के रूप में उनके अंश का उपयोग आईसी50 मूल्य की गणना करने के लिए किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: 2 डी संस्कृति प्रयोगों के लिए विशिष्ट प्लेट मानचित्रों का उदाहरण। यौगिकों और नियंत्रण के लिए रंग कोड इंगित किए गए हैं। परीक्षण किए गए यौगिकों की सांद्रता (कुओं के अंदर संख्या) μM में दी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. एक ऊतक सरोगेट में फोटोस्विचिंग दक्षता का निर्धारण

  1. नमूना विकिरण के लिए ऑप्टिकल ट्रेन को इकट्ठा करें जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है (लेजर प्रकाश स्रोत से एक ऑप्टिकल केबल, परिवर्तनीय फोकल लंबाई वाला एक लेंस, एक गैर-पारदर्शी कवर के साथ एक सिरिंज और एक फ्लैट कट एंड शामिल है)।
    1. फोकल लंबाई और लेंस के एपर्चर को बदलकर, व्यास के साथ प्रकाश की एक सपाट किरण प्राप्त करें जो उपयोग किए गए सिरिंज के आंतरिक व्यास से 1-1.5 मिमी बड़ा है, लेकिन अभी भी, जितना संभव हो सके एपर्चर के भीतर है।
  2. एक कट एंड और 12.4 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और इसे एक गैर-पारदर्शी प्लास्टिक कवर के साथ कवर किया गया है। 200 mW के लेजर पावर आउटपुट पर, ऑप्टिकल सिस्टम के आउटपुट पर पावर घनत्व ~ 103 mW /cm2 पर सेट करें जैसा कि फोटोमीटर के साथ मापा जाता है।
    नोट: बाद के सभी ऑपरेशन न्यूनतम संभव कार्यस्थल रोशनी के साथ एक अंधेरे कमरे में किए जाने चाहिए।
  3. 1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता के साथ पीबीएस में एलएमबी 002 ("रिंग-क्लोज्ड" फॉर्म) स्टॉक समाधान के 3 एमएल तैयार करें।
  4. एक प्लास्टिक कंटेनर में एलएमबी 002 के निष्क्रिय फोटोफॉर्म से भरा एक मॉडल ऊतक नमूना तैयार करें। एक सामान्य रन में, 5 ग्राम ताजा कीमा पोर्क मांस को यांत्रिक रूप से एलएमबी 002 स्टॉक समाधान के 277 μL और पीबीएस के 260 μL के साथ मिलाया जाता है ताकि नमूने में 50 मिलीग्राम / किग्रा की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके, और अनुपात ऊतक / पीबीएस ~ 9/1 (v / v) हो सके।
  5. तैयार नमूने के साथ सिरिंज भरें, यह सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले अंदर नहीं हैं, और एक्सपोज़र (कट) अंत में एक सपाट सतह बनाएं।
    नोट: सिरिंज में नमूने का सिलेंडर अक्ष के साथ ~ 40 मिमी पर कब्जा करना चाहिए।
  6. ऑप्टिकल ट्रेन में नमूने को विकिरणित करें जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है 9 मिनट 44 सेकंड के लिए, ~ 60 जे / सेमी2 एक्सपोजर के अनुरूप।
  7. एक्सपोजर के बाद नमूने के 4 मिमी-मोटे स्लाइस तैयार करें, इसे पिस्टन का उपयोग करके सिरिंज से धक्का दें और इसे स्केलपेल से काट दें। स्लाइस को अलग-अलग परीक्षण ट्यूबों में तौलें और रखें और उन्हें विकिरणित सतह से औसत दूरी (मिमी) से चिह्नित करें।
  8. परीक्षण ट्यूबों में दो नियंत्रण नमूने (इष्टतम मात्रा, 0.5-0.7 ग्राम) तैयार करें: एक में, पीबीएस (54 μL) के 10% (मात्रा) के साथ मिश्रित कीमा मांस, और दूसरे में, चरण 2.4 में प्राप्त मॉडल ऊतक नमूना 10 मिनट के लिए 500 mW लेजर प्रकाश द्वारा विकिरणित किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी LMB002 "रिंग-बंद" अणुओं को "रिंग-ओपन" रूप में परिवर्तित किया जाता है।
  9. प्रत्येक स्लाइस और नियंत्रण नमूने में एसिटोनिट्राइल-पानी मिश्रण (70%/30% वी / वी, 0.01% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए), 1.4 एमएल / जी) के साथ पूरक जोड़ें। कांच की छड़ का उपयोग करके सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं।
  10. कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें और मिश्रण को 20 मिनट के लिए 5220 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें या अघुलनशील सामग्री को हटाने और सुपरनैटेंट को इकट्ठा करने के लिए 30 मिनट के लिए 20 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  11. सुपरनैटेंट (~ 0.7 एमएल) को ध्यान से इकट्ठा करें और उन्हें 30 मिनट के लिए 16,000 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. सुपरनैटेंट (~ 0.5 एमएल प्रत्येक) एकत्र करें और एक विश्लेषणात्मक सी 18 कॉलम के साथ रिवर्स-फेज हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (आरपी एचपीएलसी), 3.46% बी / मिनट के रैखिक ए: बी ढाल, 2.0 एमएल / मिनट प्रवाह दर, और 100 μL इंजेक्शन वॉल्यूम के साथ उनका विश्लेषण करें। यूवी-पता लगाए गए क्रोमैटोग्राम को 570 एनएम ("रिंग-बंद" फॉर्म का पता लगाना) और 270 एनएम ("रिंग-ओपन" फॉर्म का पता लगाना) पर रिकॉर्ड करें। दोनों फोटोफॉर्म (एलुएंट ए: जलीय 0.1% टीएफए; एलुएंट बी: 90% एसिटोनिट्राइल-पानी, 0,1% टीएफए) के विशिष्ट अवधारण समय को निर्धारित करने के लिए गैर-विकिरणित (चरण 2.4) और विकिरणित नियंत्रण (चरण 2.8) नमूनों का उपयोग करें और विधि को कैलिब्रेट करें।
  13. ज्ञात सांद्रता के एलएमबी 002 समाधानों के क्रोमैटोग्राम लेने और विश्लेषण करके प्राप्त अंशांकन वक्रों का उपयोग करके विश्लेषण किए गए नमूनों में एलएमबी 002 फोटोफॉर्म की वास्तविक मात्रा निर्धारित करें। अंशांकन के लिए, स्टॉक समाधान (चरण 2.3) को एसिटोनिट्राइल-पानी मिश्रण (70%/30% v/v 0.01% TFA के साथ पूरक) के साथ पतला करके LMB002 "रिंग-क्लोज्ड" समाधान तैयार करें ताकि 0.36, 0.9, और 3.6 μg प्रति 100 μL (मात्रा इंजेक्ट) प्राप्त की जा सके; एलुएंट ग्रेडिएंट और प्रवाह दर चरण 2.12 के समान हैं।
  14. प्रयोग (चरण 2.4-2.12) को तीन बार दोहराएं और प्लॉट (प्रतिशत) बनाम दूरी (विकिरणित ऊतक सतह से) पर प्रत्येक फोटोफॉर्म के सामान्यीकृत प्रतिशत को प्लॉट करें। आंकड़ों की गणना करें (यानी, प्रत्येक एकाग्रता बिंदु पर मानक विचलन)।

Figure 3
चित्रा 3: मॉडल ऊतक में फोटोकन्वर्जन की दक्षता निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप। (ए) योजनाबद्ध और (बी) फोटोग्राफ; 1, लेजर प्रकाश स्रोत से ऑप्टिकल केबल; 2, परिवर्तनीय फोकल लंबाई के साथ लेंस; और 3, मांस कीमा-एलएमबी 002-फॉस्फेट-बफर ्ड खारा मिश्रण 4 में रखा गया, एक गैर-पारदर्शी कवर के साथ एक सिरिंज और कट फ्रंटएंड (कवर के बिना (बी) में दिखाया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. विवो एंटीकैंसर प्रभावकारिता निर्धारण में।

नोट: प्रयोग अनुसूची और समापन बिंदु चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। उपचार के बाद की अवधि में पशु देखभाल मानकों को 3 आर नियमों का पालन करना चाहिए-आवास में उचित पिंजरे घनत्व और संसाधन उपलब्धता शामिल होनी चाहिए। जब भी संभव हो, सुरंग या कपिंग जैसे गैर-प्रतिकूल पशु हैंडलिंग विधियों का पालन करें।

Figure 4
चित्रा 4: विवो चिकित्सीय प्रयोग के लिए अनुसूची। प्रायोगिक समूहों के पदनाम, चिकित्सा विवरण, समापन बिंदु और पोस्टमार्टम विश्लेषण कार्यक्रम। संक्षेप: एलएलसी = लुईस फेफड़े कार्सिनोमा; IV = अंतःशिरा; एससी = चमड़े के नीचे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. चमड़े के नीचे टीकाकरण के लिए कैंसर कोशिकाओं की तैयारी (दिन 0)।
    1. डीएमईएम (4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज) में एलएलसी कोशिकाओं को 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर पारित करें।
    2. 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान, सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कोशिकाओं की कटाई करें, और सीरम-मुक्त डीएमईएम में निलंबित करें।
    3. कोशिकाओं की गणना करें और हेमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण का उपयोग करके उनकी व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    4. डीएमईएम और मैट्रिगेल मिश्रण (1: 1) में 10 ×10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के साथ अंतिम सेल निलंबन तैयार करें। इंजेक्शन से पहले निलंबन को बर्फ पर रखें।
  2. एलएलसी सेल टीकाकरण (दिन 0)
    1. वयस्क महिला C57BL / 6NCrl माउस (वजन ~ 20 ग्राम) को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया मशीन के प्रेरण कक्ष में रखें। आइसोफ्लुरेन के 5% पर बेहोश करने की क्रिया करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर पूरी तरह से बेहोश न हो जाए।
    2. शेविंग द्वारा सेल टीकाकरण के क्षेत्र से फर को हटा दें।
    3. डीएमईएम के ~ 100 μL में 5 ×10 5 एलएलसी कोशिकाओं को टीका लगाएं: मैट्रिगेल (1: 1) मिश्रण को दाहिने हिंदलिम्ब में।
      नोट: जब भी संभव हो, एकल सुई उपयोग अभ्यास का पालन करें।
  3. यौगिक प्रशासन और फोटोरेडिएशन
    नोट: टीकाकरण के बाद 5-8 दिनों में, जानवर उपचार के लिए तैयार होते हैं जब उनके ट्यूमर स्पष्ट होते हैं और ~ 50-100 मिमी3 मात्रा तक पहुंच जाते हैं। एलएमबी 002 के साथ बाद के सभी ऑपरेशन करें और अर्ध-अंधेरे परिस्थितियों में इस यौगिक द्वारा इलाज किए गए चूहों (कार्यस्थल से कम से कम 5 मीटर दूर एक 4 डब्ल्यू एलईडी लैंप)।
    1. गहरे नीले रंग के सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा (IV) की खुराक के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर बाँझ शारीरिक लवण में एलएमबी 002 ("रिंग-क्लोज्ड" रूप) को घोलें।
    2. विकिरण से पहले, यादृच्छिक रूप से आठ जानवरों के चार समूहों को इकट्ठा करें और शेविंग करके ट्यूमर और आस-पास के क्षेत्रों से फर को हटा दें।
    3. आईवी इंजेक्शन के लिए धारक में एक माउस रखें और पूंछ की नस को दृश्यमान बनाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में जानवर की पूंछ को गर्म करें।
      नोट: प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिया पर विचार करें।
    4. यौगिक को पूंछ की नस में 5 एमएल / किग्रा पर इंजेक्ट करें। दो नियंत्रण समूहों के लिए, प्रति जानवर (20 ग्राम शरीर के वजन) के 100 μL नमकीन (अंतःशिरा) इंजेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि दो प्रयोगात्मक समूहों में जानवरों को निष्क्रिय फोटोफॉर्म (खारा में 1 मिलीग्राम / एमएल) में परीक्षण किए गए यौगिक प्राप्त होते हैं।
      नोट: जब भी संभव हो, एकल सुई उपयोग अभ्यास का पालन करें।
    5. फिर, यौगिक के इंजेक्शन के 2 घंटे 45 मिनट बाद, माउस को संज्ञाहरण के तहत रखें। ऑक्सीजन में 3% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ बेहोश करने की क्रिया को प्रेरित करें। ऑक्सीजन में 0.5% -1% आइसोफ्लुरेन के साथ 15 मिनट के लिए संज्ञाहरण बनाए रखें।
    6. माउस को एक काले मास्क के साथ कवर करें जिसमें एक छेद होता है जो केवल ट्यूमर क्षेत्र को प्रकाश में उजागर करता है।
    7. 650 एनएम लेजर के साथ लेजर डायोड मॉड्यूल चालू करें और लाल लेजर की शक्ति को 200 किलोवाट और नीले / यूवी गाइड लेजर को 2 किलोवाट पर सेट करें।
      नोट: लेजर डिवाइस चालू होने पर नीले सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग करें।
    8. एक फोटोमीटर के साथ लाल लेजर (चूहों से दूर) से प्रकाश प्रवाह को मापें और ऑप्टिकल केबल से दूरी निर्धारित करें जहां प्रकाश प्रवाह 100 mW / सेमी2 है। यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्टैंड पर केबल ठीक करें कि प्रकाश स्रोत ट्यूमर से निर्धारित दूरी पर है और प्रकाश पूरे ट्यूमर क्षेत्र को कवर करता है। इस प्रक्रिया के दौरान नीले / यूवी गाइड लेजर प्रकाश का उपयोग करें।
    9. 20 मिनट के लिए ट्यूमर क्षेत्र को विकिरणित करने के लिए लाल लेजर चालू करें।
    10. विकिरण के बाद, आइसोफ्लुरेन प्रवाह को बंद करें, जानवर को उसके पिंजरे में वापस करें, और अगले 30 मिनट में उसकी स्थिति का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें।
      नोट: यौगिक प्रशासन के बाद, चूहों को 2 दिनों के लिए अंधेरे में रखें। केवल प्रकाश-दिन चक्र को बदलना होगा; अन्य सभी आवास की स्थिति अपरिवर्तित रहनी चाहिए।
  4. उपचार के बाद के अवलोकन
    1. रोजाना जानवरों का निरीक्षण करें और उनके ट्यूमर के वजन और आयामों को मापें। ट्यूमर की मात्रा को मापें और नेक्रोसिस की प्रगति पर ध्यान दें।
      नोट: उपचार के बाद की अवधि में पशु देखभाल मानकों को 3 आर नियमों का पालन करना चाहिए-आवास में उचित पिंजरे घनत्व और संसाधन उपलब्धता शामिल होनी चाहिए।
    2. मृत्यु दर का मूल्यांकन करने के लिए पिछले चरण में एकत्र किए गए डेटा का उपयोग करें। मानक प्रक्रिया का उपयोग करके जीवित रहने की दर निर्धारित करें।
      नोट: गंभीर नैदानिक संकेतों (15% से अधिक शरीर के वजन में कमी, ट्यूमर अल्सर7 दिनों में ठीक नहीं होता है, और मुखरता) या जैसे ही ट्यूमर की मात्रा 2,500 मिमी3 तक पहुंचती है, का खुलासा करते समय जानवरों को बलिदान और मृत के रूप में गिना जाना चाहिए।

Representative Results

इस काम में, अलग-अलग इनक्यूबेशन समय पर एलएमबी 002 (चित्रा 1 देखें) के "रिंग-क्लोज्ड" और "रिंग-ओपन" रूपों के लिए आईसी50 निर्धारित करने के लिए 2 डी और 3 डी सेल प्रयोग आयोजित किए गए थे ( चित्र 1 देखें)। इन मूल्यों की तुलना प्रोटोटाइप पेप्टाइड, ग्रामिसिडिन एस (सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है) के लिए प्राप्त लोगों के साथ की गई थी। धुंधला होने के बाद 2 डी-विकसित एलएलसी संस्कृति में इनक्यूबेशन की छवियों का एक विशिष्ट सेट चित्रा 5 में दिखाया गया है। होकस्ट 33342 (नीला) और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) के साथ सह-धुंधलापन जिसके परिणामस्वरूप "रिंग-क्लोज्ड" की तुलना में "रिंग-ओपन" रूप के साथ उपचार के मामले में कोशिकाओं के एक बड़े अंश में बैंगनी रंग के अलग-अलग रंग होते हैं, दो रूपों के बीच साइटोटॉक्सिसिटी में एक उल्लेखनीय अंतर को इंगित करता है जिसे आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। एक सफल प्रयोग का प्रदर्शित उदाहरण 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा पर आधारित है, जहां अलग-अलग सांद्रता में पेप्टाइड वेरिएंट जोड़े गए थे, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है। इसी तरह के डेटा को 384-वेल और उच्च घनत्व वाली प्लेटों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि प्रति अच्छी मात्रा कम हो जाती है, तकनीकी और व्यवस्थित त्रुटियां और, परिणामस्वरूप, आईसी50 निर्धारण की सटीकता अच्छी तरह से घनत्व बढ़ने के साथ कम हो जाएगी।

Figure 5
चित्रा 5: मोनोलेयर-विकसित एलएलसी में साइटोटॉक्सिसिटी परख से प्रतिनिधि छवियां। कोशिकाओं को होचस्ट 33342 (नीला) और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) से दाग दिया गया था। दिखाए गए समय: 10 मिनट, 60 मिनट, 24 घंटे और 72 घंटे यौगिकों के साथ इनक्यूबेशन गुना हैं। स्केल सलाखों = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक मॉडल ऊतक में लेजर प्रकाश विकिरण द्वारा एलएमबी 002 का फोटोरूपांतरण - ताजा पोर्क कीमा - पीबीएस में घुले एलएमबी 002 "रिंग-क्लोज्ड" (निष्क्रिय) रूप के साथ मिश्रित कीमा मांस से बने एक नमूने का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और विकिरण प्रसार की दिशा में इस निष्क्रिय रूप के एलएमबी 002 "रिंग-ओपन" (सक्रिय) रूप में रूपांतरण को मापा गया था। नमूने को एक सिरिंज में रखा गया था और ~ 10 मिनट (आमतौर पर विवो प्रयोगों में उपयोग किया जाता है) के एक्सपोजर समय के लिए लेजर विकिरण के फ्लैट बीम के साथ एक तरफ से विकिरणित किया गया था, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। एक्सपोजर के बाद, नमूना सिलेंडर को सिरिंज पिस्टन दबाकर और स्केलपेल के साथ समान ऊंचाई के स्लाइस को काटकर भागों में विभाजित किया गया था। स्लाइस से अर्क में एलएमबी 002 "रिंग-ओपन" की एकाग्रता आरपी एचपीएलसी का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।

चित्रा 6 डेटा विश्लेषण से प्राप्त खुराक-प्रभाव वक्रों चित्रा 6 ए-डी को दर्शाता है। होचस्ट 33342 और पीआई रंगों के परमाणु सह-धुंधलापन के साथ मृत कोशिकाओं के प्रतिशत की पहचान करने के लिए, हमने एक अंतर्निहित क्लासिफायर टूल का उपयोग किया जो सभी सेल गणनाओं को कई श्रेणियों में विभाजित करने के लिए चयनित मापा मापदंडों पर संख्यात्मक थ्रेसहोल्ड सेट करता है। उदाहरण के लिए, जब नियंत्रण में लाल चैनल (प्रोपिडियम आयोडाइड) सिग्नल दहलीज (लगभग 110-130 इकाइयों) पर था, तो कोशिकाओं को पीआई-पॉजिटिव के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिसे मृत माना जाता है, या पीआई-नकारात्मक, यौगिकों द्वारा अप्रभावित माना जाता है। एलएमबी 002 के लिए, यौगिक एकाग्रता पर प्रोपिडियम आयोडाइड-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत की सिग्मोइडल निर्भरता देखी जा सकती है। इन आंकड़ों से, IC50 मान निर्धारित किया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: 2 डी संस्कृति में साइटोटॉक्सिसिटी का विश्लेषण। सिग्मोइड फिट बैठता है जैसा कि एलएलसी संस्कृति में (ए) 10 मिनट, (बी) 60 मिनट, (सी) 24 घंटे और (डी) 72 घंटे-समय अंतराल के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेशन के लिए प्राप्त किया गया था। फिटिंग आईसी50 मूल्यों के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देता है (दिखाया नहीं गया)। त्रुटि पट्टियाँ एसईएम हैं। संक्षेप: एलएलसी = लुईस फेफड़े कार्सिनोमा; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राप्त आईसी50 मूल्यों को ध्यान में रखते हुए, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इनक्यूबेशन समय के साथ सभी तीन यौगिकों की विषाक्तता बढ़ गई। हमारे प्रयोग से पता चला है कि एलएमबी 002 का "रिंग-ओपन" रूप प्रोटोटाइप पेप्टाइड, ग्रामिसिडिन एस की तुलना में लगभग एक कमजोर पड़ने वाला कदम कम विषाक्त है, जबकि "रिंग-क्लोज्ड" फॉर्म तीन से चार कमजोर पड़ने वाले कदम कम विषाक्तता को दर्शाता है, जो इनक्यूबेशन समय के साथ बढ़ता है। दो कमजोर पड़ने वाले चरणों के बीच का अंतर इनक्यूबेशन समय में वृद्धि से प्रभावित नहीं होता है और संभावित लाइब्रेरी स्क्रीनिंग में अन्य यौगिकों के साथ तुलना के लिए प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित फोटोथेराप्यूटिक विंडो6 के रूप में संख्यात्मक रूप से उपयोग किया जा सकता है। ग्रामिसिडिन एस के लिए आईसी50 मान को जैविक प्रतिकृति में प्रयोगात्मक त्रुटियों या अंतर आउटपुट को सही करने के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में सेट किया गया था।

3 डी सेल प्रयोगों ने एक ही प्रकार के कच्चे डेटा का उत्पादन किया - एकल सेल-हल किए गए एक-प्रति-अच्छी तरह से स्फेरॉइड छवियां। तीसरे धुंधला डाई के रूप में कैल्सीन को शामिल करने से चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं (हरे चैनल में देखा गया) के अंश का परिमाणीकरण संभव हो जाता है। 384-वेल प्लेटों का उपयोग करके, तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या में वृद्धि करके, अनावश्यक सह-इनक्यूबेशन समय बिंदुओं को छोड़कर, और कमजोर पड़ने की तह को बदलकर, हम सीधे एकल परीक्षण रन (एकल प्लेट का उपयोग करके) में कई यौगिकों की तुलना करने में सक्षम थे, जैसा कि चित्र 7 में प्लेट मानचित्र में दिखाया गया है।

Figure 7
चित्रा 7: दो यौगिकों के साथ 3 डी संस्कृति प्रयोग के लिए प्लेट मानचित्र। यौगिकों और नियंत्रण के लिए रंग कोड इंगित किए गए हैं। कुओं में संख्याएँ μM में सांद्रता हैं। 10 मिनट, 24 घंटे और 72 घंटे इनक्यूबेशन गुना हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 8 परीक्षण किए गए यौगिकों की उपस्थिति में 1 स्फेरॉइड / वेल के घनत्व पर उगाए गए एलएलसी स्फेरॉइड की चयनित तकनीकी प्रतिकृति की छवियों को प्रदर्शित करता है और धुंधला होने के बाद कैप्चर किए गए स्फेरॉइड को नियंत्रित करता है।

Figure 8
चित्रा 8: 3 डी संस्कृति साइटोटॉक्सिसिटी परख से प्रतिनिधि छवियां। तस्वीरों में 48 साल पुराने एलएलसी स्फेरॉइड ्स को 10 मिनट, 24 घंटे और 72 घंटे के बाद होचस्ट 33342 (नीला), कैल्सीन एएम (हरा), और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) के साथ 10 मिनट, 24 घंटे और 72 घंटे के सह-इनक्यूबेशन के साथ LMB002 फोटोफॉर्म और ग्रामिसिडिन एस स्केल बार = 100 μm के साथ दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उपकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, खुराक-प्रभाव वक्र, 2 डी प्रयोग की तरह, छवियों के जेड-स्टैक्ड ढेर से प्राप्त किए गए थे (चित्रा 9 ए)। इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में कॉम्पैक्ट और गैर-विकृत स्फेरॉइड को पूरे-स्फेरॉइड व्यास (चित्रा 9 बी) की विशेषता हो सकती है। यह भी ध्यान दिया गया कि समग्र स्फेरॉइड व्यास यौगिक एकाग्रता के साथ भिन्न होता है।

Figure 9
चित्रा 9: 3 डी संस्कृतियों के साथ साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन। (ए) एकाग्रता-निर्भर साइटोटॉक्सिसिटी फिटिंग कर्व्स और (बी) एलएलसी की 3 डी संस्कृतियों में प्राप्त एकाग्रता-निर्भर स्फेरॉइड के व्यास के भूखंडों को 10 मिनट, 24 घंटे और 72 घंटे के लिए ग्रामिसिडिन एस के साथ सह-इनक्यूबेट किया गया और धुंधला होने से पहले कैप्चर किया गया। त्रुटि पट्टियाँ SEM हैं. कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चरण 2 के लिए प्रयोग यूवी-पता लगाए गए उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके दोनों फोटोफॉर्म में एलएमबी 002 सांद्रता के निर्धारण की अनुमति देता है। मॉडल ऊतकों में फोटोकन्वर्जन की दक्षता का आसानी से मूल्यांकन किया गया और इस सेटअप का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई (चित्रा 3)। डेटा नमूना अर्क के क्रोमैटोग्राम के मात्रात्मक विश्लेषण से प्राप्त किया गया था। इन परीक्षण प्रयोगों में, एलएमबी 002 क्रोमैटोग्राम को स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से 270 एनएम और 570 एनएम पर पाया गया था। 270 एनएम पर, कई अतिरिक्त संकेत देखे गए और मॉडल ऊतक से सह-निकाले गए यौगिकों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया (यौगिक के बिना नियंत्रण अर्क से सत्यापित)। दोनों फोटोफॉर्म अवधारण समय और अवशोषण में पर्याप्त रूप से भिन्न थे। हालांकि, एलएमबी 002 "रिंग-ओपन" सिग्नल इन पृष्ठभूमि संकेतों से बेसलाइन-अलग था ( चित्रा 10 ए में एक प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम देखें)। इसलिए, इस सिग्नल को समस्याओं के बिना एकीकृत किया जा सकता है। 570 एनएम पर, क्रोमैटोग्राम में केवल एलएमबी 002 "रिंग-क्लोज्ड" फॉर्म सिग्नल (चित्रा 10 बी) था। यहां, हमने आरपी एचपीएलसी का उपयोग करके एकाग्रता निर्धारण किया। फिर भी, विश्लेषणात्मक विधि के रूप में एलसी / एमएस का उपयोग करके भी उच्च सटीकता और कम पहचान सीमा प्राप्त की जा सकती है।

Figure 10
चित्र 10: मॉडल ऊतकों से निकाले गए एलएमबी 002 के प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम। (ए) विकिरणित सतह से 2 मिमी पर नमूना, 270 एनएम पर दर्ज किया गया (एलएमबी 002 "रिंग-ओपन" फॉर्म एकीकृत है); (बी) विकिरणित सतह से 38 मिमी पर नमूना, 570 एनएम पर दर्ज किया गया (एलएमबी 002 "रिंग-क्लोज्ड" का शिखर एकीकृत है)। अवधारण समय मान (संकेतित) ने अतिरिक्त रूप से यौगिक की पहचान की पुष्टि की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सभी एकत्र किए गए नमूनों के संबंधित संकेतों को एकीकृत करने के बाद प्राप्त डेटा का उपयोग एकाग्रता-गहराई ग्राफ़ बनाने के लिए किया गया था, जैसा कि चित्र 11 में दिखाया गया है। इन ग्राफों के आधार पर, मॉडल ऊतक की विभिन्न गहराई पर फोटोकन्वर्जन की दक्षता का आसानी से आकलन किया गया था। यह पुष्टि करता है कि हमारा लाल प्रकाश स्रोत ऊतक सरोगेट, कीमा मांस (लगभग 103 mW / cm2 पर) में 1 c तक की गहराई पर "रिंग-क्लोज्ड" LMB002 फोटोकन्वर्जन को प्रेरित करता है।

Figure 11
चित्रा 11: फोटोकन्वर्जन दक्षता मूल्यांकन। एलएमबी 002 "रिंग-क्लोज्ड" (गैर-सक्रिय, नीले बिंदु) और "रिंग-ओपन" रूपों (सक्रिय, नारंगी बिंदु) की एकाग्रता (ए, मिलीग्राम / किग्रा) मॉडल ऊतक (एल, मिमी) की विकिरणित सतह से अलग-अलग दूरी पर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विवो प्रयोग के परिणाम - चित्रा 4 में प्रस्तुत अनुसूची के अनुसार किए गए हमारी पद्धति के चरण 3 - समय के कार्य के रूप में ट्यूमर के विकास को दिखाने वाले ग्राफ़ द्वारा दर्शाए गए थे (चित्रा 12) और कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र (चित्रा 13)।

Figure 12
चित्रा 12: जानवरों में ट्यूमर विकास गतिशीलता। वाहन-उपचारित जानवरों की तुलना में एलएमबी 002 के साथ इलाज किए गए जानवर (सी 57बीएल / 6एनसीआरएल चूहों में चमड़े के नीचे एलएलसी एलोग्राफ्ट मॉडल, यौगिक खुराक 7 मिलीग्राम / किग्रा, IV, 2 घंटे 40 मिनट इनक्यूबेशन, फिर 650 एनएम, 100 mW / cm2, 20 मिनट पर विकिरण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्र 13: जानवरों के लिए मृत्यु दर वक्र। वाहन-उपचारित जानवरों की तुलना में एलएमबी 002 के साथ इलाज किए गए जानवर (सी 57बीएल / 6एनसीआरएल चूहों में चमड़े के नीचे एलएलसी एलोग्राफ्ट मॉडल, यौगिक खुराक 7 मिलीग्राम / किग्रा, IV, 2 घंटे 40 मिनट इनक्यूबेशन, फिर 650 एनएम, 100 mW / cm2, 20 मिनट पर विकिरण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

दवा के विकास में फोटोनियंत्रित यौगिक अभूतपूर्व हैं; हालांकि, उनके प्रीक्लिनिकल और नैदानिक मूल्यांकन के लिए कोई तरीके स्थापित नहीं किए गए हैं। निकटतम मोनोथेरेपी एनालॉग, फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी), कैंसर के खिलाफ कई देशों द्वारा अपनाए गए नैदानिक उपयोग के लिए उपचार पद्धति है औरअन्य संकेतों के लिए विकास में है। फोटोफार्माकोलॉजी के समान, पीडीटी भी बायोएक्टिव पदार्थ (सिंगलेट ऑक्सीजन) को सक्रिय करने के लिए प्रकाश के उपयोग पर आधारित है। इसलिए, पीडीटी में प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ प्रयोगात्मक तरीकों को फोटोफार्माकोलॉजी के लिए अपनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रकाश स्रोत, प्रकाश वितरण दृष्टिकोण, और चिकित्सा उपकरण पीडीटी के लिए अच्छी तरह से विकसित और अनुमोदित हैं; उन्हें सीधे फोटोनियंत्रित दवाओं के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, पीडीटी और फोटोफार्माकोलॉजी मेंएक दूसरे से कई अंतर हैं, जो उत्तरार्द्ध के लिए विशिष्ट तरीकों को स्थापित करने की आवश्यकता को सही ठहराता है।

सबसे पहले, पीडीटी (ऑक्सीजन) में गैर-सक्रिय पदार्थ हमेशा गैर विषैले सांद्रता में जीवित ऊतकों में मौजूद होता है। इसके विपरीत, गैर-सक्रिय फोटोनियंत्रित जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों में अवशिष्ट गतिविधि और अवांछित विषाक्तता हो सकती है। इसलिए, आदर्श फोटोफार्माकोलॉजी दवाओं को उनके प्रशासित रूप में जैविक गतिविधि को कम करना चाहिए और उनके प्रकाश-जनित रूप में अत्यधिक सक्रिय होना चाहिए, "फोटोथेराप्यूटिक विंडो" 21 जितना संभव हो उतना बड़ा होना चाहिए। हिट खोजने और हिट-टू-लीड अनुकूलन करने के लिए उपयुक्त यौगिकों की पहचान और अपेक्षाकृत बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है, जो पहले से ही दवा के विकास के शुरुआती चरणों में हैं। यहां, हमने कुशल फोटोस्विचिंग यौगिकों की पहचान करने के लिए एक स्वचालित उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रस्ताव दिया।

साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन की चुनी हुई विधि सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता के आसान कार्यान्वयन की अनुमति देती है - पीएसएस का रखरखाव या दृश्य-प्रकाश-संवेदनशील फोटोइसोमर की स्थिरता। ऐसा इसलिए है, क्योंकि इसके कार्यान्वयन पर, प्रकाश जोखिम कम हो जाता है। इसलिए, वैकल्पिक तरीकों का चयन करते समय, स्वचालित लोगों को प्राथमिकता दी जानी चाहिए। यह दृष्टिकोण विश्वसनीय और जानकारीपूर्ण है। इस स्तर पर 3 डी सेल कल्चर (स्फेरॉइड) का उपयोग अधिक यथार्थवादी ऊतक जैसे माइक्रोएन्वायरमेंट में उपचार के लिए सेल की प्रतिक्रिया की समग्र समझ प्रदान करता है। इसके अलावा, यौगिकों के क्रिया तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रत्यक्ष विधि के रूप में माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। उचित धुंधला प्रोटोकॉल के साथ कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं और स्फेरॉइड की आकृति विज्ञान के दृश्य मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है; कोशिका मृत्यु और कोशिकाओं के अंदर परिवर्तन पर महत्वपूर्ण विवरण भी पता लगाया जा सकता है।

दूसरा, प्रकाश आवेदन के लिए प्रकाश खुराक के सावधानीपूर्वक विकल्प की आवश्यकता होती है। पीडीटी में, प्रकाश ओवरडोज ऊतकों के लिए बेहद हानिकारकहै22. अत्यधिक प्रकाश विकिरण के तहत फोटोफार्माकोलॉजिकल थेरेपी फायदेमंद हो सकती है। सक्रिय पदार्थ की ऊपरी सीमा को गैर-सक्रिय पदार्थ और इसके फार्माकोकाइनेटिक्स की प्रशासित खुराक द्वारा परिभाषित किया गया है। हालांकि, प्रकाश खुराक अभी भी फोटोफार्माकोलॉजी में एक मुद्दा है। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि इरेडिएटिंग पावर घनत्व और एक्सपोजर समय चिकित्सा के लिए आवश्यकता से कम नहीं है। सिद्धांत रूप में, विवो में सक्रिय पदार्थ की पीढ़ी की निगरानी की जा सकती है। हालांकि, बायोएथिक्स कारणों से, हमने गैर-सक्रिय यौगिक15 के साथ मिश्रित एक मॉडल ऊतक (ताजा कीमा मांस) के साथ एक प्रयोग का प्रस्ताव दिया। यह प्रयोग सरल है और विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसे प्रकाश खुराक के फोटोफिजिकल आकलन और थर्मल प्रभावों के माप के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। यहां फिर से, मॉडल ऊतकों का उपयोग करके, प्रकाश जोखिम को कम करना संभव है, उदाहरण के लिए, विवो स्थितियों में अधिक सटीक फोटोस्विचिंग दक्षता निर्धारण की तुलना में , एक विकल्प जो हमेशा विचार करने के लिए दिलचस्प हो सकता है।

अंत में, यौगिक जो इन विट्रो विषाक्तता स्क्रीन में बेहतर विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं और मॉडल ऊतक में कम से कम 1-1.5 सेमी गहरे फोटोस्विचिंग को कुशलतापूर्वक फोटोस्विच कर रहे हैं, उन्हें विवो अध्ययनों में महंगे, श्रमसाध्य और लंबे समय के लिए चुना जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने एलोग्राफ्ट कैंसर मॉडल उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो मूल्यांकन में एक ही सेल लाइन (एलएलसी) का उपयोग किया। ट्यूमर विकास की गतिशीलता, मृत्यु दर और मेटास्टेसिस गिनती एंटीकैंसर प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए सबसे उपयुक्त पैरामीटर हैं। पारंपरिक कीमोथेरेपी की तुलना में, फोटोफार्माकोलॉजिकल उपचार में एक अतिरिक्त कारक लागू होता है - प्रकाश। इसलिए, दो नियंत्रण पशु समूहों की आवश्यकता होती है: एक जो केवल वाहन प्राप्त करता है और दूसरा जो वाहन और विकिरण प्राप्त करता है। यह सेटअप मापा मापदंडों पर प्रकाश के प्रभाव के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। हमारे प्रयोग में, दो प्रयोगात्मक समूहों के जानवरों को गैर-सक्रिय यौगिक प्राप्त हुआ, और एक समूह में चूहों के ट्यूमर को विकिरणित किया गया। विकिरण शासन नियंत्रण और उपचार समूहों के लिए समान था। इस स्तर पर बेंचमार्क कीमोथेरेपी के साथ तुलना आवश्यक नहीं है क्योंकि प्रयोग का मुख्य उद्देश्य प्रकाश और यौगिक अनुप्रयोग के संयुक्त प्रभाव को प्रदर्शित करना है। इस प्रभाव को प्रदर्शित करने वाले सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले यौगिकों को तब विवो विषाक्तता पर आगे के अध्ययन के लिए चुना जा सकता है और उनके विकास पर महत्वपूर्ण निर्णय लेने के लिए बेंचमार्क के साथ तुलना की जा सकती है। तकनीकी रूप से, विवो प्रयोग जो हम वर्णन करते हैं, उसे आसानी से फार्माकोकाइनेटिक या फार्माकोडायनामिक्स अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक यौगिक जो पहले से ही दवा लीड के रूप में चुना गया है।

Disclosures

IVK, OB, SA, और ASU जारी किए गए पेटेंट परिवार पर आविष्कारक हैं: "फोटोनियंत्रित जैविक गतिविधि रखने वाले पेप्टिडोमिमेटिक्स" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) लुमोबायोटिक्स GmbH के लिए लाइसेंस प्राप्त हैं। IVK, OB, TS और SA लुमोबायोटिक्स GmbH के संस्थापक और शेयरधारक हैं। IVK एक वैज्ञानिक सलाहकार है, HK, TM, IP, और PB एनामाइन एलएलसी के कर्मचारी हैं। लेखकों के पास किसी भी संगठन या संस्था के साथ कोई अन्य प्रासंगिक संबद्धता या वित्तीय भागीदारी नहीं है, जिसमें प्रकाशन में चर्चा की गई विषय वस्तु या सामग्री के साथ वित्तीय हित या वित्तीय संघर्ष है।

Acknowledgments

लेखक ों ने पेलिको (# 690973) और एएलआईएसई (# 101007256) परियोजनाओं के माध्यम से एच 2020-एमएससीए-राइज कार्यक्रम द्वारा यूरोपीय संघ के वित्त पोषण को स्वीकार किया है। यह काम डीएफजी-जीआरके 2039 (एसए, टीएस और एएसयू), हेल्महोल्ट्ज़ सोसाइटी (एसए और एएसयू) के एनएसीआईपी कार्यक्रम और बीएमबीएफ (ओबी और एएसयू) के वीआईपी + द्वारा समर्थित था। हम डॉ सेरही कोनीव, कार्ल्सरुहे इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी को स्वीकार करते हैं, जिन्होंने यौगिक एलएमबी 002 को संश्लेषित किया है, इसे शुद्ध किया है और कृपया अध्ययन के लिए यौगिक प्रदान किया है। लेखक चुप्रिना मक्सिम के भी आभारी हैं जिन्होंने यूक्रेन में वीडियो को फिल्माया और संकलित किया, और यूक्रेन के सभी बहादुर रक्षकों के लिए जिन्होंने प्रयोगात्मक कार्य, लेखन और फिल्मांकन को संभव बनाया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1100 Series capillary LC system ALSI-Chrom (Agilent distributor) -
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line ECACC 90020104
C57BL/6NCrl mice, female, inbred Charles River Strain code: 027
CelCulture, CO2 incubator Esco Micro CCL-170B
Corning Matrigel Basement membrane matrix Merck CLS354234
Corning, 384- well spheroid microplates Merck CLS3830
Fetal bovine serum Merck F7524
Gibco, DPBS Thermo Fisher Scientific 21600044
Gramicidin S Lumobiotics Custom synthesis
HyClone, DMEM/high glucose Cytiva SH30003.04
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system Cytiva 29240358
Invitrogen, Calcein AM Thermo Fisher Scientific C1430
Isoflurane anesthesia machine ASA S/N ASA 1305
L-glutamine, 200 mM solution Merck G7513
LIKA-surgeon, diode surgery laser Fotonika plus -
LMB002 Lumobiotics Custom synthesis
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized Merck P4333
PhenoPlate, 96-well plates PerkinElmer 6055302
Photometer PCE-LED 20 PCE Instruments PCE-LED 20
Thermo Scientific, Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific 62249
Thermo Scientific, Propidium iodide Thermo Fisher Scientific J66764-MC
Trypan blue, 0.4% solution Merck T8154
Trypsin–EDTA, 10 x solution Merck T4174
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 Santa Cruz Biotechnology sc-200263
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm Santa Cruz Biotechnology sc-360882
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) Altmann Analytik (Avantor distributor) GR5103827

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References

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<em>इन विट्रो</em> और <em>इन विवो</em> फोटोकंट्रोल्ड जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों का मूल्यांकन - कैंसर फोटोफार्माकोलॉजी के लिए संभावित दवा उम्मीदवार
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Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach,… More

Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach, V., Danko, V., Kovalenko, A., Fatiushchenkov, S., Borysko, P., Pishel, I., Babii, O., Ulrich, A. S., Schober, T., Afonin, S., Komarov, I. V. In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology. J. Vis. Exp. (199), e64902, doi:10.3791/64902 (2023).

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