Summary
本研究提出了一系列从工厂制备DESI-MSI样品的方法，并详细描述了DESI组件安装、MSI数据采集和处理的过程。该协议可以应用于获取植物空间代谢组信息的几种条件。
Abstract
中药的药用主要是由于其次生代谢产物。这些代谢物分布的可视化已成为植物科学中的一个关键课题。质谱成像可以提取大量数据，并通过分析组织切片来提供有关这些数据的空间分布信息。解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）具有高通量和高精度的优点，常用于生物学研究和中药研究。然而，本研究中使用的程序很复杂，负担不起。在这项研究中，我们优化了切片和DESI成像程序，并开发了一种更具成本效益的方法来鉴定代谢物的分布，并在植物组织中对这些化合物进行分类，特别关注中药。本研究将促进DESI在中药/民族医学代谢物分析中的应用和研究相关技术的标准化。
Introduction
代谢物分布的可视化已成为植物科学中的一个关键课题，特别是在传统中医中，因为它揭示了植物内特定代谢物的形成过程。参考传统中药（TCM），它提供有关活性成分的信息，并指导植物部分在制药应用中的应用。通常，代谢物的可视化是通过原位杂交、荧光显微镜或免疫组织化学来实现的，但是这些实验检测到的化合物数量传达的化学信息有限。结合组织染色，质谱成像（MSI）可以通过扫描和分析微米级1的组织切片，提供大量的数据并提供化合物的空间分布信息。MSI使用分析物从样品表面解吸和电离，然后对产生的气相离子进行质量分析，并应用成像软件来整合信息并绘制记录特定离子丰度的二维图像。该技术可以通过检测靶组织和器官中药物及其诱导代谢物的特征分布来确定外源性和内源性分子2，3，4，5。
近几十年来，已经开发了各种成像MS模式;其中最突出的是解吸电喷雾电离基MSI （DESI-MSI）、基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和二次离子质谱（SIMS）6。DESI-MSI由于其常压操作，高通量和更高的精度而通常用于生物学研究7。MALDI已被应用于鉴定转甲状腺素蛋白片段作为庆大霉素的潜在肾毒性生物标志物，并分析在小鼠大脑中管理1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶后神经毒性代谢物1-甲基-4-苯基吡啶的分布8，9。MALDI和DESI已被用于确定药物诱导的小鼠肾脏中晶体状结构的组成;这些结构主要由由于药物的去甲基化和/或氧化而形成的代谢物组成10。此外，MSI已被应用于靶器官中药物毒性代谢分布的定位。然而，植物组织中的细胞各不相同，与动物不同，需要特殊的切片程序。
在植物中，通过使用MALDI成像，到目前为止，已经分析了小麦（小麦）茎，大豆（甘氨酸max），水稻（稻（稻）种子，拟南芥花和根以及大麦（Hordeum vulgare）种子中不同化合物的分布11，12，13，14，15，16，17，18.最近的研究报告，DESI-MSI正在天然药物和产品的代谢物分析中出现，特别是在银杏叶，夫子和青蒿L19，20，21等中药中。在这些研究中，制备植物材料样品的方案不同，有些需要更复杂的设备，如冷冻切片机。DESI-MSI对检测样品的表面平整度有严格的要求。在分析动物的器官或组织时，通常通过冷冻切片22制成样品。然而，冷冻切片的程序复杂且昂贵，并且常用的粘合剂最佳切割温度（OCT）方法在成像时具有很强的信号。此外，中医的药用组织各不相同;例如，丹参的根，在中文中被称为丹参，用于药用，而在紫苏（紫苏）中，叶子被使用23，24。因此，有必要改进样品制备程序，以促进DESI在中药代谢物分析中的应用。
作为一种多年生草本植物和常用中药， 绣线菊 最初被记录在最古老的医学专著《神农本草经》（中文称为神农本草经）中。在这项研究中，我们优化了切片和DESI成像程序，并开发了一种更具成本效益的方法来鉴定S . miltiorrhiza组织中的分布和分类。这种方法还可以克服与干燥组织相关的缺点 - 它们通常在氮气吹下容易断裂 - 并促进中医的发展。本研究将促进中医/民族医学在研究相关技术方面的标准化。
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Protocol
1. 样品制备
- 从2年生的 丹参 植物（图1A）收集干净的根和叶，并用手直接以约3-5毫米的横截面厚度切片。然后，使用双面胶带将样品粘附在粘附显微镜载玻片上（图1B）。
注意：确保双面胶带的尺寸大于样品。如果组织干燥，请在切片前将其浸泡在水或4%多聚甲醛中过夜。 - 将另一个显微镜载玻片放在样品上方，并用像三明治一样的密封膜包裹两个载玻片（图1C）。将夹心样品在-80°C下冷冻至少4小时，然后用以下设置参数将其置于空气真空下2小时（图1D）：疏水阀温度为-75至-82°C，真空计为2.5至3.7Pa。
注意：包裹密封膜时，请确保两个载玻片平行，以保持样品表面完整。如果植物组织水分含量高，请将空气真空时间延长至3小时。不要超过5小时，否则组织很容易断裂。 - 将夹心样品储存在-80°C直至分析。在干燥器中将样品置于室温，以避免样品表面冷凝。然后，将样品置于基质应用中。
2. 安装解吸电喷雾电离（DESI）装置
- 在ESI模式下实现仪器的检测器设置和质量校准;在水-乙腈 （1：1 v/v） 溶液中使用亮氨酸脑啡肽 （LE） 进行检测器设置，并在水异丙醇 （1：1 v/v） 溶液中使用甲酸钠 （NaFA） 进行质量校准。
- 取出ESI源并将DESI单元安装到质谱仪上。将N2 气体供应连接到DESI装置，并将气体压力调节到0.5 MPa左右（图2A）。交换源时无需排气仪器。
- 在水-甲醇（1：9 v / v）溶液中用LE和甲酸填充5 mL注射器，并将注射器连接到高性能注射泵，为样品中化学物质的电离提供溶剂（图2B）。
- 将提供毛细管的溶剂连接到注射器和DESI喷雾器（图2C）。提供毛细管的溶剂是标准的75 μm内径和375 μm外径毛细管;它相当狭窄，容易被杂质堵塞，因此扫描过程中使用的溶剂应该是MS级的，并在使用前过滤，以降低堵塞的风险。
- 启动注射泵并将输注速率设置为 2 μL/min，以获得恒定的流量和溶剂喷雾（图 2B）。关闭N2 气阀，然后在大约15秒后将其打开;一小滴溶剂将被吹到载物台上，如果溶剂流动处于恒定状态，则可以看到喷雾。
- 根据喷雾角度、XYZ 轴、突起和高度调整喷雾器的位置（图 2D）。使用红色和黑色标记作为参考来优化质谱信号，在灵敏度模式下获得高于 1 x 105 的 信号强度（图 2E）。
- 喷雾器的突出是影响信号强度的最重要因素;通过使用 2 mm 扳手更换 N5 气体护罩来调整突起。喷雾方向影响质量图像的质量;旋转喷雾器，直到喷雾笔直。一旦突出部分调整到最佳信号强度位置，在交换信号源时尽量不要改变它。
- 完成上述所有步骤后，设置已准备好进行实验，并且在初始设置后观察到，设置通常稳定>3周的可用性。
3. 德西-质谱图像采集
- 对于 DESI-MSI，不进行样品预处理。对于已经进行预处理的样品，请尽可能减少预处理步骤。例如，有些样品只能使用封片剂制作，因此请尽可能去除载玻片上多余的培养基。
- 在载玻片上拍摄样品的图像（图3A）。请勿触摸样品表面，以免吸入任何杂质。
- 将载玻片放在DESI载物台上的板位置上。舞台有两个板位置，A 和 B;记住正确的位置很重要。使用标准载玻片 （75 mm x 25 mm） 或全载玻片，否则载玻片将无法安装在该位置且无法稳定握持。一个完整的载玻片（120 mm x 80mm）最多可容纳四个载玻片，因此实验面积要大得多。
- 打开高清海量图像处理软件，在采集选项卡中设置新印版，选择正确的印版位置（A或B）和印版类型。在图像选择页面上，选择幻灯片的四个角，然后将图像自动调整到正确的方向（图 3A）。
- 设置 MS 参数;常用的实验类型是DESI-MS模式，在该模式下，仅检测母离子。该仪器在一个实验中只能使用一个极性;因此，选择极性为正极或负极。要获得有关少量化学品的更多信息，请应用灵敏度模式（图3B）。
- 绘制一个矩形以在“图案”选项卡中定义扫描区域并设置像素大小。通常，对于 DESI-MS 模式，请保持像素的 X 和 Y 大小相等。将扫描速率设置为不超过像素大小的5倍（图3C）。
- 保存项目并导出质谱采集软件的工作表。
- 打开质谱采集软件，导入工作表，并将其另存为新的样品列表。按开始 运行以开始 MSI 扫描。可以通过导入更多工作表将多个图像添加到实验队列中。
4. 处理 DESI-MSI 数据和可视化
- 将样品的数据文件加载到大量图像处理软件中，并设置DESI图像处理的参数（图3D）。由于亮氨酸脑啡肽用于内部锁定质量，并且锁定质量是识别实验极性的唯一点，因此设置正确的锁定质量非常重要。设置以下值：对于正模式：556.2772;对于负模式：554.2620。
- 可以建立目标化学品清单，在这种情况下，处理结果将集中在目标清单中的化学品上。加载处理后的数据文件以可视化样品的DESI图像。单击“归一化”按钮通过总离子色谱（TIC）对数据进行归一化，以获得特定化学物质与参考的相对强度，然后可以将不同的样品相互比较（图3E）。
- 绘制感兴趣区域（ROI）并在样本图像上复制多个副本;可以在不同的图像上进行投资回报。选择所有 ROI 并导出多变量分析 （MVA） 以从 MVA 的所有 ROI 中提取 MS 信息（图 3F）。
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Representative Results
该协议可以导致植物样品中化合物的鉴定和分布。在特定m/z的MS图像中，每个像素的颜色代表m/z的相对强度，因此可以与整个样品中代谢物离子的自然分布和丰度相关联。收集位置的化学物质丰度越高，颜色越亮。图片中的条形图（图4A-D）显示了颜色的渐变。在这里，我们选择了两种对S. miltiorrhiza的药用有价值的化合物。如图4A-D所示，目标化合物丹参酮IIA（m/z：333.0893，M+H）和迷迭香酸（m/z：705.1848，2M+H-O）的分布在根的不同区域可见。同时，在叶片中检测到化合物Danshenol A（m/z：297.1127，M+H;m/z：335.0686，M+K），如图4E-H所示。化合物的分布可用于指导植物部分在医疗应用中的使用;此外，导出的MVA数据可用于进一步的代谢组学分析。
图1：样品制备方法。 （A）本研究中使用的植物（Salvia miltiorrhiza）。红色箭头表示收集的组织作为样本。（乙，丙）显示如何制作三明治样品的示意图。（D） 样品的空气真空。温度设定为-83.1±3°C，真空范围为3-5Pa。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：DESI-MSI 单元中的设备和装置 。 （A） DESI 组件的前视图。（B）注射泵。（C）喷雾器毛细管。（D） DESI 组件的俯视图。（E）信号的优化。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：DESI-MSI 的采集、数据分析和可视化。 （A）将图像加载到海量图像处理软件中，并选择幻灯片的角以将图像调整到正确的方向。（B）设置MS参数，设置m/z扫描范围，选择正或负模式。（C） 定义扫描区域、图像分辨率和扫描速率。（D）设置处理参数：目标质量数、锁定质量、采样频率和持续时间。（E） 加载结果并规范化数据。从质量列表中选择预期的m/z以显示m/z的MS图像。 （F）在MS图像上绘制感兴趣区域（ROI），并导出MVA以进行代谢组学分析。 请点击此处查看此图的大图。
图4：根部和整个叶段的质谱成像。 （公元至日）图像显示了根中两种选定化合物的空间分布。（E-H）图像显示了两种选定化合物在叶片中的空间分布。每个像素的颜色代表m/z的相对强度，因此可以与整个样品中代谢物离子的自然分布和丰度相关联。收集位置的化学物质丰度越高，颜色越亮。图片中的条形图显示了颜色的渐变。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
MS技术的出现开启了近年来分子水平天然产物研究的新见解24。该质谱仪具有高灵敏度和高通量，即使在痕量浓度为25的情况下，也能对天然产物中的代谢物进行靶向和非靶向分析。因此，MS目前广泛应用于中药（TCM）化学领域。对中药化学成分进行定性和定量研究，可以提供中药成分及其相关化合物的信息，不仅为药理学研究提供了适宜的参考，而且为构建中药26质量标准体系提供了依据。此外，在天然产物中，代谢特征通常与形态学和组织学特征有关27;因此，进行 原位 分析以确定植物对各种生物和非生物胁迫条件的机制和响应具有重要价值28.然而，由于用于传统MS分析的样品是来自某种天然产物或其特定部分的提取物的溶液，因此MS无法获得有关样品中代谢物的空间或时间分布的信息。MSI技术是二十年前开发的一种相对较新的技术，它从天然产物样品中获取代谢物，定性和定量分析分子信息，并记录时空信息。此后，借助映射工具，可以模拟特定分子的2D或3D坐标29。
本研究中使用的DESI-MSI技术是由普渡大学（美国）的Cooks小组于2004年开发的一种新型MSI技术30。与其他早期使用的MSI技术相比，包括二次离子质谱（SIMS）31，基质辅助激光解吸电离（MALDI）32和激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）33，DESI具有几个优点。SIMS和MALDI都需要高真空环境来电离样品，对于MALDI，样品需要安装在导电表面上7。此外，这三种技术的样品制备涉及几个复杂的步骤。DESI作为一种新型ESI技术，基于类似于液相色谱质谱（LC-MS）30中的电喷雾电离（ESI）的软电离原理。因此，检测到的离子大多是准分子离子，必要时也可以进行碎裂，这克服了SIMS技术中硬电离的缺点，产生二次离子，可能会侮辱信息的丢失7。DESI在环境条件下工作，因此将样品放入设备后不需要太多时间即可达到工作状态。由于最小化破坏性电离原理，可以对一个样品重复执行实验，因此第二种模式（阴性或正性）不需要额外的样品。
本文主要介绍了一种使用DESI-MSI技术制备植物样品和成像的经济高效的方法。在这种方法中，样品的横截面厚度起任何关键作用;相反，样品的平坦表面至关重要，这可以通过空气真空夹层来保证。在植物的情况下，DESI样品的制备可以通过不同的方式实现，并在MS成像中发挥关键作用。叶子经常有问题，因为它们显示出不规则、柔软和蜡质的角质层表面，这可能会导致成像过程中信号低，而根含有高木质素含量，并且在成像过程中容易断裂。以前的研究表明，在DESI-MSI分析中，在低温恒温器切片机上冷冻切片S. miltiorrhiza的根部，而叶子是通过印记34制备的。然而，由于沉积在玻璃表面上的代谢物的快速溶解，印迹方法可能会在MSI成像过程中引起信号强度的损失。使用该协议（步骤1.2），正如预期的那样，根（图4A，B）和叶（图4E，F）的部分在MS成像期间保持完整。此外，由于机器昂贵，通过低温恒温器切片制备样品的方法成本很高。
尽管与其他技术相比，我们的方法具有许多优点，但仍存在一些局限性。首先，手工切割样品（步骤1.1）需要练习以保持横截面的厚度合适。此外，与MALDI相比，DESI的空间分辨率和峰值强度相对较低。尽管存在缺陷，但所有优点使DESI技术成为研究植物中代谢物时空分布的快速且具有成本效益的方法。此外，DESI-MSI已经用于医学，微生物学和天然产物化学领域35。随着该技术在几个维度上的日益普及和快速改进，未来将在所有相关领域得到越来越多的应用7。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了四川省自然科学基金（编号：2022NSFSC0171）和成都中医药大学杏林人才计划（第030058042号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
- Qiu, Z. -D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
- Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
- Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
- Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
- Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
- Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
- Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
- Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
- Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
- Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
- Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
- Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
- Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
- Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
- Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
- Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
- Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
- Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
- Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
- Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
- Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
- Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
- Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
- Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
- Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
- Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
- Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
- Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
- Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
- Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Castaing, R., Slodzian, G.
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).
