Summary
Bu çalışmada, bitkilerden DESI-MSI örnekleri hazırlamak için bir dizi yöntem sunulmuş ve DESI montaj kurulumu, MSI veri toplama ve işleme prosedürü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol, bitkilerde uzamsal metabolom bilgisi elde etmek için çeşitli koşullarda uygulanabilir.
Abstract
Geleneksel Çin tıbbının tıbbi kullanımı esas olarak ikincil metabolitlerinden kaynaklanmaktadır. Bu metabolitlerin dağılımının görselleştirilmesi, bitki biliminde çok önemli bir konu haline gelmiştir. Kütle spektrometresi görüntüleme, büyük miktarda veri çıkarabilir ve doku dilimlerini analiz ederek bunlar hakkında mekansal dağılım bilgileri sağlayabilir. Yüksek verim ve daha yüksek doğruluk avantajıyla, desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi görüntüleme (DESI-MSI) genellikle biyolojik araştırmalarda ve geleneksel Çin tıbbı çalışmalarında kullanılır. Bununla birlikte, bu araştırmada kullanılan prosedürler karmaşıktır ve uygun değildir. Bu çalışmada, kesitleme ve DESI görüntüleme prosedürlerini optimize ettik ve geleneksel Çin ilaçlarına özel olarak odaklanarak metabolitlerin dağılımını tanımlamak ve bu bileşikleri bitki dokularında kategorize etmek için daha uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Çalışma, DESI'nin metabolit analizinde ve geleneksel Çin tıbbı / etnik tıbbının araştırmayla ilgili teknolojiler için standardizasyonunda kullanılmasını teşvik edecektir.
Introduction
Metabolit dağılımının görselleştirilmesi, bitki biliminde, özellikle geleneksel Çin tıbbında, bitki içindeki spesifik metabolitlerin oluşum sürecini ortaya çıkardığı için çok önemli bir konu haline gelmiştir. Geleneksel Çin tıbbına (TCM) atıfta bulunarak, aktif bileşenler hakkında bilgi sağlar ve farmasötik uygulamalarda bitki parçalarının uygulanmasına rehberlik eder. Normalde, metabolitlerin görselleştirilmesi in situ hibridizasyon, floresan mikroskobu veya immünohistokimya ile sağlanır, ancak bu deneylerle tespit edilen bileşiklerin sayısı sınırlı kimyasal bilgi iletir. Doku boyama ile birlikte, kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI), mikron düzeyinde1'de doku dilimlerini tarayarak ve analiz ederek büyük miktarda veri sağlayabilir ve bileşiklerin uzamsal dağılım bilgilerini sağlayabilir. MSI, numune yüzeyinden desorpsiyon ve iyonizasyon için analitler kullanır, ardından ortaya çıkan buhar fazı iyonlarının kütle analizi ve bilgiyi entegre etmek ve belirli bir iyon bolluğunu kaydeden iki boyutlu bir görüntü çizmek için görüntüleme yazılımının uygulanması takip eder. Bu teknoloji, ilaçların karakteristik dağılımını ve bunların indüklediği metabolitleri hedef doku ve organlarda tespit ederek hem eksojen hem de endojen molekülleri belirleyebilir 2,3,4,5.
Son yıllarda çeşitli görüntüleme MS modaliteleri geliştirilmiştir; bunların arasında en belirgin olanları desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon bazlı MSI (DESI-MSI), matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) ve ikincil iyon kütle spektrometrisidir (SIMS)6. DESI-MSI, atmosferik çalışması, yüksek verimi ve daha yüksek doğruluğu nedeniyle biyolojik araştırmalarda sıklıkla kullanılır7. MALDI, gentamisin için potansiyel bir nefrotoksik biyobelirteç olarak bir transtiretin fragmanını tanımlamak ve farelerin beyinlerinde 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin yönetiminden sonra nörotoksik metabolit 1-metil-4-fenilpiridinyumun dağılımını analiz etmek için uygulanmıştır 8,9. MALDI ve DESI, dozlanmış tavşanların böbreğinde ilaca bağlı kristal benzeri yapıların bileşimini belirlemek için kullanılmıştır; Bu yapılar esas olarak ilacın10'unun demetilasyonu ve / veya oksidasyonu nedeniyle oluşan metabolitlerden oluşur. Ek olarak, MSI, hedef organlarda ilaç toksisitesinin metabolik dağılımının lokalizasyonunda uygulanmaktadır. Bununla birlikte, bitki dokusundaki hücreler değişir ve hayvanlardan farklıdır ve özel bölümleme prosedürleri gerektirir.
Bitkilerde, MALDI görüntüleme kullanılarak, şimdiye kadar, buğday (Triticum aestivum) sapı, soya fasulyesi (Glycine max), pirinç (Oryza sativa) tohumları, Arabidopsis thaliana çiçekleri ve kökleri ile arpa (Hordeum vulgare) tohumlarındaki farklı bileşiklerin dağılımı analiz edilmiştir 11,12,13,14,15,16,17,18 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, DESI-MSI'nin doğal ilaçların ve ürünlerin metabolit analizinde, özellikle Ginkgo biloba, Fuzi ve Artemisia annua L 19,20,21 gibi TCM'lerde ortaya çıktığını bildirmiştir. Bu çalışmalarda, bitki materyali örneklerinin hazırlanması için protokoller farklıdır ve bazıları dondurucu bir mikrotom gibi daha karmaşık ekipmanlar gerektirir. DESI-MSI, tespit edilen numunenin yüzey düzgünlüğü için katı gereksinimlere sahiptir. Bir hayvanın organını veya dokusunu analiz ederken, numune genellikle kriyo-kesit22 ile yapılır. Bununla birlikte, kriyo-kesitleme prosedürü karmaşık ve daha pahalıdır ve yaygın olarak kullanılan yapışkan optimal kesme sıcaklığı (OCT) yöntemi, görüntüleme sırasında güçlü bir sinyale sahiptir. Ek olarak, TCM'nin tıbbi dokuları değişir; Örneğin, Çince'de Danshen olarak bilinen Salvia miltiorrhiza'nın kökü tıbbi olarak kullanılırken, Zisu'da (Perilla frutescens) yaprak23,24 kullanılır. Bu nedenle, TCM için metabolit analizinde DESI kullanımını teşvik etmek için numune hazırlama prosedürlerinin iyileştirilmesi gerekmektedir.
Çok yıllık bir bitki ve yaygın olarak kullanılan bir TCM olarak, S. miltiorrhiza başlangıçta en eski tıp monografisinde, Shennong'un Materia Medica'nın Klasiği'nde (Çince'de Shennong Bencao Jing olarak bilinir) kaydedildi. Bu çalışmada, kesitleme ve DESI görüntüleme prosedürlerini optimize ettik ve S. miltiorrhiza'nın dokularındaki bileşiklerin dağılımını tanımlamak ve kategorize etmek için daha uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem aynı zamanda kuru dokularla ilişkili dezavantajların üstesinden gelebilir - genellikle azot darbesi altında kolayca kırılırlar - ve TCM'nin gelişimini teşvik eder. Çalışma, araştırma ile ilgili teknolojiler için TCM / etnik tıbbın standardizasyonunu teşvik edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune hazırlama
- 2 yaşındaki bir Salvia miltiorrhiza bitkisinden temizlenmiş kökleri ve yaprakları toplayın (Şekil 1A) ve elle yaklaşık 3-5 mm'lik bir kesit kalınlığında doğrudan dilimleyin. Ardından, numuneyi çift taraflı bant kullanarak bir yapışma mikroskobu cam slaydına yapıştırın (Şekil 1B).
NOT: Çift taraflı bandın boyutunun numuneden daha büyük olduğundan emin olun. Dokular kurutulursa, dilimlemeden önce gece boyunca suya veya% 4 paraformaldehit içine batırın. - Numunenin üzerine başka bir mikroskop cam slaydı koyun ve iki cam slaytı sandviç gibi bir sızdırmazlık filmi ile sarın (Şekil 1C). Sandviç numunesini -80 °C'de en az 4 saat dondurun, ardından aşağıdaki ayar parametreleriyle 2 saat boyunca bir hava vakumuna maruz bırakın (Şekil 1D): -75 ila -82 ° C'de tuzak sıcaklığı ve 2,5 ila 3,7 Pa'da vakum göstergesi.
NOT: Numunenin yüzeyini sağlam tutmak için sızdırmazlık filmini sararken iki cam kızağın paralel olduğundan emin olun. Bitki dokuları yüksek nem içeriğine sahipse, hava vakum süresini 3 saate kadar uzatın. 5 saati aşmayın, aksi takdirde dokular kolayca kırılır. - Sandviç numunelerini analize kadar -80 °C'de saklayın. Numune yüzeyinde yoğuşmayı önlemek için numuneleri bir kurutucuda oda sıcaklığına getirin. Ardından, örneği matris uygulamasına tabi tutun.
2. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI) ünitesinin montajı
- ESI modunda dedektör kurulumunu ve cihazın kütle kalibrasyonunu uygulamak; Su-asetonitril (1:1 v/v) çözeltisinde Lösin Enkefalin (LE) kullanarak dedektör kurulumunu gerçekleştirin ve su-izopropanol (1:1 v/v) çözeltisinde sodyum format (NaFA) ile kütle kalibrasyonu gerçekleştirin.
- ESI kaynağını dışarı çıkarın ve DESI ünitesini kütle spektrometresine monte edin. N2 gaz beslemesini DESI ünitesine bağlayın ve gaz basıncını yaklaşık 0,5 MPa'ya ayarlayın (Şekil 2A). Kaynak alışverişi yaparken cihazı havalandırmaya gerek yoktur.
- 5 mL şırıngayı su-metanol (1:9 v/v) çözeltisi içinde LE ve formik asit ile doldurun ve numunedeki kimyasalların iyonizasyonu için çözücü sağlamak üzere şırıngayı yüksek performanslı şırınga pompasına takın (Şekil 2B).
- Şırıngaya ve DESI püskürtücüye kılcal damar sağlayan bir çözücü takın (Şekil 2C). Çözücü sağlayan kılcal damar standart 75 μm iç çap ve 375 μm dış çap kılcal damardır; oldukça dardır ve safsızlıklar tarafından kolayca bloke edilir, bu nedenle tarama işlemlerinde kullanılan çözücüler MS sınıfı olmalı ve tıkanma riskini azaltmak için kullanımdan önce filtrelenmelidir.
- Şırınga pompasını çalıştırın ve çözücünün sabit bir akışını ve spreyini elde etmek için demleme hızını 2 μL / dak'ya ayarlayın (Şekil 2B). N2 gaz valfini kapatın, ardından yaklaşık 15 saniye sonra açın; Sahneye küçük bir damla çözücü üflenir ve çözücü akışı sabit bir durumda ise sprey görülebilir.
- Püskürtücünün konumunu püskürtme açısı, XYZ ekseni, çıkıntı ve yükseklik açısından ayarlayın (Şekil 2D). Hassasiyet modunda 1 x 105'in üzerinde bir sinyal yoğunluğu elde etmek için kütle spektrometresi sinyalini optimize etmek için kırmızı ve siyah işaretleyicileri referans olarak kullanın (Şekil 2E).
- Püskürtücünün çıkıntısı, sinyal yoğunluğunu etkileyen en önemli faktördür; N2 gaz korumasını 5 mm'lik bir anahtarla değiştirerek çıkıntıyı ayarlayın. Sprey yönü kütle görüntüsünün kalitesini etkiler; Sprey düz olana kadar püskürtücüyü döndürün. Çıkıntı en iyi sinyal yoğunluğu konumuna ayarlandıktan sonra, kaynak alışverişi yaparken değiştirmemeye çalışın.
- Yukarıdaki tüm adımlardan sonra, kurulum denemeler için hazırdır ve kurulum normalde ilk kurulumdan sonra gözlemlenen >3 haftalık kullanılabilirlik için kararlıdır.
3. DESI-MS görüntü alımı
- DESI-MSI için, numune ön işlemi gerçekleştirmeyin. Zaten ön işleme tabi tutulmuş numuneler için, ön işlem adımlarını mümkün olduğunca en aza indirin. Örneğin, bazı örnekler yalnızca montaj ortamıyla yapılabilir, bu nedenle mümkünse slaytlardaki fazla ortamı çıkarın.
- Slayttaki örneğin görüntüsünü alın (Şekil 3A). Herhangi bir kirlilik alımını önlemek için numunenin yüzeyine dokunmayın.
- Slaytı DESI sahnesindeki plaka konumuna yerleştirin. Sahnenin A ve B olmak üzere iki plaka konumu vardır; Doğru pozisyonu hatırlamak önemlidir. Standart slaytlar (75 mm x 25 mm) veya tam bir slayt kullanın, aksi takdirde slayt konuma sığmaz ve sabit bir şekilde tutulamaz. Tam bir slayt (120 mm x 80mm) dört slayta kadar sığabilir ve bu nedenle deneyler için çok daha geniş bir alana sahiptir.
- Yüksek tanımlı toplu görüntü işleme yazılımını açın, Al sekmesinde yeni bir plaka ayarlayın ve doğru plaka konumunu (A veya B) ve plaka türünü seçin. Görüntü seçme sayfasında, slaydın dört köşesini seçin, ardından görüntü doğru yöne otomatik olarak ayarlanır (Şekil 3A).
- MS parametrelerini ayarlayın; yaygın olarak kullanılan deney türü, yalnızca üst iyonun algılanacağı DESI-MS modudur. Cihaz bir deneyde sadece bir polarite kullanabilir; Bu nedenle, polariteyi pozitif veya negatif olarak seçin. Küçük miktarlardaki kimyasallar hakkında daha fazla bilgi edinmek için hassasiyet modunu uygulayın (Şekil 3B).
- Desen sekmesinde tarama alanını tanımlamak için bir dikdörtgen çizin ve piksel boyutunu ayarlayın. Genel olarak, DESI-MS modu için, pikselin X ve Y boyutlarını eşit tutun. Tarama hızını piksel boyutunun en fazla 5 katı olacak şekilde ayarlayın (Şekil 3C).
- Projeyi kaydedin ve kütle spektrometresi toplama yazılımı için bir çalışma sayfası dışa aktarın.
- Kütle spektrometresi edinme yazılımını açın, çalışma sayfasını alın ve yeni bir örnek liste olarak kaydedin. MSI taramasını başlatmak için Çalıştır'ı Başlat'a basın. Daha fazla çalışma sayfası içe aktarılarak deneme kuyruğuna birden çok görüntü eklenebilir.
4. DESI-MSI verilerinin işlenmesi ve görselleştirilmesi
- Numunenin veri dosyasını toplu görüntü işleme yazılımına yükleyin ve DESI görüntü işleme parametrelerini ayarlayın (Şekil 3D). Leucine Enkephalin iç kilit kütlesi için kullanıldığından ve kilit kütlesi deneyin polaritesini tanımlayan tek nokta olduğundan, doğru kilit kütlesini ayarlamak büyük önem taşımaktadır. Aşağıdaki değerleri ayarlayın: pozitif mod için: 556.2772; Negatif mod için: 554.2620.
- Hedef kimyasalların bir listesini oluşturmak mümkündür, bu durumda işleme sonucu hedef listedeki kimyasallara odaklanacaktır. Numunenin DESI görüntüsünü görselleştirmek için işlenen veri dosyasını yükleyin. Belirli bir kimyasalın referansa göreceli yoğunluğunu elde etmek için verileri toplam iyon kromatografisi (TIC) ile normalleştirmek için "Normalleştirme" düğmesine tıklayın, ardından farklı numuneler birbirleriyle karşılaştırılabilir (Şekil 3E).
- Bir ilgi alanı (YG) çizin ve örnek görüntüye birkaç kopya kopyalayın; YG'ler farklı görüntülerde yapılabilir. MVA için tüm YG'lerden MS bilgilerini çıkarmak için tüm YG'leri seçin ve çok değişkenli analizi (MVA) dışa aktarın (Şekil 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bitki örneklerinde bileşiklerin tanımlanmasına ve dağıtılmasına yol açabilir. Belirli bir m / z'nin MS görüntüsünde, her bir pikselin rengi, m / z'nin göreceli yoğunluğunu temsil eder, böylece numune boyunca metabolit iyonunun doğal dağılımı ve bolluğu ile ilişkilendirilebilir. Kimyasalın toplama pozisyonundaki bolluğu ne kadar yüksek olursa, renk o kadar parlak olur. Resimdeki çubuk (Şekil 4A-D) renklerin gradyanını gösterir. Burada, S. miltiorrhiza'nın tıbbi kullanımında değerli olan iki bileşik seçtik. Şekil 4A-D'de gösterildiği gibi, hedef bileşiklerin, Tanshinone IIA (m / z: 333.0893, M + H) ve Rosmarinik asidin (m / z: 705.1848, 2M + H-O) dağılımı, kökün farklı bölgelerinde görülebilir. Bu arada, Şekil 4E-H'de gösterildiği gibi, yaprakta Danshenol A bileşiği (m / z: 297.1127, M + H; m / z: 335.0686, M + K) tespit edildi. Bileşiklerin dağılımı, tıbbi uygulamalarda bitki kısmının kullanımına rehberlik etmek için kullanılabilir; Ek olarak, dışa aktarılan MVA verileri daha fazla metabolomik analiz yapmak için uygulanabilir.
Şekil 1: Numune hazırlama yöntemi. (A) Bu araştırmada kullanılan bitki (Salvia miltiorrhiza). Kırmızı ok, toplanan dokuyu örnek olarak gösterir. (B,C) Bir sandviç örneğinin nasıl yapılacağını gösteren şematik. (D) Numunelerin hava vakumu. Sıcaklık seti -83.1 ± 3 ° C'dir ve vakum aralığı 3-5 Pa'dır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: DESI-MSI ünitesindeki ekipman ve aparatlar . (A) DESI montajının önden görünümü. (B) Şırınga pompası. (C) Püskürtücü kılcal damar. (D) DESI montajının üstten görünümü. (E) Sinyalin optimizasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DESI-MSI ile elde etme, veri analizi ve görselleştirme. (A) Görüntüyü toplu görüntü işleme yazılımına yükleyin ve görüntüyü doğru yöne ayarlamak için slaydın köşelerini seçin. (B) MS parametrelerini ayarlayın, m / z tarama aralığını ayarlayın ve pozitif veya negatif modu seçin. (C) Tarama alanını, görüntü çözünürlüğünü ve tarama hızını tanımlayın. (D) İşleme parametrelerini ayarlayın: hedef kütle sayısı, kilit kütlesi, numune frekansı ve süre. (E) Sonucu yükleyin ve verileri normalleştirin. m / z'nin MS görüntüsünü görüntülemek için kütle listesinden beklenen m / z'yi seçin. (F) MS görüntüsünde ilgi çekici bölgeleri (ROI'ler) çizin ve metabolomik analiz için MVA'yı dışa aktarın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kök ve bütün yaprak kesitlerinin kütle spektrometresi görüntülemesi. (A-D) Seçilen iki bileşiğin kökteki uzamsal dağılımını gösteren görüntüler. (E-H) Seçilen iki bileşiğin yapraktaki uzamsal dağılımını gösteren görüntüler. Her bir pikselin rengi, m / z'nin göreceli yoğunluğunu temsil eder ve bu nedenle numune boyunca metabolit iyonunun doğal dağılımı ve bolluğu ile ilişkilendirilebilir. Kimyasalın toplama pozisyonundaki bolluğu ne kadar yüksek olursa, renk o kadar parlak olur. Resimlerdeki çubuk renklerin gradyanını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MS teknolojisinin ortaya çıkışı, son yıllarda moleküler düzeyde doğal ürün araştırmalarında yeni bir bakış açısı açmıştır24. MS cihazı, yüksek hassasiyeti ve yüksek verimi ile, eser konsantrasyonda bile doğal ürünlerdeki metabolitlerin hedefli ve hedefsiz analizini sağlar25. Bu nedenle, MS şu anda geleneksel Çin tıbbı (TCM) kimyası alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. TCM'nin kimyasal bileşimi üzerine yapılan nitel ve nicel araştırmalar, ilacın bileşenleri ve ilişkili bileşiği hakkında bilgi sağlayabilir, bu da sadece farmakolojik araştırmalar için uygun bir referans sağlamakla kalmaz, aynı zamanda TCM26 için bir kalite standardı sisteminin oluşturulması için temel oluşturur. Ayrıca doğal ürünlerde metabolik imzalar genellikle morfolojik ve histolojik özelliklerle ilişkilidir27; Bu nedenle, bitkilerin çeşitli biyotik ve abiyotik stres koşullarına mekanizmasını ve tepkisini tanımlamak için yerinde analiz yapmak büyük değer taşımaktadır28. Bununla birlikte, geleneksel MS analizi için numuneler, belirli bir doğal üründen veya belirli parçalarından elde edilen ekstraktların çözeltileri olduğundan, MS, numunelerdeki metabolitlerin mekansal veya zamansal dağılımı hakkında bilgi edinmez. Sadece yirmi yıl önce geliştirilen nispeten yeni bir teknoloji olan MSI tekniği, doğal ürün örneklerinden metabolitler elde eder, moleküler bilgiyi hem niteliksel hem de niceliksel olarak analiz eder ve uzaysal zamansal bilgileri kaydeder. Bundan sonra, haritalama araçlarının yardımıyla, belirli moleküllerin 2D veya 3D koordinatlarısimüle edilebilir 29.
Bu çalışmada kullanılan DESI-MSI tekniği, 2004 yılında Purdue Üniversitesi'nde (ABD) Cooks'un grubu tarafından geliştirilen yeni bir MSI tekniğidir30. Sekonder iyon kütle spektrometrisi (SIMS)31, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI)32 ve lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyonu (LAESI)33 dahil olmak üzere diğer erken kullanılan MSI teknikleriyle karşılaştırıldığında, DESI'nin birçok avantajı vardır. Hem SIMS hem de MALDI, numuneleri iyonize etmek için yüksek vakum ortamına ihtiyaç duyar ve MALDI için numunelerin iletken bir yüzeye monte edilmesi gerekir7. Ayrıca, bu üç tekniğin tümü için numune hazırlama birkaç karmaşık adım içerir. DESI, yeni bir ESI tekniği olarak, sıvı kromatografisi kütle spektrometrisinde (LC-MS)30 elektrosprey iyonizasyonuna (ESI) benzer yumuşak bir iyonizasyon prensibine dayanmaktadır. Bu nedenle, tespit edilen iyonlar çoğunlukla yarı-moleküler iyonlardır ve gerekirse parçalanma da yapılabilir, bu da SIMS tekniğinde sert iyonlaşmanın dezavantajının üstesinden gelerek bilgi kaybına zarar verebilecek ikincil iyonlar üretir7. DESI ortam koşullarında çalışır, bu nedenle numuneleri cihaza yerleştirdikten sonra çalışma durumuna ulaşmak için fazla zamana ihtiyaç duymaz. En aza indirilmiş tahribatlı iyonizasyon prensibi nedeniyle, deneyleri bir numune üzerinde tekrar tekrar yürütmek mümkündür, bu nedenle ikinci bir mod (negatif veya pozitif) için ek numunelere gerek yoktur.
Bu makalede temel olarak DESI-MSI tekniği kullanılarak bitki örneklerinin hazırlanması ve görüntülenmesi için uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemde, numunenin kesit kalınlığı önemli bir rol oynamaz; Bunun yerine, numunenin düz yüzeyi çok önemlidir, bu da hava vakumlu sandviç tarafından garanti edilir. Bitkiler söz konusu olduğunda, DESI numunelerinin hazırlanması farklı şekillerde sağlanabilir ve MS görüntülemede önemli bir rol oynayabilir. Yapraklar genellikle düzensiz, yumuşak ve balmumu kütikül yüzeyi gösterdikleri için sorunludur, bu da görüntüleme sırasında düşük bir sinyale neden olabilirken, kök yüksek lignin içeriği içerir ve görüntüleme sırasında kırılması kolaydır. Önceki çalışmalar, S. miltiorrhiza'nın kökünün DESI-MSI analizinde bir kriyostat mikrotomu üzerinde kriyo-kesitli olduğunu, oysa yaprağın34 basılarak hazırlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, baskı yöntemi, cam yüzeyde biriken metabolitlerin hızlı çözünmesi nedeniyle MSI görüntüleme sırasında sinyal yoğunluğu kaybına neden olabilir. Bu protokol (adım 1.2) ile, beklendiği gibi, MS görüntüleme sırasında kök (Şekil 4A, B) ve yaprak (Şekil 4E, F) bölümleri bozulmadan kalır. Ayrıca, bir kriyostat mikrotomu ile sito-kesitleme ile numuneleri hazırlama yöntemi, pahalı makine nedeniyle yüksek maliyetlidir.
Yöntemimizin diğer tekniklere göre birçok avantajı olmasına rağmen, yine de birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, numunelerin elle kesilmesi (adım 1.1), kesitin kalınlığını uygun tutmak için pratik gerektirir. Ek olarak, DESI'nin uzamsal çözünürlüğü ve tepe yoğunluğu, MALDI'ye kıyasla nispeten düşüktür. Kusurluluğa rağmen, tüm avantajlar DESI tekniğini bitkilerdeki metabolitlerin mekansal zamansal dağılımını araştırmak için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem haline getirmektedir. Ayrıca, DESI-MSI tıp, mikrobiyoloji ve doğal ürün kimyası alanında zaten kullanılmaktadır35. Bu tekniğin artan popülaritesi ve çeşitli boyutlarındaki hızlı gelişme ile gelecekte tüm göreceli alanlarda giderek daha fazla uygulama alanı bulacaktır7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sichuan eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2022NSFSC0171) ve TCM Chengdu Üniversitesi Xinglin Yetenek Programı (No. 030058042) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
- Qiu, Z. -D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
- Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
- Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
- Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
- Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
- Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
- Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
- Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
- Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
- Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
- Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
- Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
- Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
- Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
- Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
- Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
- Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
- Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
- Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
- Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
- Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
- Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
- Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
- Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
- Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
- Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
- Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
- Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
- Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
- Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Castaing, R., Slodzian, G.
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).
