Summary
इस अध्ययन में, पौधों से देसी-एमएसआई नमूने तैयार करने के लिए विधियों की एक श्रृंखला प्रस्तुत की जाती है, और देसी असेंबली इंस्टॉलेशन, एमएसआई डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण की एक प्रक्रिया विस्तार से वर्णित है। इस प्रोटोकॉल को पौधों में स्थानिक चयापचय जानकारी प्राप्त करने के लिए कई स्थितियों में लागू किया जा सकता है।
Abstract
पारंपरिक चीनी चिकित्सा का औषधीय उपयोग मुख्य रूप से इसके द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के कारण है। इन मेटाबोलाइट्स के वितरण का विज़ुअलाइज़ेशन पौधे विज्ञान में एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग बड़ी मात्रा में डेटा निकाल सकती है और ऊतक स्लाइस का विश्लेषण करके इनके बारे में स्थानिक वितरण जानकारी प्रदान कर सकती है। उच्च थ्रूपुट और उच्च सटीकता के लाभ के साथ, प्रदूषक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (DESI-MSI) का उपयोग अक्सर जैविक अनुसंधान और पारंपरिक चीनी चिकित्सा के अध्ययन में किया जाता है। हालांकि, इस शोध में उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाएं जटिल हैं और सस्ती नहीं हैं। इस अध्ययन में, हमने सेक्शनिंग और देसी इमेजिंग प्रक्रियाओं को अनुकूलित किया और पारंपरिक चीनी दवाओं पर विशेष ध्यान देने के साथ मेटाबोलाइट्स के वितरण की पहचान करने और पौधों के ऊतकों में इन यौगिकों को वर्गीकृत करने के लिए एक अधिक लागत प्रभावी विधि विकसित की। यह अध्ययन अनुसंधान से संबंधित प्रौद्योगिकियों के लिए पारंपरिक चीनी चिकित्सा / जातीय चिकित्सा के मेटाबोलाइट विश्लेषण और मानकीकरण में देसी के उपयोग को बढ़ावा देगा।
Introduction
मेटाबोलाइट वितरण का विज़ुअलाइज़ेशन पौधे विज्ञान में एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है, विशेष रूप से पारंपरिक चीनी चिकित्सा में, क्योंकि यह पौधे के भीतर विशिष्ट मेटाबोलाइट्स की गठन प्रक्रिया का खुलासा करता है। पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) के संदर्भ में, यह सक्रिय घटकों के बारे में जानकारी प्रदान करता है और दवा अनुप्रयोगों में पौधे के भागों के आवेदन का मार्गदर्शन करता है। आम तौर पर, मेटाबोलाइट्स का विज़ुअलाइज़ेशन सीटू संकरण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्राप्त किया जाता है, हालांकि इन प्रयोगों द्वारा पता लगाए गए यौगिकों की संख्या सीमित रासायनिक जानकारी देती है। ऊतक धुंधला होने के साथ संयुक्त, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) बड़ी मात्रा में डेटा प्रदान कर सकता है और माइक्रोन-स्तर1 पर ऊतक स्लाइस को स्कैन और विश्लेषण करके यौगिकों की स्थानिक वितरण जानकारी प्रदान कर सकता है। एमएसआई नमूना सतह से प्रदूषकों और आयनीकरण के लिए विश्लेषणों का उपयोग करता है, इसके बाद परिणामस्वरूप वाष्प चरण आयनों का बड़े पैमाने पर विश्लेषण और जानकारी को एकीकृत करने और एक विशिष्ट आयन बहुतायत को रिकॉर्ड करने वाली दो आयामी छवि को प्लॉट करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का अनुप्रयोग होता है। यह तकनीक लक्ष्य ऊतकों और अंगोंमें दवाओं और उनके प्रेरित मेटाबोलाइट्स के विशिष्ट वितरण का पता लगाकर बहिर्जात और अंतर्जात अणुओं दोनों को निर्धारित कर सकती है।
हाल के दशकों में विभिन्न इमेजिंग एमएस तौर-तरीके विकसित किए गए हैं; उनमें से सबसे प्रमुख प्रदूषक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-आधारित एमएसआई (देसी-एमएसआई), मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर प्रदूषक / आयनीकरण (माल्डी), और द्वितीयक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसआईएमएस) 6 हैं। DESI-MSI का उपयोग अक्सर जैविक अनुसंधान में इसके वायुमंडलीय संचालन, उच्च थ्रूपुट और उच्च सटीकताके कारण किया जाता है। माल्डी को जेंटामाइसिन के लिए एक संभावित नेफ्रोटॉक्सिक बायोमार्कर के रूप में एक ट्रांसथायरेटिन टुकड़े की पहचान करने और चूहों के दिमाग में 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपाइरिडिन के प्रबंधन के बाद न्यूरोटॉक्सिक मेटाबोलाइट 1-मिथाइल-4-फेनिलपाइरिडिनियम के वितरण का विश्लेषण करने के लिए लागूकिया गया है। माल्डी और देसी का उपयोग खुराक वाले खरगोशों के गुर्दे में दवा-प्रेरित क्रिस्टल जैसी संरचनाओं की संरचना को निर्धारित करने के लिए किया गया है; ये संरचनाएं मुख्य रूप से दवा10 के डीमिथाइलेशन और / या ऑक्सीकरण के कारण गठित मेटाबोलाइट्स से बनी होती हैं। इसके अतिरिक्त, एमएसआई को लक्षित अंगों में दवा विषाक्तता के चयापचय वितरण के स्थानीयकरण में लागू किया गया है। हालांकि, पौधे के ऊतकों में कोशिकाएं भिन्न होती हैं और जानवरों से अलग होती हैं और विशेष सेक्शनिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।
पौधों में, माल्डी इमेजिंग का उपयोग करके, अब तक, गेहूं (ट्रिटिकम एस्टिवम) तने, सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स), चावल (ओरिजा सैटिवा) बीज, एराबिडोप्सिस थैलियाना फूल और जड़ें, और जौ (होर्डियम वल्गर) बीजों में विभिन्न यौगिकों के वितरण का विश्लेषण11,12,13,14,15,16,17,18 किया गया है। . हाल के अध्ययनों ने बताया है कि देसी-एमएसआई प्राकृतिक दवाओं और उत्पादों के मेटाबोलाइट विश्लेषण में उभर रहा है, विशेष रूप से जिन्कगो बिलोबा, फूजी और आर्टेमिसिया एनुआ एल 19,20,21 जैसे टीसीएम में। इन अध्ययनों में, पौधे सामग्री के नमूने तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल भिन्न होते हैं, और कुछ को ठंड माइक्रोटोम जैसे अधिक जटिल उपकरणों की आवश्यकता होती है। देसी-एमएसआई में पता लगाए गए नमूने की सतह सपाटता के लिए सख्त आवश्यकताएं हैं। किसी जानवर के अंग या ऊतक का विश्लेषण करते समय, नमूना आमतौर पर क्रायो-सेक्शनिंग22 द्वारा बनाया जाता है। हालांकि, क्रायो-सेक्शनिंग की प्रक्रिया जटिल और अधिक महंगी है, और आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले चिपकने वाले इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) विधि में इमेजिंग करते समय एक मजबूत संकेत होता है। इसके अलावा, टीसीएम के औषधीय ऊतक भिन्न होते हैं; उदाहरण के लिए, साल्विया मिल्टियोराइजा की जड़, जिसे चीनी में डैनशेन के रूप में जाना जाता है, औषधीय रूप से उपयोग किया जाता है, जबकि ज़िसू (पेरिला फ्रुटेसेंस) में, पत्ती का उपयोग23,24 किया जाता है। इसलिए, टीसीएम के लिए मेटाबोलाइट विश्लेषण में देसी के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए नमूना तैयारी प्रक्रियाओं में सुधार करना आवश्यक है।
एक बारहमासी जड़ी बूटी और आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले टीसीएम के रूप में, एस मिल्टियोराइजा को शुरू में सबसे पुरानी दवा मोनोग्राफ में दर्ज किया गया था, शेन्नोंग के क्लासिक ऑफ मटेरिया मेडिका (चीनी में शेन्नोंग बेनकाओ जिंग के रूप में जाना जाता है)। इस अध्ययन में, हमने सेक्शनिंग और देसी इमेजिंग प्रक्रियाओं को अनुकूलित किया और वितरण की पहचान करने और एस मिल्टियोराइजा के ऊतकों में यौगिकों को वर्गीकृत करने के लिए एक अधिक लागत प्रभावी विधि विकसित की। यह विधि सूखे ऊतकों से जुड़े नुकसान को भी दूर कर सकती है - कि वे आमतौर पर नाइट्रोजन ब्लो के तहत आसानी से फ्रैक्चर करते हैं - और टीसीएम के विकास को बढ़ावा देते हैं। यह अध्ययन अनुसंधान से संबंधित प्रौद्योगिकियों के लिए टीसीएम / जातीय चिकित्सा के मानकीकरण को बढ़ावा देगा।
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Protocol
1. नमूना तैयार करना
- 2 साल पुराने साल्विया मिल्टियोराइजा पौधे (चित्रा 1 ए) से साफ जड़ों और पत्तियों को इकट्ठा करें, और सीधे हाथ से लगभग 3-5 मिमी की क्रॉस-अनुभागीय मोटाई पर स्लाइस करें। फिर, डबल-साइडेड टेप (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके नमूने को आसंजन माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर चिपकाएं।
नोट: सुनिश्चित करें कि डबल-साइडेड टेप का आकार नमूने से बड़ा है। यदि ऊतक सूख गए हैं, तो उन्हें स्लाइस करने से पहले रात भर पानी या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में भिगोदें। - नमूने के ऊपर एक और माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड रखें और सैंडविच (चित्रा 1 सी) की तरह सीलिंग फिल्म के साथ दो ग्लास स्लाइड लपेटें। सैंडविच नमूने को कम से कम 4 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, फिर इसे निम्नलिखित सेटिंग मापदंडों के साथ 2 घंटे (चित्रा 1 डी) के लिए एक एयर वैक्यूम के अधीन करें: -75 से -82 डिग्री सेल्सियस पर ट्रैप तापमान और 2.5 से 3.7 पीए पर वैक्यूम गेज।
नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने की सतह को बरकरार रखने के लिए सीलिंग फिल्म को लपेटते समय दो ग्लास स्लाइड समानांतर हैं। यदि पौधे के ऊतकों में नमी की मात्रा अधिक होती है, तो वायु-वैक्यूम के समय को 3 घंटे तक बढ़ाएं। 5 घंटे से अधिक न करें, अन्यथा ऊतक आसानी से फ्रैक्चर हो जाएंगे। - विश्लेषण तक सैंडविच नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमूना सतह पर संक्षेपण से बचने के लिए नमूने को एक डेसिकेटर में कमरे के तापमान पर लाएं। फिर, नमूना मैट्रिक्स अनुप्रयोग के अधीन।
2. प्रदूषक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (देसी) इकाई की स्थापना
- ईएसआई मोड में उपकरण के डिटेक्टर सेटअप और द्रव्यमान अंशांकन को लागू करें; पानी-एसिटोनिट्राइल (1: 1 वी / वी) समाधान में ल्यूसीन एनकेफेलिन (एलई) का उपयोग करके डिटेक्टर सेटअप करें और पानी-आइसोप्रोपेनोल (1: 1 वी / वी) समाधान में सोडियम फॉर्मेट (एनएएफए) के साथ बड़े पैमाने पर अंशांकन करें।
- ईएसआई स्रोत को बाहर निकालें और मास स्पेक्ट्रोमीटर पर देसी इकाई माउंट करें। एन2 गैस आपूर्ति को देसी इकाई से कनेक्ट करें और गैस दबाव को लगभग 0.5 एमपीए (चित्रा 2 ए) में समायोजित करें। स्रोतों का आदान-प्रदान करते समय उपकरण को बाहर निकालने की कोई आवश्यकता नहीं है।
- पानी-मेथनॉल (1: 9 वी / वी) समाधान में एलई और फॉर्मिक एसिड के साथ 5 एमएल सिरिंज भरें और नमूने में रसायनों के आयनीकरण के लिए विलायक प्रदान करने के लिए सिरिंज को उच्च प्रदर्शन सिरिंज पंप से संलग्न करें (चित्रा 2 बी)।
- सिरिंज और देसी स्प्रेयर (चित्रा 2 सी) को केशिका प्रदान करने वाला विलायक संलग्न करें। केशिका प्रदान करने वाला विलायक एक मानक 75 μm आंतरिक व्यास और 375 μm व्यास के केशिका के बाहर है; यह संकीर्ण है और आसानी से अशुद्धियों द्वारा अवरुद्ध हो जाता है, इसलिए स्कैनिंग प्रक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स को एमएस ग्रेड होना चाहिए और रुकावट के जोखिम को कम करने के लिए उपयोग से पहले फ़िल्टर किया जाना चाहिए।
- सिरिंज पंप शुरू करें और विलायक का निरंतर प्रवाह और स्प्रे प्राप्त करने के लिए 2 μL / min पर इंफ्यूज दर सेट करें (चित्रा 2 बी)। एन2 गैस वाल्व को बंद करें, फिर लगभग 15 सेकंड के बाद इसे चालू करें; विलायक की एक छोटी बूंद को मंच पर उड़ा दिया जाएगा, और यदि विलायक प्रवाह स्थिर स्थिति में है तो स्प्रे देखा जा सकता है।
- स्प्रे कोण, एक्सवाईजेड अक्ष, प्रोट्रूशियंस और ऊंचाई (चित्रा 2 डी) के संदर्भ में स्प्रेयर की स्थिति को समायोजित करें। संवेदनशीलता मोड (चित्रा 2 ई) में 1 x 10 5 से ऊपर सिग्नल तीव्रता प्राप्त करने के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिग्नल को अनुकूलित करने के लिए संदर्भके रूप में लाल और काले मार्करों का उपयोग करें।
- स्प्रेयर का प्रोट्रूशियंस सबसे महत्वपूर्ण कारक है जो सिग्नल तीव्रता को प्रभावित करता है; 5 मिमी रिंच के साथ एन2 गैस गार्ड को बदलकर प्रोट्रूशियंस को समायोजित करें। स्प्रे दिशा द्रव्यमान छवि की गुणवत्ता को प्रभावित करती है; स्प्रे को तब तक घुमाएं जब तक स्प्रे सीधा न हो जाए। एक बार जब प्रोट्रूशन को सर्वोत्तम सिग्नल तीव्रता की स्थिति में समायोजित किया जाता है, तो स्रोतों का आदान-प्रदान करते समय इसे बदलने की कोशिश न करें।
- उपरोक्त सभी चरणों के बाद, सेटअप प्रयोगों के लिए तैयार है, और सेटअप सामान्य रूप से >3 सप्ताह की प्रयोज्यता के लिए स्थिर है, जो प्रारंभिक सेटअप के बाद देखा गया है।
3. देसी-एमएस छवि अधिग्रहण
- DESI-MSI के लिए, कोई नमूना पूर्वउपचार नहीं करें। उन नमूनों के लिए जिनके पास पहले से ही प्रथागत है, पूर्व-उपचार चरणों को यथासंभव कम करें। उदाहरण के लिए, कुछ नमूने केवल बढ़ते मीडिया के साथ बनाए जा सकते हैं, इसलिए यदि संभव हो तो स्लाइड्स पर अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।
- स्लाइड पर नमूने की एक छवि लें (चित्रा 3 ए)। किसी भी अशुद्धता टेक-इन से बचने के लिए नमूने की सतह को न छुएं।
- देसी मंच पर प्लेट स्थिति पर स्लाइड रखें। मंच में दो प्लेट स्थिति होती है, ए और बी; सही स्थिति याद रखना महत्वपूर्ण है। मानक स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) या पूर्ण स्लाइड का उपयोग करें, अन्यथा स्लाइड स्थिति में फिट नहीं होगी और स्थिर रूप से आयोजित नहीं की जा सकती है। एक पूर्ण स्लाइड (120 मिमी x 80 मिमी) चार स्लाइडों को समायोजित कर सकती है, और इस प्रकार प्रयोगों के लिए बहुत बड़ा क्षेत्र है।
- उच्च परिभाषा द्रव्यमान छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर खोलें, अधिग्रहण टैब में एक नई प्लेट सेट करें, और सही प्लेट स्थिति (ए या बी) और प्लेट प्रकार का चयन करें। छवि-चयन पृष्ठ पर, स्लाइड के चार कोनों का चयन करें, फिर छवि को सही अभिविन्यास (चित्रा 3 ए) में स्वचालित रूप से समायोजित किया जाता है।
- एमएस पैरामीटर सेट करें; आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रयोग प्रकार देसी-एमएस मोड है, जिसमें केवल मूल आयन का पता लगाया जाएगा। उपकरण एक प्रयोग में केवल एक ध्रुवीयता का उपयोग कर सकता है; इसलिए, ध्रुवीयता को सकारात्मक या नकारात्मक के रूप में चुनें। कम मात्रा में रसायनों के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, संवेदनशीलता मोड (चित्रा 3 बी) लागू करें।
- पैटर्न टैब में स्कैनिंग क्षेत्र को परिभाषित करने और पिक्सेल आकार सेट करने के लिए एक आयत खींचें। आम तौर पर, देसी-एमएस मोड के लिए, पिक्सेल के एक्स और वाई आकार बराबर रखें। स्कैनिंग दर को पिक्सेल आकार (चित्रा 3C) से 5x से अधिक पर सेट न करें।
- प्रोजेक्ट सहेजें और मास स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के लिए एक कार्यपत्रक निर्यात करें।
- मास स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें, कार्यपत्रक आयात करें, और इसे एक नई नमूना सूची के रूप में सहेजें। MSI स्कैनिंग प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ चलाएँ दबाएँ । अधिक कार्यपत्रकों को आयात करके प्रयोग कतार में एकाधिक छवियाँ जोड़ी जा सकती हैं.
4. देसी-एमएसआई डेटा और विज़ुअलाइज़ेशन प्रसंस्करण
- नमूने की डेटा फ़ाइल को मास इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में लोड करें और देसी इमेज प्रोसेसिंग (चित्रा 3 डी) के लिए पैरामीटर सेट करें। जैसा कि ल्यूसीन एनकेफेलिन का उपयोग आंतरिक लॉक द्रव्यमान के लिए किया गया था, और लॉक द्रव्यमान प्रयोग की ध्रुवीयता की पहचान करने के लिए एकमात्र बिंदु है, सही लॉक द्रव्यमान सेट करना बहुत महत्वपूर्ण है। निम्न मान सेट करें: धनात्मक मोड के लिए: 556.2772; नकारात्मक मोड के लिए: 554.2620।
- लक्ष्य रसायनों की एक सूची बनाना संभव है, इस मामले में प्रसंस्करण परिणाम लक्ष्य सूची में रसायनों पर ध्यान केंद्रित करेगा। नमूने की देसी छवि की कल्पना करने के लिए संसाधित डेटा फ़ाइल लोड करें। संदर्भ के लिए एक विशिष्ट रसायन की सापेक्ष तीव्रता प्राप्त करने के लिए कुल आयन क्रोमैटोग्राफी (टीआईसी) द्वारा डेटा को सामान्य करने के लिए "सामान्यीकरण" बटन पर क्लिक करें, फिर विभिन्न नमूनों की तुलना एक दूसरे के साथ की जा सकती है (चित्रा 3 ई)।
- रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) बनाएं और नमूना छवि पर कई प्रतियां कॉपी करें; ROIs विभिन्न छवियों में बनाया जा सकता है। एमवीए (चित्रा 3 एफ) के लिए सभी आरओआई से एमएस जानकारी निकालने के लिए सभी आरओआई का चयन करें और मल्टी-वेरिएट विश्लेषण (एमवीए) निर्यात करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल पौधों के नमूनों में यौगिकों की पहचान और वितरण का कारण बन सकता है। एक विशिष्ट एम / जेड की एमएस छवि में, प्रत्येक पिक्सेल का रंग एम / जेड की सापेक्ष तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, इस प्रकार पूरे नमूने में प्राकृतिक वितरण और मेटाबोलाइट आयन की बहुतायत से जुड़ा हो सकता है। एकत्रित स्थिति में रसायन की प्रचुरता जितनी अधिक होगी, रंग उतना ही उज्जवल होगा। चित्र में बार (चित्रा 4 ए-डी) रंगों की ढाल दिखाता है। यहां, हमने दो यौगिकों का चयन किया जो एस मिल्टियोराइजा के औषधीय उपयोग में मूल्यवान हैं। जैसा कि चित्र 4A-D में दिखाया गया है, लक्ष्य यौगिकों का वितरण, Tanshinone IIA (m/z: 333.0893, M+H) और Rosmarinic एसिड (m/z: 705.1848, 2M+ H-O), जड़ के विभिन्न क्षेत्रों में दिखाई देता है। इस बीच, यौगिक डैनशेनोल ए (एम /जेड: 297.1127, एम + एच; एम / जेड: 335.0686, एम + के) पत्ती में पाया गया था, जैसा कि चित्र 4 ई-एच में दिखाया गया है। यौगिकों के वितरण का उपयोग चिकित्सा अनुप्रयोगों में पौधे के हिस्से के उपयोग को निर्देशित करने के लिए किया जा सकता है; इसके अलावा, निर्यात किए गए एमवीए डेटा को आगे मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण लेने के लिए लागू किया जा सकता है।
चित्र 1: नमूना तैयार करने की विधि। (A) इस शोध में प्रयुक्त पौधा (साल्विया मिल्टियोराइज़ा)। लाल तीर एक नमूने के रूप में एकत्रित ऊतक को इंगित करता है। (बी, सी) योजनाबद्ध दिखा रहा है कि सैंडविच नमूना कैसे बनाया जाए। (डी) नमूनों का एयर-वैक्यूम। तापमान सेट -83.1 ± 3 डिग्री सेल्सियस है, और वैक्यूम रेंज 3-5 पीए है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: DESI-MSI इकाई में उपकरण और उपकरण। (A) DESI असेंबली का फ्रंट व्यू। (बी) सिरिंज पंप। (सी) स्प्रेयर केशिका। (डी) देसी असेंबली का शीर्ष दृश्य। (ई) सिग्नल का अनुकूलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: देसी-एमएसआई द्वारा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) छवि को मास इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में लोड करें और छवि को सही अभिविन्यास में समायोजित करने के लिए स्लाइड के कोनों का चयन करें। (बी) एमएस पैरामीटर सेट करें, एम / जेड स्कैनिंग रेंज सेट करें, और सकारात्मक या नकारात्मक मोड का चयन करें। (सी) स्कैनिंग क्षेत्र, छवि संकल्प और स्कैनिंग दर को परिभाषित करें। (डी) प्रसंस्करण पैरामीटर सेट करें: लक्ष्य द्रव्यमान की संख्या, लॉक द्रव्यमान, नमूना आवृत्ति और अवधि। (ई) परिणाम लोड करें और डेटा को सामान्य करें। m/z की MS छवि प्रदर्शित करने के लिए द्रव्यमान सूची से अपेक्षित m/z का चयन करें। (F) MS छवि पर रुचि के क्षेत्रों (ROIs) को आकर्षित करें, और मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए MVA निर्यात करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: जड़ और पूरे पत्ती वर्गों की मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग। (ए-डी) जड़ में दो चयनित यौगिकों के स्थानिक वितरण को दिखाने वाली छवियां। (ई-एच) पत्ती में दो चयनित यौगिकों के स्थानिक वितरण को दिखाने वाली छवियां। प्रत्येक पिक्सेल का रंग एम / जेड की सापेक्ष तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है और इस प्रकार पूरे नमूने में प्राकृतिक वितरण और मेटाबोलाइट आयन की बहुतायत से जुड़ा हो सकता है। एकत्रित स्थिति में रसायन की प्रचुरता जितनी अधिक होगी, रंग उतना ही उज्जवल होगा। चित्रों में बार रंगों की ढाल दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एमएस प्रौद्योगिकी के उद्भव ने हाल के वर्षों के दौरान आणविक स्तर पर प्राकृतिक उत्पाद अनुसंधान में एक नई अंतर्दृष्टि खोलीहै। एमएस उपकरण, अपनी उच्च संवेदनशीलता और उच्च थ्रूपुट के साथ, प्राकृतिक उत्पादों में मेटाबोलाइट्स के लक्षित और अलक्षित विश्लेषण को सक्षम बनाता है, यहां तक कि ट्रेस एकाग्रता25 के साथ भी। इसलिए, एमएस वर्तमान में पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) रसायन विज्ञान के क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। टीसीएम की रासायनिक संरचना पर गुणात्मक और मात्रात्मक अनुसंधान दवा और इसके संबंधित यौगिक की सामग्री के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है, जो न केवल औषधीय अनुसंधान के लिए उपयुक्त संदर्भ प्रदान करता है, बल्कि टीसीएम26 के लिए एक गुणवत्ता मानक प्रणाली के निर्माण के लिए आधार भी प्रदान करता है। इसके अलावा, प्राकृतिक उत्पादों में, चयापचय हस्ताक्षर आमतौर पर रूपात्मक और हिस्टोलॉजिकलविशेषताओं से संबंधित होते हैं; इसलिए, विभिन्न जैविक और अजैविक तनाव स्थितियों के लिए पौधों के तंत्र और प्रतिक्रिया की पहचान करने के लिए सीटू विश्लेषण करना बहुत महत्वपूर्णहै। हालांकि, चूंकि पारंपरिक एमएस विश्लेषण के लिए नमूने एक निश्चित प्राकृतिक उत्पाद या उसके विशिष्ट भागों से अर्क के समाधान हैं, एमएस नमूनों में मेटाबोलाइट्स के स्थानिक या अस्थायी वितरण के संबंध में जानकारी प्राप्त नहीं करता है। एमएसआई तकनीक, केवल दो दशक पहले विकसित एक अपेक्षाकृत नई तकनीक, प्राकृतिक उत्पाद के नमूनों से मेटाबोलाइट्स प्राप्त करती है, गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से आणविक जानकारी का विश्लेषण करती है, और स्थानिक जानकारी रिकॉर्ड करती है। इसके बाद, मैपिंग टूल की मदद से, विशिष्ट अणुओं के 2 डी या 3 डी निर्देशांक को अनुकरण किया जा सकताहै।
इस अध्ययन में प्रयुक्त देसी-एमएसआई तकनीक एक नई एमएसआई तकनीक है जिसे 2004 में पर्ड्यू विश्वविद्यालय (यूएसए) 30 में कुक्स समूह द्वारा विकसित किया गया था। माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसआईएमएस) 31, मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर प्रदूषक आयनीकरण (माल्डी) 32, और लेजर एब्लेशन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (एलएईएसआई) 33 सहित अन्य प्रारंभिक उपयोग की जाने वाली एमएसआई तकनीकों की तुलना में, देसी के कई फायदे हैं। सिम्स और माल्डी दोनों को नमूनों को आयनित करने के लिए एक उच्च वैक्यूम वातावरण की आवश्यकता होती है, और माल्डी के लिए, नमूनों को प्रवाहकीय सतह7 पर रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, इन सभी तीन तकनीकों के लिए नमूना तैयारी में कई जटिल चरण शामिल हैं। देसी, एक नई ईएसआई तकनीक के रूप में, तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) 30 में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) के समान एक नरम आयनीकरण सिद्धांत पर आधारित है। इसलिए, पता लगाए गए आयन ज्यादातर अर्ध-आणविक आयन होते हैं, और यदि आवश्यक हो तो विखंडन भी किया जा सकता है, जो एसआईएमएस तकनीक में हार्ड आयनीकरण की कमी को दूर करता है, जिससे द्वितीयक आयन उत्पन्न होते हैं जो जानकारी के नुकसान का अपमान कर सकतेहैं। देसी परिवेश की स्थिति में काम करता है, इसलिए उपकरण में नमूने रखने के बाद काम करने की स्थिति तक पहुंचने के लिए इसे अधिक समय की आवश्यकता नहीं होती है। कम से कम विनाशकारी आयनीकरण सिद्धांत के कारण, एक नमूने पर बार-बार प्रयोगों को निष्पादित करना संभव है, इसलिए दूसरे मोड (नकारात्मक या सकारात्मक) के लिए कोई अतिरिक्त नमूने की आवश्यकता नहीं है।
यह लेख मुख्य रूप से देसी-एमएसआई तकनीक का उपयोग करके पौधे के नमूने और इमेजिंग तैयार करने की लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है। इस विधि में, नमूने की क्रॉस-अनुभागीय मोटाई कोई महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाती है; इसके बजाय, नमूने की सपाट सतह महत्वपूर्ण है, जो एयर-वैक्यूम सैंडविच द्वारा गारंटीकृत है। पौधों के मामले में, देसी नमूनों की तैयारी विभिन्न तरीकों से प्राप्त की जा सकती है और एमएस इमेजिंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। पत्तियां अक्सर समस्याग्रस्त होती हैं क्योंकि वे एक अनियमित, नरम और मोम छल्ली की सतह दिखाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग के दौरान कम संकेत हो सकता है, जबकि जड़ में उच्च लिग्निन सामग्री होती है और इमेजिंग के दौरान फ्रैक्चर करना आसान होता है। पिछले काम से पता चला है कि देसी-एमएसआई विश्लेषण में एस मिल्टिओराइजा की जड़ क्रायोस्टेट माइक्रोटोम पर क्रायो-सेक्शन थी, जबकि पत्ती34 छापकर तैयार की गई थी। हालांकि, छाप विधि ग्लास की सतह पर जमा मेटाबोलाइट्स के तेजी से घुलने के कारण एमएसआई इमेजिंग के दौरान सिग्नल तीव्रता के नुकसान को प्रेरित कर सकती है। इस प्रोटोकॉल (चरण 1.2) के साथ, जैसा कि अपेक्षित था, एमएस इमेजिंग के दौरान जड़ (चित्रा 4 ए, बी) और पत्ती (चित्रा 4 ई, एफ) के खंड बरकरार रहते हैं। इसके अलावा, क्रायोस्टैट माइक्रोटोम के साथ साइटो-सेक्शनिंग द्वारा नमूने तैयार करने की विधि, महंगी मशीन के कारण उच्च लागत वाली है।
यद्यपि हमारी विधि में अन्य तकनीकों की तुलना में कई फायदे हैं, फिर भी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, नमूनों की हाथ काटने (चरण 1.1) को क्रॉस-सेक्शन की मोटाई को उपयुक्त रखने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, माल्डी की तुलना में देसी का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और पीक तीव्रता अपेक्षाकृत कम है। अपूर्णता के बावजूद, सभी फायदे पौधों में मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण की जांच करने के लिए देसी तकनीक को एक तेज और लागत प्रभावी तरीका बनाते हैं। इसके अलावा, देसी-एमएसआई का उपयोग पहले से ही चिकित्सा, सूक्ष्म जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद रसायन विज्ञानके क्षेत्र में किया गया है। इस तकनीक के कई आयामों में बढ़ती लोकप्रियता और तेजी से सुधार के साथ, यह भविष्य में सभी सापेक्ष क्षेत्रों में अधिक से अधिक अनुप्रयोग प्राप्तकरेगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को सिचुआन प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 2022 एनएसएफएससी 0171) और चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ टीसीएम (नंबर 030058042) के शिंगलिन टैलेंट प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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