Summary
本研究では、プラントからDESI-MSIサンプルを調製するための一連の方法を提示し、DESIアセンブリの設置、MSIデータの取得、および処理の手順を詳細に説明します。このプロトコルは、植物における空間メタボローム情報を取得するためのいくつかの条件に適用することができる。
Abstract
伝統的な漢方薬の薬用使用は、主にその二次代謝産物によるものです。これらの代謝産物の分布の可視化は、植物科学において重要なテーマとなっています。質量分析イメージングは、組織スライスを分析することにより、膨大な量のデータを抽出し、これらに関する空間分布情報を提供できます。高スループットと高精度の利点により、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング(DESI-MSI)は、生物学研究や伝統的な漢方薬の研究でよく使用されます。ただし、この研究で使用される手順は複雑で手頃な価格ではありません。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、代謝物の分布を特定し、植物組織中のこれらの化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。本研究では、代謝物分析におけるDESIの活用と、研究関連技術のための伝統的な漢方薬/民族医学の標準化を促進します。
Introduction
代謝物分布の可視化は、植物科学、特に漢方薬において、植物内の特定の代謝物の形成過程を明らかにする重要なトピックとなっています。伝統的な漢方薬(TCM)を参照して、有効成分に関する情報を提供し、製薬用途における植物部品の応用をガイドします。通常、代謝物の可視化はin situハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡、免疫組織化学などによって行われますが、これらの実験で検出される化合物の数では、限られた化学情報しか伝えられません。組織染色と組み合わせることで、質量分析イメージング(MSI)は、ミクロンレベル1の組織スライスをスキャンして分析することにより、大量のデータを提供し、化合物の空間分布情報を提供できます。MSIは、サンプル表面からの脱離とイオン化に分析物を使用し、その後、得られた気相イオンの質量分析とイメージングソフトウェアの適用により、情報を統合し、特定のイオン存在量を記録した2次元画像をプロットします。この技術は、標的組織および器官における薬物およびそれらの誘導代謝産物の特徴的な分布を検出することにより、外因性分子および内因性分子の両方を決定することができる2,3,4,5。
さまざまなイメージングMSモダリティがここ数十年にわたって開発されてきました。その中で最も顕著なのは、脱離エレクトロスプレーイオン化ベースのMSI(DESI-MSI)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)、および二次イオン質量分析(SIMS)6です。DESI-MSIは、大気中での操作、高いスループット、およびより高い精度により、生物学研究でよく使用されます7。MALDIは、トランスサイレチンフラグメントをゲンタマイシンの潜在的な腎毒性バイオマーカーとして特定し、マウス脳における1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンの管理後の神経毒性代謝物1-メチル-4-フェニルピリジニウムの分布を分析するために適用されています8,9。MALDIおよびDESIは、投与されたウサギの腎臓における薬物誘発性結晶様構造の組成を決定するために使用されています。これらの構造は、主に薬物10の脱メチル化および/または酸化によって形成される代謝産物から構成される。さらに、MSIは、標的臓器における薬物毒性の代謝分布の局在化に適用されています。ただし、植物組織の細胞はさまざまであり、動物とは異なり、特別な切片作成手順が必要です。
植物では、MALDIイメージングを用いて、これまでに、コムギ(Triticum aestivum)茎、ダイヤ豆(Glycine max)、イネ(Oryza sativa)種子、シロイヌナズナの花と根、および大麦(Hordeum vulgare)種子における異なる化合物の分布が分析されている11,12,13,14,15,16,17,18.最近の研究では、DESI-MSIが天然の薬物および製品の代謝物分析、特にイチョウ葉、フジ、アルテミシアアヌアL 19,20,21などのTCMで出現していることが報告されています。これらの研究では、植物材料サンプルの調製のためのプロトコルが異なり、凍結ミクロトームのようなより複雑な装置を必要とするものもあります。DESI-MSIには、検出されたサンプルの表面平坦性に関する厳しい要件があります。動物の臓器または組織を分析する場合、サンプルは通常、凍結切片22によって作製される。ただし、凍結切片作成の手順は複雑で費用がかかり、一般的に使用される接着剤最適切断温度(OCT)法は、イメージング時に強い信号を示します。さらに、TCMの薬用組織はさまざまです。たとえば、中国語で丹生として知られるサルビアミルティオルリザの根は薬用に使用されますが、Zisu(シソフルテッセンス)では葉が使用されます23,24。したがって、TCMの代謝物分析におけるDESIの利用を促進するために、サンプル調製手順を改善する必要があります。
多年生のハーブおよび一般的に使用されるTCMとして、 S. miltiorrhiza は最初に最も古い医学モノグラフである神農のマテリアメディカの古典(中国語で神農ベンカオジンとして知られている)に記録されました。この研究では、切片作成とDESIイメージング手順を最適化し、 S. miltiorrhizaの組織中の分布を特定し、化合物を分類するためのより費用効果の高い方法を開発しました。この方法はまた、乾燥組織に関連する欠点(通常は窒素ブローで容易に骨折する)を克服し、TCMの発症を促進することができます。本研究では、研究関連技術のためのTCM/民族医学の標準化を推進します。
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Protocol
1. サンプル調製
- 2年生の サルビアミルティオルリザ 植物(図1A)からきれいにした根と葉を集め、手で約3〜5 mmの断面の厚さで直接スライスします。次に、両面テープを使用してサンプルを接着顕微鏡スライドガラス上に貼り付けます(図1B)。
注意: 両面テープのサイズがサンプルよりも大きいことを確認してください。ティッシュが乾燥している場合は、スライスする前に水または4%パラホルムアルデヒドに一晩浸します。 - 別の顕微鏡スライドガラスをサンプルの上に置き、2つのスライドガラスをサンドイッチのようなシーリングフィルムで包みます(図1C)。サンドイッチサンプルを-80°Cで少なくとも4時間凍結し、次に次の設定パラメータを使用して2時間空気真空にさらします(図1D):トラップ温度は-75〜-82°C、真空計は2.5〜3.7Paです。
注意: サンプルの表面を無傷に保つために、シーリングフィルムを包むときは、2つのスライドガラスが平行であることを確認してください。植物組織の水分含有量が高い場合は、空気真空の時間を3時間に延長します。5時間を超えないでください、そうでなければ組織は容易に骨折します。 - サンドイッチサンプルは、分析されるまで-80°Cで保存します。サンプル表面の結露を避けるために、デシケーターでサンプルを室温に戻します。次に、サンプルをマトリックスアプリケーションにかけます。
2. 脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI)装置の設置
- 検出器のセットアップと機器の質量校正をESIモードで実装します。水-アセトニトリル(1:1 v / v)溶液中のロイシンエンケファリン(LE)を使用して検出器のセットアップを実行し、水-イソプロパノール(1:1 v / v)溶液中のギ酸ナトリウム(NaFA)を使用して質量校正を実行します。
- ESIソースを取り出し、DESIユニットを質量分析計に取り付けます。N2 ガス供給をDESIユニットに接続し、ガス圧力を約0.5MPaに調整します(図2A)。ソースを交換するときに機器をベントする必要はありません。
- 5 mLシリンジに水-メタノール(1:9 v/v)溶液中のLEとギ酸を満たし、シリンジを高性能シリンジポンプに取り付けて、サンプル中の化学物質をイオン化するための溶媒を供給します(図2B)。
- シリンジとDESI噴霧器に毛細管を提供する溶媒を取り付けます(図2C)。溶媒供給キャピラリーは、標準的な内径75μm、外径375μmのキャピラリーです。それはかなり狭く、不純物によって簡単にブロックされるため、スキャンプロセスで使用される溶媒はMSグレードであり、閉塞のリスクを減らすために使用前にろ過する必要があります。
- シリンジポンプを始動し、注入速度を2 μL/minに設定して、溶媒の流れとスプレーを一定にします(図2B)。N2 ガスバルブをオフにし、約15秒後にオンにします。溶剤の小さな滴がステージに吹き出され、溶剤の流れが一定の状態にある場合はスプレーが見られます。
- スプレー角度、XYZ軸、突起、および高さの観点から噴霧器の位置を調整します(図2D)。赤と黒のマーカーを基準として使用して質量分析信号を最適化し、感度モードで1 x 105 を超える信号強度を取得します(図2E)。
- 噴霧器の突出は、信号強度に影響を与える最も重要な要因です。N2 ガスガードを5mmレンチで交換して突起を調整します。スプレー方向はマス画像の品質に影響します。スプレーがまっすぐになるまでスプレーを回転させます。突起を最適な信号強度位置に調整したら、ソースを交換するときに変更しないようにしてください。
- 上記のすべての手順を完了すると、セットアップは実験の準備が整い、セットアップは通常、初期設定後に観察される>3週間の使いやすさで安定しています。
3. DESI-MS画像取得
- DESI-MSIの場合、サンプルの前処理は行いません。すでに前処理が行われているサンプルの場合は、前処理ステップをできるだけ最小限に抑えます。たとえば、一部のサンプルは封入剤でしか作成できないため、可能であればスライド上の余分な媒体を取り除きます。
- スライド上のサンプルの画像を撮ります(図3A)。不純物の取り込みを防ぐため、サンプルの表面に触れないでください。
- DESIステージのプレート位置にスライドを置きます。ステージには、AとBの2つのプレート位置があります。正しい位置を覚えておくことが重要です。標準のスライド(75 mm x 25 mm)またはフルスライドを使用すると、スライドがその位置に収まらず、安定して保持できなくなります。フルスライド(120 mm x 80mm)は最大4つのスライドを収容できるため、実験用の領域がはるかに大きくなります。
- 高精細マス画像処理ソフトウェアを開き、[取得]タブで新しいプレートを設定し、正しいプレート位置(AまたはB)とプレートタイプを選択します。画像選択ページで、スライドの四隅を選択すると、画像が正しい向きに自動調整されます(図3A)。
- MSパラメータを設定します。一般的に使用される実験タイプはDESI-MSモードで、親イオンのみが検出されます。機器は1回の実験で1つの極性しか使用できません。したがって、極性を正または負として選択してください。少量の化学物質に関する詳細情報を取得するには、感度モードを適用します(図3B)。
- 長方形を描画して、[パターン]タブでスキャン領域を定義し、ピクセルサイズを設定します。一般に、DESI-MS モードでは、ピクセルの X サイズと Y サイズを等しく保ちます。スキャンレートをピクセルサイズの5倍以下に設定します(図3C)。
- プロジェクトを保存し、質量分析取得ソフトウェアのワークシートをエクスポートします。
- 質量分析取得ソフトウェアを開き、ワークシートをインポートして、新しいサンプルリストとして保存します。[ 実行の開始 ]を押して、MSIスキャンを開始します。さらにワークシートをインポートすることで、複数の画像を実験キューに追加できます。
4. DESI-MSIデータの処理と可視化
- サンプルのデータファイルを大量画像処理ソフトウェアにロードし、DESI画像処理のパラメータを設定します(図3D)。ロイシンエンケファリンは内部ロック質量に使用され、ロック質量は実験の極性を識別する唯一のポイントであるため、正しいロック質量を設定することが非常に重要です。次の値を設定します:ポジティブモードの場合:556.2772;負のモードの場合:554.2620。
- ターゲット化学物質のリストを作成することは可能であり、その場合、処理結果はターゲットリスト内の化学物質に焦点を当てます。処理されたデータファイルをロードして、サンプルのDESI画像を視覚化します。「正規化」ボタンをクリックしてトータルイオンクロマトグラフィー(TIC)でデータを正規化し、特定の化学物質の基準に対する相対強度を取得すると、異なるサンプルを相互に比較できます(図3E)。
- 関心領域(ROI)を描画し、サンプル画像にいくつかのコピーをコピーします。ROIは、さまざまな画像にわたって作成できます。すべてのROIを選択し、多変量解析(MVA)をエクスポートして、MVAのすべてのROIからMS情報を抽出します(図3F)。
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Representative Results
このプロトコルは、植物サンプル中の化合物の同定と分布につながる可能性があります。特定のm/zのMS画像では、各ピクセルの色はm/zの相対強度を表しているため、サンプル全体の自然分布と代謝物イオンの存在量に関連付けることができます。収集位置での化学物質の量が多いほど、色は明るくなります。写真のバー(図4A-D)は、色のグラデーションを示しています。ここでは、S. miltiorrhizaの薬用使用に価値のある2つの化合物を選択しました。図4A-Dに示すように、目的化合物であるタンシノンIIA(m/z:333.0893、M+H)とロスマリン酸(m/z:705.1848、2M+H-O)の分布は、根のさまざまな領域で見られます。一方、図4E-Hに示すように、化合物ダンシェノールA(m/z:297.1127、M+H、m/z:335.0686、M+K)が葉から検出されました。化合物の分布は、医療用途における植物部分の使用を導くために使用することができる。さらに、エクスポートされたMVAデータは、さらなるメタボロミクス解析を行うために適用することができる。
図1:サンプル調製の方法。 (A)本研究で用いた植物(サルビア・ミルティオルリザ)。赤矢印は採取した組織を試料として示す。(B,C)サンドイッチサンプルの作り方を示す模式図。(D)サンプルの空気真空。設定された温度は-83.1 ± 3°Cで、真空範囲は3〜5 Paです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:DESI-MSIユニット内の機器と装置 。 (A)DESIアセンブリの正面図。(B)シリンジポンプ。(C)噴霧器キャピラリー。(D) DESI アセンブリの上面図。(E)信号の最適化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DESI-MSIによる取得、データ分析、および視覚化。 (A)画像を大量画像処理ソフトウェアにロードし、スライドの角を選択して画像を正しい方向に調整します。(B)MSパラメータを設定し、m / zスキャン範囲を設定し、ポジティブモードまたはネガティブモードを選択します。(C)スキャン領域、画像解像度、およびスキャン速度を定義します。(D)処理パラメータを設定します:ターゲット質量の数、ロック質量、サンプル周波数、および持続時間。(E)結果をロードし、データを正規化します。質量リストから予想されるm/zを選択して、m/zのMS画像を表示します。 (F)MS画像に関心領域(ROI)を描画し、メタボロミクス解析用にMVAをエクスポートします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:根と葉全体の切片の質量分析イメージング。 (A-D)根における2つの選択された化合物の空間分布を示す画像。(E-H)葉中の2つの選択された化合物の空間分布を示す画像。各ピクセルの色はm / zの相対強度を表すため、サンプル全体の自然分布と代謝物イオンの存在量に関連付けることができます。収集位置での化学物質の量が多いほど、色は明るくなります。写真のバーは色のグラデーションを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
MS技術の出現は、近年の分子レベルでの天然物研究に新しい洞察を開きました24。高感度と高スループットを備えたMS装置は、微量濃度25でも天然物中の代謝物の標的分析と非標的分析を可能にします。したがって、MSは現在、伝統的な漢方薬(TCM)化学の分野で広く使用されています。TCMの化学組成に関する定性的および定量的研究は、医薬品の成分とその関連化合物に関する情報を提供することができ、薬理学的研究に適した参照を提供するだけでなく、TCM26の品質基準システムを構築するための基礎も提供します。その上、天然物では、代謝シグネチャは通常、形態学的および組織学的特徴に関連しています27;したがって、in situ 分析を実施して、さまざまな生物的および非生物的ストレス条件に対する植物のメカニズムと応答を特定することは非常に価値があります28。ただし、従来のMS分析のサンプルは、特定の天然物またはその特定の部分からの抽出物の溶液であるため、MSはサンプル中の代謝物の空間的または時間的分布に関する情報を取得しません。MSI法は、わずか20年前に開発された比較的新しい技術で、天然物サンプルから代謝物を取得し、分子情報を定性的および定量的に分析し、時空間情報を記録します。その後、マッピングツールの助けを借りて、特定の分子の2Dまたは3D座標をシミュレートすることができる29。
本研究で用いたDESI-MSI技術は、パデュー大学(米国)のクックス氏のグループによって2004年に開発された新しいMSI技術です30。二次イオン質量分析(SIMS)31、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)32、レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化(LAESI)33など、他の初期に使用されたMSI技術と比較して、DESIにはいくつかの利点があります。SIMSおよびMALDIはどちらもサンプルをイオン化するために高真空環境を必要とし、MALDIの場合、サンプルは導電性表面7に取り付ける必要がある。さらに、これら3つの技術すべてのサンプル調製には、いくつかの複雑なステップが含まれます。DESIは、新しいESI技術として、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)30におけるエレクトロスプレーイオン化(ESI)と同様のソフトイオン化原理に基づいています。したがって、検出されたイオンは、ほとんどが準分子イオンであり、必要に応じてフラグメンテーションを行うことができ、これはSIMS技術におけるハードイオン化の欠点を克服し、情報の損失を侮辱する可能性のある二次イオンを生成する7。DESIは周囲条件で動作するため、サンプルを装置に入れた後、作業条件に到達するのに多くの時間を必要としません。破壊イオン化原理が最小限に抑えられているため、1つのサンプルで実験を繰り返し実行できるため、2番目のモード(負または正)に追加のサンプルは必要ありません。
この記事では、主に、DESI-MSI技術を使用して植物サンプルを調製し、イメージングする費用効果の高い方法について説明します。この方法では、サンプルの断面の厚さは重要な役割を果たしません。代わりに、サンプルの平らな表面が重要であり、これは空気真空サンドイッチによって保証されています。植物の場合、DESIサンプルの調製はさまざまな方法で達成でき、MSイメージングで重要な役割を果たします。葉は不規則で柔らかくワックスのキューティクル表面を示すため、イメージング中の信号が低下する可能性がありますが、根はリグニン含有量が高く、イメージング中に骨折しやすいため、しばしば問題があります。以前の研究では、DESI-MSI分析では、S. miltiorrhizaの根がクライオスタットミクロトームで凍結切片化されていたのに対し、葉は刷り込みによって調製されたことが示されました34。しかし、インプリント法は、ガラス表面に沈着した代謝産物が急速に溶解するため、MSIイメージング中にシグナル強度が失われる可能性があります。このプロトコル(ステップ1.2)では、予想通り、MSイメージング中、ルート(図4A、B)とリーフ(図4E、F)のセクションはそのまま残ります。その他にも、試料を調製する方法は、クライオスタットミクロトームによる細胞切片化により、高価な機械であるため高コストである。
私たちの方法は他の技術と比較して多くの利点がありますが、まだいくつかの制限があります。まず、サンプルの手作業による切断(ステップ1.1)では、断面の厚さを適切に保つための練習が必要です。さらに、DESIの空間分解能とピーク強度はMALDIと比較して比較的低いです。不完全性にもかかわらず、すべての利点により、DESI技術は植物における代謝物の時空間分布を調査するための高速で費用効果の高い方法になります。さらに、DESI-MSIはすでに医学、微生物学、および天然物化学の分野で使用されています35。この技術のいくつかの次元での人気の高まりと急速な改善に伴い、将来的にはすべての相対的な分野でますます多くのアプリケーションが得られるでしょう7。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、四川省自然科学財団(第2022NSFSC0171号)および成都TCM大学の興林人材プログラム(第030058042号)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
References
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