Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הדמיה של מטבוליטים שזוהו במטבוליזם המרחבי של הרפואה הסינית המסורתית באמצעות DESI-MSI

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64912
Automatic Translation
1,4, 3, 3, 1, 1, 1,2
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Tianfu Chinese Medicine Innovation Harbour, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4China Resources Sanjiu (Ya’an) Pharmaceutical Co., Ltd.

Summary

במחקר זה מוצגת סדרה של שיטות להכנת דגימות DESI-MSI מצמחים, ומתואר בפירוט הליך של התקנת הרכבה של DESI, רכישת נתוני MSI ועיבודם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במספר תנאים לרכישת מידע מטבולי מרחבי בצמחים.

Abstract

השימוש הרפואי ברפואה הסינית המסורתית נובע בעיקר מהמטבוליטים המשניים שלה. הדמיה של התפלגות מטבוליטים אלה הפכה לנושא מכריע במדעי הצמח. דימות ספקטרומטריית מסות יכול לחלץ כמויות עצומות של נתונים ולספק מידע על התפלגות מרחבית על אלה על ידי ניתוח פרוסות רקמות. עם היתרון של תפוקה גבוהה ודיוק גבוה יותר, דימות ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי ספיחה (DESI-MSI) משמש לעתים קרובות במחקר ביולוגי ובחקר הרפואה הסינית המסורתית. עם זאת, ההליכים המשמשים במחקר זה הם מסובכים ולא סבירים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של הליכי חתך והדמיית DESI ופיתחנו שיטה חסכונית יותר לזיהוי התפלגות מטבוליטים וסיווג תרכובות אלה ברקמות צמחים, עם דגש מיוחד על תרופות סיניות מסורתיות. המחקר יקדם את השימוש ב- DESI בניתוח מטבוליטים ותקינה של רפואה סינית מסורתית / רפואה אתנית לטכנולוגיות הקשורות למחקר.

Introduction

הדמיה של התפלגות מטבוליטים הפכה לנושא מכריע במדעי הצמח, במיוחד ברפואה הסינית המסורתית, שכן היא חושפת את תהליך היווצרותם של מטבוליטים ספציפיים בתוך הצמח. בהתייחס לרפואה סינית מסורתית (TCM), הוא מספק מידע לגבי המרכיבים הפעילים ומנחה את היישום של חלקי צמח ביישומים פרמצבטיים. בדרך כלל, הדמיה של מטבוליטים מושגת על ידי הכלאה באתר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי או אימונוהיסטוכימיה, אולם מספר התרכובות שזוהו על ידי ניסויים אלה מעביר מידע כימי מוגבל. בשילוב עם צביעת רקמות, דימות ספקטרומטריית מסה (MSI) יכול לספק כמות גדולה של נתונים ולספק מידע התפלגות מרחבית של תרכובות על ידי סריקה וניתוח פרוסות רקמה ברמת מיקרון1. MSI משתמשת באנליטים לספיגה ויינון מפני הדגימה, ולאחר מכן בניתוח מסה של יוני פאזת האדים המתקבלים ויישום תוכנת הדמיה כדי לשלב את המידע ולהתוות תמונה דו-ממדית המתעדת שפע יונים ספציפי. טכנולוגיה זו יכולה לקבוע מולקולות אקסוגניות ואנדוגניות על ידי זיהוי ההתפלגות האופיינית של תרופות והמטבוליטים המושרים שלהן ברקמות היעד ובאיברים 2,3,4,5.

שיטות הדמיה שונות של טרשת נפוצה פותחו בעשורים האחרונים; הבולטים שבהם הם MSI (DESI-MSI) מבוסס יינון אלקטרוספריי ספיחה (DESI-MSI), ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) וספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS)6. DESI-MSI משמש לעתים קרובות במחקר ביולוגי בשל פעולתו האטמוספרית, תפוקה גבוהה ודיוק גבוה יותר7. MALDI יושם כדי לזהות מקטע transthyretin כסמן ביולוגי נפרוטוקסי פוטנציאלי עבור gentamicin ולנתח את ההתפלגות של מטבוליט neurotoxic 1-methyl-4-phenylpyridinium לאחר ניהול של 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine במוחות עכברים 8,9. MALDI ו- DESI שימשו כדי לקבוע את ההרכב של מבנים דמויי גבישים המושרים על ידי תרופות בכליה של ארנבים במינון; מבנים אלה מורכבים בעיקר ממטבוליטים שנוצרו עקב דהמתילציה ו / או חמצון של התרופה10. בנוסף, MSI יושם בלוקליזציה של הפצה מטבולית של רעילות סמים באיברי היעד. עם זאת, התאים ברקמת הצמח שונים ושונים מבעלי חיים ודורשים הליכי חתך מיוחדים.

בצמחים, באמצעות הדמיה של MALDI, נותחה עד כה התפלגות של תרכובות שונות בגבעול חיטה (Triticum aestivum), פולי סויה (Glycine max), זרעי אורז (Oryza sativa), פרחים ושורשים של Arabidopsis thaliana וזרעי שעורה (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . מחקרים אחרונים דיווחו כי DESI-MSI מתפתח בניתוח מטבוליטים של תרופות ומוצרים טבעיים, במיוחד ב- TCMs כגון Ginkgo biloba, Fuzi ו- Artemisia annua L 19,20,21. במחקרים אלה, הפרוטוקולים להכנת דגימות חומר צמחי שונים, וחלקם דורשים ציוד מורכב יותר, כמו מיקרוטום מקפיא. ל- DESI-MSI יש דרישות מחמירות לשטיחות פני השטח של הדגימה שזוהתה. בעת ניתוח האיבר או הרקמה של חיה, המדגם נעשה בדרך כלל על ידי cryo-sectioning22. עם זאת, הליך ההקפאה הוא מסובך ויקר יותר, ולשיטת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) הנפוצה יש אות חזק בעת ההדמיה. בנוסף, רקמות המרפא של TCM משתנות; לדוגמה, השורש Salvia miltiorrhiza, המכונה Danshen בסינית, משמש רפואי, בעוד Zisu (Perilla frutescens), העלה משמש23,24. לכן, יש צורך לשפר את הליכי הכנת הדגימה כדי לקדם את השימוש של DESI בניתוח מטבוליטים עבור TCM.

כצמח רב-שנתי וכצמח TCM נפוץ, S. miltiorrhiza תועד בתחילה במונוגרפיה הרפואית העתיקה ביותר, Shennong's Classic of Materia Medica (הידועה בשם Shennong Bencao Jing בסינית). במחקר זה, ייעלנו את הליכי החתך וההדמיה של DESI ופיתחנו שיטה חסכונית יותר לזיהוי ההתפלגות ולסיווג התרכובות ברקמות של S. miltiorrhiza. שיטה זו יכולה גם להתגבר על החסרונות הקשורים לרקמות יבשות - שהן בדרך כלל נשברות בקלות תחת מכת החנקן - ולקדם את התפתחות ה- TCM. המחקר יקדם סטנדרטיזציה של רפואה TCM/אתנית לטכנולוגיות הקשורות למחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדגם

  1. אספו שורשים ועלים נקיים מצמח Salvia miltiorrhiza בן שנתיים (איור 1A), וחתכו ישירות בעובי חתך של כ-3-5 מ"מ ביד. לאחר מכן, הדביקו את הדגימה על שקופית זכוכית של מיקרוסקופ הידבקות באמצעות סרט דו-צדדי (איור 1B).
    הערה: ודא שגודל הסרט הדו-צדדי גדול יותר מהדגימה. אם הרקמות מיובשות, השרו אותן במים או ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה לפני החיתוך.
  2. הניחו שקופית זכוכית נוספת במיקרוסקופ מעל הדגימה ועטפו את שתי שקופיות הזכוכית בסרט איטום כמו סנדוויץ' (איור 1C). הקפיאו את דגימת הכריך בטמפרטורה של -80°C למשך 4 שעות לפחות, ולאחר מכן העבירו אותה לשואב אוויר למשך שעתיים (איור 1D) עם פרמטרי ההגדרה הבאים: טמפרטורת לכידה בטמפרטורה של -75°C עד -82°C ומד ואקום בטמפרטורה של 2.5°-3.7 Pa.
    הערה: ודא ששתי שקופיות הזכוכית מקבילות בעת עטיפת סרט האיטום כדי לשמור על פני השטח של הדגימה שלמים. אם לרקמות הצמח יש תכולת לחות גבוהה, האריכו את זמן שאיבת האוויר ל-3 שעות. אין לחרוג מ -5 שעות, אחרת הרקמות יישברו בקלות.
  3. אחסנו את דגימות הכריך בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח. הביאו את הדגימות לטמפרטורת החדר במייבש כדי למנוע עיבוי על משטח הדגימה. לאחר מכן, הכפיף את המדגם ליישום מטריצה.

2. התקנת יחידת יינון אלקטרוספריי ספיחה (DESI)

  1. ליישם הגדרת גלאי וכיול מסה של המכשיר במצב ESI; לבצע הגדרת גלאי באמצעות לאוצין אנקפלין (LE) בתמיסת מים-אצטוניטריל (1:1 v/v) ולבצע כיול מסה עם נתרן פורמט (NaFA) בתמיסת איזופרופנול מים (1:1 v/v).
  2. הוציאו את מקור ה-ESI והרכיבו את יחידת ה-DESI על ספקטרומטר המסות. חברו את אספקת הגז N2 ליחידת DESI וכווננו את לחץ הגז לכ-0.5 מגפ"ס (איור 2A). אין צורך לאוורר את המכשיר בעת החלפת מקורות.
  3. מלאו את מזרק 5 מ"ל ב-LE ובחומצה פורמית בתמיסת מים-מתנול (1:9 v/v) וחברו את המזרק למשאבת המזרק בעלת הביצועים הגבוהים כדי לספק ממס ליינון הכימיקלים שבדגימה (איור 2B).
  4. חברו ממס המספק נימים למזרק ולמרסס DESI (איור 2C). הממס המספק נימים הוא קוטר פנימי סטנדרטי של 75 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 375 מיקרומטר; הוא צר למדי ונחסם בקלות על ידי זיהומים, ולכן ממסים המשמשים בתהליכי הסריקה צריכים להיות בדרגת MS ומסוננים לפני השימוש כדי להפחית את הסיכון לחסימה.
  5. הפעילו את משאבת המזרק וכוונו את קצב ההזרקה ל-2 מיקרוליטר/דקה כדי לקבל זרימה וריסוס קבועים של הממס (איור 2B). כבה את שסתום הגז N2 , ולאחר כ -15 שניות הפעל אותו; טיפה קטנה של ממס תועף על הבמה, וניתן לראות תרסיס אם זרימת הממס במצב קבוע.
  6. התאימו את מיקום המרסס מבחינת זווית ההתזה, ציר XYZ, הבליטה והגובה (איור 2D). השתמשו בסמנים אדומים ושחורים כהפניות כדי למטב את אות ספקטרומטריית המסות, כדי לקבל עוצמת אות מעל 1 x 105 במצב רגישות (איור 2E).
    1. בליטת המרסס היא הגורם המשמעותי ביותר המשפיע על עוצמת האות; התאם את הבליטה על ידי החלפת מגן הגז N2 עם מפתח ברגים 5 מ"מ. כיוון הריסוס משפיע על איכות תמונת המסה; סובבו את המרסס עד שהתרסיס ישר. לאחר התאמת הבליטה למיקום עוצמת האות הטוב ביותר, נסו לא לשנות אותה בעת החלפת מקורות.
  7. לאחר כל השלבים לעיל, ההתקנה מוכנה לניסויים, וההתקנה יציבה בדרך כלל למשך >3 שבועות של שימושיות, שנצפתה לאחר ההתקנה הראשונית.

3. רכישת תמונה DESI-MS

  1. עבור DESI-MSI, אין לבצע טיפול מקדים לדוגמה. עבור דגימות שכבר עברו טיפול מקדים, צמצמו את השלבים המקדימים ככל האפשר. לדוגמה, ניתן לבצע דוגמאות מסוימות רק עם מדיית הרכבה, לכן הסר את המדיה העודפת בשקופיות במידת האפשר.
  2. צלם תמונה של הדגימה בשקופית (איור 3A). אין לגעת בפני השטח של הדגימה כדי למנוע נטילת טומאה.
  3. מקם את השקופית במיקום הצלחת על במת DESI. לבמה שתי עמדות לוחות, A ו-B; חשוב לזכור את המיקום הנכון. השתמש בשקופיות רגילות (75 מ"מ x 25 מ"מ) או בשקופית מלאה, אחרת השקופית לא תתאים לתנוחה ולא ניתן יהיה להחזיק אותה ביציבות. מגלשה מלאה (120 מ"מ x 80 מ"מ) יכולה להכיל עד ארבע שקופיות, ולכן יש לה שטח גדול בהרבה לניסויים.
  4. פתח את התוכנה לעיבוד תמונה בהבחנה גבוהה להמונים, הגדר לוח חדש בכרטיסיה רכישה ובחר את מיקום הלוח הנכון (A או B) ואת סוג הצלחת. בעמוד בחירת התמונה, בחר את ארבע פינות השקופית ולאחר מכן התמונה תותאם אוטומטית לכיוון הנכון (איור 3A).
  5. הגדר את הפרמטרים של MS; סוג הניסוי הנפוץ הוא מצב DESI-MS, שבו יזוהה רק יון האב. המכשיר יכול להשתמש רק בקוטביות אחת בניסוי אחד; לכן, בחר את הקוטביות כחיובית או שלילית. כדי לקבל מידע נוסף על כימיקלים בכמויות קטנות, הפעילו את מצב הרגישות (איור 3B).
  6. ציירו מלבן כדי להגדיר את אזור הסריקה בכרטיסייה 'דוגמת מילוי' וקבעו את גודל הפיקסלים. בדרך כלל, במצב DESI-MS, שמור על גדלי X ו- Y של הפיקסל שווים. הגדר את קצב הסריקה לגודל פיקסלים של לא יותר מפי 5 (איור 3C).
  7. שמור את הפרויקט וייצא גליון עבודה עבור תוכנת רכישת ספקטרומטריית המסה.
  8. פתח את התוכנה לרכישת ספקטרומטריית מסה, יבא את גליון העבודה ושמור אותו כרשימה חדשה לדוגמה. הקש התחל הפעלה כדי להתחיל בסריקת MSI. ניתן להוסיף תמונות מרובות לתור הניסוי על-ידי ייבוא גליונות עבודה נוספים.

4. עיבוד נתוני DESI-MSI והדמיה

  1. טען את קובץ הנתונים של הדגימה לתוך תוכנת עיבוד התמונה ההמונית והגדר את הפרמטרים לעיבוד תמונה DESI (איור 3D). מכיוון שלאוצין אנקפלין שימש למסת מנעול פנימית, ומסת המנעול היא הנקודה היחידה לזיהוי קוטביות הניסוי, יש חשיבות רבה לקבוע את מסת המנעול הנכונה. הגדר את הערכים הבאים: עבור מצב חיובי: 556.2772; למצב שלילי: 554.2620.
  2. ניתן לבנות רשימה של כימיקלים מטרה, ובמקרה זה תוצאת העיבוד תתמקד בכימיקלים ברשימת היעד. טען את קובץ הנתונים המעובדים כדי להציג באופן חזותי את תמונת DESI של הדגימה. לחצו על כפתור "נורמליזציה" כדי לנרמל את הנתונים לפי כרומטוגרפיית יונים כוללת (TIC) כדי לקבל את העוצמה היחסית של כימיקל מסוים לנקודת הייחוס, ואז אפשר להשוות דגימות שונות זו לזו (איור 3E).
  3. צייר אזור עניין (ROI) והעתק מספר עותקים בתמונה לדוגמה; ניתן לבצע החזר השקעה על פני תמונות שונות. בחר את כל החזר ההשקעה וייצא ניתוח רב-משתני (MVA) כדי לחלץ מידע על MS מכל החזר ההשקעה עבור MVA (איור 3F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה יכול להוביל לזיהוי והפצה של תרכובות בדגימות צמחים. בתמונת MS של m/z מסוים, הצבע של כל פיקסל מייצג את העוצמה היחסית של m/z, ולכן ניתן לשייך אותו לפיזור הטבעי ולשפע של יון המטבוליט לאורך הדגימה. ככל ששפע הכימיקל בעמדת האיסוף גבוה יותר, כך הצבע בהיר יותר. הפס בתמונה (איור 4A-D) מראה את מעבר הצבע של הצבעים. כאן, בחרנו שתי תרכובות כי הם בעלי ערך בשימוש הרפואי של S. miltiorrhiza. כפי שניתן לראות באיור 4A-D, התפלגות תרכובות המטרה, Tanshinone IIA (m/z: 333.0893, M+H) וחומצה רוזמרינית (m/z: 705.1848, 2M+H-O), נראית באזורים שונים של השורש. בינתיים, התרכובת Danshenol A (m/z: 297.1127, M+H; m/z: 335.0686, M+K) זוהתה בעלה, כפי שניתן לראות באיור 4E-H. התפלגות התרכובות יכולה לשמש להנחיית השימוש בחלק הצמח ביישומים רפואיים; בנוסף, ניתן ליישם את נתוני MVA המיוצאים כדי לבצע ניתוח מטאבולומיקה נוסף.

Figure 1
איור 1: שיטת הכנת הדגימה . (A) הצמח (Salvia miltiorrhiza) ששימש במחקר זה. החץ האדום מציין את הרקמה שנאספה כדגימה. (ב,ג) סכמטי מראה כיצד להכין מדגם כריך. (D) ואקום אוויר של דגימות. הטמפרטורה שנקבעה היא -83.1 ± 3 מעלות צלזיוס, וטווח הוואקום הוא 3-5 Pa. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ציוד ומכשירים ביחידת DESI-MSI . (A) מבט קדמי על מכלול DESI. (B) משאבת מזרק. (ג) נימי ריסוס. (D) מבט מלמעלה על מכלול DESI. (E) אופטימיזציה של האות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רכישה, ניתוח נתונים והדמיה חזותית על-ידי DESI-MSI. (A) טען את התמונה לתוך תוכנת עיבוד התמונה ההמונית ובחר את פינות השקופית כדי להתאים את התמונה לכיוון הנכון. (B) הגדר את פרמטרי MS, הגדר את טווח הסריקה m/z ובחר מצב חיובי או שלילי. (C) הגדר את אזור הסריקה, רזולוציית התמונה וקצב הסריקה. (D) הגדר את פרמטרי העיבוד: מספר מסות היעד, מסת נעילה, תדירות הדגימה ומשך. (ה) טען את התוצאה ונרמל את הנתונים. בחר את m/z הצפוי מרשימת המסות כדי להציג את תמונת MS של m/z. (F) צייר אזורי עניין (ROIs) בתמונת MS, וייצא MVA לניתוח מטבולומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה ספקטרומטרית מסה של מקטעי שורש ועלים שלמים. (א-ד) תמונות המציגות את ההתפלגות המרחבית של שתי תרכובות שנבחרו בשורש. (ה-ה) תמונות המציגות את הפיזור המרחבי של שתי תרכובות שנבחרו בעלה. הצבע של כל פיקסל מייצג את העוצמה היחסית של m/z ולכן ניתן לשייך אותו לפיזור הטבעי ולשפע של יון המטבוליט לאורך הדגימה. ככל ששפע הכימיקל בעמדת האיסוף גבוה יותר, כך הצבע בהיר יותר. הסרגל בתמונות מציג את מעבר הצבע של הצבעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הופעתה של טכנולוגיית טרשת נפוצה פתחה תובנה חדשה במחקר מוצרים טבעיים ברמה המולקולרית בשניםהאחרונות 24. מכשיר הטרשת הנפוצה, בעל הרגישות הגבוהה והתפוקה הגבוהה שלו, מאפשר ניתוח ממוקד ולא ממוקד של מטבוליטים במוצרים טבעיים, גם עם ריכוז עקבות25. לכן, טרשת נפוצה נמצאת כיום בשימוש נרחב בתחום הרפואה הסינית המסורתית (TCM) כימיה. המחקר האיכותני והכמותי על ההרכב הכימי של TCM יכול לספק מידע על מרכיבי התרופה והתרכובת הקשורה אליה, אשר לא רק מספקים התייחסות מתאימה למחקר פרמקולוגי, אלא גם מספקים את הבסיס לבניית מערכת תקן איכות עבור TCM26. חוץ מזה, במוצרים טבעיים, חתימות מטבוליות קשורות בדרך כלל למאפיינים המורפולוגיים וההיסטולוגיים27; לכן, יש ערך רב לביצוע ניתוח באתרו כדי לזהות את המנגנון והתגובה של צמחים לתנאי עקה ביוטיים ואביוטיים שונים28. עם זאת, מכיוון שדגימות לניתוח מסורתי של טרשת נפוצה הן פתרונות של תמציות ממוצר טבעי מסוים או מחלקיו הספציפיים, טרשת נפוצה אינה מקבלת מידע ביחס להתפלגות המרחבית או הטמפורלית של מטבוליטים בדגימות. טכניקת MSI, טכנולוגיה חדשה יחסית שפותחה רק לפני שני עשורים, משיגה מטבוליטים מדגימות המוצר הטבעי, מנתחת את המידע המולקולרי הן מבחינה איכותית והן מבחינה כמותית, ורושמת את המידע המרחבי-זמני. לאחר מכן, בעזרת כלי מיפוי, ניתן לדמות את הקואורדינטות הדו-ממדיות או התלת-ממדיות של מולקולות ספציפיות29.

טכניקת DESI-MSI המשמשת במחקר זה היא טכניקת MSI חדשנית שפותחה בשנת 2004 על ידי קבוצתו של קוקס באוניברסיטת Purdue (ארה"ב)30. בהשוואה לטכניקות MSI מוקדמות אחרות, כולל ספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS)31, יינון ספיחה בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI)32, ויינון אלקטרוספריי אבלציה בלייזר (LAESI)33, ל- DESI יש מספר יתרונות. SIMS ו- MALDI זקוקים שניהם לסביבת ואקום גבוהה כדי ליינן את הדגימות, ועבור MALDI, הדגימות צריכות להיות מותקנות על משטח מוליך7. חוץ מזה, הכנת הדגימה לכל שלוש הטכניקות הללו כרוכה בכמה שלבים מסובכים. DESI, כטכניקת ESI חדשנית, מבוססת על עקרון יינון רך הדומה ליינון אלקטרוספריי (ESI) בספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS)30. לכן, היונים המתגלים הם בעיקר יונים כמו-מולקולריים, וניתן לבצע פיצול גם במידת הצורך, המתגבר על החיסרון של יינון קשה בטכניקת SIMS, ומייצר יונים משניים שעלולים להעליב את אובדן המידע7. DESI עובד בתנאי הסביבה, ולכן זה לא צריך הרבה זמן כדי להגיע למצב העבודה לאחר הצבת דגימות במנגנון. בגלל עקרון היינון ההרסני הממוזער, ניתן לבצע ניסויים שוב ושוב על דגימה אחת, ולכן אין צורך בדגימות נוספות למצב שני (שלילי או חיובי).

מאמר זה מתאר בעיקר שיטה חסכונית להכנת דגימות צמחים והדמיה באמצעות טכניקת DESI-MSI. בשיטה זו, עובי החתך של הדגימה אינו ממלא תפקיד מפתח; במקום זאת, המשטח השטוח של הדגימה הוא קריטי, אשר מובטח על ידי כריך ואקום אוויר. במקרה של צמחים, הכנת דגימות DESI יכולה להיות מושגת בדרכים שונות ולשחק תפקיד מפתח בהדמיה של טרשת נפוצה. עלים הם לעתים קרובות בעייתיים מכיוון שהם מראים משטח קוטיקולה לא סדיר, רך ושעווה, מה שעלול לגרום לאות נמוך במהלך ההדמיה, בעוד שהשורש מכיל תכולת ליגנין גבוהה וקל לשבור אותו במהלך ההדמיה. עבודות קודמות הראו כי השורש של S. miltiorrhiza היה חתך קריו-חתך על מיקרוטום קריוסטט כאשר בניתוח DESI-MSI, בעוד שהעלה הוכן על ידי הטבעה34. עם זאת, שיטת ההטבעה עלולה לגרום לאובדן עוצמת האות במהלך דימות MSI עקב המסה מהירה של מטבוליטים שהושקעו על משטח הזכוכית. עם פרוטוקול זה (שלב 1.2), כצפוי, קטעי השורש (איור 4A,B) והעלה (איור 4E,F) נשארים שלמים במהלך הדמיית הטרשת הנפוצה. חוץ מזה, השיטה להכנת הדגימות, על ידי cyto-sectioning עם מיקרוטום cryostat, היא עלות גבוהה בשל המכונה יקרה.

למרות שלשיטה שלנו יתרונות רבים בהשוואה לטכניקות אחרות, עדיין יש כמה מגבלות. ראשית, חיתוך ידני של דגימות (שלב 1.1) דורש תרגול כדי לשמור על עובי החתך מתאים. בנוסף, הרזולוציה המרחבית ועוצמת השיא של DESI נמוכה יחסית בהשוואה ל- MALDI. למרות חוסר השלמות, כל היתרונות הופכים את טכניקת DESI לשיטה מהירה וחסכונית לחקור את ההתפלגות המרחבית-זמנית של מטבוליטים בצמחים. יתר על כן, DESI-MSI כבר שימש בתחום הרפואה, מיקרוביולוגיה, וכימיה של מוצרים טבעיים35. עם הפופולריות הגוברת והשיפור המהיר במספר ממדים של טכניקה זו, היא תקבל יותר ויותר יישומים בכל התחומים היחסיים בעתיד7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז סצ'ואן (מס '2022NSFSC0171) ותוכנית הכישרונות Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (מס '030058042).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Fisher CAS:67-63-0 HPLC grade
Acetonitrile Sigma-aldrich Number-75-05-8 LC-MS grade
Adhesion Microscope slides Citotest scientific 80312-3161 Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pump EYELA FDU-2110 Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid ACS F1089 | 64-18-6 LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin) Waters 186006013-1 LC-MS grade
Methanol Sigma-aldrich Number-67-56-1 LC-MS grade
Parafilm  Bemis Company sc-200288 Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde Sigma-aldrich V900894 Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source Waters Synapt XS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
  3. Qiu, Z. -D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
  4. Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
  5. Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
  6. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
  7. Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
  8. Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
  9. Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
  10. Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
  11. Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
  12. Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
  13. Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
  14. Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
  15. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
  16. Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
  17. Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
  18. Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
  19. Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
  20. Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
  21. Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
  22. Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
  23. Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
  24. Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
  25. Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
  26. Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
  27. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
  28. Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
  29. Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
  30. Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
  31. Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
  32. Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  33. Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
  34. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  35. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 190
הדמיה של מטבוליטים שזוהו במטבוליזם המרחבי של הרפואה הסינית המסורתית באמצעות DESI-MSI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y.,… More

Xu, B., Chen, L., Lv, F., Pan, Y., Fu, X., Pei, Z. Visualization of Metabolites Identified in the Spatial Metabolome of Traditional Chinese Medicine Using DESI-MSI. J. Vis. Exp. (190), e64912, doi:10.3791/64912 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter