Summary
En este estudio, se presentan una serie de métodos para preparar muestras DESI-MSI de plantas, y se describe en detalle un procedimiento de instalación de ensamblaje DESI, adquisición de datos MSI y procesamiento. Este protocolo se puede aplicar en varias condiciones para adquirir información de metaboloma espacial en plantas.
Abstract
El uso medicinal de la medicina tradicional china se debe principalmente a sus metabolitos secundarios. La visualización de la distribución de estos metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas. Las imágenes de espectrometría de masas pueden extraer grandes volúmenes de datos y proporcionar información de distribución espacial sobre estos mediante el análisis de cortes de tejido. Con la ventaja de un alto rendimiento y una mayor precisión, las imágenes de espectrometría de masas de ionización por electrospray de desorción (DESI-MSI) se utilizan a menudo en la investigación biológica y en el estudio de la medicina tradicional china. Sin embargo, los procedimientos utilizados en esta investigación son complicados y no asequibles. En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imágenes DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución de metabolitos y categorizar estos compuestos en tejidos vegetales, con un enfoque especial en las medicinas tradicionales chinas. El estudio promoverá la utilización de DESI en el análisis de metabolitos y la estandarización de la medicina tradicional china / medicina étnica para tecnologías relacionadas con la investigación.
Introduction
La visualización de la distribución de metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas, especialmente en la medicina tradicional china, ya que revela el proceso de formación de metabolitos específicos dentro de la planta. Con referencia a la medicina tradicional china (MTC), proporciona información sobre los componentes activos y guía la aplicación de partes de plantas en aplicaciones farmacéuticas. Normalmente, la visualización de metabolitos se logra mediante hibridación in situ, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, sin embargo, el número de compuestos detectados por estos experimentos transmite información química limitada. Combinadas con la tinción tisular, las imágenes por espectrometría de masas (MSI) pueden proporcionar una gran cantidad de datos y proporcionar información de distribución espacial de compuestos mediante el escaneo y análisis de cortes de tejido a nivel de micras1. MSI utiliza analitos para la desorción e ionización de la superficie de la muestra, seguido de un análisis de masa de los iones de fase de vapor resultantes y la aplicación de software de imágenes para integrar la información y trazar una imagen bidimensional que registra una abundancia de iones específica. Esta tecnología puede determinar moléculas exógenas y endógenas mediante la detección de la distribución característica de los fármacos y sus metabolitos inducidos en los tejidos y órganos diana 2,3,4,5.
En las últimas décadas se han desarrollado varias modalidades de imágenes de EM; los más destacados entre ellos son el MSI basado en ionización por electrospray de desorción (desi-MSI), la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)6. DESI-MSI se utiliza a menudo en la investigación biológica debido a su funcionamiento atmosférico, alto rendimiento y mayor precisión7. MALDI se ha aplicado para identificar un fragmento de transtiretina como un potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina y para analizar la distribución del metabolito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridinio después del manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina en cerebros de ratones 8,9. MALDI y DESI se han utilizado para determinar la composición de estructuras cristalinas inducidas por fármacos en el riñón de conejos dosificados; Estas estructuras están compuestas principalmente por metabolitos formados debido a la desmetilación y/u oxidación del fármaco10. Además, MSI se ha aplicado en la localización de la distribución metabólica de la toxicidad del fármaco en órganos diana. Sin embargo, las células en el tejido vegetal varían y son diferentes de los animales y requieren procedimientos especiales de seccionamiento.
En plantas, mediante el uso de imágenes MALDI, hasta el momento, se ha analizado la distribución de diferentes compuestos en el tallo del trigo (Triticum aestivum), las semillas de soja (Glycine max), arroz (Oryza sativa), las flores y raíces de Arabidopsis thaliana y las semillas de cebada (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudios recientes han informado que DESI-MSI está emergiendo en el análisis de metabolitos de medicamentos y productos naturales, especialmente en MTC como Ginkgo biloba, Fuzi y Artemisia annua L 19,20,21. En estos estudios, los protocolos para la preparación de muestras de material vegetal difieren, y algunos requieren equipos más complejos, como un micrótomo de congelación. DESI-MSI tiene requisitos estrictos para la planitud superficial de la muestra detectada. Cuando se analiza el órgano o tejido de un animal, la muestra generalmente se realiza mediante criosección22. Sin embargo, el procedimiento para la criosección es complicado y más costoso, y el método de temperatura óptima de corte (OCT) del adhesivo comúnmente utilizado tiene una señal fuerte cuando se toman imágenes. Además, los tejidos medicinales de la MTC varían; por ejemplo, la raíz de Salvia miltiorrhiza, conocida como Danshen en chino, se usa medicinalmente, mientras que en Zisu (Perilla frutescens), la hoja se usa23,24. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de preparación de muestras para promover la utilización de DESI en el análisis de metabolitos para la MTC.
Como hierba perenne y una MTC de uso común, S. miltiorrhiza se registró inicialmente en la monografía de medicina más antigua, Shennong's Classic of Materia Medica (conocida como Shennong Bencao Jing en chino). En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imagen DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución y categorizar los compuestos en tejidos de S. miltiorrhiza. Este método también puede superar las desventajas asociadas con los tejidos secos, que generalmente se fracturan fácilmente bajo el golpe de nitrógeno, y promover el desarrollo de la MTC. El estudio promoverá la estandarización de la medicina tradicional china y étnica para las tecnologías relacionadas con la investigación.
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Protocol
1. Preparación de la muestra
- Recoja las raíces y hojas limpias de una planta de Salvia miltiorrhiza de 2 años (Figura 1A) y corte directamente a mano a un espesor de sección transversal de aproximadamente 3-5 mm. Luego, pegue la muestra en un portaobjetos de vidrio de microscopio de adhesión con cinta adhesiva de doble cara (Figura 1B).
NOTA: Asegúrese de que el tamaño de la cinta de doble cara sea mayor que el de la muestra. Si los tejidos están secos, sumérjalos en agua o paraformaldehído al 4% durante la noche antes de cortarlos. - Coloque otro portaobjetos de vidrio de microscopio sobre la muestra y envuelva los dos portaobjetos de vidrio con una película de sellado como un sándwich (Figura 1C). Congelar la muestra sándwich a -80 °C durante al menos 4 h, luego someterla a un vacío de aire durante 2 h (Figura 1D) con los siguientes parámetros de ajuste: temperatura de la trampa a -75 a -82 °C y manómetro de vacío a 2,5 a 3,7 Pa.
NOTA: Asegúrese de que los dos portaobjetos de vidrio estén paralelos al envolver la película de sellado para mantener intacta la superficie de la muestra. Si los tejidos vegetales tienen un alto contenido de humedad, extienda el tiempo de vacío de aire a 3 h. No exceda las 5 h, de lo contrario los tejidos se fracturarán fácilmente. - Conservar las muestras sándwich a -80 °C hasta su análisis. Lleve las muestras a temperatura ambiente en un desecador para evitar la condensación en la superficie de la muestra. A continuación, someta la muestra a la aplicación matricial.
2. Instalación de la unidad de ionización por electrospray de desorción (DESI)
- Implementar la configuración del detector y la calibración de masa del instrumento en modo ESI; llevar a cabo la configuración del detector utilizando leucina encefalina (LE) en solución de agua-acetonitrilo (1:1 v/v) y realizar calibración de masa con formiato de sodio (NaFA) en solución de isopropanol en agua (1:1 v/v).
- Saque la fuente ESI y monte la unidad DESI en el espectrómetro de masas. Conecte el suministro de gas N2 a la unidad DESI y ajuste la presión del gas a alrededor de 0,5 MPa (Figura 2A). No hay necesidad de ventilar el instrumento al intercambiar fuentes.
- Llene la jeringa de 5 ml con LE y ácido fórmico en solución de agua-metanol (1:9 v/v) y conecte la jeringa a la bomba de jeringa de alto rendimiento para proporcionar disolvente para la ionización de los productos químicos en la muestra (Figura 2B).
- Conecte un disolvente que proporcione capilar a la jeringa y al pulverizador DESI (Figura 2C). El disolvente que proporciona capilar es un capilar interno estándar de 75 μm de diámetro interno y 375 μm de diámetro exterior; es bastante estrecho y se bloquea fácilmente por impurezas, por lo tanto, los disolventes utilizados en los procesos de escaneo deben ser de grado MS y filtrados antes de su uso para reducir el riesgo de bloqueo.
- Arranque la bomba de la jeringa y ajuste la velocidad de infusión a 2 μL/min para obtener un flujo constante y la pulverización del disolvente (Figura 2B). Cierre la válvula de gas N2 , luego de aproximadamente 15 s enciéndala; Se expulsará una pequeña gota de disolvente sobre el escenario, y se puede ver el rocío si el flujo de disolvente está en un estado constante.
- Ajuste la posición del pulverizador en términos del ángulo de pulverización, el eje XYZ, la protuberancia y la altura (Figura 2D). Utilice marcadores rojos y negros como referencias para optimizar la señal de espectrometría de masas, para obtener una intensidad de señal superior a 1 x 105 en modo de sensibilidad (Figura 2E).
- La protrusión del pulverizador es el factor más importante que afecta la intensidad de la señal; ajuste la protuberancia cambiando el protector de gas N2 con una llave de 5 mm. La dirección de pulverización influye en la calidad de la imagen de masa; Gire el pulverizador hasta que el aerosol esté recto. Una vez que la protuberancia se ajusta a la mejor posición de intensidad de señal, trate de no cambiarla al intercambiar fuentes.
- Después de todos los pasos anteriores, la configuración está lista para experimentos, y la configuración es normalmente estable durante >3 semanas de usabilidad, observada después de la configuración inicial.
3. Adquisición de imágenes DESI-MS
- Para DESI-MSI, no realizar ningún pretratamiento de la muestra. Para las muestras que ya tienen pretratamiento, minimice los pasos de pretratamiento tanto como sea posible. Por ejemplo, algunas muestras solo se pueden hacer con medios de montaje, así que elimine el exceso de medios en las diapositivas si es posible.
- Tome una imagen de la muestra en la diapositiva (Figura 3A). No toque la superficie de la muestra para evitar la absorción de impurezas.
- Coloque la corredera en la posición de la placa en la plataforma DSI. El escenario tiene dos posiciones de placa, A y B; Es importante recordar la posición correcta. Utilice guías estándar (75 mm x 25 mm) o una corredera completa, de lo contrario la corredera no encajará en la posición y no se podrá sujetar de forma estable. Una diapositiva completa (120 mm x 80 mm) puede acomodar hasta cuatro diapositivas, y por lo tanto tiene un área mucho más grande para experimentos.
- Abra el software de procesamiento masivo de imágenes de alta definición, establezca una nueva placa en la pestaña Adquirir y seleccione la posición correcta de la placa (A o B) y el tipo de placa. En la página de selección de imagen, seleccione las cuatro esquinas de la diapositiva y, a continuación, la imagen se ajusta automáticamente a la orientación correcta (Figura 3A).
- Establecer los parámetros de MS; el tipo de experimento comúnmente utilizado es el modo DESI-MS, en el que solo se detectará el ion padre. El instrumento puede usar solo una polaridad en un experimento; Por lo tanto, seleccione la polaridad como positiva o negativa. Para obtener más información sobre los productos químicos en pequeñas cantidades, aplique el modo de sensibilidad (Figura 3B).
- Dibuje un rectángulo para definir el área de escaneo en la ficha Patrón y defina el tamaño del píxel. Generalmente, para el modo DESI-MS, mantenga iguales los tamaños X e Y del píxel. Establezca la velocidad de escaneo en no más de 5 veces el tamaño del píxel (Figura 3C).
- Guarde el proyecto y exporte una hoja de trabajo para el software de adquisición de espectrometría de masas.
- Abra el software de adquisición de espectrometría de masas, importe la hoja de cálculo y guárdela como una nueva lista de muestra. Presione Iniciar ejecución para comenzar el escaneo MSI. Se pueden agregar varias imágenes a la cola de experimentos importando más hojas de cálculo.
4. Procesamiento de datos y visualización DESI-MSI
- Cargue el archivo de datos de la muestra en el software de procesamiento masivo de imágenes y establezca los parámetros para el procesamiento de imágenes DESI (Figura 3D). Como la encefalina leucina se utilizó para la masa de bloqueo interna, y la masa de bloqueo es el único punto para identificar la polaridad del experimento, es de gran importancia establecer la masa de bloqueo correcta. Establezca los siguientes valores: para el modo positivo: 556.2772; Para el modo negativo: 554.2620.
- Es posible crear una lista de productos químicos objetivo, en cuyo caso el resultado del procesamiento se centrará en los productos químicos de la lista objetivo. Cargue el archivo de datos procesados para visualizar la imagen DESI de la muestra. Haga clic en el botón "Normalización" para normalizar los datos por cromatografía iónica total (TIC) para obtener la intensidad relativa de un producto químico específico a la referencia, luego se pueden comparar diferentes muestras entre sí (Figura 3E).
- Dibuje una región de interés (ROI) y copie varias copias en la imagen de muestra; Los ROI se pueden hacer a través de diferentes imágenes. Seleccione todos los ROI y exporte el análisis multivariante (MVA) para extraer información de MS de todos los ROI para MVA (Figura 3F).
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Representative Results
Este protocolo puede conducir a la identificación y distribución de compuestos en muestras de plantas. En la imagen MS de un m/z específico, el color de cada píxel representa la intensidad relativa del m/z, por lo que puede asociarse con la distribución natural y la abundancia del ion metabolito en toda la muestra. Cuanto mayor sea la abundancia del producto químico en la posición de recolección, más brillante será el color. La barra de la imagen (Figura 4A-D) muestra el degradado de los colores. Aquí, seleccionamos dos compuestos que son valiosos en el uso medicinal de S. miltiorrhiza. Como se muestra en la Figura 4A-D, la distribución de los compuestos objetivo, Tanshinone IIA (m/z: 333.0893, M+H) y ácido rosmarínico (m/z: 705.1848, 2M+H-O), es visible en diferentes áreas de la raíz. Mientras tanto, el compuesto Danshenol A (m/z: 297.1127, M+H; m/z: 335.0686, M+K) fue detectado en la hoja, como se muestra en la Figura 4E-H. La distribución de los compuestos se puede utilizar para guiar el uso de la parte de la planta en aplicaciones médicas; además, los datos de MVA exportados se pueden aplicar para realizar un análisis metabolómico adicional.
Figura 1: Método de preparación de la muestra . (A) La planta (Salvia miltiorrhiza) utilizada en esta investigación. La flecha roja indica el tejido recogido como una muestra. (B,C) Esquema que muestra cómo hacer una muestra de sándwich. D) Vacío de aire de las muestras. La temperatura establecida es de -83.1 ± 3 ° C, y el rango de vacío es de 3-5 Pa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Equipo y aparatos de la unidad DESI-MSI . (A) Vista frontal del conjunto DESI. (B) Bomba de jeringa. (C) Pulverizador capilar. (D) Vista superior de la asamblea DESI. (E) Optimización de la señal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Adquisición, análisis de datos y visualización por DESI-MSI. (A) Cargue la imagen en el software de procesamiento masivo de imágenes y seleccione las esquinas de la diapositiva para ajustar la imagen a la orientación correcta. (B) Establezca los parámetros MS, establezca el rango de escaneo m / z y seleccione el modo positivo o negativo. (C) Defina el área de escaneo, la resolución de la imagen y la velocidad de escaneo. (D) Establecer los parámetros de procesamiento: número de masas objetivo, masa de bloqueo, frecuencia de muestreo y duración. (E) Cargar el resultado y normalizar los datos. Seleccione el m/z esperado de la lista de masa para mostrar la imagen MS del m/z. (F) Dibuje regiones de interés (ROI) en la imagen MS y exporte MVA para el análisis metabolómico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes por espectrometría de masas de secciones de raíces y hojas enteras. (A-D) Imágenes que muestran la distribución espacial de dos compuestos seleccionados en la raíz. (E-H) Imágenes que muestran la distribución espacial de dos compuestos seleccionados en hoja. El color de cada píxel representa la intensidad relativa del m/z y, por lo tanto, puede asociarse con la distribución natural y la abundancia del ion metabolito en toda la muestra. Cuanto mayor sea la abundancia del producto químico en la posición de recolección, más brillante será el color. La barra en las imágenes muestra el degradado de los colores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La aparición de la tecnología MS ha abierto una nueva visión en la investigación de productos naturales a nivel molecular durante los últimos años24. El instrumento MS, con su alta sensibilidad y alto rendimiento, permite el análisis dirigido y no dirigido de metabolitos en productos naturales, incluso con concentración de trazas25. Por lo tanto, la EM es actualmente ampliamente utilizada en el campo de la química de la medicina tradicional china (MTC). La investigación cualitativa y cuantitativa sobre la composición química de la MTC puede proporcionar información sobre los ingredientes del medicamento y su compuesto asociado, que no solo proporcionan una referencia adecuada para la investigación farmacológica, sino que también proporcionan la base para la construcción de un sistema estándar de calidad para la MTC26. Además, en los productos naturales, las firmas metabólicas suelen estar relacionadas a las características morfológicas e histológicas27; Por lo tanto, es de gran valor realizar análisis in situ para identificar el mecanismo y la respuesta de las plantas a diversas condiciones de estrés biótico y abiótico28. Sin embargo, como las muestras para el análisis tradicional de EM son soluciones de extractos de un determinado producto natural o sus partes específicas, la EM no obtiene información con respecto a la distribución espacial o temporal de los metabolitos en las muestras. La técnica MSI, una tecnología relativamente nueva desarrollada hace solo dos décadas, obtiene metabolitos de las muestras de productos naturales, analiza la información molecular tanto cualitativa como cuantitativamente, y registra la información espaciotemporal. Posteriormente, con la ayuda de herramientas de mapeo, se pueden simular las coordenadas 2D o 3D de moléculas específicas29.
La técnica DESI-MSI utilizada en este estudio es una novedosa técnica MSI desarrollada en 2004 por el grupo de Cooks de la Universidad de Purdue (EE.UU.)30. En comparación con otras técnicas MSI utilizadas anteriormente, incluida la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)31, la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI)32 y la ionización por electrospray de ablación láser (LAESI)33, DESI tiene varias ventajas. Tanto SIMS como MALDI necesitan un entorno de alto vacío para ionizar las muestras, y para MALDI, las muestras deben montarse en una superficie conductora7. Además, la preparación de la muestra para estas tres técnicas implica varios pasos complicados. DESI, como una novedosa técnica ESI, se basa en un principio de ionización suave similar a la ionización por electrospray (ESI) en la espectrometría de masas de cromatografía líquida (LC-MS)30. Por lo tanto, los iones detectados son en su mayoría iones cuasi-moleculares, y la fragmentación también se puede realizar si es necesario, lo que supera el inconveniente de la ionización dura en la técnica SIMS, generando iones secundarios que pueden insultar la pérdida de información7. DESI funciona en condiciones ambientales, por lo que no necesita mucho tiempo para alcanzar las condiciones de trabajo después de colocar muestras en el aparato. Debido al principio de ionización destructiva minimizada, es posible ejecutar experimentos repetidamente en una muestra, por lo tanto, no se necesitan muestras adicionales para un segundo modo (negativo o positivo).
Este artículo describe principalmente un método rentable para preparar muestras de plantas e imágenes utilizando la técnica DESI-MSI. En este método, el espesor transversal de la muestra no juega ningún papel clave; En cambio, la superficie plana de la muestra es crucial, lo que está garantizado por el sándwich de vacío de aire. En el caso de las plantas, la preparación de muestras DESI se puede lograr de diferentes maneras y juega un papel clave en las imágenes de EM. Las hojas a menudo son problemáticas ya que muestran una superficie de cutícula irregular, suave y de cera, lo que puede resultar en una señal baja durante la imagen, mientras que la raíz contiene un alto contenido de lignina y es fácil de fracturar durante la imagen. Trabajos previos mostraron que la raíz de S. miltiorrhiza fue crioseccionada en un microtomo de criostato cuando en el análisis DESI-MSI, mientras que la hoja se preparó mediante impresión34. Sin embargo, el método de impresión podría inducir una pérdida de intensidad de señal durante las imágenes MSI debido a la rápida disolución de los metabolitos depositados en la superficie del vidrio. Con este protocolo (paso 1.2), como se esperaba, las secciones de raíz (Figura 4A, B) y hoja (Figura 4E, F) permanecen intactas durante la imagen de EM. Además, el método para preparar las muestras, mediante citoseccionamiento con un micrótomo criostato, es de alto costo debido a la costosa máquina.
Aunque nuestro método tiene muchas ventajas en comparación con otras técnicas, todavía hay algunas limitaciones. En primer lugar, el corte manual de muestras (paso 1.1) requiere práctica para mantener el grosor de la sección transversal adecuado. Además, la resolución espacial y la intensidad máxima de DESI es relativamente baja en comparación con MALDI. A pesar de la imperfección, todas las ventajas hacen de la técnica DESI un método rápido y rentable para investigar la distribución espaciotemporal de metabolitos en las plantas. Además, DESI-MSI ya se ha utilizado en el campo de la medicina, la microbiología y la química de productos naturales35. Con la creciente popularidad y la rápida mejora en varias dimensiones de esta técnica, obtendrá más y más aplicaciones en todos los campos relativos en el futuro7.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Sichuan (No. 2022NSFSC0171) y el Programa de Talento Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No. 030058042).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Fisher | CAS:67-63-0 | HPLC grade |
| Acetonitrile | Sigma-aldrich | Number-75-05-8 | LC-MS grade |
| Adhesion Microscope slides | Citotest scientific | 80312-3161 | Microscope glass slides can adhere to the sample |
| Air cooled dry vacuum pump | EYELA | FDU-2110 | Air-vaccum equipment at -80°C |
| Formic Acid | ACS | F1089 | 64-18-6 | LC-MS grade |
| LE (Leucine Enkephalin) | Waters | 186006013-1 | LC-MS grade |
| Methanol | Sigma-aldrich | Number-67-56-1 | LC-MS grade |
| Parafilm | Bemis Company | sc-200288 | Laboratory Sealing Film |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | V900894 | Reagent grade |
| Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source | Waters | Synapt XS |
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