Summary
يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي مجموعة غير متجانسة من الحويصلات الغشائية التي تطلقها الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي. إن وجودها في كل مكان ودورها الهام كحاملين للمعلومات البيولوجية يجعلها كائنات دراسة مثيرة للاهتمام ، وتتطلب بروتوكولات موثوقة ومتكررة لعزلها. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتهم الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات التقنية المتعلقة بأبحاثهم (مثل الاستحواذ المناسب). تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة (وفقا لتسمية MISEV 2018) من طاف الثقافة لخطوط الخلايا السرطانية على أساس الطرد المركزي التفاضلي. يتضمن البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالسموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية وكيفية تقييمها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية للمركبات الكهربائية إلى إعاقة التجارب اللاحقة بشكل كبير أو حتى إخفاء آثارها البيولوجية الحقيقية. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التغاضي عن وجود السموم الداخلية إلى استنتاجات غير صحيحة. هذا له أهمية خاصة عند الإشارة إلى خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، لأن الوحيدات تشكل مجموعة حساسة بشكل خاص لبقايا السموم الداخلية. لذلك ، يوصى بشدة بفحص EVs بحثا عن تلوث السموم الداخلية ، خاصة عند العمل مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية مثل الخلايا الوحيدة أو الضامة أو الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أو الخلايا المتغصنة.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وفقا لتسمية MISEV 2018 ، هي مصطلح جماعي يصف أنواعا فرعية مختلفة من الحويصلات الغشائية التي تفرزها الخلايا والتي تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية 1,2. علاوة على ذلك ، تظهر المركبات الكهربائية واعدة كمؤشرات حيوية جديدة لمختلف الأمراض ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية ووسائل توصيل الأدوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتها الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات الفنية المتعلقة بالاستحواذ عليها3. أحد هذه التحديات هو عزل المركبات الكهربائية الخالية من السموم الداخلية ، والتي تم إهمالها في كثير من الحالات. واحدة من السموم الداخلية الأكثر شيوعا هي عديد السكاريد الدهني (LPS) ، وهو مكون رئيسي لجدران الخلايا البكتيرية سالبة الجرام ويمكن أن يسبب استجابة التهابية حادة ، بسبب إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية بواسطة خلايا مختلفة 4,5. يحفز LPS استجابة عن طريق الارتباط ببروتين ربط LPS ، يليه التفاعل مع مركب CD14 / TLR4 / MD2 على الخلايا النخاعية. يؤدي هذا التفاعل إلى تنشيط مسارات الإشارات المعتمدة على MyD88 و TRIF ، والتي بدورها تؤدي إلى العامل النووي kappa B (NFkB). يؤدي نقل NFkB إلى النواة إلى بدء إنتاج السيتوكينات6. تعتبر الخلايا الوحيدة والبلاعم شديدة الحساسية ل LPS ، ويؤدي تعرضها ل LPS إلى إطلاق السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات (على سبيل المثال ، IL-6 و IL-12 و CXCL8 و TNF-α)7,8. يتيح هيكل CD14 ربط أنواع LPS المختلفة ذات التقارب المماثل ويعمل كمستقبل مشارك للمستقبلات الأخرى الشبيهة بالحصيلة (TLR1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 7 و 9) 6. لا يزال عدد الدراسات التي أجريت حول تأثيرات المركبات الكهربائية على الخلايا الوحيدة / الضامة يتزايد9،10،11. خاصة من منظور دراسة وظائف الخلايا الوحيدة ، ومجموعاتها الفرعية ، والخلايا المناعية الأخرى ، فإن وجود السموم الداخلية وحتى وجودها المقنع في المركبات الكهربائية له أهمية كبيرة12. قد يؤدي التلوث الذي يتم التغاضي عنه للمركبات الكهربائية بالسموم الداخلية إلى استنتاجات مضللة وإخفاء نشاطها البيولوجي الحقيقي. وبعبارة أخرى ، فإن العمل مع الخلايا الوحيدة يتطلب الثقة في غياب تلوث السموم الداخلية13. يمكن أن تكون المصادر المحتملة للسموم الداخلية هي الماء ، والوسائط والأمصال التي تم الحصول عليها تجاريا ، ومكونات الوسائط والمواد المضافة ، والأواني الزجاجية المختبرية ، والأواني البلاستيكية5،14،15.
لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول لعزل المركبات الكهربائية منخفضة السموم الداخلية. يوفر البروتوكول تلميحات بسيطة حول كيفية تجنب تلوث السموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية بدلا من إزالة السموم الداخلية من المركبات الكهربائية. في السابق ، تم تقديم العديد من البروتوكولات حول كيفية إزالة السموم الداخلية من ، على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية المهندسة المستخدمة في الطب النانوي. ومع ذلك ، لا يوجد أي منها مفيد للهياكل البيولوجية مثل المركبات الكهربائية. يمكن إجراء إزالة الحرارة الفعالة للجسيمات النانوية عن طريق شطف الإيثانول أو حمض الخليك ، أو التسخين عند 175 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، أو تشعيع γ ، أو معالجة Triton X-100 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات تؤدي إلى تدمير المركبات الكهربائية16,17.
البروتوكول المقدم هو دراسة رائدة تركز على تجنب شوائب السموم الداخلية في المركبات الكهربائية ، على عكس الدراسات السابقة حول تأثير EVs على الخلايا الوحيدة9. قد يساعد تطبيق المبادئ المقترحة على الممارسة المختبرية في الحصول على نتائج بحثية موثوقة ، والتي يمكن أن تكون حاسمة عند النظر في الاستخدام المحتمل للمركبات الكهربائية كعوامل علاجية فيالعيادة 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أنابيب الطرد المركزي الفائقة
- استخدم أنابيب معقمة تستخدم مرة واحدة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فأعد استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائقة بعد غسلها بمنظف باستخدام ماصة باستور معقمة أو غيرها من أدوات التطبيق ذات الاستخدام الواحد. تذكر أن أنابيب الطرد المركزي الفائقة يجب أن تكون مخصصة لنوع واحد من مواد الطرد المركزي (طاف زراعة الخلايا / المصل / البلازما) والأنواع (الإنسان / الفأر / إلخ).
- بعد غسل المنظفات ، اشطف أنابيب الطرد المركزي الفائقة بماء منزوع الأيونات وخالي من LPS 3x.
ملاحظة: لا تستخدم مياه منخفضة الجودة. - جفف أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، ثم املأها بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الأنابيب مع 70 ٪ من الإيثانول للتطهير بين عشية وضحاها. قم بإزالة الإيثانول وتجفيف الأنابيب مرة أخرى.
- ضع الأنابيب والأغطية في عبوة التعقيم وأغلقها بإحكام. استخدم طريقة تعقيم البلازما أو الغاز (أكسيد الإيثيلين)18,19. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الفائقة المغلقة في عبوة التعقيم في مكان جاف ، واستخدمها قبل تاريخ انتهاء الصلاحية.
ملاحظة: قم بإجراء مراقبة شهرية لمستوى LPS في محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) والمياه المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية. يجب أن تشمل المراقبة الأنابيب أيضا (على سبيل المثال ، عن طريق اختبار الماء [التحكم في الغسيل] الذي تم تخزينه في أنابيب الطرد المركزي الفائقة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة [RT]).
2. تحضير مصل بقري جنيني منخفض الذيفان الداخلي مستنفد (EE-FBS)
- تأكد من استخدام FBS منخفض للغاية من السموم الداخلية (متوفر تجاريا ؛ انظر جدول المواد ؛ <0.1 EU / mL).
- ضع زجاجة من FBS منخفض للغاية في حمام مائي واحتضانها على حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مطلوبة لإلغاء تنشيط النظام التكميلي.
- ماصة FBS المعطلة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة وأجهزة الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنابيب معقمة سعة 50 مل ، مع ضمان عدم تجاوز 45 مل لكل أنبوب لتجنب تلوث الغطاء وترطيب حلقة الأنبوب.
- قم بتخزين سيروم EE-FBS المحضر بهذه الطريقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. تحقق من تركيز LPS في EE-FBS (الخطوة 6). يجب أن يكون تركيز LPS عند نفس المستوى كما كان قبل الطرد المركزي الفائق.
3. ثقافة الخلية
- في هذه الدراسة ، تم استزراع خطوط خلايا SW480 و SW620 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، L- الجلوتامين ، بيروفات الصوديوم ، والجنتاميسين (50 ميكرولتر / مل) مع 10٪ EE-FBS وفقا لذلك في قوارير استزراع 75 سم2 باستخدام تقنية التعقيم. بذر ما يقرب من 4.5 × 10 6 خلايا و6.5 × 106 خلايا لكل قارورة ل SW480 و SW620 ، على التوالي.
- اجمع المواد الطافية مرتين في الأسبوع (~ 10 مل لكل قارورة) عندما تصل الخلايا إلى التقاء كامل (~ 13.5 × 10 6 و 20 × 106 خلايا لكل قارورة ل SW480 و SW620 ، على التوالي) ، وتقسيمها. تأكد من أن صلاحية الخلايا لا تقل عن 99٪ وأن الخلايا مستزرعة عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪.
- اجمع المواد الطافية من مزرعة الخلايا في أنابيب سعة 15 مل تحمل علامات مناسبة. أجهزة الطرد المركزي للطاف التي تم جمعها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT لإزالة حطام الخلية.
- اجمع المواد الطافية بعناية ، وتجنب شفط الحطام ، وضعها في أنابيب مصنفة ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 3200 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- اجمع المواد الطافية من خطوة الطرد المركزي الثانية إلى أنابيب معقمة تحمل علامة 50 مل. تجنب ترطيب حواف الأنابيب. تأكد من أن حجم المادة الطافية لا يتجاوز 45 مل وأن الأنابيب محفوظة عموديا.
- لف غطاء الأنبوب بغشاء شفاف معقم وقم بتخزين المواد الطافية في الوضع الرأسي عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: إجراء التحكم الشهري في الميكوبلازما spp. وتلوث LPS في طاف الثقافة الطازجة (الخطوة 6). إذا تجاوز مستوى السموم الداخلية في المواد الطافية 0.05 EU / mL ، فتحقق من المرحلة التي قد يكون التلوث قد حدث فيها وأعد تشغيل العملية من البداية. إذا تلوث ثقافة الخلية بواسطة الميكوبلازما النيابة. تم الكشف عنها ، يجب إيقاف عزل المركبات الكهربائية عن هذه المواد الطافية.
4. عزل EVs من طافات زراعة الخلايا
- إعداد مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر والمحاقن ذات الحجم المناسب. تحضير أنبوبين مع طافات الثقافة (90 مل).
- املأ المحقنة بالمادة الطافية وقم بتوصيل المرشح بمحول الإبرة. ضع المحقنة المملوءة بالفلتر فوق أنبوب سعة 50 مل. اضغط على شفة المكبس واجمع ~ 90 مل من الترشيح.
- ماصة المرشح (7 مل) إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة (ضمان سحب نفس الحجم إلى كل أنبوب لتحقيق التوازن المناسب) وأجهزة الطرد المركزي عند 100000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تعتمد كفاءة تكوير المركبات الكهربائية على العديد من العوامل (على سبيل المثال, نوع الدوار, عامل k, طول مسار الهجرة, لزوجة الوسط, إلخ), والتي تحتاج إلى تحسين لاستعادة أفضل للمركبات الكهربائية20. - تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة باستور المعقمة. اجمع الكريات المتبقية باستخدام أطراف ماصة طويلة ومفلترة وقم بتجميعها في أنبوبي طرد مركزي فائقين. املأها حتى 7 مل باستخدام برنامج تلفزيوني مصفى خال من السموم الداخلية لشطف المركبات الكهربائية.
- أجهزة الطرد المركزي الكريات المعاد تعليقها بواسطة PBS عند 100000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما باستخدام ماصة باستور معقمة ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS المصفى والخالي من السموم الداخلية إلى كلا الأنبوبين لإعادة تعليق المركبات الكهربائية. ماصة بلطف بيليه المركبات الكهربائية لجمع كل المركبات الكهربائية.
- انقل تعليق المركبات الكهربائية إلى أنبوب اختبار معقم سعة 1.5 مل (إن أمكن ، استخدم أنبوب ربط منخفض البروتين). احتفظ ب 10 ميكرولتر من معلق EV لإعداد التخفيف لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ولأغراض أخرى (على سبيل المثال ، قياس تركيز البروتين).
- قم بتخفيف المركبات الكهربائية باستخدام PBS المصفى (1: 1,000) للقياسات بواسطة NTA ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتأمين أنابيب EV عن طريق لف الغطاء بفيلم شفاف معقم. قم بتخزين المركبات الكهربائية في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
5. الكشف عن علامات محددة عن طريق النشاف الغربي
- تحديد مستوى البروتين في العينات (على سبيل المثال ، بواسطة فحص برادفورد) ، وإعداد العينات (20 ميكروغرام) مع تحميل المخزن المؤقت. قم بإعداد مخزن التحميل المؤقت عن طريق خلط 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة (4x) و 2 ميكرولتر من عامل اختزال العينة (10x) إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحضير المواد الهلامية بولي أكريلاميد مع SDS (10 ٪ -14 ٪) وتحميل 20 ميكروغرام من EVs إلى كل بئر.
- قم بتشغيل الكهربائي مع تشغيل المخزن المؤقت (30 جم من Tris ، 144 جم من الجلايسين ، 10٪ SDS لكل 1 لتر) لمدة 45 دقيقة عند 150 فولت.
- إجراء نقل شبه جاف للبروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) في آلة نقل مع مخزن توبين المؤقت (1.51 جم من تريس ، 7.2 جم من الجلايسين ، 10٪ ميثانول لكل 0.5 لتر) عند 25 فولت لمدة 1 ساعة.
- ضع الغشاء في محلول TBST (1 مل من توين ، 100 مل من محلول ملحي مخزن تريس (TBS 10x) لكل 1 لتر) للحجب باستخدام 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في المخزن المؤقت TBST ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الروك في RT.
- أضف الأجسام المضادة المخففة (1: 1,000) ، أو anti-CD9 1 (clone # D8O1A) أو anti-Alix 1 (clone # 3A9) ، في1٪ BSA واحتضانها بالغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية على الروك. إزالة الأجسام المضادة وغسل الغشاء 3x مع 10 مل من 1x TBST لمدة 10 دقائق.
- أضف الأجسام المضادة للأرانب الماعز أو الماعز المضادة للفأر (التخفيف: 1: 2,000) الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيديز الفجل ، اعتمادا على الجسم المضاد الأساسي على الغشاء ، واحتضان لمدة 1 ساعة على الروك في RT. إزالة الأجسام المضادة وغسل الغشاء 3x مع 10 مل من 1x TBST لمدة 10 دقائق.
- امزج الركيزة واللومينول بنسبة 1: 1 للحصول على محلول 1 مل. صب الحل على الغشاء. ضع الغشاء على الفور في غرفة القياس لنظام التصوير ، واختر وحدة التلألؤ الكيميائي ، وتصور أشرطة البروتين على الشاشة.
6. قياس مستوى الذيفان الداخلي عن طريق اختبار Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
- إجراء قياس LAL كروموجينيك لمستوى السموم الداخلية ، وفقا لتوصية الشركة المصنعة. باختصار ، استخدم الطريقة القائمة على تفاعل الذيفان الداخلي مع تحلل الخلايا الأميبية (LAL). حد الكشف عن هذه الطريقة هو 0.005 EU / mL.
ملاحظة: لا يزال اختبار LAL ، على الرغم من قيوده ، حاليا الطريقة القياسية للكشف عن تلوث السموم الداخلية وقياسه في أنواع مختلفة من المحاليل والمنتجات الأخرى المستخدمة في العلوم أو الطب8. العامل المحدد لهذه المجموعة هو استقرار محلول تحلل الخلايا الأميبية المعاد تشكيله ، وهو مستقر لمدة 1 أسبوع فقط عند -20 درجة مئوية إذا تم تجميده مباشرة بعد إعادة التكوين. - استخدم تخفيفا بمقدار عشرة أضعاف من المركبات الكهربائية والعينات الأخرى وتخفيفا بمقدار 50 ضعفا من المصل. لمزيد من التجارب ، استخدم فقط الكواشف منخفضة السموم الداخلية مثل EE-FBS و DMEM و PBS و RPMI (<0.005 EU / mL) وطافات الثقافة الخالية من LPS.
7. الكشف عن جين 16S rRNA بدائية النواة في عينات EV
- عزل الحمض النووي من عينات EV. حاول الحفاظ على الكواشف وموقع العزل معقما. قياس تركيز الحمض النووي وجودته (على سبيل المثال ، باستخدام مقياس الطيف الضوئي).
- أداء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، كما هو موضح سابقا21. تحضير 1.5٪ هلام الأغاروز مع بروميد الإيثيديوم أو SYBR الأخضر لتصور منتجات PCR في الأشعة فوق البنفسجية (UV).
- قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للعينة وعلامة الوزن باستخدام المخزن المؤقت TRIS-acetate-EDTA عند 75 فولت لمدة 45 دقيقة. تصور أشرطة الحمض النووي باستخدام نظام التصوير.
8. تحديد تركيز LPS الفعال للتحفيز في نموذج وحيدات الإنسان
- قم بإعداد 2 × 106 حيدات / مل من معلق الوحيدات في RPMI 1640 المكمل ب L-glutamine والجلوكوز و 2٪ EE-FBS. أضف 50 ميكرولتر من المعلق لكل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا22.
- أضف حجما مناسبا من LPS أو وسط الاستزراع للحصول على التركيزات النهائية التالية: 0 بيكوغرام / مل (تحكم) ، 10 بيكوغرام / مل ، 50 بيكوغرام / مل ، 100 بيكوغرام / مل ، 1 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل ، في الحجم الكلي 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. اصنع ثلاث نسخ من كل تركيز LPS.
- استزراع الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. جمع طاف .
- أدر المادة الطافية عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق. نقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة. قم بقياس تركيز TNF 8,23 و IL-1023 في المواد الطافية المجمعة باستخدام مجموعة السيتوكين البشرية لمصفوفة الخرز الخلوي (CBA) ، وفقا لإجراء الشركة المصنعة ، باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشرط الأساسي أو الخطوة الإلزامية لهذا البروتوكول هي استبعاد التلوث المحتمل للسموم الداخلية من الكواشف. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة ، مثل FBS و DMEM و RPMI و PBS وحتى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، خالية من السموم الداخلية (<0.005 EU / mL). إن الحفاظ على نظام عدم التلوث بالذيفان الداخلي ليس بالأمر السهل ، على سبيل المثال ، يمكن أن يكون المصل العادي / القياسي لزراعة الخلايا مصدره الغني (0.364 EU / mL ؛ انظر الجدول 1).
على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره لعزل المركبات الكهربائية ذات المحتوى المنخفض من السموم الداخلية ، فمن المهم توصيف المركبات الكهربائية المعزولة. في هذه الدراسة ، تم عزل المركبات الكهربائية من خطين لخلايا سرطان القولون والمستقيم ، SW480 و SW620. تم تأكيد التعبير عن علامات EVs ، CD9 و Alix ، من خلال اللطخة الغربية (الشكل 1 أ). لم يكن هناك فرق في متوسط حجم المركبات الكهربائية المعزولة من خلايا SW480 و SW620 (134 نانومتر و 128.2 نانومتر ، على التوالي ؛ الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن هناك فروق في تركيز EVs المعزولة بين خطوط الخلايا هذه (الشكل 1C). يتم عرض التوزيعات النموذجية لحجم EV ، كما تم قياسها بواسطة NTA ، في الشكل 1D. تم تحسين وقت الطرد المركزي الفائق وفقا لنتائج Cvjetkovic et al.20. باختصار ، تم استخدام الصيغة الرياضية لتحويل معلمات تشغيل الطرد المركزي بين دوارين بزاوية ثابتة (70Ti و T-1270). كانت فعالية استنفاد المركبات الكهربائية الصغيرة عن طريق الدوران بدوار T-1270 لمدة 120 دقيقة عند 100000 × جم أقل بقليل من تلك التي تحققت باستخدام دوار 70Ti عند 118000 × جم لمدة 155 دقيقة ؛ ومع ذلك ، كان لا يزال في نطاق الحمض النووي الريبي الفعال وتكوير البروتين. تم تأكيد الحساب من خلال البيانات التجريبية (الجدول S1) ، حيث لم يكن للوقت الممتد للطرد المركزي (4 ساعات مقابل 2 ساعة) أي تأثير ذي مغزى على عدد المركبات الكهربائية المحببة أو التي لا تزال موجودة في المواد الطافية.
تم تقييم مستوى LPS الذي تسبب في استجابة وحيدة. لهذا الغرض ، تم استزراع الخلايا الوحيدة البشرية بتركيزات متتالية من LPS (0 بيكوغرام / مل ، 10 بيكوغرام / مل ، 50 بيكوغرام / مل ، 100 بيكوغرام / مل ، 1 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل). بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، تم تحديد مستوى IL-10 و TNF في طافات الثقافة. في هذه الدراسة ، كانت أقل جرعة من LPS تمكن من إفراز IL-10 و TNF في الخلايا الوحيدة 50 بيكوغرام / مل ، والتي تتوافق مع 0.5 EU / mL (الشكل 2).
أخيرا ، كانت الخطوة الأخيرة تتعلق باختبار مستوى LPS في المركبات الكهربائية المعزولة على النحو الوارد أعلاه. كان تلوث LPS لعينات EV حوالي 0.5 EU / mL (50 pg / mL; الشكل 3) لكلا خطي الخلايا (45.80 ± 20.39 بيكوغرام / مل و 48.75 ± 7.412 بيكوغرام / مل ل SW480 و SW620 ، على التوالي). هذا يعني أن 1 ميكرولتر من EVs (حوالي 109 EVs) يحتوي على أقل من 0.05 بيكوغرام من السموم الداخلية ، وعند إضافته إلى 100 ميكرولتر من تعليق الوحيدات (نسبة 104 EVs لكل خلية وحيدة) يتم تخفيفه 100 مرة (التركيز النهائي ل LPS حوالي 0.5 بيكوغرام / مل).
بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار نقاء المركبات الكهربائية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين 16S rRNA21 ، مما يؤكد عدم وجود تلوث بكتيري في المركبات الكهربائية المعزولة من خطوط خلايا SW480 و SW620 (الشكل التكميلي 1).
الشكل 1: توصيف المركبات الكهربائية المعزولة. (أ) تحليل اللطخة الغربية لعلامات البروتين للمركبات الكهربائية المعزولة من خطوط خلايا SW480 و SW620. (ب) تم استخدام NTA لقياس حجم المركبات الكهربائية المعزولة من خطوط الخلايا SW480 و SW620 (نانومتر). (C) تم استخدام NTA لقياس تركيز المركبات الكهربائية المعزولة من خطوط الخلايا SW480 و SW620 (EVs / mL). (د) التوزيعات النموذجية لحجم المركبات الكهربائية ، كما تم قياسها بواسطة NTA (تشير الأرقام الزرقاء إلى حجم الجسيمات عند نقطة معينة على المنحنى). وتعرض البيانات الواردة في B وC كمتوسط ± SD (n = 10)؛ تم استخدام اختبار t للتحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إفراز IL-10 و TNF بواسطة الخلايا الوحيدة المحفزة بجرعات مختلفة من LPS. تم تحديد إفراز السيتوكينات بواسطة الخلايا الوحيدة بعد التحفيز بجرعات LPS كما هو موضح: 10 بيكوغرام / مل ، 50 بيكوغرام / مل ، 100 بيكوغرام / مل ، 1 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل ، مقارنة بالخلايا الوحيدة الضابطة (MO). وتعرض البيانات كمتوسط ± SD (ن = 4)؛ تم استخدام اختبار مان ويتني يو. تم قياس تركيزات عامل نخر الورم و IL-10 في طافات الاستزراع بطريقة مصفوفة الخرز الخلوي (CBA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس مستوى LPS في عينات EV المعزولة عن طريق اختبار LAL الكروموجيني. محتوى LPS في عينات EV التي تم الحصول عليها من خطوط خلايا SW480 و SW620 (pg / mL). يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (ن = 6). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| S.No. | عينة | مستوى السموم الداخلية [الاتحاد الأوروبي / مل] | مستوى السموم الداخلية [بيكوغرام / مل] | ||
| 1 | دميم | <0.005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0.005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS منخفض للغاية من السموم الداخلية | <0.005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS سموم داخلية منخفضة للغاية بعد الطرد المركزي لمدة 4 ساعات (EE-FBS) | <0.005 | <0.5 | ||
| 5 | FBS العادية | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | برنامج تلفزيوني تمت تصفيته | <0.005 | <0.5 | ||
| 7 | تشكل الخلايا الطافية للثقافة SW480 بعد 2 ساعة من السنتريفيغ | <0.005 | <0.5 | ||
| 8 | طاف الثقافة من خلايا SW620 بعد الطرد المركزي 2 ساعة | <0.005 | <0.5 | ||
| 9 | التحكم في الغسيل (المياه المخزنة في أنابيب الطرد المركزي الفائقة) | <0.005 | <0.5 | ||
الجدول 1: مستوى LPS في مختلف الكواشف والعينات التي يحددها اختبار LAL الكروموجيني. يتم تقديم القياسات على أنها EU / mL و pg / mL. وشملت العينات DMEM و RPMI و EE-FBS و FBS و PBS المصفى والتحكم في الغسيل (الماء من أنابيب الطرد المركزي الفائقة).
الجدول التكميلي 1: أمثلة تمثيلية لقياسات تركيز المركبات الكهربائية (EVs / mL) والحجم (نانومتر) في الكريات والطافات بعد الطرد المركزي لمدة 2 ساعة أو 4 ساعات لطاف الثقافة من خطوط خلايا SW480 و SW620 و PBS. تم إجراء القياسات بواسطة NTA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 1: نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين الحمض النووي الريبي 16S لعموم بدائيات النوى في العينات التالية ، من اليسار: سلم الوزن الجزيئي (MW ، 100-1000 bp) ، التحكم السلبي NC ، EVs المشتقة من SW480 و SW620 ، و PC (الحمض النووي البكتيري للتحكم الإيجابي) الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في السنوات القليلة الماضية ، أصبحت طرق عزل المركبات الكهربائية المناسبة ذات أهمية متزايدة ، مما يتيح إجراء مزيد من التحليلات الموثوقة ، على سبيل المثال ، في سياق الحصول على بيانات أوميكس وبيانات وظيفية موثوقة24. بناء على الخبرة البحثية السابقة ، يبدو أنه ليس فقط نوع طريقة العزل ، ولكن أيضا الحالات الأخرى أثناء هذا الإجراء قد تكون مهمة. من المسلم به على نطاق واسع أن استخدام FBS المستنفدة للمركبات الكهربائية ضرورة25,26 ؛ ومع ذلك ، غالبا ما يتم إهمال مراقبة تلوث السموم الداخلية في المركبات الكهربائية.
ومع ذلك ، يجب أن تكون جميع الطرق المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية قد طورت معايير للتعامل المعقم الصارم ومراقبة الجودة في كل مرحلة من مراحل الإجراء. هذا مهم بشكل خاص بسبب تطبيق EVs الإضافي في المصب. البروتوكول المقترح هو نتيجة تجربة سابقة مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية ، مثل الخلايا الوحيدة والبلاعم ، والتي تكون حساسة للسموم الداخلية. CD14 ، علامة على الوحيدات ، قادر على ربط LPS بتركيزات بيكومولار. تشير النتائج التي تم الحصول عليها إلى أن الخلايا الوحيدة ، بعد التحفيز باستخدام 50 بيكوغرام / مل (0.5 وحدة حرارية أوروبية / مل) من LPS تفرز TNF و IL-10. ومع ذلك ، أفاد يانغ وآخرون أنه حتى 0.1 EU / mL (10 pg / mL) من الذيفان الداخلي قد يحفز تفاعلا قويا (تنظيم جين IL1B الالتهابي)27. علاوة على ذلك ، أظهر Chaiwut et al. أن الإنتاج داخل الخلايا ل TNF و IL-6 في الخلايا الوحيدة قد يكون ناتجا بتركيزات أقل من LPS ، 2.5 بيكوغرام / مل أو 5 بيكوغرام / مل ،على التوالي 23. أكد Alvarez et al. أن معدل تنشيط الخلية الوحيدة (القيمة المحسوبة) يرتفع بعد تركيز صغير من LPS ، مثل 5 pg / mL28. لذلك ، فإن الحد من تلوث السموم الداخلية في المركبات الكهربائية في كل مرحلة ممكنة من بروتوكول العزل أمر بالغ الأهمية لإجراء مزيد من التجارب مع الخلايا الحساسة ل LPS. حاليا ، يعد الطرد المركزي الفائق هو الطريقة الأكثر استخداما لعزل المركبات الكهربائية. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لا توجد دراسات حول تلوث LPS للمركبات الكهربائية المعزولة بهذه الطريقة. ومن ثم ، يركز البروتوكول أعلاه على الحصول على EVs منخفضة السموم الداخلية دون تلوث EVs خارجي من طافات الثقافة.
كما ذكر أعلاه ، قد يكون للتلوث الداخلي مصادر مختلفة. أولا ، يجب التأكيد على أن السموم الداخلية هي معارضة صعبة ، وليست كل طرق تعقيم الزجاج أو الأواني البلاستيكية فعالة في إزالته أو تدهوره. على سبيل المثال ، لا يمكن لإجراء التعقيم القياسي القضاء على LPS بسبب استقرار الحرارة العالية للذيفان الداخلي27. أيضا ، الغسيل ، حتى على نطاق واسع ، لا يمكن إزالة السموم الداخلية تماما. من خلال تطبيق المزيد من الطرق الخالية من الحرارة على الممارسة المختبرية ، مثل تعقيم البلازما أو ETO (أكسيد الإيثيلين)18,19 ، يمكن الحد من تلوث السموم الداخلية. بعد ذلك ، يعد الرصد الدائم ومنع التلوث المحتمل أمرا بالغ الأهمية. تشير النتائج المقدمة إلى أهمية استخدام كواشف السموم الداخلية المنخفضة للغاية ، مثل المصل ، لمكملات الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بشدة بالتحكم الروتيني في تلوث السموم الداخلية لجميع الكواشف (مثل PBS و DMEM و RPMI) وحتى الأواني البلاستيكية (مثل الأنابيب). من الضروري أيضا التحقق مسبقا من طافات الثقافة قبل عزل المركبات الكهربائية لمنع تراكم السموم الداخلية. كما هو موضح أعلاه ، فإن البديل المثير للاهتمام للقياس القياسي لمستويات السموم الداخلية بواسطة مقايسة LAL هو تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجين rRNA البكتيري 16s. يعد تحديد مستويات السموم الداخلية المتساهلة (التي لا تحفز تحفيز الخلايا الوحيدة) من LPS في المركبات الكهربائية أمرا بالغ الأهمية. النظر في ظروف الاستزراع (تركيز الخلايا الوحيدة والتلوث مع LPS من EVs المطبقة ، وتركيز EVs ؛ الشكل 3) ، التركيز النهائي للذيفان الداخلي الذي يؤثر على الخلايا الوحيدة المحفزة ب EVs لا يزيد عن 0.5 بيكوغرام / مل (عادة ما يتم تخفيف EVs 100-1000 مرة). هذه الجرعة أقل بخمس مرات من تلك التي افترضها Chaiwut et al. كأقل جرعة فعالة (2.5 بيكوغرام / مل) قادرة على تحفيز إنتاج TNF بواسطة الخلاياالوحيدة 23. في دراسة Chaiwut et al. ، تم تحديد إنتاج السيتوكين باستخدام قياس التدفق الخلوي وتقديمه على أنه تحول MFI (متوسط كثافة الفلورسنت) دون تحديد كمي. علاوة على ذلك ، تم إجراء تحفيز وحيدات بجرعات منخفضة جدا من LPS في وسط مكمل ب 10٪ FBS ، والذي قد يكون مصدرا إضافيا ل LPS23. قد يشير هذا إلى أن الجرعة الفعالة من LPS المستخدمة لتحفيز الوحيدات كانت أعلى. وبالتالي ، بالنظر إلى النتائج المقدمة وبيانات الأدبيات ، يبدو أن تركيز الذيفان الداخلي حتى 50 بيكوغرام / مل (0.5 EU / mL) في EVs متساهل ، وليس سبب تنشيط الخلايا الوحيدة. الخطوة التالية في تحسين هذا البروتوكول هي زيادة الحد من تلوث السموم الداخلية ، حتى إلى المستوى الذي لم يتم اكتشافه بواسطة LAL أو المقايسات القائمة على الخلايا. في الآونة الأخيرة ، يوصى بشدة بأهمية استخدام النماذج البيولوجية للكشف عن تلوث السموم الداخلية المقنعة ، والتي تسمى استعادة السموم الداخلية المنخفضة (LER) ،8.
وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مبتكر في هذا الصدد لأنه يجمع جميع الجوانب اللازمة لعزل المركبات الكهربائية بأقل محتوى ممكن من السموم الداخلية ، والتي لم يتم تناولها بعد في دراسات أخرى.
كما هو الحال مع كل طريقة ، يحتوي هذا البروتوكول على بعض القيود. أولا ، يقلل البروتوكول المقترح من تلوث السموم الداخلية ولكنه لا يقضي عليه. ثانيا ، من غير المعروف ما إذا كانت النقاء التي تحققت كافية للخلايا المناعية الأخرى. لذلك ، يجب تكييف كل بروتوكول لمزيد من التطبيق. سيسمح إنشاء مثل هذا البروتوكول بالحصول على نتائج تتوافق مع المكونات النشطة بيولوجيا للمركبات الكهربائية أكثر من تلوثها العرضي. أخيرا ، يكون الإجراء أكثر تكلفة من المعتاد بسبب الحاجة إلى شراء العديد من مجموعات اختبار السموم الداخلية ومصل السموم الداخلية المنخفض. كبديل واعد ، قدمت Bussolati طريقة جديدة ومتطورة لعزل المركبات الكهربائية عن طريق ترشيح التدفق العرضي. تسمح هذه الطريقة بالحصول على EVs ذات السمية الداخلية المنخفضة (0.1-0.7 EU / mL ؛ 10-70 pg / mL)29. حتى الآن ، لم يتم استخدام هذه الطريقة الجديدة بشكل شائع لعزل المركبات الكهربائية ، وتتطلب معدات متخصصة في شكل نظام ترشيح التدفق العرضي (TFF). في الآونة الأخيرة ، اقترح Gałuszka et al. طريقة مختلفة للقضاء على السموم الداخلية من ملوثات الهواء (الجسيمات بحجم EVs ولكن بدون بنية غشاء) باستخدام polymyxin B30. ومع ذلك ، يجب التحقق من فائدة هذا البروتوكول للحويصلات المشتقة من الخلايا من خلال النماذج البيولوجية ، خاصة عند التفكير في التجارب في الجسم الحي . تم وصف Polymixin B و deoxycholate الصوديوم (ينطبق أيضا على إزالة السموم الداخلية) سابقا على أنه سام عصبيوكلوي 31. الاحتمالات الأخرى هي أعمدة التقارب مع بولي (ε-ليسين) ، والتي تربط السموم الداخلية بشكل انتقائي. هذه الطريقة سريعة وفعالة ، ومع ذلك ، فهي مخصصة لعينات / حلول البروتين. لذلك ، فإن تطبيقه على هياكل معقدة مثل المركبات الكهربائية يحتاج إلى التحقق من الصحة32. علاوة على ذلك ، فإن هذه الأعمدة مخصصة للعينات ذات المستويات العالية من السموم الداخلية الأولية ، وفعاليتها في إزالة كميات صغيرة نسبيا من LPS غير معروفة وتتطلب التحقق. قد لا يزال التركيز النهائي المتوقع ل LPS بعد التنقية باستخدام الأعمدة المستنفدة ل LPS مرتفعا جدا لاختبارات الخلايا المناعية (على سبيل المثال ، <5 EU / mL).
باختصار ، اقترح هذا البروتوكول كيفية تجنب تلوث السموم الداخلية من خلال تطبيق عدة مبادئ على الممارسة المختبرية ، مثل تقنية التعقيم الصارمة خلال جميع خطوات عزل EVs ، باستخدام كواشف السموم الداخلية المنخفضة للغاية ، ومراقبة شوائب السموم الداخلية في جميع خطوات الإجراء ، وتغيير طريقة التعقيم. علاوة على ذلك ، يوفر البروتوكول المقدم تلميحات حول كيفية التحكم في مستويات السموم الداخلية في كل خطوة من خطوات إجراء العزل. يؤثر LPS الموجود في EVs على وظيفة الخلايا المناعية ، وبالتالي قد يتسبب في نتائج خاطئة في الفحوصات التي أجريت مع هذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن بناؤها كتضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا ، رقم المنحة 2019/33 / B / NZ5 / 00647. نود أن نشكر البروفيسور توماس جوسيفسكي وأغنيسكا كراوتشيك من قسم علم الأحياء الدقيقة الطبية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن في الكشف عن الحمض النووي البكتيري في المركبات الكهربائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
