Summary
O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são uma população heterogênea de vesículas de membrana liberadas por células in vitro e in vivo. Sua onipresença e seu significativo papel como portadores de informações biológicas os tornam objetos de estudo intrigantes, exigindo protocolos confiáveis e repetitivos para seu isolamento. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua pesquisa (como a aquisição adequada). Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento de pequenos EVs (de acordo com a nomenclatura MISEV 2018) a partir do sobrenadante de cultura de linhagens de células tumorais baseado em centrifugação diferencial. O protocolo inclui orientações sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs e como avaliá-los adequadamente. A contaminação por endotoxinas de EVs pode dificultar significativamente experimentos subsequentes ou mesmo mascarar seus verdadeiros efeitos biológicos. Por outro lado, a presença negligenciada de endotoxinas pode levar a conclusões incorretas. Isso é de particular importância quando se refere a células do sistema imunológico, incluindo monócitos, porque os monócitos constituem uma população especialmente sensível a resíduos de endotoxinas. Portanto, é altamente recomendável rastrear EVs para contaminação por endotoxinas, especialmente quando se trabalha com células sensíveis à endotoxina, como monócitos, macrófagos, células supressoras derivadas do mielóide ou células dendríticas.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a nomenclatura MISEV 2018, são um termo coletivo que descreve vários subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempenham papéis cruciais em inúmeros processos fisiológicos e patológicos 1,2. Além disso, os EVs mostram-se promissores como novos biomarcadores para várias doenças, bem como agentes terapêuticos e veículos de liberação de medicamentos. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua aquisição3. Um desses desafios é o isolamento de EVs livres de endotoxinas, que tem sido negligenciado em muitos casos. Uma das endotoxinas mais comuns é o lipopolissacarídeo (LPS), que é um dos principais componentes da parede celular de bactérias gram-negativas e pode causar uma resposta inflamatória aguda, devido à liberação de um grande número de citocinas inflamatórias por várias células 4,5. O LPS induz uma resposta por ligação à proteína ligadora do LPS, seguida de interação com o complexo CD14/TLR4/MD2 em células mieloides. Essa interação leva à ativação das vias de sinalização dependentes de MyD88 e TRIF, que por sua vez desencadeiam o fator nuclear kappa B (NFkB). A translocação do NFkB para o núcleo inicia a produção de citocinas6. Monócitos e macrófagos são altamente sensíveis ao LPS, e sua exposição ao LPS resulta em uma liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. A estrutura CD14 permite a ligação de diferentes espécies de LPS com afinidade semelhante e serve como co-receptor para outros receptores toll-like (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. O número de estudos sendo conduzidos sobre os efeitos dos EVs em monócitos/macrófagos ainda está aumentando 9,10,11. Especialmente do ponto de vista do estudo das funções dos monócitos, suas subpopulações e outras células imunes, a presença de endotoxina e mesmo sua presença mascarada em EVs é de grande importância12. A contaminação negligenciada de EVs com endotoxinas pode levar a conclusões enganosas e ocultar sua verdadeira atividade biológica. Em outras palavras, trabalhar com células monocíticas requer confiança na ausência de contaminação por endotoxinas13. Fontes potenciais de endotoxinas podem ser água, meios e soros obtidos comercialmente, componentes e aditivos de meios, vidraria de laboratório e plasticware 5,14,15.
Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo para o isolamento de EVs com baixo teor de endotoxinas. O protocolo fornece dicas simples sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs em vez de remover endotoxinas de EVs. Anteriormente, muitos protocolos foram apresentados sobre como remover endotoxinas de, por exemplo, nanopartículas projetadas usadas em nanomedicina; no entanto, nenhum deles é útil para estruturas biológicas como EVs. A despirogenação efetiva das nanopartículas pode ser realizada por enxágue com etanol ou ácido acético, aquecimento a 175 °C por 3 h, irradiação γ ou tratamento com triton X-100; entretanto, esses procedimentos levam à destruição dos EVs16,17.
O protocolo apresentado é um estudo pioneiro focado em evitar impurezas de endotoxinas em EVs, ao contrário de estudos anteriores sobre o efeito de EVs em monócitos9. A aplicação dos princípios propostos à prática laboratorial pode auxiliar na obtenção de resultados confiáveis de pesquisa, o que pode ser crucial quando se considera o potencial uso dos EVs como agentes terapêuticos na clínica12.
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Protocol
1. Preparação de tubos de ultracentrífuga
- Use tubos estéreis de uso único. Se isso não for possível, reutilize os tubos ultracentrífugos depois de lavá-los com detergente usando uma pipeta Pasteur estéril ou outros aplicadores de uso único. Lembre-se que os tubos de ultracentrífuga devem ser dedicados a um tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultura celular/soro/plasma) e espécie (humano/camundongo/etc.).
- Após uma lavagem com detergente, enxágue os tubos ultracentrífugos com água deionizada e livre de LPS 3x.
NOTA: Não utilize água de baixa qualidade. - Seque os tubos de ultracentrífuga e depois preencha-os com etanol 70%. Deixe os tubos com etanol 70% para desinfecção durante a noite. Retire o etanol e seque os tubos novamente.
- Coloque os tubos e tampas em embalagens de esterilização e feche-os bem. Utilizar o método de esterilização por plasma ou gás (óxido de etileno)18,19. Conservar os tubos de ultracentrífuga incluídos na embalagem de esterilização em local seco e utilizá-los antes do prazo de validade.
OBS: Realizar monitoramento mensal do nível de LPS em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e da água utilizada para isolamento de EVs. O monitoramento também deve incluir os tubos (por exemplo, testando a água [controle de lavagem] que foi armazenada nos tubos ultracentrífugos durante a noite à temperatura ambiente [RT]).
2. Preparação de soro fetal bovino de baixa endotoxina com baixa endotoxina EV (EE-FBS)
- Certifique-se de usar FBS de endotoxina ultrabaixa (comercialmente disponível; ver Tabela de Materiais; <0,1 EU/mL).
- Coloque um frasco de ultra-baixo endotoxina FBS em banho-maria e incube a 56 °C por 30 min. Esta etapa é necessária para desativar o sistema complemento.
- Pipetar o FBS inativado para tubos de ultracentrifugação e centrifugar a 100.000 x g por 4 h a 4 °C. Recolher o sobrenadante em tubos estéreis de 50 ml, garantindo que não exceda 45 ml por tubo para evitar a contaminação da tampa e molhar o anel do tubo.
- Conservar o soro EE-FBS preparado desta forma a -20 °C. Verificar a concentração de LPS em EE-FBS (etapa 6). A concentração de LPS deve estar no mesmo nível de antes da ultracentrifugação.
3. Cultura celular
- Para este estudo, as culturas SW480 e SW620 em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e gentamicina (50 μL/mL) foram suplementadas com EE-FBS a 10% em frascos de cultura de 75cm2 usando técnica asséptica. Semeando cerca de 4,5 x 10 6 células e6,5 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente.
- Coletar os sobrenadantes duas vezes por semana (~10 mL por frasco) quando as células atingirem confluência total (~13,5 x 10 6 e 20 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente) e dividir. Assegurar que a viabilidade das células não seja inferior a 99% e que as células sejam cultivadas a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2.
- Coletar sobrenadantes da cultura celular em tubos de 15 mL adequadamente marcados. Centrifugar os sobrenadantes coletados a 500 x g por 5 min no RT para remover restos celulares.
- Recolher cuidadosamente os sobrenadantes, evitar aspirar detritos, colocar em tubos marcados e centrifugar novamente a 3.200 x g durante 12 minutos a 4 °C.
- Coletar sobrenadantes da segunda etapa de centrifugação em tubos estéreis marcados com 50 mL. Evite molhar as bordas dos tubos. Certifique-se de que o volume de sobrenadante não exceda 45 mL e que os tubos sejam mantidos verticalmente.
- Embrulhe a tampa do tubo com uma película transparente estéril e guarde os sobrenadantes na posição vertical a -80 °C.
OBS: Realizar controle mensal de Mycoplasma spp. e contaminação por LPS em sobrenadantes de culturas frescas (etapa 6). Se o nível de endotoxina nos sobrenadantes exceder 0,05 EU/mL, verifique em que estágio a contaminação pode ter ocorrido e reinicie o processo desde o início. Se contaminação da cultura celular por Mycoplasma spp. é detectado, o isolamento dos EVs de tais sobrenadantes deve ser descontinuado.
4. Isolamento de EVs a partir de sobrenadantes de cultura celular
- Preparar filtros de seringas de 0,22 μm e seringas de volume adequado. Preparar dois tubos com sobrenadantes de cultura (90 mL).
- Encha a seringa com o sobrenadante e prenda o filtro ao adaptador da agulha. Coloque a seringa cheia com o filtro sobre um tubo de 50 ml. Empurre o êmbolo flange e colete ~90 mL de filtrado.
- Pipetar o filtrado (7 mL) para os tubos de ultracentrífuga (garantindo que o mesmo volume seja pipetado para cada tubo para equilíbrio adequado) e centrifugar a 100.000 x g por 2 h a 4 °C.
NOTA: A eficiência da peletização de EVs depende de muitos fatores (por exemplo, tipo de rotor, seu fator k, comprimento do caminho de migração, viscosidade do meio, etc.), que precisam ser otimizados para uma melhor recuperação de EVs20. - Descarte o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril. Colete os pellets restantes usando pontas de pipeta longas e filtradas e junte-os em dois tubos de ultracentrífuga. Preenchê-los até 7 mL com PBS livre de endotoxinas filtradas para enxaguar os EVs.
- Centrifugar os pellets ressuspensos de PBS a 100.000 x g por 2 h a 4 °C. Remova completamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril e adicione 200 μL de PBS filtrado e livre de endotoxinas a ambos os tubos para ressuspender os EVs. Pipetar suavemente a pelota de EVs para coletar todos os EVs.
- Transfira a suspensão de EVs para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mL (se possível, use um tubo de baixa ligação de proteínas). Reter 10 μL da suspensão de EV para preparar uma diluição para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e para outros fins (por exemplo, medição da concentração de proteínas).
- Diluir os EVs com PBS filtrado (1:1.000) para medições por NTA, de acordo com as instruções do fabricante. Fixe os tubos EV envolvendo a tampa com uma película transparente estéril. Conservar os veículos elétricos a -80 °C.
5. Detecção de marcadores específicos por western blotting
- Determinar o nível de proteína nas amostras (por exemplo, pelo ensaio de Bradford) e preparar as amostras (20 μg) com tampão de carga. Preparar o tampão de carga misturando 5 μL de tampão de amostra (4x) e 2 μL de agente redutor de amostra (10x) para um volume total de 20 μL. Incubar as amostras a 70 °C durante 10 min.
- Prepare géis de poliacrilamida com SDS (10%-14%) e carregue os 20 μg de EVs em cada poço.
- Executar a eletroforese com tampão de corrida (30 g de Tris, 144 g de glicina, 10% SDS por 1 L) por 45 min a 150 V.
- Realizar a transferência semi-seca de proteínas do gel para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) em uma máquina de transferência com tampão Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glicina, 10% de metanol por 0,5 L) a 25 V por 1 h.
- Colocar a membrana em tampão TBST (1 mL de Tween, 100 mL de solução salina tamponada com Tris (TBS 10x) por 1 L) para bloqueio com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em tampão TBST e incubar por 1 h no balancim em TR.
- Adicionar anticorpos diluídos (1:1.000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) ou anti-Alix 1 (clone#3A9), em BSA a1% e incubar com a membrana durante a noite a 4 °C no balancim. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.
- Adicionar o anticorpo secundário de cabra anticoelho ou cabra anti-rato (diluição: 1:2.000) conjugado com peroxidase de raiz forte, dependendo do anticorpo primário na membrana, e incubar por 1 h no balancim em RT. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.
- Misturar o substrato e o luminol na proporção de 1:1 para obter 1 mL de solução. Despeje a solução sobre a membrana. Coloque a membrana imediatamente na câmara de medição do sistema de imagem, escolha o módulo de quimioluminescência e visualize as bandas de proteínas na tela.
6. Medição do nível de endotoxina pelo teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
- Realizar a dosagem cromogênica do LAL do nível de endotoxina, de acordo com a recomendação do fabricante. Resumidamente, utilizar o método baseado na interação da endotoxina com o lisado de amebócito de límulo (LAL). O limite de detecção deste método é de 0,005 EU/mL.
NOTA: O ensaio LAL, apesar de suas limitações, continua sendo atualmente o método padrão para detectar e quantificar a contaminação por endotoxinas em diferentes tipos de soluções e outros produtos utilizados na ciência ou na medicina8. O fator limitante deste kit é a estabilidade da solução de lisado de amebócito reconstituída, que é estável por apenas 1 semana a -20 °C se congelada imediatamente após a reconstituição. - Use uma diluição dez vezes maior de EVs e outras amostras e uma diluição de 50 vezes de soro. Para experimentos posteriores, use apenas reagentes de baixa endotoxina, como EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) e sobrenadantes de cultura livres de LPS.
7. Detecção do gene procariótico 16S rRNA em amostras de EV
- Isolar o DNA das amostras de EV. Procure manter assépticos os reagentes e o local de isolamento. Medir a concentração e a qualidade do DNA (por exemplo, usando um espectrofotômetro).
- Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR), conforme descrito anteriormente21. Preparar gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio ou verde SYBR para visualizar os produtos de PCR em luz ultravioleta (UV).
- Executar a eletroforese da amostra e do marcador de peso com tampão TRIS-acetato-EDTA a 75 V por 45 min. Visualize bandas de DNA usando o sistema de imagem.
8. Determinação da concentração efetiva de LPS para estimulação em modelo de monócitos humanos
- Preparar 2 x 106 monócitos/mL de suspensão de monócitos em RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, glicose e EE-FBS a 2%. Adicionar 50 μL da suspensão por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96poços 22.
- Adicionar um volume adequado de LPS ou meio de cultura para obter as seguintes concentrações finais: 0 pg/mL (controle), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL, em 100 μL de volume total de suspensão celular. Faça triplicatas de cada concentração de LPS.
- Cultivar as células por 18 h a 37 °C, 5% CO2. Colete o sobrenadante.
- Gire o sobrenadante a 2.000 x g por 5 min. Transfira os sobrenadantes para novos tubos. Medir as concentrações de TNF8,23 e IL-1023 no sobrenadante coletado com o kit de citocinas humanas cytometric beads array (CBA), de acordo com o procedimento do fabricante, com citômetro de fluxo.
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Representative Results
Um pré-requisito ou etapa obrigatória para este protocolo é a exclusão de possível contaminação por endotoxinas de reagentes. Todos os reagentes utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e até mesmo tubos de ultracentrífuga, devem ser isentos de endotoxinas (<0,005 EU/mL). Manter o regime de ausência de contaminação por endotoxinas não é fácil, pois, por exemplo, o soro regular/padrão para cultura celular pode ser sua rica fonte (0,364 EU/mL; ver Tabela 1).
Embora este protocolo tenha sido desenvolvido para isolar EVs com baixo conteúdo de endotoxinas, é importante caracterizar as EVs isoladas. Neste estudo, os EVs foram isolados de duas linhagens celulares de câncer colorretal, SW480 e SW620. A expressão dos marcadores EVs, CD9 e Alix, foi confirmada por western blot (Figura 1A). Não houve diferença no tamanho médio dos EVs isolados das células SW480 e SW620 (134 nm e 128,2 nm, respectivamente; Figura 1B). Além disso, não houve diferenças na concentração de EVs isolados entre essas linhagens celulares (Figura 1C). As distribuições exemplares do tamanho do VE, medidas pela NTA, são apresentadas na Figura 1D. O tempo de ultracentrifugação foi otimizado de acordo com os resultados de Cvjetkovic et al.20. Resumidamente, foi utilizada a fórmula matemática para a conversão dos parâmetros centrífugos de corrida entre dois rotores de ângulo fixo (70Ti e T-1270). A eficácia da depleção de pequenos EVs girando com um rotor T-1270 por 120 min a 100.000 x g foi ligeiramente menor do que a alcançada usando um rotor de 70Ti a 118.000 x g por 155 min; no entanto, ainda estava na faixa de peletização efetiva de RNA e proteínas. O cálculo foi confirmado por dados experimentais (Tabela S1), onde o tempo prolongado de centrifugação (4 h vs. 2 h) não teve impacto significativo no número de EVs peletizados ou ainda presentes no sobrenadante.
O nível de LPS que causou uma resposta de monócitos foi avaliado. Para isso, monócitos humanos foram cultivados com concentrações sucessivas de LPS (0 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL). Após cultura noturna, o nível de IL-10 e TNF foi determinado nos sobrenadantes da cultura. Neste estudo, a menor dose de LPS que permitiu a secreção de IL-10 e TNF nos monócitos foi de 50 pg/mL, o que correspondeu a 0,5 EU/mL (Figura 2).
Finalmente, a última etapa foi relacionada ao teste do nível de LPS nos EVs isolados como acima. A contaminação por LPS das amostras de EV foi em torno de 0,5 EU/mL (50 pg/mL; Gráfico 3) para ambas as linhagens celulares (45,80 ± 20,39 pg/mL e 48,75 ± 7,412 pg/mL para SW480 e SW620, respectivamente). Isso significa que 1 μL de EVs (cerca de 10 a9 EVs) contém menos de 0,05 pg de endotoxina, e quando adicionado a 100 μL de suspensão de monócitos (proporção de 10a 4 EVs por monócito) é diluído 100 vezes (a concentração final de LPS é de cerca de 0,5 pg/mL).
Adicionalmente, a pureza dos EVs foi testada por PCR para o gene 16S rRNA21, o que confirma a ausência de contaminação bacteriana em EVs isolados das linhagens SW480 e SW620 (Figura 1 Suplementar).
Figura 1: Caracterização dos EVs isolados. (A) Análise por Western blot dos marcadores proteicos dos EVs isolados das linhagens SW480 e SW620. (B) NTA foi usado para medir o tamanho de EVs isolados de linhagens celulares SW480 e SW620 (nm). (C) NTA foi usado para medir a concentração de EVs isolados de linhagens celulares SW480 e SW620 (EVs/mL). (D) Distribuições exemplares do tamanho dos EVs, medido por NTA (números azuis indicam o tamanho da partícula em um determinado ponto da curva). Os dados em B e C são apresentados como média ± DP (n = 10); Para análise estatística foi utilizado o teste t. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Secreção de IL-10 e TNF por monócitos estimulados com diferentes doses de LPS. A secreção de citocinas pelos monócitos foi determinada após estimulação com doses de LPS indicadas: 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL, em comparação com monócitos controle (MO). Os dados são apresentados como média ± DP (n = 4); O teste U de Mann-Whitney foi utilizado. As concentrações de TNF e IL-10 foram medidas no sobrenadante da cultura pelo método cytometric beads array (CBA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição do nível de LPS em amostras isoladas de EV pelo teste de LAL cromogênico. Teor de LPS em amostras de EV obtidas de linhagens celulares SW480 e SW620 (pg/mL). Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| S.No. | amostra | nível de endotoxina [EU/mL] | nível de endotoxina [pg/mL] | ||
| 1 | DMEM | <0,005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS ultra baixa endotoxina | <0,005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS ultra baixa endotoxina após centrifugação de 4 h (EE-FBS) | <0,005 | <0.5 | ||
| 5 | FBS regular | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | PBS filtrado | <0,005 | <0.5 | ||
| 7 | sobrenadante de cultura forma células SW480 após centrifigação de 2 h | <0,005 | <0.5 | ||
| 8 | sobrenadante de cultura de células SW620 após centrifugação de 2 h | <0,005 | <0.5 | ||
| 9 | Controle de lavagem (água armazenada em tubos ultracentrífugos) | <0,005 | <0.5 | ||
Tabela 1: Nível de LPS em vários reagentes e amostras determinado pelo teste de LAL cromogênico. As medidas são apresentadas como EU/mL e pg/mL. As amostras incluíram DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, PBS FILTRADO E CONTROLE DE LAVAGEM (ÁGUA DE TUBOS DE ULTRACENTRIFUGAÇÃO).
Quadro Complementar 1: Exemplos representativos de medidas de concentração (EVs/mL) e tamanho (nm) de EVs em pellets e sobrenadantes após centrifugação de 2 h ou 4 h de sobrenadantes de cultura de linhagens celulares SW480 e SW620 e PBS. As medidas foram realizadas por NTA. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 1: Resultados da PCR da amplificação do gene 16S rRNA pan-procariota nas seguintes amostras, a partir da esquerda: escada de peso molecular (MW, 100-1000 pb), controle NC-negativo, EVs derivados de SW480 e SW620, e PC (controle positivo-DNA bacteriano) Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Nos últimos anos, métodos para o isolamento adequado dos EVs têm se tornado cada vez mais importantes, possibilitando suas análises mais confiáveis, por exemplo, no contexto da obtenção de dados ômicos e funcionais confiáveis24. Com base na experiência de pesquisa prévia, parece que não só o tipo de método de isolamento, mas também outras condições durante este procedimento podem ser importantes. O uso de SFB com DEPLEÇÃO de EV é amplamente reconhecido como uma necessidade25,26; no entanto, o monitoramento da contaminação por endotoxinas em EVs é frequentemente negligenciado.
No entanto, todos os métodos utilizados para o isolamento de veículos elétricos devem ter desenvolvido padrões para o manuseio asséptico rigoroso e controle de qualidade em todas as etapas do procedimento. Isso é particularmente significativo devido à maior aplicação a jusante dos veículos elétricos. O protocolo proposto é resultado da experiência prévia com células sensíveis à endotoxina, como monócitos e macrófagos, que são sensíveis à endotoxina. CD14, um marcador de monócitos, é capaz de se ligar ao LPS em concentrações picomolares. Os resultados obtidos indicam que os monócitos, após estimulação com 50 pg/mL (0,5 EU/mL) de LPS, secretam TNF e IL-10. Yang e col., entretanto, relataram que mesmo 0,1 EU/mL (10 pg/mL) de endotoxina poderia induzir uma potente reação (upregulation do gene inflamatório IL1B )27. Além disso, Chaiwut e col. demonstraram que a produção intracelular de TNF e IL-6 em monócitos pode ser induzida por concentrações ainda menores de LPS, 2,5 pg/mL ou 5 pg/mL, respectivamente23. confirmaram que a taxa de ativação dos monócitos (valor calculado) aumenta após uma pequena concentração de LPS, como 5 pg/mL28. Portanto, limitar a contaminação por endotoxinas em EVs em todos os estágios possíveis do protocolo de isolamento é crucial para futuros experimentos conduzidos com células sensíveis ao LPS. Atualmente, a ultracentrifugação é o método mais utilizado para o isolamento de VE. No entanto, até onde sabemos, não há estudos sobre a contaminação por LPS de EVs isolados por esse método. Assim, o protocolo acima se concentra na obtenção de EVs de baixa endotoxina sem contaminação externa de EVs a partir do sobrenadante da cultura.
Como mencionado acima, a contaminação por endotoxinas pode ter várias fontes. Primeiramente, deve-se ressaltar que a endotoxina é um oponente resistente e nem todos os métodos de esterilização de vidros ou plásticos são eficazes em sua remoção ou degradação. Por exemplo, o procedimento padrão de autoclavagem não pode eliminar o LPS devido à alta estabilidade térmica da endotoxina27. Além disso, a lavagem, mesmo extensiva, não pode remover a endotoxina completamente. Com a aplicação de métodos mais depirogênicos à prática laboratorial, como a esterilização por plasma ou ETO (óxido de etileno)18,19, a contaminação por endotoxinas pode ser limitada. Em seguida, o monitoramento permanente e a prevenção de possíveis contaminações são cruciais. Os resultados apresentados indicam a importância do uso de reagentes ultrabaixos de endotoxina, como o soro, para a suplementação da cultura. Além disso, o controle rotineiro da contaminação por endotoxinas de todos os reagentes (como PBS, DMEM e RPMI) e até mesmo de produtos plásticos (por exemplo, tubos) é altamente recomendado. Também é necessário pré-verificar os sobrenadantes da cultura antes do isolamento dos EVs para evitar o acúmulo de endotoxinas. Como apresentado acima, uma alternativa interessante para a medida padrão dos níveis de endotoxinas pelo ensaio LAL é a amplificação por PCR do gene 16s rRNA bacteriano. A determinação dos níveis permissivos (que não induzem estimulação de monócitos) de LPS em EVs é crucial. Considerando as condições de cultura (concentração de monócitos e contaminação com LPS dos EVs aplicados, a concentração de EVs; Figura 3), a concentração final de endotoxina que afeta monócitos estimulados com EVs não é superior a 0,5 pg/mL (EVs são geralmente diluídas 100-1.000 vezes). Essa dose é cinco vezes menor do que a postulada por Chaiwut e col. como a dose menos efetiva (2,5 pg/mL) capaz de induzir a produção de TNF pelos monócitos23. No estudo de Chaiwut et al., a produção de citocinas foi determinada por citometria de fluxo e apresentada como um desvio de MFI (intensidade fluorescente média) sem quantificação. Além disso, a estimulação de monócitos com doses muito baixas de LPS foi realizada em meio suplementado com SFB a 10%, o que pode ser uma fonte adicional de LPS23. Isso pode sugerir que a dose efetiva de LPS usada para estimulação de monócitos foi maior. Assim, considerando os resultados apresentados e dados da literatura, parece que a concentração de endotoxina até 50 pg/mL (0,5 EU/mL) em EVs é permissiva, não sendo a causa da ativação dos monócitos. O próximo passo na otimização deste protocolo é reduzir ainda mais a contaminação por endotoxinas, mesmo a um nível não detectado por LAL ou ensaios baseados em células. Recentemente, a importância do uso de modelos biológicos para detectar contaminação mascarada por endotoxinas, denominada baixa recuperação de endotoxinas (LER), é fortementerecomendada8.
Assim, este protocolo é inovador nesse aspecto, pois reúne todos os aspectos necessários para o isolamento de EVs com o menor conteúdo possível de endotoxinas, o que ainda não foi abordado em outros estudos.
Assim como cada método, esse protocolo apresenta algumas limitações. Primeiro, o protocolo proposto reduz a contaminação por endotoxinas, mas não a elimina. Em segundo lugar, não se sabe se a pureza alcançada é suficiente para outras células imunológicas. Portanto, cada protocolo deve ser adaptado para posterior aplicação. O estabelecimento de tal protocolo permitirá a obtenção de resultados que corresponderão mais aos componentes biologicamente ativos dos EVs do que à sua contaminação acidental. Finalmente, o procedimento é mais caro do que o habitual devido à necessidade de adquirir vários kits de teste de endotoxina e soro de baixa endotoxina. Como uma alternativa promissora, Bussolati apresentou um novo e sofisticado método para isolamento de EVs por filtração tangencial em fluxo. Esse método permite a aquisição de EVs com baixa endotoxicidade (0,1-0,7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29. Até agora, este novo método não tem sido comumente usado para isolamento de EVs, e requer equipamentos especializados na forma de um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF). Recentemente, Gałuszka e colaboradores propuseram uma maneira diferente de eliminar a endotoxina dos poluentes atmosféricos (material particulado com o tamanho de EVs, mas sem estrutura de membrana) usando polimixina B30. No entanto, a utilidade deste protocolo para vesículas derivadas de células precisa ser verificada através de modelos biológicos, especialmente quando se pensa em experimentos in vivo . A polimixina B e o desoxicolato de sódio (também aplicáveis à remoção de endotoxinas) foram previamente descritos como neurotóxicos e nefrotóxicos31. Outras possibilidades são colunas de afinidade com poli(ε-lisina), que se ligam seletivamente às endotoxinas. Este método é rápido e eficiente, no entanto, dedicado a amostras/soluções proteicas; portanto, aplicá-lo a estruturas tão complicadas como os EVs precisa de validação32. Além disso, essas colunas são destinadas a amostras com altos níveis iniciais de endotoxina, e sua eficácia na remoção de quantidades relativamente pequenas de LPS é desconhecida e requer verificação. A concentração final prevista de LPS após purificação com colunas de empobrecimento de LPS pode ainda ser demasiado elevada para testes de células imunitárias (por exemplo, <5 EU/ml).
Em resumo, este protocolo propôs como evitar a contaminação por endotoxinas aplicando vários princípios à prática laboratorial, tais como técnica asséptica rigorosa durante todas as etapas do isolamento dos EVs, uso de reagentes de endotoxina ultra-baixa, monitoramento das impurezas da endotoxina em todas as etapas do procedimento e mudança do método de esterilização. Além disso, o protocolo apresentado fornece dicas sobre como controlar os níveis de endotoxinas em cada etapa do procedimento de isolamento. O LPS presente nos EVs afeta a função das células imunes e, portanto, pode causar resultados falsos em ensaios realizados com essas células.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser construídas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia, número de bolsa 2019/33/B/NZ5/00647. Gostaríamos de agradecer ao Professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk do Departamento de Microbiologia Médica Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica por sua inestimável ajuda na detecção de DNA bacteriano em EVs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
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