Summary
Det föreslagna protokollet innehåller riktlinjer för hur man undviker kontaminering med endotoxin under isolering av extracellulära vesiklar från cellodlingssupernatanter och hur man korrekt utvärderar dem.
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) är en heterogen population av membranvesiklar som frigörs av celler in vitro och in vivo. Deras allestädes närvaro och betydande roll som bärare av biologisk information gör dem spännande studieobjekt, vilket kräver tillförlitliga och repetitiva protokoll för deras isolering. Att förverkliga sin fulla potential är dock svårt eftersom det fortfarande finns många tekniska hinder relaterade till deras forskning (som korrekt förvärv). Denna studie presenterar ett protokoll för isolering av små EV (enligt MISEV 2018-nomenklaturen) från odlingssupernatanten av tumörcellinjer baserat på differentiell centrifugering. Protokollet innehåller riktlinjer för hur man undviker kontaminering med endotoxiner under isolering av elfordon och hur man korrekt utvärderar dem. Endotoxinkontaminering av elfordon kan avsevärt hindra efterföljande experiment eller till och med maskera deras verkliga biologiska effekter. Å andra sidan kan den förbisedda närvaron av endotoxiner leda till felaktiga slutsatser. Detta är särskilt viktigt när man hänvisar till celler i immunsystemet, inklusive monocyter, eftersom monocyter utgör en population som är särskilt känslig för endotoxinrester. Därför rekommenderas det starkt att screena EV för endotoxinkontaminering, särskilt när man arbetar med endotoxinkänsliga celler såsom monocyter, makrofager, myeloid-härledda suppressorceller eller dendritiska celler.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV), enligt MISEV 2018-nomenklaturen, är en kollektiv term som beskriver olika subtyper av cellutsöndrade membranösa vesiklar som spelar avgörande roller i många fysiologiska och patologiska processer 1,2. Dessutom visar elbilar lovande som nya biomarkörer för olika sjukdomar, liksom terapeutiska medel och läkemedelsleveransfordon. Att förverkliga sin fulla potential är dock svårt eftersom det fortfarande finns många tekniska hinder relaterade till deras förvärv3. En sådan utmaning är isoleringen av endotoxinfria elfordon, som i många fall har försummats. Ett av de vanligaste endotoxinerna är lipopolysackarid (LPS), som är en viktig komponent i gramnegativa bakteriecellväggar och kan orsaka ett akut inflammatoriskt svar på grund av frisättningen av ett stort antal inflammatoriska cytokiner av olika celler 4,5. LPS inducerar ett svar genom att binda till LPS-bindande protein, följt av interaktion med CD14 / TLR4 / MD2-komplexet på myeloida celler. Denna interaktion leder till aktivering av MyD88- och TRIF-beroende signalvägar, vilket i sin tur utlöser kärnfaktorn kappa B (NFkB). Translokation av NFkB till kärnan initierar produktionen av cytokiner6. Monocyter och makrofager är mycket känsliga för LPS, och deras exponering för LPS resulterar i frisättning av inflammatoriska cytokiner och kemokiner (t.ex. IL-6, IL-12, CXCL8 och TNF-α)7,8. CD14-strukturen möjliggör bindning av olika LPS-arter med liknande affinitet och fungerar som en co-receptor för andra tollliknande receptorer (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 och 9)6. Antalet studier som genomförs om effekterna av EV på monocyter / makrofager ökar fortfarande 9,10,11. Speciellt ur perspektivet att studera monocyternas funktioner, deras subpopulationer och andra immunceller är närvaron av endotoxin och till och med deras maskerade närvaro i EV av stor betydelse12. Den förbisedda kontamineringen av elfordon med endotoxiner kan leda till vilseledande slutsatser och dölja deras verkliga biologiska aktivitet. Med andra ord kräver arbete med monocytiska celler förtroende för frånvaro av endotoxinförorening13. Potentiella källor till endotoxiner kan vara vatten, kommersiellt erhållna medier och serum, mediekomponenter och tillsatser, laboratorieglas och plastvaror 5,14,15.
Därför syftade denna studie till att utveckla ett protokoll för isolering av låga endotoxinhaltiga EV. Protokollet ger enkla tips om hur man undviker endotoxinkontaminering under isolering av elbilar istället för att ta bort endotoxiner från elbilar. Tidigare har många protokoll presenterats om hur man tar bort endotoxiner från till exempel konstruerade nanopartiklar som används inom nanomedicin; Ingen av dem är dock användbara för biologiska strukturer som EV. Den effektiva depyrogeneringen av nanopartiklar kan utföras genom sköljning av etanol eller ättiksyra, uppvärmning vid 175 °C i 3 timmar, γ bestrålning eller triton X-100-behandling. Dessa förfaranden leder dock till förstörelse av elfordon16,17.
Det presenterade protokollet är en banbrytande studie som fokuserar på att undvika endotoxinföroreningar i elbilar, till skillnad från tidigare studier om effekten av elbilar på monocyter9. Att tillämpa föreslagna principer på laboratoriepraxis kan bidra till att få tillförlitliga forskningsresultat, vilket kan vara avgörande när man överväger den potentiella användningen av EV som terapeutiska medel i kliniken12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av ultracentrifugrör
- Använd sterila engångsrör. Om detta inte är möjligt, återanvänd ultracentrifugrören efter att ha tvättat dem med ett tvättmedel med en steril Pasteur-pipett eller andra engångsapplikatorer. Kom ihåg att ultracentrifugrör bör vara avsedda för en typ av centrifugerat material (cellodlingssupernatant / serum / plasma) och art (människa / mus / etc.).
- Efter tvättmedel, skölj ultracentrifugrören med avjoniserat, LPS-fritt vatten 3x.
OBS: Använd inte vatten av låg kvalitet. - Torka ultracentrifugrören och fyll dem sedan med 70% etanol. Lämna rören med 70% etanol för desinfektion över natten. Ta bort etanolen och torka rören igen.
- Placera rören och locken i steriliseringsförpackningar och stäng dem tätt. Använd steriliseringsmetoden för plasma eller gas (etylenoxid)18,19. Förvara ultracentrifugrören som är inneslutna i steriliseringsförpackningen på en torr plats och använd dem före utgångsdatumet.
OBS: Utför månatlig övervakning av LPS-nivån i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och vattnet som används för EV-isolering. Övervakningen bör även omfatta rören (t.ex. genom att testa vattnet [tvättkontroll] som har lagrats i ultracentrifugrören över natten vid rumstemperatur [RT]).
2. Beredning av EV-utarmat lågendotoxin fetalt bovint serum (EE-FBS)
- Se till att använda ultralågt endotoxin FBS (kommersiellt tillgängligt; se materialförteckning; <0.1 EU / ml).
- Placera en flaska med ultralågt endotoxin FBS i ett vattenbad och inkubera vid 56 °C i 30 minuter. Detta steg krävs för att inaktivera komplementsystemet.
- Pipettera den inaktiverade FBS-rören till ultracentrifugrör och centrifugera den vid 100 000 x g i 4 timmar vid 4 °C. Samla supernatanten i sterila 50 ml rör, se till att inte överstiga 45 ml per rör för att undvika kontaminering av locket och vätning av rörets ring.
- Förvara EE-FBS-serumet som beretts på detta sätt vid -20 °C. Kontrollera koncentrationen av LPS i EE-FBS (steg 6). LPS-koncentrationen bör vara på samma nivå som före ultracentrifugering.
3. Cellodling
- För denna studie odlades SW480- och SW620-cellinjer i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 4,5 g / L glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och gentamicin (50 μL / ml) kompletterat med 10% EE-FBS i 75 cm2 odlingskolvar med aseptisk teknik. Frö nästan 4,5 x 10 6 celler och 6,5 x 106 celler per kolv för SW480 respektive SW620.
- Samla supernatanterna två gånger i veckan (~ 10 ml per kolv) när cellerna når full sammanflöde (~ 13,5 x 10 6 och 20 x 106 celler per kolv för SW480 respektive SW620) och dela. Se till att cellernas livskraft inte är mindre än 99 % och att cellerna odlas vid 37 °C i en atmosfär med 5 %CO2.
- Samla supernatanter från cellkulturen i lämpligt märkta 15 ml rör. Centrifugera de uppsamlade supernatanterna vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna cellskräp.
- Samla supernatanterna försiktigt, undvik aspirerande skräp, placera i märkta rör och centrifugera igen vid 3 200 x g i 12 minuter vid 4 °C.
- Samla supernatanter från det andra centrifugeringssteget i sterila, märkta 50 ml rör. Undvik att väta rörens kanter. Se till att volymen supernatant inte överstiger 45 ml och att rören hålls vertikalt.
- Linda tubens lock med en steril genomskinlig hinna och förvara supernatanter i vertikalt läge vid -80 °C.
OBS: Utför månatlig kontroll av Mycoplasma spp. och LPS-kontaminering i färskkultursupernatanter (steg 6). Om halten endotoxin i supernatanterna överstiger 0,05 EU/ml, kontrollera i vilket skede kontaminering kan ha inträffat och starta om processen från början. Om kontaminering av cellkulturen med Mycoplasma spp. detekteras, bör isoleringen av elfordonen från sådana supernatanter avbrytas.
4. Isolering av elfordon från cellodlingssupernatanter
- Förbered 0,22 μm sprutfilter och sprutor med rätt volym. Förbered två rör med odlingssupernatanter (90 ml).
- Fyll sprutan med supernatanten och fäst filtret på nåladaptern. Placera den fyllda sprutan med filtret över ett 50 ml rör. Tryck på kolvflänsen och samla upp ~ 90 ml filtrat.
- Pipettera filtratet (7 ml) till ultracentrifugrören (se till att samma volym pipetteras till varje rör för korrekt balans) och centrifugera vid 100 000 x g i 2 timmar vid 4 °C.
OBS: Effektiviteten hos pelletering av elfordon beror på många faktorer (t.ex. rotortyp, dess k-faktor, migrationsvägslängd, mediets viskositet osv.) som måste optimeras för bättre återvinning av EV20. - Kassera supernatanten med en steril Pasteurpipett. Samla upp de återstående pelletsen med långa, filtrerade pipettspetsar och slå ihop dem i två ultracentrifugrör. Fyll dem upp till 7 ml med filtrerad endotoxinfri PBS för att skölja elfordonen.
- Centrifugera de PBS-återsuspenderade pelletsen vid 100 000 x g i 2 timmar vid 4 °C. Ta bort supernatanten helt med en steril Pasteurpipett och tillsätt 200 μl filtrerad, endotoxinfri PBS till båda rören för att återsuspendera EV. Pipettera försiktigt elbilspelletsen för att samla alla elbilar.
- Överför EV-upphängningen till ett sterilt 1,5 ml provrör (använd om möjligt ett lågproteinbindande rör). Behåll 10 μl av EV-suspensionen för beredning av en utspädning för nanopartikelspårningsanalys (NTA) och för andra ändamål (t.ex. mätning av proteinkoncentration).
- Späd elbilarna med filtrerad PBS (1:1 000) för mätningar med NTA, enligt tillverkarens anvisningar. Säkra EV-rören genom att linda locket med en steril transparent film. Förvara elfordonen vid -80 °C.
5. Specifik markördetektering med western blotting
- Bestäm proteinnivån i proverna (t.ex. genom Bradford-test) och bereda proverna (20 μg) med laddningsbuffert. Bered påfyllningsbufferten genom att blanda 5 μl provbuffert (4x) och 2 μl provreduktionsmedel (10x) till en total volym på 20 μl. Inkubera proverna vid 70 °C i 10 minuter.
- Förbered polyakrylamidgeler med SDS (10% -14%) och ladda 20 μg EV till varje brunn.
- Kör elektroforesen med löpande buffert (30 g Tris, 144 g glycin, 10% SDS per 1 liter) i 45 minuter vid 150 V.
- Utför halvtorr överföring av proteiner från gelén till polyvinylidendifluoridmembranet (PVDF) i en överföringsmaskin med Towbin-buffert (1,51 g Tris, 7,2 g glycin, 10% metanol per 0,5 L) vid 25 V i 1 timme.
- Placera membranet i TBST-buffert (1 ml Tween, 100 ml Tris-buffrad saltlösning (TBS 10x) per 1 liter) för blockering med 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBST-buffert och inkubera i 1 timme på vippan vid RT.
- Tillsätt utspädda (1:1 000) antikroppar, anti-CD9 1 (klon#D8O1A) eller anti-Alix 1 (klon#3A9) i1 % BSA och inkubera med membranet över natten vid 4 °C på vippan. Ta bort antikroppar och tvätta membranet 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minuter.
- Tillsätt getantikanin eller getantimus (spädning: 1:2 000) sekundär antikropp konjugerad med pepparrotsperoxidas, beroende på den primära antikroppen på membranet, och inkubera i 1 timme på vippan vid rumstemperatur. Ta bort antikroppar och tvätta membranet 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minuter.
- Blanda substratet och luminolen i förhållandet 1: 1 för att erhålla en 1 ml lösning. Häll lösningen på membranet. Placera membranet omedelbart i mätkammaren i bildsystemet, välj kemiluminiscensmodulen och visualisera proteinband på skärmen.
6. Mätning av endotoxinnivå med Limulus Amebocytlysattest (LAL)
- Utför kromogen LAL-mätning av endotoxinnivån enligt tillverkarens rekommendation. Använd kortfattat metoden baserad på interaktionen mellan endotoxinet och limulus amebocytlysat (LAL). Detektionsgränsen för denna metod är 0,005 EU / ml.
OBS: LAL-analys, trots sina begränsningar, är för närvarande standardmetoden för att detektera och kvantifiera endotoxinkontaminering i olika typer av lösningar och andra produkter som används inom vetenskap eller medicin8. Den begränsande faktorn för detta kit är stabiliteten hos den rekonstituerade amebocytlysatlösningen, som är stabil i endast 1 vecka vid -20 °C om den fryses omedelbart efter beredning. - Använd en tiofaldig utspädning av EV och andra prover och en 50-faldig utspädning av serum. För ytterligare experiment, använd endast lågendotoxinreagens såsom EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU / ml) och LPS-fria kultursupernatanter.
7. Detektion av prokaryot 16S rRNA-gen i EV-prover
- Isolera DNA från EV-proverna. Försök att hålla reagenserna och isoleringsstället aseptiskt. Mät DNA-koncentrationen och kvaliteten (t.ex. med hjälp av en spektrofotometer).
- Utför polymeraskedjereaktion (PCR), som beskrivits tidigare21. Förbered 1,5% agarosgel med etidiumbromid eller SYBR-grön för att visualisera PCR-produkterna i ultraviolett ljus (UV).
- Kör elektrofores av provet och viktmarkören med TRIS-acetat-EDTA-buffert vid 75 V i 45 minuter. Visualisera DNA-band med hjälp av bildsystemet.
8. Bestämning av effektiv LPS-koncentration för stimulering i human monocytmodell
- Bered 2 x 106 monocyter/ml monocytsuspension i RPMI 1640 kompletterat med L-glutamin, glukos och 2% EE-FBS. Tillsätt 50 μl suspension per brunn av en vävnadsodlingsplatta22 med 96 brunnar.
- Tillsätt en lämplig volym LPS eller odlingsmedium för att erhålla följande slutliga koncentrationer: 0 pg/ml (kontroll), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml och 100 ng/ml, i 100 μl total volym cellsuspension. Gör tre exemplar av varje LPS-koncentration.
- Odla cellerna i 18 timmar vid 37 °C, 5%CO2. Samla supernatanten.
- Snurra ner supernatanten vid 2 000 x g i 5 minuter. Överför supernatanterna till nya rör. Mät TNF8,23 och IL-10 23 koncentration i uppsamlade supernatanter med cytometriska pärlor array (CBA) humant cytokinkit, enligt tillverkarens procedur, med en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett förutsättnings- eller obligatoriskt steg för detta protokoll är uteslutning av eventuell endotoxinkontaminering från reagens. Alla reagenser som används, såsom FBS, DMEM, RPMI, PBS och till och med ultracentrifugrör, måste vara endotoxinfria (<0,005 EU / ml). Det är inte lätt att upprätthålla systemet med ingen endotoxinkontaminering eftersom till exempel det vanliga/standardserumet för cellodling kan vara dess rika källa (0,364 EU/ml, se tabell 1).
Även om detta protokoll utvecklades för att isolera elbilar med lågt endotoxininnehåll är det viktigt att karakterisera de isolerade elfordonen. I denna studie isolerades elbilarna från två kolorektala cancercellinjer, SW480 och SW620. Uttrycket av EV-markörer, CD9 och Alix, bekräftades av western blot (figur 1A). Det fanns ingen skillnad i medelstorleken på elfordon isolerade från SW480- och SW620-celler (134 nm respektive 128,2 nm; Figur 1B). Dessutom fanns det inga skillnader i koncentrationen av isolerade EV mellan dessa cellinjer (figur 1C). De exemplifierande fördelningarna av EV-storlek, mätt med NTA, presenteras i figur 1D. Tiden för ultracentrifugering optimerades enligt resultaten från Cvjetkovic et al.20. Kortfattat användes den matematiska formeln för omvandling av centrifugalkörningsparametrar mellan två fasta vinkelrotorer (70Ti och T-1270). Effektiviteten av små EV: s utarmning genom att snurra med en T-1270-rotor i 120 minuter vid 100 000 x g var något mindre än den som uppnåddes genom att använda en 70Ti-rotor vid 118 000 x g i 155 min; Det var dock fortfarande inom området effektiv RNA- och proteinpelletering. Beräkningen bekräftades av experimentella data (tabell S1), där den förlängda centrifugeringstiden (4 timmar jämfört med 2 timmar) inte hade någon meningsfull inverkan på antalet elfordon som pelleterades eller fortfarande fanns i supernatanter.
Nivån av LPS som orsakade ett monocytsvar utvärderades. För detta ändamål odlades humana monocyter med successiva koncentrationer av LPS (0 pg / ml, 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml och 100 ng / ml). Efter nattkultur bestämdes nivån av IL-10 och TNF i kultursupernatanterna. I denna studie var den lägsta dosen av LPS som möjliggjorde utsöndring av IL-10 och TNF i monocyter 50 pg/ml, vilket motsvarade 0,5 EU/ml (figur 2).
Slutligen var det sista steget relaterat till att testa LPS-nivån i de elbilar som isolerats enligt ovan. LPS-kontamineringen av EV-proverna var cirka 0,5 EU/ml (50 pg/ml; Figur 3) för båda cellinjerna (45,80 ± 20,39 pg/ml och 48,75 ± 7,412 pg/ml för SW480 respektive SW620). Detta innebär att 1 μL EV (cirka 109 EV) innehåller mindre än 0,05 pg endotoxin, och när det tillsätts till 100 μL monocytsuspension (förhållandet 104 EV per en monocyt) späds 100 gånger (den slutliga koncentrationen av LPS är cirka 0,5 pg / ml).
Dessutom testades renheten hos EV med PCR för 16S rRNA-gen21, vilket bekräftar bristen på bakteriell kontaminering i EV isolerade från SW480- och SW620-cellinjer (kompletterande figur 1).
Figur 1: Karakterisering av isolerade EV. (A) Western blot-analys av proteinmarkörerna för EV isolerade från SW480- och SW620-cellinjer. (B) NTA användes för att mäta storleken på elfordon isolerade från SW480- och SW620-cellinjer (nm). (C) NTA användes för att mäta koncentrationen av EV isolerade från SW480 och SW620 cellinjer (EV / ml). (D) Exempel på fördelning av EV-storlek, mätt med NTA (blå siffror anger partikelstorlek vid en given punkt på kurvan). Data i B och C presenteras som medelvärde ± SD (n = 10); T-test för statistisk analys användes. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: IL-10 och TNF-utsöndring av monocyter stimulerade med olika doser LPS. Utsöndring av cytokiner av monocyter bestämdes efter stimulering med LPS-doser enligt indikation: 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml och 100 ng/ml, jämfört med kontrollmonocyter (MO). Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 4); Mann-Whitney U-test användes. TNF- och IL-10-koncentrationer mättes i odlingssupernatanter med cytometriska pärlor (CBA) -metoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av LPS-nivå i isolerade EV-prover genom kromogent LAL-test. LPS-innehåll i EV-prover erhållna från SW480- och SW620-cellinjer (pg / ml). Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| S.No. | prov | endotoxinnivå [EU/ml] | endotoxinnivå [pg/ml] | ||
| 1 | DMEM | <0,005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS ultralågt endotoxin | <0,005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS ultralågt endotoxin efter 4 timmars centrifugering (EE-FBS) | <0,005 | <0.5 | ||
| 5 | vanlig FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | filtrerad PBS | <0,005 | <0.5 | ||
| 7 | odlingssupernatantform SW480-celler efter 2 timmars centrifigation | <0,005 | <0.5 | ||
| 8 | odlingssupernatant från SW620-celler efter 2 timmars centrifugering | <0,005 | <0.5 | ||
| 9 | tvättkontroll (vatten lagrat i ultracentrifugrör) | <0,005 | <0.5 | ||
Tabell 1: LPS-nivå i olika reagens och prover bestämda genom kromogent LAL-test. Mätningarna presenteras som EU/ml och pg/ml. Prover inkluderade DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, filtrerad PBS och tvättkontroll (vatten från ultracentrifugeringsrör).
Kompletterande tabell 1: Representativa exempel på mätningar av EV-koncentration (EV/ml) och storlek (nm) i pellets och supernatanter efter 2 timmar eller 4 timmars centrifugering av odlingssupernatanter från SW480- och SW620-cellinjer och PBS. Mätningarna utfördes av NTA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 1: PCR-resultat av pan-prokaryot 16S rRNA-genamplifiering i följande prover, från vänster: molekylviktstege (MW, 100-1000 bp), NC-negativ kontroll, EV härledd från SW480 och SW620 och PC (positivt kontrollbakteriellt DNA) Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har metoder för korrekt isolering av elfordon blivit allt viktigare, vilket möjliggör ytterligare tillförlitliga analyser, till exempel i samband med att få tillförlitliga omics och funktionella data24. Baserat på tidigare forskningserfarenhet verkar det som att inte bara typen av isoleringsmetod utan även andra förhållanden under denna procedur kan vara viktiga. Användningen av EV-utarmad FBS är allmänt erkänd som en nödvändighet25,26; Övervakningen av endotoxinkontaminering i elfordon försummas dock ofta.
Alla metoder som används för isolering av elfordon bör dock ha utvecklat standarder för rigorös aseptisk hantering och kvalitetskontroll i varje steg av förfarandet. Detta är särskilt viktigt på grund av elfordonens vidare tillämpning i senare led. Det föreslagna protokollet är resultatet av tidigare erfarenheter av endotoxinkänsliga celler, såsom monocyter och makrofager, som är endotoxinkänsliga. CD14, en markör för monocyter, kan binda LPS vid pikomolära koncentrationer. Erhållna resultat indikerar att monocyter, efter stimulering med 50 pg/ml (0,5 EU/ml) LPS utsöndrar TNF och IL-10. Yang et al. rapporterade dock att även 0,1 EU/ml (10 pg/ml) endotoxin kan inducera en potent reaktion (uppreglering av den inflammatoriska IL1B-genen )27. Dessutom visade Chaiwut et al. att den intracellulära produktionen av TNF och IL-6 i monocyter kan induceras av ännu lägre koncentrationer av LPS, 2,5 pg / ml respektive 5 pg / ml,23. Alvarez et al. bekräftade att monocytaktiveringshastigheten (beräknat värde) stiger efter en liten koncentration av LPS, såsom 5 pg / ml28. Därför är det avgörande att begränsa endotoxinkontaminering i EV i varje möjligt steg i isoleringsprotokollet för ytterligare experiment som utförs med LPS-känsliga celler. För närvarande är ultracentrifugering den mest använda metoden för EV-isolering. Så vitt vi vet finns det dock inga studier om LPS-kontaminering av elbilar som isolerats med denna metod. Därför fokuserar ovanstående protokoll på att erhålla EV med låg endotoxinhalt utan extern EV-kontaminering från kultursupernatanterna.
Som nämnts ovan kan endotoxinkontaminering ha olika källor. För det första bör det betonas att endotoxin är en tuff oppponent, och inte alla metoder för sterilisering av glas eller plastvaror är effektiva vid avlägsnande eller nedbrytning. Till exempel kan standardautoklaveringsproceduren inte eliminera LPS på grund av endotoxinets höga värmestabilitet27. Tvätt, även i stor utsträckning, kan inte heller ta bort endotoxin helt. Genom att tillämpa mer depyrogena metoder på laboratoriepraxis, såsom plasma eller ETO (etylenoxid) sterilisering18,19, kan endotoxinkontaminering begränsas. Vidare är permanent övervakning och förebyggande av eventuell kontaminering avgörande. De presenterade resultaten indikerar vikten av att använda ultralåga endotoxinreagens, såsom serum, för odlingstillskott. Dessutom rekommenderas rutinmässig kontroll av endotoxinkontaminering av alla reagens (såsom PBS, DMEM och RPMI) och till och med plastvaror (t.ex. rör). Det är också nödvändigt att förkontrollera kultursupernatanterna före isolering av elfordon för att förhindra ansamling av endotoxin. Som presenterats ovan är ett intressant alternativ till standardmätningen av endotoxinnivåer med LAL-analys PCR-amplifiering av den bakteriella 16s rRNA-genen. Bestämning av tillåtna (som inte inducerar monocytstimulering) endotoxinnivåer av LPS i EV är avgörande. Med tanke på odlingsförhållanden (koncentration av monocyter och kontaminering med LPS av de applicerade EV: erna, koncentrationen av EV; Figur 3) är den slutliga koncentrationen av endotoxin som påverkar monocyter stimulerade med EV inte högre än 0,5 pg / ml (EV späds vanligtvis 100-1,000 gånger). Denna dos är fem gånger lägre än den som postulerats av Chaiwut et al. som den minst effektiva dosen (2,5 pg/ml) som kan inducera produktionen av TNF av monocyter23. I Chaiwut et al.-studien bestämdes cytokinproduktionen med hjälp av flödescytometri och presenterades som ett MFI-skift (genomsnittlig fluorescerande intensitet) utan kvantifiering. Vidare utfördes monocytstimulering med mycket låga doser LPS i medium kompletterat med 10% FBS, vilket kan vara en ytterligare källa till LPS23. Detta kan tyda på att den effektiva dosen av LPS som användes för monocytstimulering var högre. Med tanke på de presenterade resultaten och litteraturdata verkar det således som om koncentrationen av endotoxin upp till 50 pg / ml (0,5 EU / ml) i EV är tillåten och inte är orsaken till monocyternas aktivering. Nästa steg i att optimera detta protokoll är ytterligare minskning av endotoxinkontaminering, även till den nivå som inte detekteras av LAL eller cellbaserade analyser. Nyligen rekommenderas starkt vikten av att använda biologiska modeller för att upptäcka maskerad endotoxinkontaminering, kallad låg endotoxinåtervinning (LER),8.
Således är detta protokoll innovativt i detta avseende eftersom det samlar alla aspekter som är nödvändiga för isolering av elfordon med lägsta möjliga endotoxininnehåll, vilket ännu inte har behandlats i andra studier.
Som med varje metod har detta protokoll vissa begränsningar. För det första minskar det föreslagna protokollet endotoxinkontaminering men eliminerar det inte. För det andra är det okänt om den renhet som uppnås är tillräcklig för andra immunceller. Därför bör varje protokoll anpassas för vidare tillämpning. Upprättandet av ett sådant protokoll gör det möjligt att uppnå resultat som kommer att motsvara mer de biologiskt aktiva komponenterna i elfordon än deras oavsiktliga kontaminering. Slutligen är förfarandet dyrare än vanligt på grund av behovet av att köpa flera endotoxintestsatser och lågt endotoxinserum. Som ett lovande alternativ presenterade Bussolati en ny, sofistikerad metod för isolering av elbilar genom tangentiell flödesfiltrering. Denna metod möjliggör förvärv av EV med låg endotoxicitet (0,1-0,7 EU / ml; 10-70 pg / ml)29. Hittills har denna nya metod inte använts för isolering av elbilar och kräver specialutrustning i form av ett TFF-system (tangentiell flödesfiltrering). Nyligen föreslog Gałuszka et al. ett annat sätt att eliminera endotoxin från luftföroreningar (partiklar med storleken på EV men utan membranstruktur) genom att använda polymyxin B30. Användbarheten av detta protokoll för cell-härledda vesiklar måste dock verifieras genom biologiska modeller, särskilt när man tänker på in vivo-experiment . Polymixin B och natriumdeoxikolat (även tillämpligt vid avlägsnande av endotoxin) har tidigare beskrivits som neuro- och nefrotoxiska31. Andra möjligheter är affinitetskolonner med poly(ε-lysin), som selektivt binder endotoxiner. Denna metod är snabb och effektiv, men dedikerad till proteinprover / lösningar; Därför måste tillämpningen på så komplicerade strukturer som elfordon valideras32. Dessutom är dessa kolumner avsedda för prover med höga initiala endotoxinnivåer, och deras effektivitet vid avlägsnande av relativt små mängder LPS är okänd och kräver verifiering. Den slutliga förväntade koncentrationen av LPS efter rening med LPS-nedbrytande kolonner kan fortfarande vara för hög för immuncellstester (till exempel <5 EU/ml).
Sammanfattningsvis föreslog detta protokoll hur man undviker endotoxinkontaminering genom att tillämpa flera principer på laboratoriepraxis, såsom rigorös aseptisk teknik under alla steg av EV-isolering, användning av ultralåga endotoxinreagens, övervakning av endotoxinföroreningar vid alla procedursteg och ändring av steriliseringsmetoden. Dessutom ger det presenterade protokollet tips om hur man kontrollerar endotoxinnivåer vid varje steg i isoleringsproceduren. LPS som finns i EV påverkar immuncellernas funktion och kan därför orsaka falska resultat i analyser som utförs med dessa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kunde konstrueras som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Centre, Polen, bidragsnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vill tacka professor Tomasz Gosiewski och Agnieszka Krawczyk från Institutionen för molekylär medicinsk mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College för deras ovärderliga hjälp med att upptäcka bakteriellt DNA i EV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
