Summary
הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות ממברנות המשוחררות על ידי תאים במבחנה ו-in vivo. נוכחותם בכל מקום ותפקידם המשמעותי כנשאים של מידע ביולוגי הופכים אותם למושאי מחקר מסקרנים, הדורשים פרוטוקולים אמינים וחוזרים על עצמם לבידודם. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה מכיוון שעדיין ישנם מכשולים טכניים רבים הקשורים למחקר שלהם (כמו רכישה נכונה). מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד כלי רכב חשמליים קטנים (על פי המינוח MISEV 2018) מהתרבית של קווי תאי הגידול המבוססת על צנטריפוגה דיפרנציאלית. הפרוטוקול כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסינים במהלך בידוד של כלי רכב חשמליים וכיצד להעריך אותם כראוי. זיהום אנדוטוקסין של כלי רכב חשמליים יכול לעכב באופן משמעותי ניסויים עתידיים או אפילו להסוות את ההשפעות הביולוגיות האמיתיות שלהם. מצד שני, נוכחות התעלמות של אנדוטוקסינים עלולה להוביל למסקנות שגויות. יש לכך חשיבות מיוחדת כאשר מתייחסים לתאים של מערכת החיסון, כולל מונוציטים, מכיוון שמונוציטים מהווים אוכלוסייה רגישה במיוחד לשאריות אנדוטוקסין. לכן, מומלץ מאוד לסנן כלי רכב חשמליים לאיתור זיהום אנדוטוקסין, במיוחד כאשר עובדים עם תאים רגישים לאנדוטוקסין כגון מונוציטים, מקרופאגים, תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים או תאים דנדריטיים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), על פי המינוח MISEV 2018, הן מונח קולקטיבי המתאר תת-סוגים שונים של שלפוחיות קרומיות המופרשות על ידי תאים הממלאות תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים 1,2. יתר על כן, כלי רכב חשמליים נראים מבטיחים כסמנים ביולוגיים חדשניים למחלות שונות, כמו גם סוכנים טיפוליים וכלי רכב לאספקת תרופות. עם זאת, מימוש מלוא הפוטנציאל שלהם הוא קשה שכן ישנם עדיין מכשולים טכניים רבים הקשורים לרכישתם3. אתגר אחד כזה הוא הבידוד של כלי רכב חשמליים נטולי אנדוטוקסין, שהוזנח במקרים רבים. אחד האנדוטוקסינים הנפוצים ביותר הוא ליפופוליסכריד (LPS), שהוא מרכיב עיקרי בדפנות תאי חיידקים גראם-שליליים ויכול לגרום לתגובה דלקתית חריפה, עקב שחרור מספר רב של ציטוקינים דלקתיים על ידי תאים שונים 4,5. LPS משרה תגובה על ידי קשירה לחלבון קושר LPS, ואחריו אינטראקציה עם קומפלקס CD14/TLR4/MD2 על תאים מיאלואידים. אינטראקציה זו מובילה להפעלה של מסלולי איתות תלויי MyD88 ו- TRIF, אשר בתורו מפעיל את הגורם הגרעיני קאפה B (NFkB). טרנסלוקציה של NFkB לגרעין יוזמת ייצור ציטוקינים6. מונוציטים ומקרופאגים רגישים מאוד ל-LPS, וחשיפתם ל-LPS גורמת לשחרור ציטוקינים וכימוקינים דלקתיים (למשל, IL-6, IL-12, CXCL8 ו-TNF-α)7,8. מבנה CD14 מאפשר קשירה של מיני LPS שונים בעלי זיקה דומה ומשמש כקולטן משותף לקולטנים דמויי אגרה אחרים (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ו-9)6. מספר המחקרים הנערכים על ההשפעות של כלי רכב חשמליים על מונוציטים/מקרופאגים עדיין גדל ב-9,10,11. במיוחד מנקודת המבט של חקר תפקודם של מונוציטים, תת-אוכלוסיות שלהם ותאים חיסוניים אחרים, נוכחותם של אנדוטוקסין ואפילו נוכחותם המוסווית ברכבים חשמליים היא בעלת חשיבות רבה12. הזיהום המתעלם של כלי רכב חשמליים באנדוטוקסינים עלול להוביל למסקנות מטעות ולהסתיר את פעילותם הביולוגית האמיתית. במילים אחרות, עבודה עם תאים מונוציטיים דורשת ביטחון בהיעדר זיהום אנדוטוקסין13. מקורות פוטנציאליים של אנדוטוקסינים יכולים להיות מים, מדיה מסחרית וסרה, רכיבי מדיה ותוספים, כלי זכוכית מעבדה וכלי פלסטיק 5,14,15.
לכן, מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול לבידוד של כלי רכב חשמליים בעלי אנדוטוקסין נמוך. הפרוטוקול מספק רמזים פשוטים כיצד להימנע מזיהום אנדוטוקסין במהלך בידוד כלי רכב חשמליים, במקום להסיר אנדוטוקסינים מכלי רכב חשמליים. בעבר, פרוטוקולים רבים הוצגו כיצד להסיר אנדוטוקסינים מננו-חלקיקים מהונדסים המשמשים בננו-רפואה; עם זאת, אף אחד מהם אינו שימושי עבור מבנים ביולוגיים כגון כלי רכב חשמליים. דפירוגנציה יעילה של ננו-חלקיקים יכולה להתבצע על ידי שטיפת אתנול או חומצה אצטית, חימום ב 175 ° C במשך 3 שעות, γ הקרנה, או טיפול טריטון X-100; עם זאת, נהלים אלה מובילים להשמדת כלי רכב חשמליים16,17.
הפרוטוקול המוצג הוא מחקר חלוצי המתמקד במניעת זיהומים אנדוטוקסינים ברכב חשמלי, בניגוד למחקרים קודמים על השפעת כלי רכב חשמליים על מונוציטים9. יישום העקרונות המוצעים לפרקטיקה במעבדה עשוי לסייע בהשגת תוצאות מחקר אמינות, אשר יכולות להיות חיוניות כאשר שוקלים את השימוש הפוטנציאלי של כלי רכב חשמליים כסוכנים טיפוליים במרפאה12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צינורות אולטרה-צנטריפוגות
- השתמשו בצינורות סטריליים לשימוש חד פעמי. אם הדבר אינו אפשרי, עשו שימוש חוזר בצינורות האולטרה-צנטריפוגות לאחר שטיפתם בחומר ניקוי באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר או אפליקטורים חד-פעמיים אחרים. זכרו כי צינורות אולטרה-צנטריפוגות צריכים להיות מוקדשים לסוג אחד של חומר צנטריפוגי (סופרנטנט תרבית תאים/נסיוב/פלזמה) ומינים (אדם/עכבר/וכו').
- לאחר שטיפת חומר ניקוי, שטפו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות במים נטולי LPS 3x.
הערה: אין להשתמש במים באיכות נמוכה. - יבש את צינורות ultracentrifuge, ולאחר מכן למלא אותם עם 70% אתנול. השאירו את הצינורות עם 70% אתנול לחיטוי לילה. מוציאים את האתנול ומייבשים שוב את הצינורות.
- מניחים את הצינורות והפקקים באריזות סטריליזציה וסוגרים אותם היטב. השתמש בשיטת העיקור פלזמה או גז (אתילן אוקסיד)18,19. אחסנו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות הסגורים באריזת העיקור במקום יבש, והשתמשו בהם לפני תאריך התפוגה.
הערה: בצע ניטור חודשי של רמת LPS במי מלח חוצצים פוספט (PBS) והמים המשמשים לבידוד כלי רכב חשמליים. הניטור צריך לכלול גם את הצינורות (למשל, על ידי בדיקת המים [בקרת שטיפה] שאוחסנו בצינורות האולטרה-צנטריפוגות במשך הלילה בטמפרטורת החדר [RT]).
2. הכנת סרום בקר עוברי דל אנדוטוקסין דל EV (EE-FBS)
- הקפד להשתמש באנדוטוקסין FBS נמוך במיוחד (זמין מסחרית; ראה טבלת חומרים; <0.1 האיחוד האירופי/מ"ל).
- הניחו בקבוק של אנדוטוקסין FBS נמוך במיוחד באמבט מים ודגרו בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות. שלב זה נדרש כדי להשבית את מערכת המשלים.
- פיפטה FBS בלתי פעיל צינורות אולטרה צנטריפוגות וצנטריפוגה אותו ב 100,000 x גרם במשך 4 שעות ב 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינורות סטריליים של 50 מ"ל, תוך הקפדה שלא יעלה על 45 מ"ל לצינור כדי למנוע זיהום המכסה והרטבת טבעת הצינור.
- יש לאחסן את סרום EE-FBS שהוכן באופן זה בטמפרטורה של -20°C. בדוק את ריכוז LPS ב- EE-FBS (שלב 6). ריכוז LPS צריך להיות באותה רמה כמו לפני אולטרהצנטריפוגה.
3. תרבית תאים
- עבור מחקר זה, תרבית SW480 ו SW620 שורות תאים בתווך הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן, וגנטמיצין (50 μL / מ"ל) בתוספת 10% EE-FBS בהתאם ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית בטכניקה אספטית. זרעו כמעט 4.5 x 106 תאים ו- 6.5 x 106 תאים לבקבוק עבור SW480 ו- SW620, בהתאמה.
- אספו את הסופרנאטנטים פעמיים בשבוע (~10 מ"ל לצלוחית) כאשר התאים מגיעים למפגש מלא (~13.5 x 10, 6 ו-20 x 10,6 תאים לבקבוק עבור SW480 ו-SW620, בהתאמה), ופצלו. ודא כי הכדאיות של תאים היא לא פחות מ 99% וכי התאים הם בתרבית ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2.
- אספו סופרנאטנטים מתרבית התאים לתוך צינורות 15 מ"ל המסומנים כראוי. צנטריפוגה את הסופרנאטנטים שנאספו ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT כדי להסיר פסולת התא.
- אספו את הסופרנאטנטים בזהירות, הימנעו משאיפת פסולת, הניחו בצינורות מסומנים וצנטריפוגה שוב בטמפרטורה של 3,200 x גרם למשך 12 דקות ב-4°C.
- אספו סופרנאטנטים משלב הצנטריפוגה השני לתוך צינורות סטריליים המסומנים ב-50 מ"ל. הימנעו מהרטבת שולי הצינורות. ודא כי נפח supernatant אינו עולה על 45 מ"ל וכי צינורות נשמרים אנכית.
- עטפו את מכסה הצינור בסרט סטרילי ושקוף ואחסנו סופרנאטנטים במצב אנכי בטמפרטורה של -80°C.
הערה: בצע בקרה חודשית של Mycoplasma spp. וזיהום LPS בסופרנאטנטים של תרביות טריות (שלב 6). אם רמת האנדוטוקסין בסופרנאטנטים עולה על 0.05 EU/mL, יש לוודא באיזה שלב ייתכן שהתרחש זיהום ולהפעיל מחדש את התהליך מההתחלה. אם זיהום של תרבית התא על ידי Mycoplasma spp. אם זוהה, יש להפסיק את הבידוד של כלי הרכב החשמליים מסופרנאטנטים כאלה.
4. בידוד כלי רכב חשמליים מסופרנאטנטים של תרביות תאים
- הכינו מסנני מזרקים 0.22 מיקרומטר ומזרקים בנפח מתאים. הכינו שני צינורות עם סופרנאטנטים לתרבית (90 מ"ל).
- ממלאים את המזרק בסופרנאטנט ומחברים את המסנן למתאם המחט. מניחים את המזרק המלא עם המסנן מעל צינור 50 מ"ל. לחץ על אוגן הבוכנה ואסוף ~ 90 מ"ל של תסנין.
- פיפטה את המסנן (7 מ"ל) לצינורות אולטרה צנטריפוגות (להבטיח כי נפח זהה הוא pipeted לכל צינור עבור איזון תקין) וצנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C.
הערה: היעילות של כדורי כלי רכב חשמליים תלויה בגורמים רבים (למשל, סוג הרוטור, גורם ה-k שלו, אורך נתיב הנדידה, צמיגות התווך וכו'), שיש למטב אותם להתאוששות טובה יותר של כלי רכב חשמליים20. - השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סטרילית של פסטר. אספו את הכדורים הנותרים בעזרת קצות פיפטה ארוכים ומסוננים ואגרו אותם לשני צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מלא אותם עד 7 מ"ל עם PBS מסונן ללא אנדוטוקסין כדי לשטוף את EVs.
- צנטריפוגה את הכדוריות התלויות PBS ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. הסירו לחלוטין את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר, והוסיפו 200 מיקרוליטר של PBS מסונן ונטול אנדוטוקסין לשני הצינורות כדי להשהות מחדש את הרכבים החשמליים. מקציפים בעדינות את כדורי הרכב החשמלי כדי לאסוף את כל כלי הרכב החשמליים.
- העבירו את מתלי הרכב החשמלי למבחנה סטרילית בנפח 1.5 מ"ל (במידת האפשר, השתמשו במבחנה דלת קשירת חלבון). שמור על 10 μL של מתלה EV להכנת דילול לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ולמטרות אחרות (למשל, מדידת ריכוז חלבונים).
- יש לדלל את כלי הרכב החשמליים ב-PBS מסונן (בקנ"מ 1:1,000) לצורך מדידות של נת"ע, בהתאם להוראות היצרן. אבטחו את צינורות הרכב החשמלי על ידי עטיפת הפקק בסרט סטרילי שקוף. אחסנו את כלי הרכב החשמליים בטמפרטורה של -80°C.
5. זיהוי סמנים ספציפיים על ידי כתם מערבי
- קבע את רמת החלבון בדגימות (למשל, על ידי בדיקת ברדפורד), והכן את הדגימות (20 מיקרוגרם) עם מאגר העמסה. הכן את מאגר ההעמסה על ידי ערבוב 5 μL של מאגר הדגימה (4x) ו- 2 μL של חומר מקטין דגימה (10x) לנפח כולל של 20 μL. דגור על הדגימות ב- 70 ° C למשך 10 דקות.
- הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד עם SDS (10%-14%) והעמיסו את 20 מיקרוגרם כלי הרכב החשמליים לכל באר.
- הפעל את האלקטרופורזה עם חיץ ריצה (30 גרם טריס, 144 גרם גליצין, 10% SDS לכל 1 ליטר) במשך 45 דקות ב- 150 וולט.
- בצע העברה חצי יבשה של חלבונים מהג'ל אל קרום הפוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) במכונת העברה עם חיץ Towbin (1.51 גרם טריס, 7.2 גרם גליצין, 10% מתנול ל-0.5 ליטר) ב-25 וולט למשך שעה אחת.
- הניחו את הממברנה במאגר TBST (1 מ"ל טווין, 100 מ"ל מלח חוצץ טריס (TBS 10x) לכל 1 ליטר) לחסימה עם אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) במאגר TBST, ודגרו במשך שעה אחת על הנדנדה ב-RT.
- הוסף נוגדנים מדוללים (1:1,000), אנטיCD9 1 (שיבוט #D8O1A) או אנטי אליקס 1 (שיבוט #3A9), ב1 % BSA ודגור עם הממברנה לילה ב 4 ° C על הנדנדה. הסר נוגדנים ושטוף את הממברנה 3x עם 10 מ"ל של 1x TBST למשך 10 דקות.
- הוסף נוגדן נגדי עז או עז נגד עכבר (דילול: 1:2,000) נוגדן משני מצומד עם פרוקסידז חזרת, בהתאם לנוגדן העיקרי על הממברנה, ודגר במשך שעה על הנדנדה ב- RT. הסר נוגדנים ושטוף את הממברנה 3x עם 10 מ"ל של 1x TBST למשך 10 דקות.
- ערבבו את המצע והאלומיניום ביחס של 1:1 לקבלת תמיסה של 1 מ"ל. יוצקים את התמיסה על הממברנה. מקם את הממברנה מיד בתא המדידה של מערכת ההדמיה, בחר את מודול הכימילומינסנציה והצג פסי חלבון על המסך.
6. מדידת רמת אנדוטוקסין על ידי בדיקת לימולוס אמבוציטים ליזט (LAL)
- בצע מדידת LAL כרומוגנית של רמת האנדוטוקסין, בהתאם להמלצת היצרן. בקצרה, להשתמש בשיטה המבוססת על האינטראקציה של אנדוטוקסין עם לימולוס amebocyte lysate (LAL). מגבלת הזיהוי של שיטה זו היא 0.005 EU/mL.
הערה: בדיקת LAL, למרות מגבלותיה, נותרה כיום השיטה הסטנדרטית לאיתור וכימות זיהום אנדוטוקסין בסוגים שונים של תמיסות ומוצרים אחרים המשמשים במדע או ברפואה8. הגורם המגביל של ערכה זו הוא היציבות של פתרון amebocyte lysate reconstituted, אשר יציב רק 1 שבוע ב -20 °C אם קפוא מיד לאחר reconstitution. - השתמשו בדילול של פי עשרה של כלי רכב חשמליים ודגימות אחרות ובדילול של נסיוב של פי 50. לניסויים נוספים, השתמשו רק בריאגנטים בעלי אנדוטוקסין נמוך כגון EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 EU/mL) וסופרנאטנטים של תרבית ללא LPS.
7. איתור גן rRNA פרוקריוטי 16S בדגימות EV
- בודדו DNA מדגימות EV. נסה לשמור על ריאגנטים ואת האתר של בידוד אספטי. למדוד את ריכוז הדנ"א ואת איכותו (למשל, באמצעות ספקטרופוטומטר).
- בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR), כפי שתואר קודם לכן21. הכינו ג'ל אגרוז 1.5% עם אתידיום ברומיד או ירוק SYBR כדי לדמיין את מוצרי ה-PCR באור אולטרה סגול (UV).
- הפעל אלקטרופורזה של סמן הדגימה והמשקל עם חיץ TRIS-אצטט-EDTA במתח של 75 וולט למשך 45 דקות. דמיינו פסי דנ"א באמצעות מערכת ההדמיה.
8. קביעת ריכוז LPS יעיל לגירוי במודל מונוציטים אנושי
- הכינו 2 x 106 מונוציטים/מ"ל של תרחיף מונוציטים בסל"ד 1640 בתוספת L-גלוטמין, גלוקוז ו-2% EE-FBS. הוסף 50 μL של המתלה לכל באר של צלחת תרבית רקמה 96 באר22.
- הוסף נפח מתאים של LPS או מדיום תרבית כדי לקבל את הריכוזים הסופיים הבאים: 0 pg/mL (בקרה), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL ו-100 ng/mL, בנפח כולל של 100 μL של תרחיף תאים. צור טריפליקטים מכל ריכוז LPS.
- תרבית את התאים במשך 18 שעות ב 37 ° C, 5% CO2. לאסוף את supernatant.
- סובבו את הסופרנאטנט במהירות של 2,000 x גרם למשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים. יש למדוד את ריכוז TNF 8,23 ו-IL-1023 בסופרנאטנטים שנאספו באמצעות ערכת הציטוקינים האנושית של מערך החרוזים הציטומטריים (CBA), בהתאם לנוהל היצרן, עם ציטומטר זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תנאי מוקדם או צעד חובה עבור פרוטוקול זה הוא אי הכללת זיהום אנדוטוקסין אפשרי מגיבים. כל הריאגנטים הנמצאים בשימוש, כגון FBS, DMEM, RPMI, PBS, ואפילו צינורות אולטרה-צנטריפוגה, חייבים להיות נטולי אנדוטוקסין (<0.005 האיחוד האירופי / מ"ל). שמירה על משטר ללא זיהום אנדוטוקסין אינה קלה, שכן לדוגמה, הסרום הרגיל/סטנדרטי לתרבית תאים יכול להיות המקור העשיר שלו (0.364 EU/mL; ראה טבלה 1).
למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לבודד כלי רכב חשמליים עם תכולת אנדוטוקסין נמוכה, חשוב לאפיין את כלי הרכב החשמליים המבודדים. במחקר זה, כלי הרכב החשמליים בודדו משני קווי תאים של סרטן המעי הגס, SW480 ו-SW620. הביטוי של סמני EV, CD9 ו-Alix, אושר על-ידי כתם מערבי (איור 1A). לא היה הבדל בגודל הממוצע של כלי רכב חשמליים שבודדו מתאי SW480 ו-SW620 (134 ננומטר ו-128.2 ננומטר, בהתאמה; איור 1B). נוסף על כך, לא היו הבדלים בריכוז של כלי רכב חשמליים מבודדים בין שורות התאים האלה (איור 1C). ההתפלגויות המופתיות של גודל הרכב החשמלי, כפי שנמדדו על ידי נת"ע, מוצגות באיור 1D. הזמן של ultracentrifugation היה אופטימלי על פי התוצאות של Cvjetkovic et al.20. בקצרה, נעשה שימוש בנוסחה המתמטית להמרה של פרמטרי ריצה צנטריפוגליים בין שני רוטורים בעלי זווית קבועה (70Ti ו- T-1270). היעילות של דלדול כלי רכב חשמליים קטנים על ידי סיבוב עם רוטור T-1270 למשך 120 דקות במהירות של 100,000 x גרם הייתה מעט פחותה מזו שהושגה על ידי שימוש ברוטור 70Ti ב 118,000 x גרם במשך 155 דקות; עם זאת, זה עדיין היה בטווח של RNA יעיל גלולות חלבון. החישוב אושר על ידי נתוני ניסוי (טבלה S1), שבהם להארכת זמן הצנטריפוגה (4 שעות לעומת 2 שעות) לא הייתה השפעה משמעותית על מספר כלי הרכב החשמליים שנפלטו או עדיין נמצאים בסופרנאטים.
רמת LPS שגרמה לתגובת מונוציטים הוערכה. למטרה זו, מונוציטים אנושיים גודלו בתרבית עם ריכוזים עוקבים של LPS (0 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL ו-100 ng/mL). לאחר תרבית לילה, רמת IL-10 ו- TNF נקבעה בסופרנאטים של התרביות. במחקר זה, המינון הנמוך ביותר של LPS המאפשר הפרשת IL-10 ו-TNF במונוציטים היה 50 pg/mL, אשר התאים ל-0.5 EU/mL (איור 2).
לבסוף, השלב האחרון היה קשור לבדיקת רמת LPS ברכבים החשמליים שבודדו כאמור לעיל. זיהום LPS של דגימות EV היה סביב 0.5 האיחוד האירופי / מ"ל (50 pg / mL; איור 3) עבור שני קווי התאים (45.80 ± 20.39 pg/mL ו- 48.75 ± 7.412 pg/mL עבור SW480 ו- SW620, בהתאמה). משמעות הדבר היא כי 1 μL של EVs (סביב 109 EVs) מכיל פחות מ 0.05 pg של אנדוטוקסין, וכאשר הוסיף 100 μL של תרחיף מונוציטים (יחס של 104 EV לכל מונוציטים אחד) הוא מדולל 100 פעמים (הריכוז הסופי של LPS הוא סביב 0.5 pg / mL).
נוסף על כך, טוהר כלי הרכב החשמליים נבדק על-ידי PCR עבור הגן 16S rRNA21, אשר מאשר את היעדר זיהום חיידקי בכלי רכב חשמליים שבודדו מקווי תאים SW480 ו-SW620 (איור משלים 1).
איור 1: אפיון כלי רכב חשמליים מבודדים. (A) ניתוח כתמים מערביים של סמנים חלבוניים של כלי רכב חשמליים שבודדו מקווי תאים SW480 ו-SW620. (B) נת"ע שימשה למדידת גודלם של כלי רכב חשמליים שבודדו מקווי תאים SW480 ו-SW620 (ננומטר). (C) נת"ע שימשה למדידת ריכוז כלי הרכב החשמליים שבודדו מקווי תאים SW480 ו-SW620 (EVs/mL). (D) התפלגות מופתית של גודל כלי הרכב החשמליים, כפי שנמדדה על ידי נת"ע (מספרים כחולים מציינים את גודל החלקיקים בנקודה נתונה בעקומה). הנתונים ב- B ו- C מוצגים כממוצע ± SD (n = 10); נעשה שימוש במבחן T לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפרשת IL-10 ו-TNF על-ידי מונוציטים שעוררו במינונים שונים של LPS. הפרשת ציטוקינים על ידי מונוציטים נקבעה לאחר גירוי במינונים של LPS כפי שצוין: 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL ו-100 ng/mL, בהשוואה למונוציטים בקרה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 4); נעשה שימוש במבחן Mann-Whitney U. ריכוזי TNF ו-IL-10 נמדדו בתרביות על ידי שיטת CBA (Cytometric Beads Array). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידת רמת LPS בדגימות EV מבודדות באמצעות בדיקת LAL כרומוגנית. תוכן LPS בדגימות EV שהתקבלו מקווי תאים SW480 ו-SW620 (pg/mL). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| S.No. | לדוגמה | רמת אנדוטוקסין [האיחוד האירופי/מ"ל] | רמת אנדוטוקסין [pg/mL] | ||
| 1 | DMEM | <0.005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0.005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS אנדוטוקסין נמוך במיוחד | <0.005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS אנדוטוקסין נמוך במיוחד לאחר צנטריפוגה של 4 שעות (EE-FBS) | <0.005 | <0.5 | ||
| 5 | FBS רגיל | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | PBS מסונן | <0.005 | <0.5 | ||
| 7 | סופרנאטנט תרבית יוצר תאי SW480 לאחר צנטריפיגה של שעתיים | <0.005 | <0.5 | ||
| 8 | תרבית supernatant מ SW620 תאים לאחר 2 שעות צנטריפוגה | <0.005 | <0.5 | ||
| 9 | בקרת שטיפה (מים מאוחסנים בצינורות אולטרה-צנטריפוגה) | <0.005 | <0.5 | ||
טבלה 1: רמת LPS בריאגנטים שונים ובדגימות שנקבעו על ידי בדיקת LAL כרומוגנית. המדידות מוצגות כ- EU/mL ו- pg/mL. הדגימות כללו DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, PBS מסונן ובקרת שטיפה (מים מצינורות אולטרה-צנטריפוגה).
טבלה משלימה 1: דוגמאות מייצגות למדידות ריכוז (EVs/mL) וגודל (nm) בכדוריות ובסופרנאטנטים לאחר צנטריפוגה של שעתיים או 4 שעות של סופרנאטנטים בתרבית מקווי תאים SW480 ו-SW620 ו-PBS. המדידות בוצעו על ידי נת"ע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
תרשים משלים 1: תוצאות PCR של הגברת גן rRNA pan-prokaryote 16S בדגימות הבאות, משמאל: סולם משקל מולקולרי (MW, 100-1000 bp), בקרת NC-שלילית, EVs הנגזרים מ- SW480 ו- SW620, ו- PC (DNA בקרה חיובי חיידקי) אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות, שיטות לבידוד נכון של כלי רכב חשמליים הפכו חשובות יותר ויותר, ומאפשרות ניתוחים אמינים נוספים, למשל, בהקשר של קבלת אומיקה מהימנה ונתונים פונקציונליים24. בהתבסס על ניסיון מחקרי קודם, נראה כי לא רק סוג שיטת הבידוד, אלא גם תנאים אחרים במהלך הליך זה עשויים להיות חשובים. השימוש ב- FBS מדולדל EV מוכר באופן נרחב כהכרח25,26; עם זאת, ניטור זיהום אנדוטוקסין ברכב חשמלי מוזנח לעתים קרובות.
עם זאת, כל השיטות המשמשות לבידוד כלי רכב חשמליים היו צריכות לפתח סטנדרטים לטיפול אספטי קפדני ובקרת איכות בכל שלב של ההליך. זה משמעותי במיוחד בשל היישום הנוסף של כלי רכב חשמליים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצע הוא תוצאה של ניסיון קודם עם תאים רגישים לאנדוטוקסין, כגון מונוציטים ומקרופאגים, שהם רגישים לאנדוטוקסין. CD14, סמן של מונוציטים, מסוגל לקשור LPS בריכוזים פיקומולריים. התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שמונוציטים, לאחר גירוי עם 50 pg/mL (0.5 EU/mL) של LPS מפרישים TNF ו- IL-10. יאנג ועמיתיו, לעומת זאת, דיווחו כי אפילו 0.1 EU/mL (10 pg/mL) של אנדוטוקסין עשוי לגרום לתגובה חזקה (upregulation של הגן הדלקתי IL1B )27. יתר על כן, Chaiwut et al. הראו כי הייצור התוך-תאי של TNF ו- IL-6 במונוציטים עשוי להיגרם על ידי ריכוזים נמוכים עוד יותר של LPS, 2.5 pg/mL או 5 pg/mL, בהתאמה23. Alvarez et al. אישרו כי קצב הפעלת מונוציטים (ערך מחושב) עולה לאחר ריכוז קטן של LPS, כגון 5 pg/mL28. לכן, הגבלת זיהום האנדוטוקסין ברכב חשמלי בכל שלב אפשרי של פרוטוקול הבידוד חיונית לניסויים נוספים הנערכים בתאים רגישים ל-LPS. נכון לעכשיו, אולטרה-צנטריפוגה היא השיטה הנפוצה ביותר לבידוד רכב חשמלי. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין מחקרים על זיהום LPS של כלי רכב חשמליים שבודדו בשיטה זו. לפיכך, הפרוטוקול הנ"ל מתמקד בהשגת כלי רכב חשמליים בעלי אנדוטוקסין נמוך ללא זיהום חיצוני של כלי רכב חשמליים מהסופרנאטנטים של התרביות.
כאמור, זיהום אנדוטוקסין עשויים להיות מקורות שונים. ראשית, יש להדגיש כי אנדוטוקסין הוא נוגד קשה, ולא כל שיטות העיקור של זכוכית או כלי פלסטיק יעילים בהסרתו או השפלתו. לדוגמה, הליך autoclaving סטנדרטי לא יכול לחסל LPS עקב יציבות חום גבוהה של אנדוטוקסין27. כמו כן, שטיפה, אפילו באופן נרחב, לא יכול להסיר אנדוטוקסין לחלוטין. על ידי יישום שיטות דפירוגניות יותר לשיטות מעבדה, כגון עיקור פלזמה או ETO (אתילן אוקסיד)18,19, זיהום אנדוטוקסין יכול להיות מוגבל. לאחר מכן, ניטור קבוע ומניעת זיהום אפשרי הם חיוניים. התוצאות המוצגות מצביעות על החשיבות של שימוש בריאגנטים אנדוטוקסינים נמוכים במיוחד, כגון סרום, לתוספת תרבית. בנוסף, מומלץ מאוד לבצע בקרה שגרתית של זיהום אנדוטוקסין בכל הריאגנטים (כגון PBS, DMEM ו-RPMI) ואפילו בכלי פלסטיק (כגון צינורות). כמו כן, יש צורך לבדוק מראש את תרבית העל לפני בידוד EVs כדי למנוע הצטברות אנדוטוקסין. כפי שהוצג לעיל, חלופה מעניינת למדידה הסטנדרטית של רמות אנדוטוקסין על ידי בדיקת LAL היא הגברת PCR של הגן rRNA 16s חיידקי. קביעת רמות אנדוטוקסין מתירניות (שאינן גורמות לגירוי מונוציטים) של LPS ברכב חשמלי היא חיונית. בהתחשב בתנאי התרבית (ריכוז מונוציטים וזיהום עם LPS של כלי רכב חשמליים מיושמים, ריכוז של EVs; איור 3), הריכוז הסופי של אנדוטוקסין שמשפיע על מונוציטים שמעוררים עם כלי רכב חשמליים אינו גבוה מ-0.5 pg/mL (כלי רכב חשמליים בדרך כלל מדוללים פי 100-1,000). מינון זה נמוך פי חמישה מזה שהונח על ידי Chaiwut et al. כמינון הכי פחות יעיל (2.5 pg / mL) המסוגל לגרום לייצור TNF על ידי מונוציטים23. במחקר של Chaiwut et al. נקבע ייצור ציטוקינים באמצעות ציטומטריית זרימה והוצג כשינוי MFI (עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת) ללא כימות. יתר על כן, גירוי מונוציטים עם מינונים נמוכים מאוד של LPS בוצע בתוספת בינונית עם 10% FBS, אשר עשוי להיות מקור נוסף של LPS23. זה עשוי להצביע על כך שהמינון היעיל של LPS המשמש לגירוי מונוציטים היה גבוה יותר. לפיכך, בהתחשב בתוצאות המוצגות ובנתוני הספרות, נראה כי ריכוז אנדוטוקסין עד 50 pg/mL (0.5 EU/mL) ברכב חשמלי הוא מתירני, ואינו הגורם להפעלת מונוציטים. השלב הבא במיטוב פרוטוקול זה הוא הפחתה נוספת של זיהום אנדוטוקסין, אפילו לרמה שלא זוהתה על ידי LAL או בדיקות מבוססות תאים. לאחרונה, החשיבות של שימוש במודלים ביולוגיים כדי לזהות זיהום אנדוטוקסין מוסווה, הנקרא התאוששות אנדוטוקסין נמוכה (LER), מומלץ מאוד8.
לפיכך, פרוטוקול זה הוא חדשני מבחינה זו מכיוון שהוא אוסף את כל ההיבטים הדרושים לבידוד של כלי רכב חשמליים עם תכולת האנדוטוקסין הנמוכה ביותר האפשרית, דבר שעדיין לא טופל במחקרים אחרים.
כמו בכל שיטה, גם לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות. ראשית, הפרוטוקול המוצע מפחית את זיהום האנדוטוקסין אך אינו מבטל אותו. שנית, לא ידוע אם הטוהר שהושג מספיק לתאי חיסון אחרים. לכן, כל פרוטוקול צריך להיות מותאם ליישום נוסף. קביעת פרוטוקול כזה תאפשר קבלת תוצאות שיתאימו יותר לרכיבים הפעילים ביולוגית של כלי רכב חשמליים מאשר לזיהום המקרי שלהם. לבסוף, ההליך יקר מהרגיל בגלל הצורך לרכוש מספר ערכות בדיקת אנדוטוקסין וסרום אנדוטוקסין נמוך. כחלופה מבטיחה, הציג בוסולאטי שיטה חדשה ומתוחכמת לבידוד כלי רכב חשמליים על ידי סינון זרימה משיק. שיטה זו מאפשרת רכישה של כלי רכב חשמליים עם אנדוטוקסיות נמוכה (0.1-0.7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29. עד כה, שיטה חדשנית זו לא הייתה נפוצה לבידוד כלי רכב חשמליים, והיא דורשת ציוד מיוחד בצורת מערכת סינון זרימה משיקה (TFF). לאחרונה, Gałuszka et al. הציעו דרך אחרת לחסל אנדוטוקסין ממזהמי אוויר (חומר חלקיקי בגודל של כלי רכב חשמליים אך ללא מבנה ממברנה) באמצעות פולימיקסין B30. עם זאת, התועלת של פרוטוקול זה עבור שלפוחיות שמקורן בתאים צריכה להיות מאומתת באמצעות מודלים ביולוגיים, במיוחד כאשר חושבים על ניסויים in vivo . פולימיקסין B ונתרן דאוקסיכולאט (ישים גם להסרת אנדוטוקסין) תוארו בעבר כנוירוטוקסיים ונפרוטוקסיים31. אפשרויות אחרות הן עמודות זיקה עם פולי(ε-ליזין), אשר קושרות באופן סלקטיבי אנדוטוקסינים. שיטה זו מהירה ויעילה, עם זאת, מוקדשת לדגימות / פתרונות חלבון; לכן, החלתו על מבנים מסובכים כמו כלי רכב חשמליים זקוקה לאימות32. יתר על כן, עמודות אלה מיועדות לדגימות בעלות רמות אנדוטוקסין התחלתיות גבוהות, ויעילותן בהסרת כמויות קטנות יחסית של LPS אינה ידועה ודורשת אימות. הריכוז הסופי הצפוי של LPS לאחר טיהור עם עמודות מדלדלות LPS עשוי עדיין להיות גבוה מדי עבור בדיקות תאי חיסון (לדוגמה, <5 EU/mL).
לסיכום, פרוטוקול זה הציע כיצד להימנע מזיהום אנדוטוקסין על ידי יישום מספר עקרונות לתרגול מעבדה, כגון טכניקה אספטית קפדנית במהלך כל שלבי הבידוד של כלי רכב חשמליים, שימוש בריאגנטים אנדוטוקסינים נמוכים במיוחד, ניטור זיהומים אנדוטוקסינים בכל שלבי ההליך, ושינוי שיטת העיקור. יתר על כן, הפרוטוקול המוצג מספק רמזים כיצד לשלוט ברמות האנדוטוקסין בכל שלב של הליך הבידוד. LPS הקיים ברכבים חשמליים משפיע על תפקוד תאי מערכת החיסון, ולכן עלול לגרום לתוצאות שגויות בבדיקות שנערכו עם תאים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שניתן לבנות כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין, מענק מספר 2019/33/B/NZ5/00647. ברצוננו להודות לפרופ' תומאש גוסייבסקי ואגניישקה קרבצ'יק מהמחלקה למיקרוביולוגיה רפואית מולקולרית, המכללה הרפואית של האוניברסיטה היגלונית על עזרתם רבת הערך בזיהוי דנ"א חיידקי ברכבים חשמליים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
