Summary
Den foreslåede protokol indeholder retningslinjer for, hvordan kontaminering med endotoksin undgås under isolering af ekstracellulære vesikler fra cellekultursupernatanter, og hvordan de evalueres korrekt.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er en heterogen population af membranvesikler frigivet af celler in vitro og in vivo. Deres allestedsnærværende og betydelige rolle som bærere af biologisk information gør dem spændende studieobjekter, der kræver pålidelige og gentagne protokoller for deres isolering. Det er imidlertid vanskeligt at realisere deres fulde potentiale, da der stadig er mange tekniske hindringer relateret til deres forskning (som korrekt erhvervelse). Denne undersøgelse præsenterer en protokol til isolering af små elbiler (ifølge MISEV 2018-nomenklaturen) fra kultursupernatanten af tumorcellelinjer baseret på differentiel centrifugering. Protokollen indeholder retningslinjer for, hvordan man undgår forurening med endotoksiner under isolering af elbiler, og hvordan man korrekt evaluerer dem. Endotoksinforurening af elbiler kan betydeligt hindre efterfølgende eksperimenter eller endda maskere deres sande biologiske virkninger. På den anden side kan den oversete tilstedeværelse af endotoksiner føre til forkerte konklusioner. Dette er af særlig betydning, når der henvises til celler i immunsystemet, herunder monocytter, fordi monocytter udgør en befolkning, der er særlig følsom over for endotoksinrester. Derfor anbefales det stærkt at screene EV'er for endotoksinforurening, især når man arbejder med endotoksinfølsomme celler såsom monocytter, makrofager, myeloidafledte suppressorceller eller dendritiske celler.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er ifølge MISEV 2018-nomenklaturen et kollektivt udtryk, der beskriver forskellige undertyper af celleudskillede membranøse vesikler, der spiller afgørende roller i adskillige fysiologiske og patologiske processer 1,2. Desuden viser elbiler lovende som nye biomarkører for forskellige sygdomme samt terapeutiske midler og lægemiddelleveringskøretøjer. Det er imidlertid vanskeligt at realisere deres fulde potentiale, da der stadig er mange tekniske hindringer i forbindelse med deres erhvervelse3. En sådan udfordring er isoleringen af endotoksinfrie elbiler, som i mange tilfælde er blevet forsømt. En af de mest almindelige endotoksiner er lipopolysaccharid (LPS), som er en vigtig bestanddel af gramnegative bakteriecellevægge og kan forårsage en akut inflammatorisk reaktion på grund af frigivelsen af et stort antal inflammatoriske cytokiner af forskellige celler 4,5. LPS inducerer et respons ved binding til LPS-bindende protein efterfulgt af interaktion med CD14/TLR4/MD2-komplekset på myeloide celler. Denne interaktion fører til aktivering af MyD88- og TRIF-afhængige signalveje, som igen udløser den nukleare faktor kappa B (NFkB). Translokation af NFkB til kernen initierer produktionen af cytokiner6. Monocytter og makrofager er meget følsomme over for LPS, og deres eksponering for LPS resulterer i frigivelse af inflammatoriske cytokiner og kemokiner (fx IL-6, IL-12, CXCL8 og TNF-α)7,8. CD14-strukturen muliggør binding af forskellige LPS-arter med lignende affinitet og fungerer som en co-receptor for andre toll-lignende receptorer (TLR'er) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 og 9)6. Antallet af undersøgelser, der udføres på virkningerne af EV'er på monocytter / makrofager, stiger stadig 9,10,11. Især ud fra perspektivet om at studere monocytternes funktioner, deres subpopulationer og andre immunceller er tilstedeværelsen af endotoksin og endda deres maskerede tilstedeværelse i elbiler af stor betydning12. Den oversete forurening af elbiler med endotoksiner kan føre til vildledende konklusioner og skjule deres sande biologiske aktivitet. Med andre ord kræver arbejde med monocytiske celler tillid til fravær af endotoksinforurening13. Potentielle kilder til endotoksiner kan være vand, kommercielt opnåede medier og sera, mediekomponenter og additiver, laboratorieglasvarer og plastvarer 5,14,15.
Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle en protokol til isolering af elbiler med lavt endotoksinholdigt indhold. Protokollen giver enkle tip til, hvordan man undgår endotoksinforurening under EVs isolering i stedet for at fjerne endotoksiner fra EV'er. Tidligere er der blevet præsenteret mange protokoller om, hvordan man fjerner endotoksiner fra for eksempel konstruerede nanopartikler, der anvendes i nanomedicin; Ingen af dem er dog nyttige til biologiske strukturer såsom elbiler. Den effektive depyrogenering af nanopartikler kan udføres ved skylning af ethanol eller eddikesyre, opvarmning til 175 °C i 3 timer, γ bestråling eller triton X-100-behandling; Disse procedurer fører imidlertid til destruktion af elbiler16,17.
Den præsenterede protokol er en banebrydende undersøgelse med fokus på at undgå endotoksin urenheder i EV'er, i modsætning til tidligere undersøgelser af effekten af EV'er på monocytter9. Anvendelse af foreslåede principper på laboratoriepraksis kan bidrage til at opnå pålidelige forskningsresultater, hvilket kan være afgørende, når man overvejer den potentielle anvendelse af EV'er som terapeutiske midler i klinikken12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af ultracentrifugerør
- Brug sterile engangsrør. Hvis dette ikke er muligt, skal du genbruge ultracentrifugeglassene efter at have vasket dem med et vaskemiddel med en steril Pasteur-pipette eller andre engangsapplikatorer. Husk, at ultracentrifugeglas skal være dedikeret til én type centrifugeret materiale (cellekultursupernatant/serum/plasma) og arter (menneske/mus/osv.).
- Efter vask af vaskemiddel skylles ultracentrifugeglassene med deioniseret, LPS-frit vand 3x.
BEMÆRK: Brug ikke vand af lav kvalitet. - Tør ultracentrifugerørene, og fyld dem derefter op med 70% ethanol. Lad rørene stå med 70% ethanol til desinfektion natten over. Fjern ethanolen og tør rørene igen.
- Anbring rørene og hætterne i steriliseringsemballage og luk dem tæt. Der anvendes plasma- eller gassteriliseringsmetode18,19. Opbevar ultracentrifugerørene, der er indesluttet i steriliseringsemballagen, på et tørt sted, og brug dem inden udløbsdatoen.
BEMÆRK: Udfør månedlig overvågning af LPS-niveauet i fosfatbufret saltvand (PBS) og det vand, der bruges til isolering af elbiler. Overvågningen bør også omfatte reagensglassene (f.eks. ved at teste vandet [vaskekontrol], som har været opbevaret i ultracentrifugeglassene natten over ved stuetemperatur [RT]).
2. Fremstilling af EV-depleteret lavendotoksin føtalt bovint serum (EE-FBS)
- Sørg for at bruge ultralavt endotoksin FBS (kommercielt tilgængeligt; se materialefortegnelsen; <0,1 EU / ml).
- Anbring en flaske ultralavt endotoksin FBS i et vandbad og inkuber ved 56 ° C i 30 minutter. Dette trin er nødvendigt for at deaktivere komplementsystemet.
- Det inaktiverede FBS pipetteres til ultracentrifugeglas og centrifugeres ved 100.000 x g i 4 timer ved 4 °C. Supernatanten samles i sterile 50 ml reagensglas, og sørg for, at den ikke overstiger 45 ml pr. glas for at undgå kontaminering af hætten og vædning af rørets ring.
- EE-FBS serum fremstillet på denne måde opbevares ved -20 °C. Kontroller koncentrationen af LPS i EE-FBS (trin 6). LPS-koncentrationen skal være på samme niveau som før ultracentrifugering.
3. Cellekultur
- Til denne undersøgelse blev dyrkning SW480 og SW620 cellelinjer i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) med 4,5 g / L glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og gentamicin (50 μL / ml) suppleret med 10% EE-FBS tilsvarende i 75 cm2 kulturkolber ved hjælp af aseptisk teknik. Der sås næsten 4,5 x 10 6 celler og 6,5 x 106 celler pr. kolbe for henholdsvis SW480 og SW620.
- Supernatanterne indsamles to gange om ugen (~10 ml pr. kolbe), når cellerne når fuld sammenløb (~13,5 x 10 6 og 20 x 106 celler pr. kolbe for henholdsvis SW480 og SW620), og deles. Sørg for, at cellernes levedygtighed ikke er mindre end 99 %, og at cellerne dyrkes ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære.
- Supernatanterne fra cellekulturen samles i behørigt mærkede 15 ml reagensglas. De opsamlede supernatanter centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved RT for at fjerne cellerester.
- Supernatanterne opsamles omhyggeligt, undgå at opsuge snavs, anbringes i mærkede glas og centrifugeres igen ved 3.200 x g i 12 minutter ved 4 °C.
- Supernatanterne fra det andet centrifugeringstrin samles i sterile, mærkede 50 ml reagensglas. Undgå at fugte rørkanterne. Sørg for, at rumfanget af supernatant ikke overstiger 45 ml, og at reagensglassene holdes lodret.
- Tubens hætte pakkes ind med en steril, gennemsigtig film, og supernatanterne opbevares lodret ved -80 °C.
BEMÆRK: Udfør månedlig kontrol af Mycoplasma spp. og LPS-kontaminering i friske kultursupernatanter (trin 6). Hvis indholdet af endotoksin i supernatanterne overstiger 0,05 EU/ml, kontrolleres det, på hvilket stadium kontaminering der kan have fundet sted, og processen genstartes fra begyndelsen. Ved kontaminering af cellekulturen med Mycoplasma spp. detekteres, bør isolationen af EV'erne fra sådanne supernatanter seponeres.
4. Dyrkning af elektriske køretøjer fra cellekultursupernatanter
- Forbered 0,22 μm sprøjtefiltre og sprøjter med korrekt volumen. Der fremstilles to reagensglas med kultursupernatanter (90 ml).
- Fyld sprøjten med supernatanten og sæt filteret på kanyleadapteren. Placer den fyldte sprøjte med filteret over et 50 ml rør. Tryk på stempelflangen, og opsaml ~90 ml filtrat.
- Filtratet (7 ml) pipetteres til ultracentrifugeglassene (idet det sikres, at det samme volumen pipetteres til hvert rør for korrekt balance) og centrifugeres ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Effektiviteten af pelletering af elbiler afhænger af mange faktorer (f.eks. rotortype, k-faktor, migrationsvejlængde, mediets viskositet osv.), som skal optimeres for bedre genvinding af elbiler20. - Supernatanten kasseres med en steril Pasteur-pipette. Opsaml de resterende pellets ved hjælp af lange, filtrerede pipettespidser og saml dem i to ultracentrifugerør. Fyld dem op til 7 ml med filtreret endotoksinfri PBS for at skylle elbilerne.
- De PBS-opslæmmede pellets centrifugeres ved 100.000 x g i 2 timer ved 4 °C. Supernatanten fjernes fuldstændigt med en steril Pasteur-pipette, og der tilsættes 200 μL filtreret, endotoksinfri PBS til begge reagensglas for at resuspendere elbilerne. Afpipetter forsigtigt elbilpillen for at opsamle alle elbilerne.
- Overfør EVs suspension til et sterilt 1,5 ml reagensglas (brug om muligt et lavproteinbindingsrør). Der tilbageholdes 10 μL EV-suspensionen til fremstilling af en fortynding til nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og til andre formål (f.eks. måling af proteinkoncentration).
- Fortynd elbilerne med filtreret PBS (1:1.000) til målinger foretaget af NTA i henhold til producentens anvisninger. Fastgør EV-rørene ved at pakke hætten ind med en steril gennemsigtig film. Opbevar elbilerne ved -80 °C.
5. Påvisning af specifikke markører ved western blotting
- Proteinniveauet i prøverne bestemmes (f.eks. ved Bradford-analyse), og prøverne (20 μg) fremstilles med belastningsbuffer. Påfyldningsbufferen fremstilles ved at blande 5 μL prøvebuffer (4x) og 2 μL prøvereduktionsmiddel (10x) til et samlet volumen på 20 μL. Prøverne inkuberes ved 70 °C i 10 minutter.
- Forbered polyacrylamidgeler med SDS (10% -14%) og fyld de 20 μg EV'er til hver brønd.
- Kør elektroforesen med løbende buffer (30 g Tris, 144 g glycin, 10% SDS pr. 1 L) i 45 minutter ved 150 V.
- Udfør halvtør overførsel af proteiner fra gelen til polyvinylidendifluorid (PVDF) membranen i en overførselsmaskine med Towbin-buffer (1,51 g Tris, 7,2 g glycin, 10% methanol pr. 0,5 L) ved 25 V i 1 time.
- Membranen anbringes i TBST-buffer (1 ml Tween, 100 ml Tris-bufret saltvand (TBS 10x) pr. 1 liter) til blokering med 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBST-buffer, og inkuberes i 1 time på vipperen ved RT.
- Der tilsættes fortyndede (1:1.000) antistoffer, anti-CD9 1 (klon#D8O1A) eller anti-Alix 1 (klon#3A9), i1% BSA og inkuberes med membranen natten over ved 4 °C på vipperen. Fjern antistoffer og vask membranen 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minutter.
- Tilsæt ged anti-kanin eller ged anti-mus (fortynding: 1:2.000) sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase, afhængigt af det primære antistof på membranen, og inkuber i 1 time på vippen ved RT. Fjern antistoffer og vask membran 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minutter.
- Bland substratet og luminol i forholdet 1:1 for at opnå en 1 ml opløsning. Hæld opløsningen på membranen. Placer membranen straks i billeddannelsessystemets målekammer, vælg kemiluminescensmodulet, og visualiser proteinbånd på skærmen.
6. Måling af endotoksinniveau ved Limulus Amebocyte Lysate test (LAL)
- Udfør kromogen LAL-måling af endotoksinniveauet i henhold til producentens anbefaling. Kort sagt, brug metoden baseret på interaktionen mellem endotoksinet og limulus amebocytlysat (LAL). Detektionsgrænsen for denne metode er 0,005 EU/ml.
BEMÆRK: LAL-assay er trods sine begrænsninger i øjeblikket standardmetoden til påvisning og kvantificering af endotoksinforurening i forskellige former for opløsninger og andre produkter, der anvendes inden for videnskab eller medicin8. Den begrænsende faktor for dette kit er stabiliteten af den rekonstituerede amebocytlysatopløsning, som kun er stabil i 1 uge ved -20 °C, hvis den fryses umiddelbart efter rekonstitution. - Brug en ti gange fortynding af elbiler og andre prøver og en 50 gange fortynding af serum. Til yderligere forsøg må der kun anvendes reagenser med lavt endotoksinindhold såsom EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) og LPS-frie kultursupernatanter.
7. Påvisning af prokaryot 16S rRNA-gen i EV-prøver
- Isoler DNA fra EV-prøverne. Prøv at holde reagenserne og isolationsstedet aseptisk. Mål DNA-koncentrationen og kvaliteten (f.eks. ved hjælp af et spektrofotometer).
- Udfør polymerasekædereaktion (PCR) som beskrevet tidligere21. Forbered 1,5% agarosegel med ethidiumbromid eller SYBR-grøn for at visualisere PCR-produkterne i ultraviolet lys (UV).
- Der køres elektroforese af prøven og vægtmarkøren med TRIS-acetat-EDTA-buffer ved 75 V i 45 minutter. Visualiser DNA-bånd ved hjælp af billeddannelsessystemet.
8. Bestemmelse af effektiv LPS-koncentration til stimulering i human monocytmodel
- Forbered 2 x 106 monocytter/ml monocytsuspension i RPMI 1640 suppleret med L-glutamin, glucose og 2% EE-FBS. Der tilsættes 50 μL suspension pr. hul på en 96-brønds vævskulturplade22.
- Der tilsættes en passende mængde LPS eller dyrkningsmedium for at opnå følgende slutkoncentrationer: 0 pg/ml (kontrol), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml og 100 ng/ml i 100 μL samlet volumen cellesuspension. Lav tredoblinger af hver LPS-koncentration.
- Cellerne dyrkes i 18 timer ved 37 °C, 5% CO2. Supernatanten hentes.
- Centrifuger supernatanten ned ved 2.000 x g i 5 min. Supernatanterne overføres til nye glas. TNF 8,23- og IL-10 23-koncentrationen måles i indsamlede supernatanter med det cytometriske perlearray (CBA) humane cytokinsæt i overensstemmelse med producentens procedure med et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forudsætning eller obligatorisk trin for denne protokol er udelukkelse af mulig endotoksinforurening fra reagenser. Alle de anvendte reagenser, såsom FBS, DMEM, RPMI, PBS og endda ultracentrifugerør, skal være endotoksinfri (<0,005 EU / ml). Det er ikke let at opretholde regimet uden endotoksinkontaminering, da f.eks. det almindelige/standardserum til cellekultur kan være dets rige kilde (0,364 EU/ml; se tabel 1).
Selvom denne protokol blev udviklet til at isolere elbiler med lavt endotoksinindhold, er det vigtigt at karakterisere de isolerede elbiler. I denne undersøgelse blev elbilerne isoleret fra to kolorektal cancercellelinjer, SW480 og SW620. Ekspressionen af EVs markører, CD9 og Alix, blev bekræftet af western blot (figur 1A). Der var ingen forskel i gennemsnitsstørrelsen af elbiler isoleret fra SW480- og SW620-celler (henholdsvis 134 nm og 128,2 nm; Figur 1B). Derudover var der ingen forskelle i koncentrationen af isolerede EV'er mellem disse cellelinjer (figur 1C). De eksemplariske fordelinger af EV-størrelse, målt ved NTA, er vist i figur 1D. Tiden for ultracentrifugering blev optimeret i henhold til resultaterne af Cvjetkovic et al.20. Kort fortalt blev den matematiske formel til konvertering af centrifugalkørselsparametre mellem to fastvinklede rotorer (70Ti og T-1270) anvendt. Effektiviteten af små elbilers udtømning ved at dreje med en T-1270 rotor i 120 min ved 100.000 x g var lidt mindre end den, der opnås ved at bruge en 70Ti rotor ved 118.000 x g i 155 min; Det var dog stadig inden for området for effektiv RNA- og proteinpelletering. Beregningen blev bekræftet af eksperimentelle data (tabel S1), hvor den forlængede centrifugeringstid (4 timer vs. 2 timer) ikke havde nogen meningsfuld indvirkning på antallet af pelleterede eller stadig tilstedeværende EV'er i supernatanter.
Niveauet af LPS, der forårsagede et monocytrespons, blev vurderet. Til dette formål blev humane monocytter dyrket med successive koncentrationer af LPS (0 pg / ml, 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml og 100 ng / ml). Efter dyrkning natten over blev niveauet af IL-10 og TNF bestemt i kultursupernatanterne. I denne undersøgelse var den laveste dosis LPS, der muliggjorde sekretion af IL-10 og TNF i monocytter, 50 pg / ml, hvilket svarede til 0,5 EU / ml (figur 2).
Endelig var det sidste trin relateret til test af niveauet af LPS i elbiler isoleret som ovenfor. LPS-forureningen af EV-prøverne var omkring 0,5 EU/ml (50 pg/ml; Figur 3) for begge cellelinjer (45,80 ± 20,39 pg/ml og 48,75 ± 7,412 pg/ml for henholdsvis SW480 og SW620). Dette betyder, at 1 μL EV'er (ca. 109 EV'er) indeholder mindre end 0,05 pg endotoksin, og når de tilsættes til 100 μL monocytsuspension (forhold på 104 EV'er pr. Monocyt) fortyndes 100 gange (den endelige koncentration af LPS er ca. 0,5 pg / ml).
Derudover blev renheden af EV'er testet ved PCR for 16S rRNA-gen21, hvilket bekræfter manglen på bakteriel kontaminering i EV'er isoleret fra SW480- og SW620-cellelinjer (supplerende figur 1).
Figur 1: Karakterisering af isolerede EV'er . (A) Western blot-analyse af proteinmarkørerne for EV'er isoleret fra SW480- og SW620-cellelinjer. (B) NTA blev anvendt til at måle størrelsen af elektriske køretøjer isoleret fra SW480- og SW620-cellelinjer (nm). (C) NTA blev anvendt til at måle koncentrationen af elektriske køretøjer isoleret fra SW480- og SW620-cellelinjer (EV'er/ml). (D) Eksemplariske fordelinger af EVs størrelse målt ved NTA (blå tal angiver partikelstørrelse på et givet punkt på kurven). Data i B og C præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 10); T-test til statistisk analyse blev anvendt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: IL-10 og TNF-sekretion af monocytter stimuleret med forskellige doser LPS. Monocytternes sekretion af cytokiner blev bestemt efter stimulation med LPS-doser som angivet: 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml og 100 ng/ml sammenlignet med kontrolmonocytter (MO). Data præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 4); Mann-Whitney U-test blev brugt. TNF- og IL-10-koncentrationer blev målt i kultursupernatanter ved hjælp af den cytometriske perlematrix (CBA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Måling af LPS-niveauet i isolerede EV-prøver ved kromogen LAL-test. LPS-indhold i EV-prøver opnået fra SW480- og SW620-cellelinjer (pg / ml). Data præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
| S.No. | prøve | endotoksinniveau [EU/ml] | endotoksinniveau [pg / ml] | ||
| 1 | DMEM | <0,005 | <0,5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0,5 | ||
| 3 | FBS ultra lavt endotoksin | <0,005 | <0,5 | ||
| 4 | FBS ultralavt endotoksin efter 4 timers centrifugering (EE-FBS) | <0,005 | <0,5 | ||
| 5 | almindelig FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | filtreret PBS | <0,005 | <0,5 | ||
| 7 | kultursupernatant danner SW480-celler efter 2 timers centrifigation | <0,005 | <0,5 | ||
| 8 | kultursupernatant fra SW620-celler efter 2 timers centrifugering | <0,005 | <0,5 | ||
| 9 | vaskekontrol (vand opbevaret i ultracentrifugerør) | <0,005 | <0,5 | ||
Tabel 1: LPS-niveau i forskellige reagenser og prøver bestemt ved kromogen LAL-test. Målingerne præsenteres som EU/ml og pg/ml. Prøverne omfattede DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, filtreret PBS og vaskekontrol (vand fra ultracentrifugeringsrør).
Supplerende tabel 1: Repræsentative eksempler på målinger af EV-koncentration (EV/ml) og størrelse (nm) i pellets og supernatanter efter 2 timers eller 4 timers centrifugering af kultursupernatanter fra SW480- og SW620-cellelinjer og PBS. Målinger blev udført af NTA. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 1: PCR-resultater af pan-prokaryot 16S rRNA-genamplifikation i følgende prøver fra venstre: molekylvægtstige (MW, 100-1000 bp), NC-negativ kontrol, EV'er afledt af SW480 og SW620 og PC (positivt kontrolbakterielt DNA) Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste år er metoder til korrekt isolering af elektriske køretøjer blevet stadig vigtigere, hvilket gør det muligt at foretage yderligere pålidelige analyser, f.eks. i forbindelse med opnåelse af pålidelige omics og funktionelle data24. Baseret på tidligere forskningserfaringer ser det ud til, at ikke kun typen af isolationsmetode, men også andre forhold under denne procedure kan være vigtige. Brugen af EV-forarmet FBS er bredt anerkendt som en nødvendighed25,26; Overvågningen af endotoksinforurening i elbiler forsømmes imidlertid ofte.
Ikke desto mindre bør alle metoder, der anvendes til isolering af elektriske køretøjer, have udviklet standarder for streng aseptisk håndtering og kvalitetskontrol på alle trin i proceduren. Dette er især vigtigt på grund af elbilernes videre downstream-anvendelse. Den foreslåede protokol er resultatet af tidligere erfaringer med endotoksinfølsomme celler, såsom monocytter og makrofager, som er endotoksinfølsomme. CD14, en markør for monocytter, er i stand til at binde LPS ved picomolære koncentrationer. Opnåede resultater indikerer, at monocytter efter stimulering med 50 pg / ml (0,5 EU / ml) LPS udskiller TNF og IL-10. Yang et al. rapporterede imidlertid, at selv 0,1 EU/ml (10 pg/ml) endotoksin kunne fremkalde en potent reaktion (opregulering af det inflammatoriske IL1B-gen )27. Desuden viste Chaiwut et al., at den intracellulære produktion af TNF og IL-6 i monocytter kan induceres af endnu lavere koncentrationer af LPS, henholdsvis 2,5 pg / ml eller 5 pg / ml23. Alvarez et al. bekræftede, at monocytaktiveringshastigheden (beregnet værdi) stiger efter en lille koncentration af LPS, såsom 5 pg / ml28. Derfor er begrænsning af endotoksinforurening i elbiler på alle mulige stadier af isolationsprotokollen afgørende for yderligere eksperimenter udført med LPS-følsomme celler. I øjeblikket er ultracentrifugering den mest anvendte metode til EV-isolering. Så vidt vi ved, er der imidlertid ingen undersøgelser af LPS-forurening af elbiler, der er isoleret ved denne metode. Derfor fokuserer ovennævnte protokol på at opnå EV'er med lavt endotoksin uden ekstern EV-forurening fra kultursupernatanterne.
Som nævnt ovenfor kan endotoksinforurening have forskellige kilder. For det første skal det understreges, at endotoksin er en hård oppponent, og ikke alle metoder til sterilisering af glas eller plastvarer er effektive til fjernelse eller nedbrydning. For eksempel kan standardautoklaveringsproceduren ikke eliminere LPS på grund af endotoksins høje varmestabilitet27. Vask, selv i vid udstrækning, kan heller ikke fjerne endotoksin fuldstændigt. Ved at anvende mere depyrogene metoder til laboratoriepraksis, såsom plasma eller ETO (ethylenoxid) sterilisering18,19, kan endotoksinforurening begrænses. Dernæst er permanent overvågning og forebyggelse af eventuel kontaminering afgørende. De præsenterede resultater indikerer vigtigheden af at anvende ultra-lave endotoksinreagenser, såsom serum, til kulturtilskud. Derudover anbefales rutinemæssig kontrol af endotoksinforurening af alle reagenser (såsom PBS, DMEM og RPMI) og endda plastvarer (f.eks. Rør). Det er også nødvendigt at forhåndskontrollere dyrkningssupernatanterne, før elbiler isoleres, for at forhindre endotoksinakkumulering. Som præsenteret ovenfor er et interessant alternativ til standardmåling af endotoksinniveauer ved LAL-assay PCR-amplifikation af det bakterielle 16s rRNA-gen. Bestemmelse af tilladende (som ikke inducerer monocytstimulering) endotoksinniveauer af LPS i EV'er er afgørende. I betragtning af dyrkningsbetingelserne (koncentration af monocytter og kontaminering med LPS af de anvendte EV'er, koncentrationen af EV'er; Figur 3), er den endelige koncentration af endotoksin, der påvirker monocytter stimuleret med EV'er, ikke højere end 0,5 pg / ml (EV'er fortyndes normalt 100-1.000 gange). Denne dosis er fem gange lavere end den, der postuleres af Chaiwut et al. som den mindst effektive dosis (2,5 pg / ml), der er i stand til at inducere produktionen af TNF af monocytter23. I Chaiwut et al.-undersøgelsen blev cytokinproduktionen bestemt ved hjælp af flowcytometri og præsenteret som et MFI-skift (gennemsnitlig fluorescerende intensitet) uden kvantificering. Desuden blev monocytstimulering med meget lave doser LPS udført i medium suppleret med 10% FBS, hvilket kan være en yderligere kilde til LPS23. Dette kan tyde på, at den effektive dosis LPS, der blev anvendt til monocytstimulering, var højere. I betragtning af de præsenterede resultater og litteraturdata ser det således ud til, at koncentrationen af endotoksin op til 50 pg / ml (0,5 EU / ml) i elbiler er tilladt og ikke er årsagen til monocytternes aktivering. Det næste trin i optimeringen af denne protokol er yderligere reduktion af endotoksinforurening, selv til det niveau, der ikke opdages af LAL eller cellebaserede assays. For nylig anbefales vigtigheden af at bruge biologiske modeller til at detektere maskeret endotoksinforurening, kaldet lav endotoksingendannelse (LER), stærkt8.
Denne protokol er således innovativ i denne henseende, fordi den samler alle aspekter, der er nødvendige for isolering af elbiler med det lavest mulige endotoksinindhold, hvilket endnu ikke er blevet behandlet i andre undersøgelser.
Som med hver metode har denne protokol nogle begrænsninger. For det første reducerer den foreslåede protokol endotoksinforurening, men eliminerer den ikke. For det andet er det uvist, om den opnåede renhed er tilstrækkelig for andre immunceller. Hver protokol bør derfor tilpasses med henblik på videre anvendelse. Indførelsen af en sådan protokol vil gøre det muligt at opnå resultater, der i højere grad svarer til de biologisk aktive komponenter i elbiler end til utilsigtet kontaminering af dem. Endelig er proceduren dyrere end normalt på grund af behovet for at købe flere endotoksintestsæt og lavt endotoksinserum. Som et lovende alternativ præsenterede Bussolati en ny, sofistikeret metode til isolering af elbiler ved hjælp af tangentiel flowfiltrering. Denne metode gør det muligt at erhverve elektriske køretøjer med lav endotoksicitet (0,1-0,7 EU/ml; 10-70 pg/ml)29. Indtil nu har denne nye metode ikke været almindeligt anvendt til isolering af elbiler og kræver specialudstyr i form af et tangentielt flowfiltreringssystem (TFF). For nylig foreslog Gałuszka et al. en anden måde at eliminere endotoksin fra luftforurenende stoffer (partikler med størrelsen af elbiler, men uden membranstruktur) ved hjælp af polymyxin B30. Imidlertid skal nytten af denne protokol for celleafledte vesikler verificeres gennem biologiske modeller, især når man tænker på in vivo-eksperimenter . Polymixin B og natriumdeoxycholat (også anvendelig til fjernelse af endotoksin) er tidligere blevet beskrevet som neuro- og nefrotoksiske31. Andre muligheder er affinitetskolonner med poly(ε-lysin), som selektivt binder endotoksiner. Denne metode er hurtig og effektiv, men dedikeret til proteinprøver / opløsninger; Derfor skal det valideres at anvende det på så komplicerede strukturer som elbiler32. Desuden er disse kolonner beregnet til prøver med høje indledende endotoksinniveauer, og deres effektivitet til fjernelse af relativt små mængder LPS er ukendt og kræver verifikation. Den endelige forventede koncentration af LPS efter oprensning med LPS-nedbrydende søjler kan stadig være for høj til immuncelletest (f.eks. <5 EU/ml).
Sammenfattende foreslog denne protokol, hvordan man undgår endotoksinforurening ved at anvende flere principper til laboratoriepraksis, såsom streng aseptisk teknik under alle trin i EV-isolering, ved hjælp af ultralave endotoksinreagenser, overvågning af endotoksin urenheder ved alle proceduretrin og ændring af steriliseringsmetoden. Desuden giver den præsenterede protokol tip til, hvordan man kontrollerer endotoksinniveauer på hvert trin i isolationsproceduren. LPS til stede i EV'er påvirker immuncellernes funktion og kan derfor forårsage falske resultater i assays udført med disse celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne konstrueres som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Centre, Polen, bevillingsnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vil gerne takke professor Tomasz Gosiewski og Agnieszka Krawczyk fra Institut for Molekylær Medicinsk Mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College for deres uvurderlige hjælp til påvisning af bakterielt DNA i elbiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
