Summary
제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.
Abstract
세포외 소포(EV)는 시험관 내 및 생체 내 세포에서 방출되는 이질적인 막 소포 집단입니다. 그들의 편재성과 생물학적 정보의 운반자로서의 중요한 역할은 그들을 흥미로운 연구 대상으로 만들고 분리를 위해 신뢰할 수 있고 반복적인 프로토콜이 필요합니다. 그러나 연구와 관련된 많은 기술적 장애물(예: 적절한 획득)이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다. 이 연구는 차등 원심분리를 기반으로 하는 종양 세포주의 배양 상층액에서 소형 EV(MISEV 2018 명명법에 따름)를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 EV를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. EV의 내독소 오염은 후속 실험을 크게 방해하거나 실제 생물학적 효과를 가릴 수도 있습니다. 반면에, 내 독소의 간과 된 존재는 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이것은 단핵구를 포함한 면역계의 세포를 언급 할 때 특히 중요한데, 이는 단핵구가 내 독소 잔기에 특히 민감한 집단을 구성하기 때문입니다. 따라서 특히 단핵구, 대식세포, 골수 유래 억제 세포 또는 수지상 세포와 같은 내독소에 민감한 세포로 작업할 때 EV의 내독소 오염을 스크리닝하는 것이 좋습니다.
Introduction
MISEV 2018 명명법에 따르면 세포외 소포(EV)는 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 분비 막낭의 다양한 하위 유형을 설명하는 집합적인 용어입니다 1,2. 또한 EV는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커, 치료제 및 약물 전달 수단으로서의 가능성을 보여줍니다. 그러나 인수와 관련된 기술적 장애물이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다3. 이러한 과제 중 하나는 많은 경우 무시되어 온 내독소가 없는 EV의 분리입니다. 가장 흔한 내독소 중 하나는 지질다당류(LPS)로, 그람 음성 박테리아 세포벽의 주요 구성 요소이며 다양한 세포에 의한 많은 수의 염증성 사이토카인의 방출로 인해 급성 염증 반응을 일으킬 수 있습니다 4,5. LPS는 LPS 결합 단백질에 결합한 후 골수 세포에서 CD14/TLR4/MD2 복합체와 상호작용하여 반응을 유도합니다. 이 상호 작용은 MyD88 및 TRIF 의존성 신호 전달 경로의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 핵 인자 카파 B(NFkB)를 유발합니다. NFkB의 핵으로의 전좌는 사이토카인의 생산을 개시한다6. 단핵구와 대식세포는 LPS에 매우 민감하며 LPS에 노출되면 염증성 사이토카인과 케모카인(예: IL-6, IL-12, CXCL8 및 TNF-α)이 방출됩니다7,8. CD14 구조는 유사한 친화도를 갖는 상이한 LPS 종의 결합을 가능하게 하고, 다른 톨-유사 수용체 (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 및 9)에 대한 공동-수용체로서 작용한다6. 단핵구/대식세포에 대한 EV의 영향에 대한 연구의 수는 여전히 증가하고 있습니다 9,10,11. 특히 단핵구, 그 하위 집단 및 기타 면역 세포의 기능을 연구하는 관점에서 볼 때, 내독소의 존재와 EV에서 가려진 존재는 매우 중요합니다12. 내독소로 인한 EV의 간과된 오염은 오해의 소지가 있는 결론으로 이어지고 진정한 생물학적 활성을 숨길 수 있습니다. 즉, 단핵구 세포로 작업하려면 내독소 오염이 없다는 확신이 필요합니다13. 내독소의 잠재적 공급원은 물, 상업적으로 입수된 배지 및 혈청, 배지 성분 및 첨가제, 실험실 유리 제품 및 플라스틱 제품일 수 있다 5,14,15.
따라서 본 연구는 저내독소 함유 EV의 분리를 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이 프로토콜은 EV에서 내독소를 제거하는 대신 EV 격리 중에 내독소 오염을 피하는 방법에 대한 간단한 힌트를 제공합니다. 이전에는 예를 들어 나노 의학에 사용되는 조작 된 나노 입자에서 내 독소를 제거하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 제시되었습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 EV와 같은 생물학적 구조에 유용하지 않습니다. 나노 입자의 효과적인 발열원 제거는 에탄올 또는 아세트산 헹굼, 175 °C에서 3 시간 동안 가열, γ 조사 또는 트리톤 X-100 처리에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차는 EV16,17의 파괴로 이어집니다.
제시된 프로토콜은 단핵구에 대한 EV의 효과에 대한 이전 연구와 달리 EV의 내독소 불순물을 피하는 데 초점을 맞춘 선구적인 연구입니다9. 제안된 원리를 실험실 실습에 적용하면 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 클리닉에서 치료제로서 EV의 잠재적 사용을 고려할 때 중요할 수 있다12.
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Protocol
1. 초원심분리기 튜브의 제조
- 멸균된 일회용 튜브를 사용하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 멸균 파스퇴르 피펫 또는 기타 일회용 애플리케이터를 사용하여 세제로 세척한 후 초원심분리기 튜브를 재사용하십시오. 초원심분리기 튜브는 한 가지 유형의 원심분리 물질(세포 배양 상청액/혈청/혈장)과 종(인간/마우스 등) 전용이어야 합니다.
- 세제 세척 후 초원심분리기 튜브를 탈이온화된 LPS가 없는 물로 3회 헹굽니다.
알림: 저질의 물을 사용하지 마십시오. - 초원심분리기 튜브를 건조시킨 다음 70% 에탄올로 채웁니다. 밤새 소독을 위해 튜브에 70% 에탄올을 그대로 두십시오. 에탄올을 제거하고 튜브를 다시 건조시킵니다.
- 튜브와 캡을 멸균 포장에 넣고 단단히 닫으십시오. 플라즈마 또는 기체(에틸렌옥사이드) 멸균법18,19를 사용한다. 멸균 포장에 동봉된 초원심분리기 튜브는 건조한 곳에 보관하고 유통기한이 지난 전에 사용하십시오.
알림: 인산염 완충 식염수(PBS)의 LPS 수준과 EV 격리에 사용되는 물을 매월 모니터링합니다. 모니터링에는 튜브도 포함되어야 합니다(예: 실온[RT]에서 밤새 초원심분리기 튜브에 저장된 물[세척 제어]을 테스트).
2. EV가 고갈된 저내독소 소태아혈청(EE-FBS)의 제조
- 초저 내독소 FBS(시판, 재료 표 참조, <0.1 EU/mL)를 사용하십시오.
- 초저내독소 FBS 병을 수조에 넣고 56°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계는 보완 시스템을 비활성화하는 데 필요합니다.
- 비활성화된 FBS를 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고 4°C에서 4시간 동안 100,000 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 멸균된 50mL 튜브에 모으고 튜브당 45mL를 초과하지 않도록 하여 캡 오염을 방지하고 튜브 링을 적시십시오.
- 이와 같이 제조된 EE-FBS 혈청을 -20°C에서 보관한다. EE-FBS에서 LPS의 농도를 확인하십시오(6단계). LPS 농도는 초원심분리 전과 같은 수준이어야 합니다.
3. 세포 배양
- 이 연구를 위해 SW480 및 SW620 세포주를 4.5g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산나트륨 및 겐타마이신(50μL/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 무균 기술을 사용하여 75cm2 배양 플라스크에서 배양했습니다. SW480 및 SW620에 대해 각각 플라스크당 거의 4.5 x 10 6 셀 및 6.5 x 106 셀을 시드합니다.
- 세포가 완전한 밀도(SW480 및 SW620의 경우 각각 플라스크당 ~13.5 x 106 및 20 x 10 6 세포)에 도달하면 일주일에 두 번(플라스크당 ~10mL) 상층액을 수집하고 분할합니다. 세포의 생존율이 99% 이상인지 확인하고 세포가 5%CO2 분위기에서 37°C에서 배양되는지 확인한다.
- 세포 배양에서 상층액을 적절하게 표지된 15mL 튜브에 수집합니다. 수집된 상층액을 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
- 상층액을 조심스럽게 수집하고, 파편을 흡입하지 않도록 하고, 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 4°C에서 12분 동안 3,200 x g 에서 다시 원심분리합니다.
- 두 번째 원심분리 단계에서 얻은 상층액을 라벨이 붙은 멸균된 50mL 튜브에 수집합니다. 튜브의 가장자리가 젖지 않도록 하십시오. 상청액의 부피가 45mL를 초과하지 않고 튜브가 수직으로 유지되는지 확인하십시오.
- 튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 상층액을 -80°C의 수직 위치에 보관합니다.
참고: Mycoplasma spp.의 월간 제어를 수행합니다. 및 신선한 배양 상청액에서의 LPS 오염 (단계 6). 상층액의 내독소 수준이 0.05 EU/mL를 초과하는 경우 오염이 발생했을 수 있는 단계를 확인하고 처음부터 공정을 다시 시작하십시오. Mycoplasma spp.에 의한 세포 배양물의 오염 감지되면 이러한 상청액으로부터 EV의 분리를 중단해야 합니다.
4. 세포 배양 상층액에서 EV의 분리
- 0.22μm 주사기 필터와 적절한 부피의 주사기를 준비합니다. 배양 상청액(90mL)이 담긴 두 개의 튜브를 준비합니다.
- 주사기에 상층액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 부착하십시오. 필터가 있는 채워진 주사기를 50mL 튜브 위에 놓습니다. 플런저 플랜지를 누르고 ~90mL의 여과액을 수집합니다.
- 여과액(7 mL)을 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고(적절한 균형을 위해 동일한 부피가 각 튜브에 피펫팅되도록 보장) 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다.
참고: EV 펠릿화의 효율은 EV의 더 나은 회수를 위해 최적화되어야 하는 많은 요인(예: 로터 유형, k-factor, 이동 경로 길이, 매체의 점도 등)에 따라 달라집니다(20). - 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 여과된 긴 피펫 팁을 사용하여 나머지 펠릿을 수집하고 두 개의 초원심분리기 튜브에 풀링합니다. 여과된 내독소가 없는 PBS로 최대 7mL를 채워 EV를 헹굽니다.
- PBS 재현탁 펠릿을 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하고 여과된 내독소가 없는 PBS 200μL를 두 튜브에 추가하여 EV를 재현탁합니다. EV 펠릿을 부드럽게 피펫팅하여 모든 EV를 수집합니다.
- EV 현탁액을 멸균된 1.5mL 시험관으로 옮깁니다(가능하면 저단백질 결합 튜브 사용). 나노입자 추적 분석(NTA) 및 기타 목적(예: 단백질 농도 측정)을 위한 희석액을 준비하기 위해 EV 현탁액 10μL를 유지합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 NTA로 측정하기 위해 여과된 PBS(1:1,000)로 EV를 희석합니다. 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸 EV 튜브를 고정합니다. EV를 -80 °C에서 보관하십시오.
5. 웨스턴 블로팅에 의한 특정 마커 검출
- 샘플에서 단백질 수준을 결정하고(예를 들어, 브래드포드 분석에 의해), 로딩 완충액으로 샘플(20 μg)을 준비한다. 5 μL의 샘플 버퍼(4x)와 2 μL의 샘플 환원제(10x)를 총 부피 20 μL로 혼합하여 로딩 버퍼를 준비합니다. 샘플을 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
- SDS(10%-14%)로 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 20μg의 EV를 각 웰에 로드합니다.
- 150V에서 45분 동안 러닝 버퍼(트리스 30g, 글리신 144g, 1L당 10% SDS)로 전기영동을 실행합니다.
- Towbin 버퍼(트리스 1.51g, 글리신 7.2g, 0.5L당 10% 메탄올)를 사용하여 이송 기계에서 겔에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 25V에서 1시간 동안 반건식으로 전달합니다.
- 멤브레인을 TBST 완충액 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹하기 위해 TBST 완충액(1 L 당 1 mL의 Tween, 100 mL의 Tris-완충 식염수(TBS 10x))에 넣고, RT에서 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 희석된(1:1,000) 항체, 항-CD9 1(클론#D8O1A) 또는 항-알릭스 1(클론#3A9)을1% BSA에 넣고 로커에서 4°C에서 밤새 멤브레인과 함께 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.
- 멤브레인의 1차 항체에 따라 염소 항토끼 또는 염소 항-마우스(희석: 1:2,000) 2차 항체를 양고추냉이 과산화효소와 접합하고 RT의 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.
- 기질과 루미놀을 1:1 비율로 혼합하여 1mL 용액을 얻습니다. 멤브레인에 용액을 붓습니다. 멤브레인을 이미징 시스템의 측정 챔버에 즉시 배치하고, 화학발광 모듈을 선택하고, 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다.
6. Limulus Amebocyte Lysate test(LAL)에 의한 내독소 수준 측정
- 제조업체의 권장 사항에 따라 내독소 수준의 발색 LAL 측정을 수행합니다. 간단히 말해서, 내 독소와 limulus amebocyte lysate (LAL)의 상호 작용에 기초한 방법을 사용하십시오. 이 방법의 검출 한계는 0.005 EU/mL입니다.
참고: LAL 분석은 한계에도 불구하고 현재 과학 또는 의학에서 사용되는 다양한 종류의 용액 및 기타 제품에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 표준 방법으로 남아 있습니다8. 이 키트의 제한 요소는 재구성 직후 동결된 경우 -20°C에서 1주일 동안만 안정한 재구성된 아메보사이트 용해물 용액의 안정성입니다. - EV 및 기타 샘플의 10배 희석과 혈청의 50배 희석을 사용하십시오. 추가 실험을 위해 EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI(<0.005 EU/mL) 및 LPS가 없는 배양 상층액과 같은 저내독소 시약만 사용하십시오.
7. EV 샘플에서 원핵 16S rRNA 유전자 검출
- EV 샘플에서 DNA를 분리합니다. 시약과 격리 부위를 무균 상태로 유지하십시오. DNA 농도 및 품질을 측정합니다(예: 분광 광도계 사용).
- 앞서 설명한 바와 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한다21. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 녹색으로 1.5% 아가로스 겔을 준비하여 PCR 산물을 자외선(UV)으로 시각화합니다.
- TRIS-아세테이트-EDTA 버퍼를 사용하여 45분 동안 75V에서 샘플 및 중량 마커의 전기영동을 실행합니다. 이미징 시스템을 사용하여 DNA 밴드를 시각화합니다.
8. 인간 단핵구 모델에서 자극을 위한 효과적인 LPS 농도의 결정
- L-글루타민, 포도당 및 2% EE-FBS가 보충된 RPMI 1640에 2 x 106 단핵구/mL의 단핵구 현탁액을 준비합니다. 96-웰 조직 배양 플레이트22의 웰 당 50 μL의 현탁액을 첨가한다.
- 적절한 부피의 LPS 또는 배양 배지를 추가하여 0 pg/mL(대조군), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL 및 100 ng/mL, 100 μL 총 부피의 세포 현탁액. 각 LPS 농도를 세 번 만듭니다.
- 세포를 37°C, 5%CO2에서 18시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집합니다.
- 상층액을 2,000 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 수집된 상층액에서 TNF 8,23 및 IL-10 23 농도를 유세포 분석기로 제조업체의 절차에 따라 세포측정 비드 어레이(CBA) 인간 사이토카인 키트로 측정합니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 전제 조건 또는 필수 단계는 시약에서 가능한 내독소 오염을 배제하는 것입니다. FBS, DMEM, RPMI, PBS 및 초원심분리기 튜브와 같이 사용되는 모든 시약은 내독소가 없어야 합니다(<0.005 EU/mL). 예를 들어, 세포 배양을 위한 일반/표준 혈청이 풍부한 공급원이 될 수 있기 때문에 내독소 오염이 없는 체계를 유지하는 것은 쉽지 않습니다(0.364 EU/mL, 표 1 참조).
이 프로토콜은 내독소 함량이 낮은 EV를 분리하기 위해 개발되었지만 분리된 EV를 특성화하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 EV는 두 개의 대장암 세포주인 SW480과 SW620에서 분리되었습니다. EVs 마커인 CD9 및 Alix의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 1A). SW480 및 SW620 셀에서 분리된 EV의 평균 크기에는 차이가 없었습니다(각각 134nm 및 128.2nm; 그림 1B). 또한, 이들 세포주 사이에 분리된 EV의 농도에는 차이가 없었습니다(그림 1C). NTA에 의해 측정된 EV 크기의 예시적인 분포는 그림 1D에 나와 있습니다. 초원심분리 시간은 Cvjetkovic et al.20의 결과에 따라 최적화되었습니다. 간단히 말해서, 두 개의 고정각 로터(70Ti 및 T-1270) 사이의 원심 실행 매개변수 변환을 위한 수학 공식이 사용되었습니다. 100,000 x g에서 120분 동안 T-1270 로터로 회전하여 소형 EV 고갈의 효과는 155분 동안 118,000 x g에서 70Ti 로터를 사용하여 달성한 것보다 약간 낮았습니다. 그러나 여전히 효과적인 RNA 및 단백질 펠릿화 범위에 있었습니다. 계산은 실험 데이터(표 S1)에 의해 확인되었으며, 여기서 연장된 원심분리 시간(4시간 대 2시간)은 펠릿화되거나 상층액에 여전히 존재하는 EV의 수에 의미 있는 영향을 미치지 않았습니다.
단핵구 반응을 일으킨 LPS의 수준을 평가하였다. 이를 위해 인간 단핵구를 연속적인 농도의 LPS(0pg/mL, 10pg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 1ng/mL 및 100ng/mL)로 배양했습니다. 하룻밤 배양 후, 배양 상청액에서 IL-10 및 TNF의 수준을 측정하였다. 이 연구에서 단핵구에서 IL-10 및 TNF의 분비를 가능하게 하는 LPS의 최저 용량은 50pg/mL였으며 이는 0.5EU/mL에 해당합니다(그림 2).
마지막으로 마지막 단계는 위와 같이 분리된 EV의 LPS 수준을 테스트하는 것과 관련이 있습니다. EV 샘플의 LPS 오염은 약 0.5 EU/mL(50 pg/mL; 그림 3) 두 세포주 모두(SW480 및 SW620의 경우 각각 45.80 ± 20.39pg/mL 및 48.75 ± 7.412pg/mL). 즉, 1μL의 EV(약 10개의9EV )에는 0.05pg 미만의 내독소가 포함되어 있으며, 100μL의 단핵구 현탁액(단핵구 1개당10개의 4EV 의 비율)에 추가하면 100배 희석됩니다(LPS의 최종 농도는 약 0.5pg/mL).
또한, EV의 순도는 SW480 및 SW620 세포주에서 분리된 EV에서 박테리아 오염의 부족을 확인하는 16S rRNA 유전자21에 대한 PCR에 의해 테스트되었습니다(보충 그림 1).
그림 1: 분리된 EV의 특성화. (A) SW480 및 SW620 세포주에서 분리된 EV의 단백질 마커에 대한 웨스턴 블롯 분석. (B) SW480 및 SW620 세포주에서 분리된 EVs의 크기(nm)를 측정하기 위해 NTA를 사용하였다. (C) NTA를 사용하여 SW480 및 SW620 세포주(EV/mL)에서 분리된 EV의 농도를 측정했습니다. (D) NTA로 측정한 EV 크기의 예시 분포(파란색 숫자는 곡선의 특정 지점에서 입자 크기를 나타냄). B 및 C의 데이터는 평균 ± SD(n=10)로 표시됩니다. 통계 분석을 위해 t-test를 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 용량의 LPS로 자극된 단핵구에 의한 IL-10 및 TNF 분비. 단핵구에 의한 사이토카인의 분비는 대조군 단핵구(MO)와 비교하여 10pg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 1ng/mL 및 100ng/mL와 같이 표시된 대로 LPS 용량으로 자극한 후 결정되었습니다. 데이터는 평균 ± SD(n=4)로 표시됩니다. Mann-Whitney U 검정을 사용하였다. TNF 및 IL-10 농도는 세포측정 비드 어레이(CBA) 방법에 의해 배양 상청액에서 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 발색 LAL 테스트를 통해 분리된 EV 샘플의 LPS 수준 측정. EV 샘플의 LPS 함량ampSW480 및 SW620 세포주에서 얻은 파일(pg/mL). 데이터는 평균 ± SD(n=6)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| S.No. | 견본 | 내독소 수준[EU/mL] | 내독소 수준[pg/mL] | ||
| 1 | 디엠엠 | <0.005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 시리즈 | <0.005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS 초저 내독소 | <0.005 | <0.5 | ||
| 4 | 4시간 원심분리 후 FBS 초저내독소(EE-FBS) | <0.005 | <0.5 | ||
| 5 | 일반 FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | 필터링된 PBS | <0.005 | <0.5 | ||
| 7 | 2시간 원심화 후 배양 상청액 형태 SW480 세포 | <0.005 | <0.5 | ||
| 8 | 2시간 원심분리 후 SW620 세포에서 배양 상등액 | <0.005 | <0.5 | ||
| 9 | 세척 제어(초원심분리기 튜브에 저장된 물) | <0.005 | <0.5 | ||
표 1: 발색 LAL 시험에 의해 결정된 다양한 시약 및 샘플의 LPS 수준. 측정값은 EU/mL 및 pg/mL로 표시됩니다. 샘플에는 DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, 여과된 PBS 및 세척 제어(초원심분리 튜브의 물)가 포함되었습니다.
보충 표 1 : SW480 및 SW620 세포주와 PBS에서 배양 상층액을 2시간 또는 4시간 원심분리한 후 펠릿 및 상층액에서 EV 농도(EV/mL) 및 크기(nm) 측정의 대표적인 예. 측정은 NTA에 의해 수행되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 다음 샘플에서 pan-prokaryote 16S rRNA 유전자 증폭의 PCR 결과, 왼쪽부터: 분자량 사다리(MW, 100-1000 bp), NC-음성 대조군, SW480 및 SW620 유래 EV, 및 PC(양성 대조군-박테리아 DNA) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 몇 년 동안, 적절한 전기차 분리를 위한 방법들이 점점 더 중요해졌으며, 예를 들어, 신뢰할 수 있는 오믹스 및 기능 데이터를 얻는 맥락에서 더욱 신뢰할 수 있는 분석이 가능해졌다24. 이전 연구 경험에 비추어 볼 때, 격리 방법의 유형뿐만 아니라이 절차 중 다른 조건도 중요 할 수 있습니다. EV-고갈 FBS의 사용은 필요성으로 널리 인식되고 있다25,26; 그러나 EV의 내독소 오염 모니터링은 종종 무시됩니다.
그럼에도 불구하고 EV 격리에 사용되는 모든 방법은 절차의 모든 단계에서 엄격한 무균 취급 및 품질 관리에 대한 표준을 개발해야 합니다. 이는 EV의 추가 다운스트림 애플리케이션으로 인해 특히 중요합니다. 제안된 프로토콜은 내독소에 민감한 단핵구 및 대식세포와 같은 내독소 민감성 세포에 대한 이전 경험의 결과입니다. 단핵구의 마커인 CD14는 피코몰 농도에서 LPS에 결합할 수 있습니다. 얻어진 결과는 단핵구가 50pg/mL(0.5EU/mL)의 LPS로 자극한 후 TNF와 IL-10을 분비한다는 것을 나타냅니다. 그러나 Yang 등은 0.1 EU/mL(10pg/mL)의 내독소도 강력한 반응(염증성 IL1B 유전자의 상향 조절)을 유발할 수 있다고 보고했습니다.27. 또한, Chaiwut et al. 단핵구에서 TNF와 IL-6의 세포 내 생산은 각각 2.5 pg / mL 또는 5 pg / mL의 더 낮은 농도의 LPS에 의해 유도 될 수 있음을 입증했다23. Alvarez et al. 단핵구 활성화율(계산값)은 5pg/mL와 같은 작은 농도의 LPS 후에 상승하는 것을 확인했습니다28. 따라서 분리 프로토콜의 가능한 모든 단계에서 EV의 내독소 오염을 제한하는 것은 LPS에 민감한 세포로 수행되는 추가 실험에 매우 중요합니다. 현재 초원심분리는 EV 절연에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 그러나 우리가 아는 한, 이 방법으로 분리된 EV의 LPS 오염에 대한 연구는 없습니다. 따라서 위의 프로토콜은 배양 상청액에서 외부 EV 오염 없이 낮은 내독소 EV를 얻는 데 중점을 둡니다.
위에서 언급했듯이 내독소 오염에는 다양한 원인이 있을 수 있습니다. 첫째, 내 독소는 힘든 oppponent이며, 유리 또는 플라스틱 제품의 모든 살균 방법이 제거 또는 분해에 효과적이지는 않다는 점을 강조해야합니다. 예를 들어, 표준 오토클레이빙 절차는 내독소의 높은 열 안정성으로 인해 LPS를 제거할 수 없다27. 또한 광범위하게 세척해도 내 독소를 완전히 제거 할 수 없습니다. 플라즈마 또는 ETO (에틸렌 옥사이드) 멸균18,19와 같은 실험실 실습에 더 많은 발열 제거 방법을 적용함으로써 내 독소 오염을 제한 할 수 있습니다. 다음으로, 오염 가능성에 대한 영구적인 모니터링과 예방이 중요합니다. 제시된 결과는 배양 보충을 위해 혈청과 같은 초저 내독소 시약을 사용하는 것의 중요성을 나타냅니다. 또한 모든 시약(예: PBS, DMEM 및 RPMI)과 플라스틱 제품(예: 튜브)의 내독소 오염을 일상적으로 제어하는 것이 좋습니다. 또한 내독소 축적을 방지하기 위해 EVs 분리 전에 배양 상층액을 사전 확인해야 합니다. 상기 제시된 바와 같이, LAL 분석에 의한 내독소 수준의 표준 측정에 대한 흥미로운 대안은 박테리아 16s rRNA 유전자의 PCR 증폭입니다. EV에서 LPS의 허용(단핵구 자극을 유도하지 않음) 내독소 수준을 결정하는 것이 중요합니다. 배양 조건(적용된 EVs의 단핵구 농도 및 LPS에 의한 오염, EVs의 농도; 그림 3), EV로 자극된 단핵구에 영향을 미치는 내독소의 최종 농도는 0.5pg/mL 이하입니다(EV는 일반적으로 100-1,000배 희석됨). 이 용량은 단핵구에 의한 TNF 생성을 유도할 수 있는 가장 효과적이지 않은 용량(2.5pg/mL)으로 Chaiwut 등이 가정한 것보다 5배 낮다23. Chaiwut et al. 연구, 사이토카인 생산은 유세포 분석을 사용하여 결정되었으며 정량화 없이 MFI(평균 형광 강도) 이동으로 제시되었습니다. 또한, 매우 낮은 용량의 LPS를 사용한 단핵구 자극은 LPS23의 추가 공급원이 될 수 있는 10% FBS가 보충된 배지에서 수행되었습니다. 이는 단핵구 자극에 사용된 LPS의 유효 용량이 더 높았음을 시사할 수 있다. 따라서 제시된 결과와 문헌 데이터를 고려할 때 EV에서 최대 50pg/mL(0.5EU/mL)의 내독소 농도는 허용적이며 단핵구 활성화의 원인이 아닌 것으로 보입니다. 이 프로토콜을 최적화하는 다음 단계는 LAL 또는 세포 기반 분석으로 검출되지 않는 수준까지 내독소 오염을 추가로 줄이는 것입니다. 최근, 낮은 내독소 회수율(LER)이라고 하는 마스킹된 내독소 오염을 검출하기 위해 생물학적 모델을 사용하는 것이 중요하다는 것이 강력히 권장되고 있다8.
따라서 이 프로토콜은 다른 연구에서 아직 다루지 않은 가능한 가장 낮은 내독소 함량을 가진 EV의 분리에 필요한 모든 측면을 수집하기 때문에 이 점에서 혁신적입니다.
각 방법과 마찬가지로 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 제안된 프로토콜은 내독소 오염을 감소시키지만 제거하지는 않습니다. 둘째, 달성 된 순도가 다른 면역 세포에 충분한 지 여부는 알려져 있지 않습니다. 따라서 각 프로토콜은 추가 적용을 위해 조정되어야 합니다. 이러한 프로토콜을 수립하면 우발적인 오염보다 EV의 생물학적 활성 구성 요소에 더 부합하는 결과를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 절차는 여러 내 독소 테스트 키트와 낮은 내 독소 혈청을 구입해야하기 때문에 평소보다 비용이 많이 듭니다. 유망한 대안으로 Bussolati는 접선 유동 여과에 의한 EV 격리를 위한 새롭고 정교한 방법을 제시했습니다. 이 방법을 사용하면 내독성이 낮은(0.1-0.7 EU/mL, 10-70 pg/mL)29의 EV를 획득할 수 있습니다. 지금까지 이 새로운 방법은 EV 절연에 일반적으로 사용되지 않았으며 접선 유동 여과(TFF) 시스템 형태의 특수 장비가 필요합니다. 최근 Gałuszka et al. 폴리믹신 B30을 사용하여 대기 오염 물질(EV 크기는 있지만 막 구조가 없는 입자상 물질)에서 내독소를 제거하는 다른 방법을 제안했습니다. 그러나 세포 유래 소포에 대한 이 프로토콜의 유용성은 특히 생체 내 실험을 고려할 때 생물학적 모델을 통해 검증되어야 합니다. 폴리믹신 B와 소듐 데옥시콜레이트(내독소 제거에도 적용 가능)는 이전에 신경독성 및 신독성으로 기술된 바 있다31. 다른 가능성은 내독소에 선택적으로 결합하는 폴리(ε-라이신)와의 친화성 컬럼입니다. 이 방법은 빠르고 효율적이지만 단백질 샘플/용액 전용입니다. 따라서 전기차와 같은 복잡한 구조에 적용하려면 검증32가 필요합니다. 또한, 이 컬럼은 초기 내독소 수준이 높은 시료를 대상으로 하며, 상대적으로 적은 양의 LPS를 제거하는 데 미치는 영향은 알려져 있지 않으며 검증이 필요합니다. LPS 고갈 컬럼으로 정제한 후 최종 예상 LPS 농도는 면역 세포 검사에 비해 여전히 너무 높을 수 있습니다(예: <5 EU/mL).
요약하면, 이 프로토콜은 EV 분리의 모든 단계에서 엄격한 무균 기술, 초저 내독소 시약 사용, 모든 절차 단계에서 내독소 불순물 모니터링, 멸균 방법 변경과 같은 몇 가지 원칙을 실험실 실습에 적용하여 내독소 오염을 방지하는 방법을 제안했습니다. 또한, 제시된 프로토콜은 분리 절차의 모든 단계에서 내독소 수준을 제어하는 방법에 대한 힌트를 제공합니다. EV에 존재하는 LPS는 면역 세포의 기능에 영향을 미치므로 이러한 세포로 수행된 분석에서 잘못된 결과를 유발할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 잠재적인 이해 상충으로 구성될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(National Science Centre)의 보조금 번호 2019/33/B/NZ5/00647의 지원을 받았습니다. EV에서 박테리아 DNA를 검출하는 데 귀중한 도움을 주신 Jagiellonian University Medical College의 분자 의료 미생물학과의 Tomasz Gosiewski 교수와 Agnieszka Krawczyk 교수에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
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