Summary
El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EV) son una población heterogénea de vesículas de membrana liberadas por las células in vitro e in vivo. Su omnipresencia y su importante papel como portadores de información biológica los convierten en objetos de estudio intrigantes, que requieren protocolos confiables y repetitivos para su aislamiento. Sin embargo, darse cuenta de todo su potencial es difícil ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su investigación (como la adquisición adecuada). Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento de EVs pequeñas (según la nomenclatura MISEV 2018) a partir del sobrenadante de cultivo de líneas celulares tumorales basado en centrifugación diferencial. El protocolo incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de EV y cómo evaluarlas adecuadamente. La contaminación por endotoxinas de los vehículos eléctricos puede obstaculizar significativamente los experimentos posteriores o incluso enmascarar sus verdaderos efectos biológicos. Por otro lado, la presencia pasada por alto de endotoxinas puede llevar a conclusiones incorrectas. Esto es de particular importancia cuando se refiere a las células del sistema inmune, incluidos los monocitos, porque los monocitos constituyen una población que es especialmente sensible a los residuos de endotoxinas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente detectar la contaminación por endotoxinas en los EV, especialmente cuando se trabaja con células sensibles a las endotoxinas, como monocitos, macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides o células dendríticas.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EV), según la nomenclatura MISEV 2018, son un término colectivo que describe varios subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos y patológicos 1,2. Además, los vehículos eléctricos son prometedores como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades, así como como agentes terapéuticos y vehículos de administración de fármacos. Sin embargo, realizar todo su potencial es difícil, ya que todavía hay muchos obstáculos técnicos relacionados con su adquisición3. Uno de esos desafíos es el aislamiento de EV libres de endotoxinas, que se ha descuidado en muchos casos. Una de las endotoxinas más comunes es el lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de las paredes celulares bacterianas gramnegativas y puede causar una respuesta inflamatoria aguda, debido a la liberación de un gran número de citoquinas inflamatorias por varias células 4,5. LPS induce una respuesta mediante la unión a la proteína de unión a LPS, seguida de la interacción con el complejo CD14/TLR4/MD2 en las células mieloides. Esta interacción conduce a la activación de vías de señalización dependientes de MyD88 y TRIF, que a su vez desencadenan el factor nuclear kappa B (NFkB). La translocación de NFkB al núcleo inicia la producción de citoquinas6. Los monocitos y macrófagos son altamente sensibles al LPS, y su exposición al LPS resulta en una liberación de citoquinas inflamatorias y quimiocinas (por ejemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 y TNF-α)7,8. La estructura CD14 permite la unión de diferentes especies de LPS con afinidad similar y sirve como co-receptor para otros receptores tipo toll (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 y 9)6. El número de estudios que se están realizando sobre los efectos de las EV en monocitos/macrófagos sigue aumentando 9,10,11. Especialmente desde la perspectiva del estudio de las funciones de los monocitos, sus subpoblaciones y otras células inmunes, la presencia de endotoxinas e incluso su presencia enmascarada en EV es de gran importancia12. La contaminación pasada por alto de los vehículos eléctricos con endotoxinas puede llevar a conclusiones engañosas y ocultar su verdadera actividad biológica. En otras palabras, trabajar con células monocíticas requiere confianza en ausencia de contaminación por endotoxinas13. Las fuentes potenciales de endotoxinas pueden ser agua, medios y sueros obtenidos comercialmente, componentes y aditivos de medios, cristalería de laboratorio y artículos de plástico 5,14,15.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo para el aislamiento de EV con bajo contenido de endotoxinas. El protocolo proporciona consejos simples sobre cómo evitar la contaminación por endotoxinas durante el aislamiento de EV en lugar de eliminar las endotoxinas de EV. Anteriormente, se han presentado muchos protocolos sobre cómo eliminar endotoxinas de, por ejemplo, nanopartículas diseñadas utilizadas en nanomedicina; sin embargo, ninguno de ellos es útil para estructuras biológicas como los EV. La despirogenación efectiva de nanopartículas puede llevarse a cabo mediante enjuague con etanol o ácido acético, calentamiento a 175 °C durante 3 h, irradiación γ o tratamiento con tritón X-100; sin embargo, estos procedimientos conducen a la destrucción de los vehículos eléctricos16,17.
El protocolo presentado es un estudio pionero centrado en evitar las impurezas de endotoxinas en las EV, a diferencia de estudios previos sobre el efecto de las EV en los monocitos9. La aplicación de los principios propuestos a la práctica de laboratorio puede ayudar a obtener resultados de investigación confiables, lo que puede ser crucial cuando se considera el uso potencial de EV como agentes terapéuticos en la clínica12.
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Protocol
1. Preparación de tubos de ultracentrífuga
- Use tubos estériles de un solo uso. Si esto no es posible, reutilice los tubos de ultracentrífuga después de lavarlos con un detergente utilizando una pipeta estéril Pasteur u otros aplicadores de un solo uso. Recuerde que los tubos de ultracentrífuga deben dedicarse a un tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultivo celular / suero / plasma) y especies (humano / ratón / etc.).
- Después de un lavado con detergente, enjuague los tubos de ultracentrífuga con agua desionizada y sin LPS 3x.
NOTA: No utilice agua de baja calidad. - Seque los tubos de ultracentrífuga y luego llénelos con etanol al 70%. Deje los tubos con etanol al 70% para la desinfección durante la noche. Retire el etanol y seque los tubos nuevamente.
- Coloque los tubos y tapas en el embalaje de esterilización y ciérrelos herméticamente. Utilizar el método de esterilización por plasma o gas (óxido de etileno)18,19. Guarde los tubos de ultracentrífuga encerrados en el embalaje de esterilización en un lugar seco y utilícelos antes de la fecha de vencimiento.
NOTA: Realice un monitoreo mensual del nivel de LPS en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el agua utilizada para el aislamiento de EV. El monitoreo también debe incluir los tubos (por ejemplo, probando el agua [control de lavado] que se ha almacenado en los tubos de ultracentrífuga durante la noche a temperatura ambiente [RT]).
2. Preparación de suero fetal bovino con bajo contenido de endotoxinas sin EV (EE-FBS)
- Asegúrese de usar FBS de endotoxinas ultra bajas (disponible comercialmente; ver Tabla de materiales; <0.1 EU/mL).
- Colocar un frasco de endotoxina ultra baja FBS en un baño maría e incubar a 56 °C durante 30 min. Este paso es necesario para desactivar el sistema del complemento.
- Pipetear el FBS inactivado a tubos de ultracentrífuga y centrifugarlo a 100.000 x g durante 4 h a 4 °C. Recoja el sobrenadante en tubos estériles de 50 ml, asegurándose de no exceder los 45 ml por tubo para evitar la contaminación de la tapa y humedecer el anillo del tubo.
- Conservar el suero EE-FBS preparado de esta manera a -20 °C. Compruebe la concentración de LPS en EE-FBS (paso 6). La concentración de LPS debe estar al mismo nivel que antes de la ultracentrifugación.
3. Cultivo celular
- Para este estudio, cultivar líneas celulares SW480 y SW620 en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y gentamicina (50 μL/ml) suplementado con EE-FBS al 10% en matraces de cultivo de 75cm2 utilizando una técnica aséptica. Sembrar casi 4,5 x 106 células y 6,5 x 106 células por matraz para SW480 y SW620, respectivamente.
- Recoger los sobrenadantes dos veces por semana (~10 ml por matraz) cuando las células alcancen la confluencia completa (~13,5 x 10 6 y 20 x 106 células por matraz para SW480 y SW620, respectivamente), y dividir. Asegurar que la viabilidad de las células no sea inferior al 99% y que las células se cultiven a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%.
- Recoja los sobrenadantes del cultivo celular en tubos de 15 ml debidamente etiquetados. Centrifugar los sobrenadantes recolectados a 500 x g durante 5 minutos a RT para eliminar los restos celulares.
- Recoja los sobrenadantes con cuidado, evite aspirar residuos, colóquelos en tubos etiquetados y centrifugar nuevamente a 3.200 x g durante 12 minutos a 4 °C.
- Recoja sobrenadantes del segundo paso de centrifugación en tubos estériles etiquetados de 50 ml. Evite mojar los bordes de los tubos. Asegúrese de que el volumen de sobrenadante no exceda los 45 ml y que los tubos se mantengan verticalmente.
- Envuelva la tapa del tubo con una película transparente estéril y guarde los sobrenadantes en posición vertical a -80 °C.
NOTA: Realizar un control mensual de Mycoplasma spp. y contaminación por LPS en sobrenadantes de cultivo fresco (paso 6). Si el nivel de endotoxina en los sobrenadantes supernadante supera 0,05 EU/ml, verifique en qué etapa podría haberse producido la contaminación y reinicie el proceso desde el principio. Si la contaminación del cultivo celular por Mycoplasma spp. se detecta, el aislamiento de los vehículos eléctricos de tales sobrenadantes debe suspenderse.
4. Aislamiento de EVs de sobrenadantes de cultivos celulares
- Prepare filtros de jeringa de 0,22 μm y jeringas de volumen adecuado. Preparar dos tubos con sobrenadantes de cultivo (90 mL).
- Llene la jeringa con el sobrenadante y conecte el filtro al adaptador de aguja. Coloque la jeringa llena con el filtro sobre un tubo de 50 ml. Empuje la brida del émbolo y recoja ~90 ml de filtrado.
- Pipetear el filtrado (7 ml) a los tubos de ultracentrífuga (asegurándose de que se pipetea el mismo volumen a cada tubo para un equilibrio adecuado) y centrifugar a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C.
NOTA: La eficiencia de la peletización de vehículos eléctricos depende de muchos factores (por ejemplo, el tipo de rotor, su factor k, la longitud de la ruta de migración, la viscosidad del medio, etc.), que deben optimizarse para una mejor recuperación de los vehículos eléctricos20. - Deseche el sobrenadante con una pipeta estéril de Pasteur. Recoja los gránulos restantes con puntas de pipeta largas y filtradas y agrúyelos en dos tubos de ultracentrífuga. Llénelos hasta 7 ml con PBS filtrado libre de endotoxinas para enjuagar los EV.
- Centrifugar los pellets resuspendidos con PBS a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C. Retire completamente el sobrenadante con una pipeta estéril de Pasteur y añada 200 μL de PBS filtrado y libre de endotoxinas a ambos tubos para resuspender los EV. Pipetea suavemente el pellet de EV para recoger todos los EV.
- Transfiera la suspensión EV a un tubo de ensayo estéril de 1,5 ml (si es posible, use un tubo de unión a proteínas bajas). Retener 10 μL de la suspensión EV para preparar una dilución para el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y para otros fines (por ejemplo, medición de la concentración de proteínas).
- Diluir los EV con PBS filtrado (1:1.000) para mediciones por NTA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegure los tubos EV envolviendo la tapa con una película transparente estéril. Guarde los vehículos eléctricos a -80 °C.
5. Detección de marcadores específicos por western blotting
- Determinar el nivel de proteína en las muestras (por ejemplo, mediante el ensayo de Bradford) y preparar las muestras (20 μg) con tampón de carga. Preparar el tampón de carga mezclando 5 μL de tampón de muestra (4x) y 2 μL de agente reductor de muestras (10x) hasta un volumen total de 20 μL. Incubar las muestras a 70 °C durante 10 min.
- Prepare geles de poliacrilamida con SDS (10%-14%) y cargue los 20 μg de EV en cada pocillo.
- Ejecutar la electroforesis con tampón de funcionamiento (30 g de Tris, 144 g de glicina, 10% SDS por 1 L) durante 45 min a 150 V.
- Realizar la transferencia semiseca de proteínas del gel a la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) en una máquina de transferencia con tampón Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glicina, 10% de metanol por 0,5 L) a 25 V durante 1 h.
- Coloque la membrana en tampón TBST (1 ml de Tween, 100 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS 10x) por 1 L) para bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en tampón TBST, e incube durante 1 h en el balancín en RT.
- Añadir anticuerpos diluidos (1:1.000), anti-CD9 1 (clon#D8O1A) o anti-Alix 1 (clon#3A9), en BSA al1% e incubar con la membrana durante la noche a 4 °C en el balancín. Retire los anticuerpos y lave la membrana 3x con 10 mL de 1x TBST durante 10 minutos.
- Añadir anticuerpo secundario anticonejo de cabra o antiratón de cabra (dilución: 1:2.000) conjugado con peroxidasa de rábano picante, dependiendo del anticuerpo primario en la membrana, e incubar durante 1 h en el balancín en RT. Eliminar anticuerpos y lavar la membrana 3x con 10 ml de 1x TBST durante 10 minutos.
- Mezcle el sustrato y el luminol en una proporción de 1:1 para obtener una solución de 1 ml. Vierta la solución sobre la membrana. Coloque la membrana inmediatamente en la cámara de medición del sistema de imágenes, elija el módulo de quimioluminiscencia y visualice las bandas de proteínas en la pantalla.
6. Medición del nivel de endotoxinas mediante la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL)
- Realizar la medición cromogénica de LAL del nivel de endotoxinas, de acuerdo con la recomendación del fabricante. Brevemente, use el método basado en la interacción de la endotoxina con el lisado de amebocitos de limulus (LAL). El límite de detección de este método es de 0,005 EU/mL.
NOTA: El ensayo LAL, a pesar de sus limitaciones, sigue siendo actualmente el método estándar para detectar y cuantificar la contaminación por endotoxinas en diferentes tipos de soluciones y otros productos utilizados en ciencia o medicina8. El factor limitante de este kit es la estabilidad de la solución de lisado de amebocitos reconstituida, que es estable durante solo 1 semana a -20 °C si se congela inmediatamente después de la reconstitución. - Use una dilución diez veces mayor de EV y otras muestras y una dilución de suero de 50 veces. Para experimentos adicionales, use solo reactivos de endotoxinas bajas como EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 EU/mL) y sobrenadantes de cultivo libres de LPS.
7. Detección del gen procariota 16S rRNA en muestras de EV
- Aislar el ADN de las muestras EV. Trate de mantener los reactivos y el sitio de aislamiento asépticos. Mida la concentración y calidad del ADN (por ejemplo, usando un espectrofotómetro).
- Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describió anteriormente21. Prepare gel de agarosa al 1,5% con bromuro de etidio o verde SYBR para visualizar los productos de PCR en luz ultravioleta (UV).
- Ejecute la electroforesis de la muestra y el marcador de peso con tampón TRIS-acetato-EDTA a 75 V durante 45 min. Visualice las bandas de ADN utilizando el sistema de imágenes.
8. Determinación de la concentración efectiva de LPS para la estimulación en el modelo de monocitos humanos
- Preparar 2 x 106 monocitos/ml de suspensión de monocitos en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina, glucosa y EE-FBS al 2%. Añadir 50 μL de la suspensión por pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos22.
- Añadir un volumen adecuado de LPS o medio de cultivo para obtener las siguientes concentraciones finales: 0 pg/mL (control), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL y 100 ng/mL, en 100 μL de volumen total de suspensión celular. Haga triplicados de cada concentración de LPS.
- Cultivar las células durante 18 h a 37 °C, 5%CO2. Recoge el sobrenadante.
- Girar el sobrenadante a 2.000 x g durante 5 min. Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos. Mida la concentración de TNF8,23 e IL-1023 en sobrenadantes recolectados con el kit de citoquinas humanas de matriz de perlas citométricas (CBA), de acuerdo con el procedimiento del fabricante, con un citómetro de flujo.
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Representative Results
Un requisito previo o paso obligatorio para este protocolo es la exclusión de la posible contaminación por endotoxinas de los reactivos. Todos los reactivos utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e incluso tubos de ultracentrífuga, deben estar libres de endotoxinas (<0.005 EU/mL). Mantener el régimen de no contaminación por endotoxinas no es fácil ya que, por ejemplo, el suero regular/estándar para cultivo celular puede ser su fuente rica (0,364 EU/ml; ver Tabla 1).
Aunque este protocolo fue desarrollado para aislar EVs con bajo contenido de endotoxinas, es importante caracterizar los EVs aislados. En este estudio, los EV se aislaron de dos líneas celulares de cáncer colorrectal, SW480 y SW620. La expresión de los marcadores EVs, CD9 y Alix, fue confirmada por Western blot (Figura 1A). No hubo diferencias en el tamaño medio de los EV aislados de las células SW480 y SW620 (134 nm y 128,2 nm, respectivamente; Figura 1B). Además, no hubo diferencias en la concentración de EV aisladas entre estas líneas celulares (Figura 1C). Las distribuciones ejemplares del tamaño EV, medidas por NTA, se presentan en la Figura 1D. El tiempo de ultracentrifugación fue optimizado de acuerdo con los resultados de Cvjetkovic et al.20. Brevemente, se utilizó la fórmula matemática para la conversión de parámetros de funcionamiento centrífugo entre dos rotores de ángulo fijo (70Ti y T-1270). La efectividad del agotamiento de los EV pequeños al girar con un rotor T-1270 durante 120 min a 100,000 x g fue ligeramente menor que la lograda al usar un rotor 70Ti a 118,000 x g durante 155 min; sin embargo, todavía estaba en el rango de granulación efectiva de ARN y proteínas. El cálculo fue confirmado por datos experimentales (Tabla S1), donde el tiempo prolongado de centrifugación (4 h vs. 2 h) no tuvo un impacto significativo en el número de EV peletizados o aún presentes en sobrenadantes.
Se evaluó el nivel de LPS que causó una respuesta de monocitos. Para ello, se cultivaron monocitos humanos con concentraciones sucesivas de LPS (0 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL y 100 ng/mL). Después del cultivo nocturno, se determinó el nivel de IL-10 y TNF en los sobrenadantes del cultivo. En este estudio, la dosis más baja de LPS que permite la secreción de IL-10 y TNF en monocitos fue de 50 pg/mL, lo que correspondió a 0,5 EU/mL (Figura 2).
Finalmente, el último paso se relacionó con probar el nivel de LPS en los EV aislados como se mencionó anteriormente. La contaminación por LPS de las muestras de EV fue de alrededor de 0,5 EU/mL (50 pg/mL; Figura 3) para ambas líneas celulares (45,80 ± 20,39 pg/mL y 48,75 ± 7,412 pg/mL para SW480 y SW620, respectivamente). Esto significa que 1 μL de EV (alrededor de 109 EVs) contiene menos de 0,05 pg de endotoxina, y cuando se agrega a 100 μL de suspensión de monocitos (proporción de 104 EVs por un monocito) se diluye 100 veces (la concentración final de LPS es de alrededor de 0,5 pg/mL).
Además, la pureza de los EV se probó mediante PCR para el gen21 del ARNr 16S, lo que confirma la falta de contaminación bacteriana en los EV aislados de las líneas celulares SW480 y SW620 (Figura complementaria 1).
Figura 1: Caracterización de EVs aislados. (A) Análisis de Western blot de los marcadores proteicos de EVs aislados de líneas celulares SW480 y SW620. (B) NTA se utilizó para medir el tamaño de los EV aislados de las líneas celulares SW480 y SW620 (nm). (C) NTA se utilizó para medir la concentración de EVs aislados de líneas celulares SW480 y SW620 (EVs/mL). (D) Distribuciones ejemplares del tamaño de los vehículos eléctricos, medidos por NTA (los números azules indican el tamaño de partícula en un punto dado de la curva). Los datos en B y C se presentan como media ± DE (n = 10); Se utilizó la prueba t para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Secreción de IL-10 y TNF por monocitos estimulados con diferentes dosis de LPS. La secreción de citocinas por los monocitos se determinó después de la estimulación con dosis de LPS según lo indicado: 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL y 100 ng/mL, en comparación con los monocitos control (MO). Los datos se presentan como media ± DE (n = 4); Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. Las concentraciones de TNF e IL-10 se midieron en sobrenadantes de cultivo mediante el método de matriz de perlas citométricas (CBA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición del nivel de LPS en muestras aisladas de EV mediante prueba cromogénica de LAL. Contenido de LPS en muestras de EV obtenidas de líneas celulares SW480 y SW620 (pg/mL). Los datos se presentan como media ± DE (n = 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| S.No. | muestra | nivel de endotoxinas [UE/ml] | nivel de endotoxinas [pg/mL] | ||
| 1 | DMEM | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 3 | FBS endotoxina ultra baja | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 4 | FBS endotoxina ultra baja después de 4 h de centrifugación (EE-FBS) | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 5 | FBS regular | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | PBS filtrado | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 7 | sobrenadante de cultivo forma células SW480 después de 2 h de centrifigación | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 8 | sobrenadante de cultivo de células SW620 después de 2 h de centrifugación | <0,005 | <0,5 Español | ||
| 9 | Control de lavado (agua almacenada en tubos de ultracentrífuga) | <0,005 | <0,5 Español | ||
Tabla 1: Nivel de LPS en diversos reactivos y muestras determinado por prueba de LAL cromogénica. Las mediciones se presentan como EU/mL y pg/mL. Las muestras incluyeron DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, PBS filtrado y control de lavado (agua de tubos de ultracentrifugación).
Cuadro complementario 1: Ejemplos representativos de mediciones de concentración de EVs (EVs/mL) y tamaño (nm) en pellets y sobrenadantes después de 2 h o 4 h de centrifugación de sobrenadantes de cultivo de líneas celulares SW480 y SW620 y PBS. Las mediciones fueron realizadas por NTA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 1: Resultados de PCR de amplificación del gen pan-procariota 16S rRNA en las siguientes muestras, desde la izquierda: escala de peso molecular (MW, 100-1000 pb), control NC-negativo, EVs derivados de SW480 y SW620, y PC (control positivo-ADN bacteriano) Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En los últimos años, los métodos para el aislamiento adecuado de los vehículos eléctricos se han vuelto cada vez más importantes, lo que permite sus análisis más confiables, por ejemplo, en el contexto de la obtención de datos ómicos y funcionales confiables24. Con base en la experiencia de investigación previa, parece que no solo el tipo de método de aislamiento, sino también otras condiciones durante este procedimiento pueden ser importantes. El uso de FBS sin EV es ampliamente reconocido como una necesidad25,26; sin embargo, a menudo se descuida el monitoreo de la contaminación por endotoxinas en los vehículos eléctricos.
Sin embargo, todos los métodos utilizados para el aislamiento de vehículos eléctricos deben haber desarrollado estándares para el manejo aséptico riguroso y el control de calidad en cada etapa del procedimiento. Esto es particularmente significativo debido a la aplicación posterior de los vehículos eléctricos. El protocolo propuesto es el resultado de la experiencia previa con células sensibles a las endotoxinas, como los monocitos y los macrófagos, que son sensibles a las endotoxinas. CD14, un marcador de monocitos, es capaz de unirse a LPS a concentraciones picomolares. Los resultados obtenidos indican que los monocitos, tras la estimulación con 50 pg/mL (0,5 EU/mL) de LPS secretan TNF e IL-10. Yang et al., sin embargo, relataron que incluso 0,1 EU/mL (10 pg/mL) de endotoxina podrían inducir una reacción potente (regulación positiva del gen inflamatorio IL1B )27. Además, Chaiwut et al. demostraron que la producción intracelular de TNF e IL-6 en monocitos podría ser inducida por concentraciones aún más bajas de LPS, 2,5 pg/mL o 5 pg/mL, respectivamente23. Alvarez et al. confirmaron que la tasa de activación de monocitos (valor calculado) aumenta después de una pequeña concentración de LPS, como 5 pg / ml28. Por lo tanto, limitar la contaminación por endotoxinas en los vehículos eléctricos en todas las etapas posibles del protocolo de aislamiento es crucial para futuros experimentos realizados con células sensibles al LPS. Actualmente, la ultracentrifugación es el método más utilizado para el aislamiento de EV. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay estudios sobre la contaminación por LPS de los vehículos eléctricos aislados por este método. Por lo tanto, el protocolo anterior se centra en la obtención de EV de baja endotoxina sin contaminación externa de EV de los sobrenadantes de cultivo.
Como se mencionó anteriormente, la contaminación por endotoxinas puede tener varias fuentes. En primer lugar, debe enfatizarse que la endotoxina es un oponente difícil, y no todos los métodos de esterilización de vidrio o plástico son efectivos para su eliminación o degradación. Por ejemplo, el procedimiento estándar de autoclave no puede eliminar el LPS debido a la alta estabilidad térmica de la endotoxina27. Además, el lavado, incluso extensamente, no puede eliminar la endotoxina por completo. Al aplicar más métodos despirogénicos a la práctica de laboratorio, como la esterilización por plasma o ETO (óxido de etileno)18,19, la contaminación por endotoxinas puede limitarse. A continuación, el monitoreo permanente y la prevención de posibles contaminaciones son cruciales. Los resultados presentados indican la importancia del uso de reactivos de endotoxinas ultrabajas, como el suero, para la suplementación con cultivos. Además, se recomienda encarecidamente el control rutinario de la contaminación por endotoxinas de todos los reactivos (como PBS, DMEM y RPMI) e incluso de artículos de plástico (por ejemplo, tubos). También es necesario verificar previamente los sobrenadantes de cultivo antes del aislamiento de EV para evitar la acumulación de endotoxinas. Como se presentó anteriormente, una alternativa interesante a la medición estándar de los niveles de endotoxinas mediante el ensayo LAL es la amplificación por PCR del gen bacteriano 16s rRNA. La determinación de los niveles permisivos (que no inducen la estimulación de monocitos) de endotoxinas de LPS en EV es crucial. Considerando las condiciones de cultivo (concentración de monocitos y contaminación con LPS de los EVs aplicados, la concentración de EVs; Figura 3), la concentración final de endotoxina que afecta a los monocitos estimulados con EVs no es superior a 0,5 pg/mL (los EVs generalmente se diluyen 100-1,000 veces). Esta dosis es cinco veces menor que la postulada por Chaiwut et al. como la dosis menos efectiva (2,5 pg/mL) capaz de inducir la producción de TNF por monocitos23. En el estudio de Chaiwut et al., la producción de citoquinas se determinó mediante citometría de flujo y se presentó como un cambio MFI (intensidad fluorescente media) sin cuantificación. Además, la estimulación de monocitos con dosis muy bajas de LPS se realizó en medio suplementado con FBS al 10%, que puede ser una fuente adicional de LPS23. Esto puede sugerir que la dosis efectiva de LPS utilizada para la estimulación de monocitos fue mayor. Por lo tanto, considerando los resultados presentados y los datos de la literatura, parece que la concentración de endotoxina hasta 50 pg / ml (0,5 UE / ml) en EV es permisiva y no es la causa de la activación de los monocitos. El siguiente paso para optimizar este protocolo es una mayor reducción de la contaminación por endotoxinas, incluso al nivel no detectado por LAL o ensayos basados en células. Recientemente, se recomienda encarecidamente la importancia de utilizar modelos biológicos para detectar la contaminación por endotoxinas enmascaradas, llamada baja recuperación de endotoxinas (LER)8.
Por lo tanto, este protocolo es innovador en este sentido porque recoge todos los aspectos necesarios para el aislamiento de EVs con el menor contenido posible de endotoxinas, que aún no se ha abordado en otros estudios.
Al igual que con cada método, este protocolo tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el protocolo propuesto reduce la contaminación por endotoxinas, pero no la elimina. En segundo lugar, se desconoce si la pureza alcanzada es suficiente para otras células inmunes. Por lo tanto, cada protocolo debe adaptarse para su posterior aplicación. Establecer dicho protocolo permitirá obtener resultados que corresponderán más a los componentes biológicamente activos de los vehículos eléctricos que a su contaminación accidental. Finalmente, el procedimiento es más costoso de lo habitual debido a la necesidad de comprar varios kits de prueba de endotoxinas y suero bajo en endotoxinas. Como alternativa prometedora, Bussolati presentó un nuevo y sofisticado método para el aislamiento de EV por filtración de flujo tangencial. Este método permite la adquisición de EVs con baja endotoxicidad (0,1-0,7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29. Hasta ahora, este nuevo método no se ha utilizado comúnmente para el aislamiento de vehículos eléctricos y requiere equipos especializados en forma de un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF). Recientemente, Gałuszka et al. propusieron una forma diferente de eliminar la endotoxina de los contaminantes del aire (partículas con el tamaño de EV pero sin estructura de membrana) mediante el uso de polimixina B30. Sin embargo, la utilidad de este protocolo para vesículas derivadas de células debe verificarse a través de modelos biológicos, especialmente cuando se piensa en experimentos in vivo . La polimixina B y el desoxicolato de sodio (también aplicable a la eliminación de endotoxinas) han sido descritos previamente como neuro y nefrotóxicos31. Otras posibilidades son las columnas de afinidad con poli(ε-lisina), que se unen selectivamente a las endotoxinas. Sin embargo, este método es rápido y eficiente, dedicado a muestras / soluciones de proteínas; por lo tanto, aplicarlo a estructuras tan complicadas como los vehículos eléctricos necesita validación32. Además, estas columnas están destinadas a muestras con altos niveles iniciales de endotoxinas, y su efectividad en la eliminación de cantidades relativamente pequeñas de LPS es desconocida y requiere verificación. La concentración final anticipada de LPS después de la purificación con columnas que agotan el LPS aún puede ser demasiado alta para las pruebas de células inmunes (por ejemplo, <5 EU/mL).
En resumen, este protocolo propuso cómo evitar la contaminación por endotoxinas aplicando varios principios a la práctica de laboratorio, como la técnica aséptica rigurosa durante todos los pasos del aislamiento de EV, el uso de reactivos de endotoxinas ultrabajas, el monitoreo de las impurezas de endotoxinas en todos los pasos del procedimiento y el cambio del método de esterilización. Además, el protocolo presentado proporciona sugerencias sobre cómo controlar los niveles de endotoxinas en cada paso del procedimiento de aislamiento. El LPS presente en las EV afecta la función de las células inmunes y, por lo tanto, puede causar resultados falsos en los ensayos realizados con estas células.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera construirse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia, número de subvención 2019/33 / B / NZ5 / 00647. Nos gustaría agradecer al profesor Tomasz Gosiewski y Agnieszka Krawczyk del Departamento de Microbiología Médica Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad Jagiellonian por su inestimable ayuda en la detección de ADN bacteriano en EV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
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