Summary
Den foreslåtte protokollen inneholder retningslinjer for hvordan man kan unngå forurensning med endotoksin under isolering av ekstracellulære vesikler fra cellekultursupernatanter, og hvordan man skal evaluere dem riktig.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) er en heterogen populasjon av membranvesikler frigjort av celler in vitro og in vivo. Deres allestedsnærvær og betydelige rolle som bærere av biologisk informasjon gjør dem til spennende studieobjekter, og krever pålitelige og repeterende protokoller for deres isolasjon. Det er imidlertid vanskelig å realisere sitt fulle potensiale, da det fortsatt er mange tekniske hindringer knyttet til deres forskning (som riktig oppkjøp). Denne studien presenterer en protokoll for isolering av små EV (i henhold til MISEV 2018-nomenklaturen) fra kultursupernatanten av tumorcellelinjer basert på differensialsentrifugering. Protokollen inneholder retningslinjer for hvordan man kan unngå forurensning med endotoksiner under isolering av elbiler og hvordan man skal evaluere dem riktig. Endotoksinforurensning av elbiler kan betydelig hindre påfølgende eksperimenter eller til og med maskere deres sanne biologiske effekter. På den annen side kan den oversette tilstedeværelsen av endotoksiner føre til feil konklusjoner. Dette er spesielt viktig når det refereres til celler i immunsystemet, inkludert monocytter, fordi monocytter utgjør en populasjon som er spesielt følsom for endotoksinrester. Derfor anbefales det sterkt å screene EV for endotoksinforurensning, spesielt når du arbeider med endotoksinfølsomme celler som monocytter, makrofager, myeloidederiverte suppressorceller eller dendrittiske celler.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV), ifølge MISEV 2018-nomenklaturen, er et samlebegrep som beskriver ulike subtyper av celleutskillede membranøse vesikler som spiller avgjørende roller i mange fysiologiske og patologiske prosesser 1,2. Videre viser EV løfte som nye biomarkører for ulike sykdommer, samt terapeutiske midler og legemiddelleveringsbiler. Det er imidlertid vanskelig å realisere sitt fulle potensiale, da det fortsatt er mange tekniske hindringer knyttet til oppkjøpet3. En slik utfordring er isoleringen av endotoksinfrie elbiler, som har blitt neglisjert i mange tilfeller. En av de vanligste endotoksinene er lipopolysakkarid (LPS), som er en viktig komponent i gramnegative bakterielle cellevegger og kan forårsake en akutt inflammatorisk respons på grunn av frigjøring av et stort antall inflammatoriske cytokiner av forskjellige celler 4,5. LPS induserer en respons ved binding til LPS-bindende protein, etterfulgt av interaksjon med CD14/TLR4/MD2-komplekset på myeloide celler. Denne interaksjonen fører til aktivering av MyD88- og TRIF-avhengige signalveier, som igjen utløser nukleærfaktoren kappa B (NFkB). Translokasjon av NFkB til kjernen initierer produksjonen av cytokiner6. Monocytter og makrofager er svært følsomme for LPS, og deres eksponering for LPS resulterer i frigjøring av inflammatoriske cytokiner og kjemokiner (f.eks. IL-6, IL-12, CXCL8 og TNF-α) 7,8. CD14-strukturen muliggjør binding av forskjellige LPS-arter med lignende affinitet og fungerer som en co-reseptor for andre toll-lignende reseptorer (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 og 9) 6. Antall studier som utføres på effekten av elbiler på monocytter/makrofager øker fortsattmed 9,10,11. Spesielt fra perspektivet om å studere funksjonene til monocytter, deres underpopulasjoner og andre immunceller, er tilstedeværelsen av endotoksin og til og med deres maskerte tilstedeværelse i EV av stor betydning12. Den oversette forurensningen av elbiler med endotoksiner kan føre til misvisende konklusjoner og skjule deres sanne biologiske aktivitet. Med andre ord, arbeid med monocytiske celler krever tillit i fravær av endotoksinforurensning13. Potensielle kilder til endotoksiner kan være vann, kommersielt oppnådde medier og sera, mediekomponenter og tilsetningsstoffer, laboratorieglass og plastvarer 5,14,15.
Derfor hadde denne studien som mål å utvikle en protokoll for isolering av lavendotoksinholdige EVer. Protokollen gir enkle tips om hvordan man kan unngå endotoksinsmitte under isolasjon av elbiler i stedet for å fjerne endotoksiner fra elbiler. Tidligere har mange protokoller blitt presentert for hvordan man fjerner endotoksiner fra for eksempel konstruerte nanopartikler som brukes i nanomedisin; Ingen av dem er imidlertid nyttige for biologiske strukturer som elbiler. Den effektive depyrogeneringen av nanopartikler kan utføres ved etanol eller eddiksyre skylling, oppvarming ved 175 ° C i 3 timer, γ bestråling eller triton X-100 behandling; Disse prosedyrene fører imidlertid til ødeleggelse av elbiler16,17.
Den presenterte protokollen er en banebrytende studie fokusert på å unngå endotoksin urenheter i EV, i motsetning til tidligere studier på effekten av EV på monocytter9. Bruk av foreslåtte prinsipper i laboratoriepraksis kan bidra til å oppnå pålitelige forskningsresultater, noe som kan være avgjørende når man vurderer potensiell bruk av elbiler som terapeutiske midler i klinikken12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av ultrasentrifugerør
- Bruk sterile engangsrør. Hvis dette ikke er mulig, gjenbruk ultrasentrifugerørene etter å ha vasket dem med et vaskemiddel ved hjelp av en steril Pasteur-pipette eller andre engangsapplikatorer. Husk at ultrasentrifugerør bør være dedikert til en type sentrifugert materiale (cellekultursupernatant / serum / plasma) og arter (menneske / mus / etc.).
- Etter en vaskemiddelvask, skyll ultrasentrifugerørene med avionisert, LPS-fritt vann 3x.
MERK: Ikke bruk vann av lav kvalitet. - Tørk ultrasentrifugerørene, og fyll dem deretter opp med 70% etanol. La rørene stå med 70% etanol for desinfeksjon over natten. Fjern etanolen og tørk rørene igjen.
- Legg rørene og lokkene i steriliseringsemballasjen og lukk dem tett. Bruk steriliseringsmetoden i plasma eller gass (etylenoksid)18,19. Oppbevar ultrasentrifugerørene som er vedlagt i steriliseringsemballasjen på et tørt sted, og bruk dem før utløpsdatoen.
MERK: Utfør månedlig overvåking av LPS-nivået i fosfatbufret saltvann (PBS) og vannet som brukes til isolering av elbiler. Overvåking bør også omfatte rørene (f.eks. ved å teste vannet [vaskekontroll] som har blitt lagret i ultrasentrifugerørene over natten ved romtemperatur [RT]).
2. Fremstilling av EV-utarmet lav-endotoksin føtalt bovint serum (EE-FBS)
- Sørg for å bruke FBS med ultralavt endotoksin (kommersielt tilgjengelig; se materialfortegnelse; <0,1 EU/ml).
- Legg en flaske med FBS med ultralavt endotoksin i et vannbad og rug ved 56 °C i 30 minutter. Dette trinnet er nødvendig for å deaktivere komplementsystemet.
- Pipetter den inaktiverte FBS til ultrasentrifugerør og sentrifugerer den ved 100 000 x g i 4 timer ved 4 °C. Samle supernatanten i sterile 50 ml rør, og pass på at den ikke overskrider 45 ml per rør for å unngå kontaminering av lokket og fukting av ringen på røret.
- Oppbevar EE-FBS serum tilberedt på denne måten ved -20 °C. Kontroller konsentrasjonen av LPS i EE-FBS (trinn 6). LPS-konsentrasjonen bør være på samme nivå som før ultrasentrifugering.
3. Cellekultur
- For denne studien ble kultur SW480 og SW620 cellelinjer i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 4,5 g / L glukose, L- glutamin, natriumpyruvat og gentamicin (50 μL / ml) supplert med 10% EE-FBS tilsvarende i 75 cm2 kulturflasker ved bruk av aseptisk teknikk. Frø nesten 4,5 x 10 6 celler og 6,5 x 106 celler per kolbe for henholdsvis SW480 og SW620.
- Samle supernatantene to ganger i uken (~ 10 ml per kolbe) når cellene når full sammenløp (~ 13,5 x 10 6 og 20 x 106 celler per kolbe for henholdsvis SW480 og SW620), og delt. Sørg for at cellens levedyktighet ikke er mindre enn 99% og at cellene dyrkes ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Samle supernatanter fra cellekulturen i passende merkede 15 ml rør. Sentrifuge de oppsamlede supernatantene ved 500 x g i 5 minutter ved RT for å fjerne celleavfall.
- Samle supernatantene forsiktig, unngå å aspirere rusk, legg i merkede rør og sentrifuge igjen ved 3,200 x g i 12 minutter ved 4 ° C.
- Samle supernatanter fra det andre sentrifugeringstrinnet i sterile, merkede 50 ml rør. Unngå å fukte kantene på rørene. Forsikre deg om at volumet av supernatant ikke overstiger 45 ml og at slangene holdes vertikalt.
- Pakk rørhetten inn med en steril gjennomsiktig film og oppbevar supernatanter i vertikal stilling ved -80 °C.
MERK: Utfør månedlig kontroll av Mycoplasma spp. og LPS-forurensning i ferskkultursupernatanter (trinn 6). Hvis nivået av endotoksin i supernatantene overstiger 0,05 EU/ml, må du kontrollere på hvilket stadium forurensning kan ha oppstått, og starte prosessen på nytt fra begynnelsen. Hvis forurensning av cellekulturen ved Mycoplasma spp. oppdages, bør isolering av elbilene fra slike supernatanter seponeres.
4. Isolering av elbiler fra cellekultursupernatanter
- Klargjør 0,22 mikrom sprøytefiltre og sprøyter med riktig volum. Forbered to rør med dyrkningssupernatanter (90 ml).
- Fyll sprøyten med supernatanten og fest filteret til kanyleadapteren. Plasser den fylte sprøyten med filteret over et 50 ml rør. Trykk på stempelflensen og samle ~90 ml filtrat.
- Pipetter filtratet (7 ml) til ultrasentrifugerørene (sikrer at samme volum pipetteres til hvert rør for riktig balanse) og sentrifuger ved 100 000 x g i 2 timer ved 4 °C.
MERK: Effektiviteten til pelletering av elbiler avhenger av mange faktorer (f.eks. rotortype, k-faktor, lengden på migrasjonsbanen, viskositeten til mediet osv.), Som må optimaliseres for bedre gjenvinning av elbiler20. - Kast supernatanten med en steril Pasteur-pipette. Samle de resterende pellets ved hjelp av lange, filtrerte pipettespisser og samle dem i to ultrasentrifugerør. Fyll dem opptil 7 ml med filtrert endotoksinfri PBS for å skylle elbilene.
- Sentrifuger PBS-resuspenderte pellets ved 100 000 x g i 2 timer ved 4 °C. Fjern supernatanten helt med en steril Pasteur-pipette, og tilsett 200 μL filtrert, endotoksinfri PBS til begge rørene for å resuspendere elbilene. Pipetter elletsen forsiktig for å samle opp alle elbilene.
- Overfør elbilens suspensjon til et sterilt 1,5 ml reagensrør (bruk om mulig et bindingsrør med lavt proteininnhold). Behold 10 μL av EV-suspensjonen for å forberede en fortynning for nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og til andre formål (f.eks. Måling av proteinkonsentrasjon).
- Fortynn elbilene med filtrert PBS (1:1,000) for målinger av NTA, i henhold til produsentens instruksjoner. Fest EV-rørene ved å pakke hetten med en steril gjennomsiktig film. Oppbevar elbilene ved -80 °C.
5. Spesifikk markørdeteksjon ved vestlig blotting
- Bestem proteinnivået i prøvene (f.eks. ved Bradford-analyse), og klargjør prøvene (20 μg) med lastbuffer. Forbered lastbufferen ved å blande 5 μL prøvebuffer (4x) og 2 μL prøvereduksjonsmiddel (10x) til et totalt volum på 20 μL. Inkuber prøvene ved 70 °C i 10 minutter.
- Forbered polyakrylamidgeler med SDS (10%-14%) og last 20 μg elbiler til hver brønn.
- Kjør elektroforesen med løpende buffer (30 g Tris, 144 g glycin, 10% SDS per 1 L) i 45 minutter ved 150 V.
- Utfør halvtørr overføring av proteiner fra gelen til polyvinylidendifluoridmembranen (PVDF) i en overføringsmaskin med Towbin-buffer (1,51 g Tris, 7,2 g glycin, 10% metanol per 0,5 l) ved 25 V i 1 time.
- Plasser membranen i TBST-buffer (1 ml mellom, 100 ml Tris-bufret saltvann (TBS 10x) per 1 L) for blokkering med 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBST-buffer, og inkuber i 1 time på vipperen ved RT.
- Tilsett fortynnede (1:1 000) antistoffer, anti-CD9 1 (klone#D8O1A) eller anti-Alix 1 (klone#3A9), i1 % BSA og inkuber med membranen over natten ved 4 °C på vippen. Fjern antistoffer og vask membran 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minutter.
- Tilsett geiteantikanin eller geiteantimus (fortynning: 1:2000) sekundært antistoff konjugert med pepperrotperoksidase, avhengig av det primære antistoffet på membranen, og inkuber i 1 time på vipperen ved RT. Fjern antistoffer og vask membran 3x med 10 ml 1x TBST i 10 minutter.
- Bland substratet og luminol i forholdet 1: 1 for å oppnå en 1 ml løsning. Hell løsningen på membranen. Plasser membranen umiddelbart i målekammeret til bildesystemet, velg kjemiluminescensmodulen og visualiser proteinbånd på skjermen.
6. Måling av endotoksinnivå ved Limulus Amebocyte Lysate test (LAL)
- Utfør kromogen LAL-måling av endotoksinnivået, i henhold til produsentens anbefaling. Kort sagt, bruk metoden basert på samspillet mellom endotoksinet og limulus amebocytlysatet (LAL). Deteksjonsgrensen for denne metoden er 0,005 EU/ml.
MERK: LAL-analyse, til tross for begrensningene, er for tiden standardmetoden for å oppdage og kvantifisere endotoksinforurensning i forskjellige typer løsninger og andre produkter som brukes i vitenskap eller medisin8. Den begrensende faktoren for dette settet er stabiliteten til den rekonstituerte amøbocyttlysatoppløsningen, som er stabil i bare 1 uke ved -20 °C hvis den fryses umiddelbart etter rekonstituering. - Bruk en ti ganger fortynning av EV og andre prøver og en 50 ganger fortynning av serum. For videre eksperimenter, bruk bare lavendotoksinreagenser som EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU / ml) og LPS-frie kultursupernatanter.
7. Påvisning av prokaryot 16S rRNA-gen i EV-prøver
- Isoler DNA fra EV-prøvene. Prøv å holde reagensene og isolasjonsstedet aseptisk. Mål DNA-konsentrasjonen og -kvaliteten (f.eks. ved hjelp av et spektrofotometer).
- Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR), som beskrevet tidligere21. Forbered 1,5% agarosegel med ethidiumbromid eller SYBR-grønn for å visualisere PCR-produktene i ultrafiolett lys (UV).
- Kjør elektroforese av prøven og vektmarkør med TRIS-acetat-EDTA-buffer ved 75 V i 45 minutter. Visualiser DNA-bånd ved hjelp av bildesystemet.
8. Bestemmelse av effektiv LPS-konsentrasjon for stimulering i humane monocyttmodeller
- Klargjør 2 x 106 monocytter/ml monocyttsuspensjon i RPMI 1640 supplert med L-glutamin, glukose og 2% EE-FBS. Tilsett 50 μL av suspensjonen per brønn på en 96-brønns vevskulturplate22.
- Legg til et passende volum LPS eller dyrkningsmedium for å oppnå følgende endelige konsentrasjoner: 0 pg / ml (kontroll), 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml og 100 ng / ml, i 100 μL totalt volum cellesuspensjon. Lag triplikater av hver LPS-konsentrasjon.
- Dyrk cellene i 18 timer ved 37 °C, 5% CO2. Samle supernatanten.
- Spinn ned supernatanten på 2000 x g i 5 min. Overfør supernatantene til nye rør. Mål TNF8,23 og IL-10 23 konsentrasjon i innsamlede supernatanter med cytometrisk perler array (CBA) humant cytokinsett, i henhold til produsentens prosedyre, med et strømningscytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En forutsetning eller obligatorisk trinn for denne protokollen er utelukkelse av mulig endotoksinforurensning fra reagenser. Alle reagensene som brukes, for eksempel FBS, DMEM, RPMI, PBS og til og med ultrasentrifugerør, må være endotoksinfrie (<0,005 EU / ml). Det er ikke lett å opprettholde regimet uten endotoksinkontaminering, da for eksempel vanlig/standard serum for cellekultur kan være dets rike kilde (0,364 EU/ml; se tabell 1).
Selv om denne protokollen ble utviklet for å isolere elbiler med lavt endotoksininnhold, er det viktig å karakterisere de isolerte elbilene. I denne studien ble elbilene isolert fra to kolorektal kreftcellelinjer, SW480 og SW620. Uttrykket av EVs markører, CD9 og Alix, ble bekreftet av western blot (figur 1A). Det var ingen forskjell i gjennomsnittlig størrelse på elbiler isolert fra SW480- og SW620-celler (henholdsvis 134 nm og 128,2 nm; Figur 1B). I tillegg var det ingen forskjeller i konsentrasjonen av isolerte EV mellom disse cellelinjene (figur 1C). De eksemplariske fordelingene av elbilstørrelse, målt ved NTA, er presentert i figur 1D. Tiden for ultrasentrifugering ble optimalisert i henhold til resultatene fra Cvjetkovic et al.20. Kort fortalt ble den matematiske formelen for konvertering av sentrifugalløpsparametere mellom to faste vinkelrotorer (70Ti og T-1270) brukt. Effektiviteten av uttømming av små elbiler ved å spinne med en T-1270-rotor i 120 minutter ved 100 000 x g var litt mindre enn det som oppnås ved å bruke en 70Ti rotor ved 118 000 x g i 155 minutter; Det var imidlertid fortsatt innenfor rekkevidden av effektiv RNA- og proteinpelletering. Beregningen ble bekreftet av eksperimentelle data (tabell S1), hvor den utvidede sentrifugeringstiden (4 timer vs. 2 timer) ikke hadde noen meningsfull innvirkning på antall elbiler pelletert eller fortsatt tilstede i supernatanter.
Nivået av LPS som forårsaket monocyttrespons ble vurdert. For dette formålet ble humane monocytter dyrket med suksessive konsentrasjoner av LPS (0 pg / ml, 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml og 100 ng / ml). Etter kultur over natten ble nivået av IL-10 og TNF bestemt i kultursupernatantene. I denne studien var laveste dose LPS som muliggjorde utskillelse av IL-10 og TNF i monocytter 50 pg/ml, noe som tilsvarte 0,5 EU/ml (figur 2).
Til slutt var det siste trinnet knyttet til å teste nivået av LPS i elbilene isolert som ovenfor. LPS-forurensningen av EV-prøvene var rundt 0,5 EU/ml (50 pg/ml; Figur 3) for begge cellelinjene (45,80 ± 20,39 pg/ml og 48,75 ± 7,412 pg/ml for henholdsvis SW480 og SW620). Dette betyr at 1 μL EV (rundt 109 EV) inneholder mindre enn 0,05 pg endotoksin, og når det tilsettes 100 μL monocytsuspensjon (forhold på 104 EV per monocytt) fortynnes 100 ganger (den endelige konsentrasjonen av LPS er rundt 0,5 pg / ml).
I tillegg ble renheten til EV testet ved PCR for 16S rRNA-gen21, som bekrefter mangelen på bakteriell forurensning i EV isolert fra SW480- og SW620-cellelinjer (tilleggsfigur 1).
Figur 1: Karakterisering av isolerte elbiler . (A) Western blot analyse av proteinmarkørene til EV isolert fra SW480 og SW620 cellelinjer. (B) NTA ble brukt til å måle størrelsen på EV isolert fra SW480 og SW620 cellelinjer (nm). (C) NTA ble brukt til å måle konsentrasjonen av EV isolert fra SW480 og SW620 cellelinjer (EV / ml). (D) Eksemplariske fordelinger av EVs størrelse, målt ved NTA (blå tall indikerer partikkelstørrelse på et gitt punkt på kurven). Data i B og C er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 10); T-test for statistisk analyse ble benyttet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 IL-10 og TNF-sekresjon fra monocytter stimulert med ulike doser LPS. Sekresjon av cytokiner fra monocytter ble bestemt etter stimulering med LPS-doser som indisert: 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml og 100 ng/ml, sammenlignet med kontrollmonocytter (MO). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 4); Mann-Whitney U-test ble brukt. TNF- og IL-10-konsentrasjoner ble målt i dyrkningssupernatanter ved hjelp av cytometrisk perlerekke (CBA)-metoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av LPS-nivå i isolerte EV-prøver ved kromogen LAL-test. LPS-innhold i EV-prøver hentet fra SW480- og SW620-cellelinjer (pg/ml). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| S.No. | eksempel | endotoksinnivå [EU/ml] | endotoksin nivå [pg / ml] | ||
| 1 | DMEM | <0.005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0.005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS ultra lav endotoksin | <0.005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS ultra lavt endotoksin etter 4 timers sentrifugering (EE-FBS) | <0.005 | <0.5 | ||
| 5 | vanlig FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | filtrert PBS | <0.005 | <0.5 | ||
| 7 | dyrkningssupernatant danner SW480-celler etter 2 timers sentrifigering | <0.005 | <0.5 | ||
| 8 | dyrkningssupernatant fra SW620-celler etter 2 timers sentrifugering | <0.005 | <0.5 | ||
| 9 | vaskekontroll (vann lagret i ultrasentrifugerør) | <0.005 | <0.5 | ||
Tabell 1: LPS-nivå i ulike reagenser og prøver bestemt ved kromogen LAL-test. Målingene presenteres som EU/mL og pg/ml. Prøvene inkluderte DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, filtrert PBS og vaskekontroll (vann fra ultrasentrifugeringsrør).
Tilleggstabell 1: Representative eksempler på EVs konsentrasjon (EV / ml) og størrelse (nm) målinger i pellets og supernatanter etter 2 timer eller 4 timer sentrifugering av kultursupernatanter fra SW480 og SW620 cellelinjer og PBS. Målingene ble utført av NTA. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 1: PCR-resultater av pan-prokaryote 16S rRNA-genamplifisering i følgende prøver, fra venstre: molekylvektstige (MW, 100-1000 bp), NC-negativ kontroll, EV avledet fra SW480 og SW620, og PC (positivt kontrollbakterielt DNA) Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste årene har metoder for riktig isolering av elbiler blitt stadig viktigere, noe som muliggjør ytterligere pålitelige analyser, for eksempel i sammenheng med å skaffe pålitelig omikk og funksjonelle data24. Basert på tidligere forskningserfaring ser det ut til at ikke bare typen isolasjonsmetode, men også andre forhold under denne prosedyren kan være viktige. Bruken av EV-utarmet FBS er allment anerkjent som en nødvendighet25,26; Imidlertid blir overvåking av endotoksinforurensning i elbiler ofte neglisjert.
Likevel bør alle metoder som brukes for isolering av elbiler ha utviklet standarder for streng aseptisk håndtering og kvalitetskontroll i alle stadier av prosedyren. Dette er spesielt viktig på grunn av elbilenes videre nedstrømsbruk. Den foreslåtte protokollen er et resultat av tidligere erfaring med endotoksinfølsomme celler, som monocytter og makrofager, som er endotoksinfølsomme. CD14, en markør for monocytter, er i stand til å binde LPS ved picomolære konsentrasjoner. Oppnådde resultater indikerer at monocytter, etter stimulering med 50 pg / ml (0,5 EU / ml) LPS, utskiller TNF og IL-10. Yang et al. rapporterte imidlertid at selv 0,1 EU/ml (10 pg/ml) endotoksin kan indusere en potent reaksjon (oppregulering av det inflammatoriske IL1B-genet )27. Videre viste Chaiwut et al. at den intracellulære produksjonen av TNF og IL-6 i monocytter kan induseres av enda lavere konsentrasjoner av LPS, henholdsvis2,5 pg / ml eller 5 pg / ml 23. Alvarez et al. bekreftet at monocytaktiveringshastigheten (beregnet verdi) stiger etter en liten konsentrasjon av LPS, for eksempel 5 pg / ml28. Derfor er begrensning av endotoksinforurensning i elbiler på alle mulige stadier av isolasjonsprotokollen avgjørende for videre eksperimenter utført med LPS-følsomme celler. For tiden er ultrasentrifugering den mest brukte metoden for EV-isolasjon. Så vidt vi vet, er det imidlertid ingen studier på LPS-forurensning av elbiler isolert med denne metoden. Derfor fokuserer protokollen ovenfor på å skaffe EV-er med lav endotoksin uten ekstern EV-forurensning fra kultursupernatantene.
Som nevnt ovenfor kan endotoksinforurensning ha forskjellige kilder. Først bør det understrekes at endotoksin er en tøff motstander, og ikke alle metoder for sterilisering av glass eller plastvarer er effektive i fjerning eller nedbrytning. For eksempel kan standard autoklaverprosedyre ikke eliminere LPS på grunn av endotoksinets høye varmestabilitet27. Vask, selv omfattende, kan heller ikke fjerne endotoksin helt. Ved å bruke flere depyrogene metoder til laboratoriepraksis, for eksempel plasma eller ETO (etylenoksid) sterilisering18,19, kan endotoksinforurensning begrenses. Deretter er permanent overvåking og forebygging av mulig forurensning avgjørende. De presenterte resultatene indikerer viktigheten av å bruke ultra-lave endotoksinreagenser, som serum, for kulturtilskudd. I tillegg anbefales rutinemessig kontroll av endotoksinforurensning av alle reagenser (som PBS, DMEM og RPMI) og til og med plastvarer (f.eks. rør) sterkt. Det er også nødvendig å forhåndssjekke kultursupernatantene før EVs isolasjon for å forhindre endotoksinakkumulering. Som presentert ovenfor er et interessant alternativ til standardmåling av endotoksinnivåer ved LAL-analyse PCR-amplifisering av det bakterielle 16s rRNA-genet. Bestemmelse av permissive (som ikke induserer monocytstimulering) endotoksinnivåer av LPS i EV er avgjørende. Tatt i betraktning kulturforhold (konsentrasjon av monocytter og forurensning med LPS av de anvendte EVene, konsentrasjonen av EVer; Figur 3), er den endelige konsentrasjonen av endotoksin som påvirker monocytter stimulert med elbiler ikke høyere enn 0,5 pg/ml (EV fortynnes vanligvis 100-1000 ganger). Denne dosen er fem ganger lavere enn den som er postulert av Chaiwut et al. som den minst effektive dosen (2,5 pg / ml) som er i stand til å indusere produksjonen av TNF av monocytter23. I Chaiwut et al.-studien ble cytokinproduksjonen bestemt ved hjelp av flowcytometri og presentert som et MFI-skift (gjennomsnittlig fluorescerende intensitet) uten kvantifisering. Videre ble monocyttstimulering med svært lave doser LPS utført i medium supplert med 10 % FBS, som kan være en tilleggskilde til LPS23. Dette kan tyde på at den effektive dosen LPS brukt til monocyttstimulering var høyere. Således, med tanke på de presenterte resultatene og litteraturdataene, ser det ut til at konsentrasjonen av endotoksin opp til 50 pg / ml (0,5 EU / ml) i EV er ettergivende, og er ikke årsaken til monocytters aktivering. Det neste trinnet i optimalisering av denne protokollen er ytterligere reduksjon av endotoksinforurensning, selv til nivået som ikke er oppdaget av LAL eller cellebaserte analyser. Nylig er viktigheten av å bruke biologiske modeller for å oppdage maskert endotoksinforurensning, kalt lav endotoksinutvinning (LER), sterkt anbefalt8.
Dermed er denne protokollen nyskapende i denne forbindelse fordi den samler alle aspekter som er nødvendige for isolering av EV med lavest mulig endotoksininnhold, som ennå ikke er adressert i andre studier.
Som med hver metode har denne protokollen noen begrensninger. For det første reduserer den foreslåtte protokollen endotoksinforurensning, men eliminerer den ikke. For det andre er det ukjent om den oppnådde renheten er tilstrekkelig for andre immunceller. Derfor bør hver protokoll tilpasses for videre bruk. Etablering av en slik protokoll vil tillate å oppnå resultater som vil tilsvare mer de biologisk aktive komponentene til elbiler enn til deres utilsiktede forurensning. Endelig er prosedyren dyrere enn vanlig på grunn av behovet for å kjøpe flere endotoksintestsett og lavt endotoksinserum. Som et lovende alternativ presenterte Bussolati en ny, sofistikert metode for isolering av elbiler ved tangentiell strømningsfiltrering. Denne metoden tillater anskaffelse av elbiler med lav endotoksisitet (0,1-0,7 EU/ml; 10-70 pg/ml)29. Hittil har denne nye metoden ikke vært vanlig brukt til isolasjon av elbiler, og krever spesialutstyr i form av et tangentielt strømningsfiltreringssystem (TFF). Nylig foreslo Gałuszka et al. en annen måte å eliminere endotoksin fra luftforurensende stoffer (partikler med størrelsen på EV, men uten membranstruktur) ved å bruke polymyxin B30. Imidlertid må nytten av denne protokollen for celleavledede vesikler verifiseres gjennom biologiske modeller, spesielt når man tenker på in vivo-eksperimenter . Polymixin B og natriumdeoksykolat (også aktuelt for endotoksinfjerning) er tidligere beskrevet som nevro- og nefrotoksisk31. Andre muligheter er affinitetskolonner med poly(ε-lysin), som selektivt binder endotoksiner. Denne metoden er rask og effektiv, men dedikert til proteinprøver / løsninger; Derfor trenger det validering32 å bruke det på så kompliserte strukturer som elbiler. Videre er disse kolonnene beregnet på prøver med høye innledende endotoksinnivåer, og deres effektivitet i å fjerne relativt små mengder LPS er ukjent og krever verifisering. Den endelige forventede konsentrasjonen av LPS etter rensing med LPS-nedbrytende kolonner kan fortsatt være for høy for immuncelletester (for eksempel <5 EU/ml).
Oppsummert foreslo denne protokollen hvordan man kan unngå endotoksinforurensning ved å anvende flere prinsipper for laboratoriepraksis, for eksempel streng aseptisk teknikk under alle trinn av EVs isolasjon, ved bruk av ultra-lave endotoksinreagenser, overvåking av endotoksin urenheter ved alle prosedyretrinn og endring av steriliseringsmetoden. Videre gir den presenterte protokollen hint om hvordan man kontrollerer endotoksinnivåene i hvert trinn av isolasjonsprosedyren. LPS tilstede i EV påvirker funksjonen til immunceller, og kan derfor forårsake falske resultater i analyser utført med disse cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan konstrueres som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Centre, Polen, stipendnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vil gjerne takke professor Tomasz Gosiewski og Agnieszka Krawczyk fra Institutt for molekylær medisinsk mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College for deres uvurderlige hjelp i påvisning av bakterielt DNA i elbiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
