Summary
يكشف اختبار التشابك الكيميائي BS3 عن انخفاض تعبير مستقبلات GABAA لسطح الخلية في أدمغة الفئران في ظل ظروف الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمنة.
Abstract
القلق هو حالة من العاطفة التي تؤثر بشكل متغير على سلوكيات الحيوانات ، بما في ذلك الوظائف المعرفية. لوحظت العلامات السلوكية للقلق في جميع أنحاء المملكة الحيوانية ويمكن التعرف عليها على أنها استجابات تكيفية أو غير قادرة على التكيف مع مجموعة واسعة من طرق الإجهاد. توفر القوارض نموذجا تجريبيا مثبتا للدراسات الانتقالية التي تتناول الآليات التكاملية للقلق على المستويات الجزيئية والخلوية والدائرة. على وجه الخصوص ، يثير نموذج الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن استجابات غير قادرة على التكيف تحاكي الأنماط الظاهرية السلوكية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب والتي تشبه البشر والقوارض. بينما تظهر الدراسات السابقة آثارا كبيرة للإجهاد المزمن على محتويات الناقل العصبي في الدماغ ، فإن تأثير الإجهاد على مستويات مستقبلات الناقل العصبي غير مدروس. في هذه المقالة ، نقدم طريقة تجريبية لتحديد مستويات السطح العصبي لمستقبلات الناقلات العصبية في الفئران تحت الضغط المزمن ، مع التركيز بشكل خاص على مستقبلات حمض جاما أمينوبتيريك (GABA) ، والتي تشارك في تنظيم العاطفة والإدراك. باستخدام التشابك الكيميائي غير المنفذ الذي لا رجعة فيه ، bissulfosuccinimidyl suberate (BS3) ، نظهر أن الإجهاد المزمن يقلل بشكل كبير من توافر السطح لمستقبلات GABAA في قشرة الفص الجبهي. مستويات السطح العصبي لمستقبلات GABAA هي عملية تحديد معدل النقل العصبي GABA ، وبالتالي ، يمكن استخدامها كعلامة جزيئية أو وكيل لدرجة الأنماط الظاهرية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب في النماذج الحيوانية التجريبية. ينطبق هذا النهج المتشابك على مجموعة متنوعة من أنظمة المستقبلات للناقلات العصبية أو المعدلات العصبية المعبر عنها في أي منطقة دماغية ومن المتوقع أن يساهم في فهم أعمق للآليات الكامنة وراء العاطفة والإدراك.
Introduction
تتوضع مستقبلات الناقل العصبي إما على سطح غشاء البلازما العصبية أو داخل الخلايا على الأغشية الداخلية (على سبيل المثال ، الإندوسوم أو الشبكة الإندوبلازمية [ER] أو جهاز Trans-Golgi) وتنتقل ديناميكيا بين هاتين الجزأين اعتمادا على الحالات الفسيولوجية الجوهرية في الخلايا العصبية أو استجابة لأنشطة الشبكة العصبية الخارجية 1,2. نظرا لأن الناقلات العصبية المفرزة حديثا تثير وظائفها الفسيولوجية بشكل أساسي من خلال مجموعة المستقبلات الموضعية على السطح ، فإن مستويات المستقبلات السطحية لناقل عصبي معين هي أحد المحددات الحاسمة لقدرتها على الإشارة داخل الدائرة العصبية3.
تتوفر عدة طرق لمراقبة مستويات المستقبلات السطحية في الخلايا العصبية المستزرعة ، بما في ذلك مقايسة البيوتينيل السطحي4 ، ومقايسة التألق المناعي مع جسم مضاد محدد في ظروف غير نفاذية5 ، أو استخدام جين محوري مستقبلات مدمج وراثيا مع مؤشر بصري فلوري حساس لدرجة الحموضة (على سبيل المثال ، pHluorin)6. على النقيض من ذلك ، فإن هذه الأساليب إما محدودة أو غير عملية عند تقييم مستويات المستقبلات السطحية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، قد لا يكون إجراء البيوتينيل السطحي عمليا لمعالجة كميات كبيرة وأعداد عينات من أنسجة المخ في الجسم الحي بسبب سعره المرتفع نسبيا والخطوات اللاحقة اللازمة لتنقية البروتينات البيوتينيل على حبات مقترنة بالأفيدين. بالنسبة للخلايا العصبية المضمنة في بنية الدماغ ثلاثية الأبعاد ، قد يشكل انخفاض إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة أو الصعوبات في القياس الكمي القائم على المجهر قيدا كبيرا لتقييم مستويات المستقبلات السطحية في الجسم الحي. لتصور توزيع مستقبلات الناقلات العصبية في أدمغة سليمة ، يمكن استخدام طرق غير جراحية ، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، لقياس إشغال المستقبلات وتقدير مستويات المستقبلات السطحية7. ومع ذلك ، يعتمد هذا النهج بشكل حاسم على توافر روابط راديوية محددة ، ومعدات باهظة الثمن ، وخبرة خاصة ، مما يجعلها أقل سهولة للاستخدام الروتيني من قبل معظم الباحثين.
هنا ، نصف طريقة بسيطة ومتعددة الاستخدامات لقياس مستويات المستقبلات السطحية في أدمغة التجارب خارج الجسم الحي باستخدام رابط متشابك كيميائي قابل للذوبان في الماء وغير منفذ للغشاء ، مكرر (سلفوسوسينيميديل) suberate (BS3) 8,9. يستهدف BS3 الأمينات الأولية في السلسلة الجانبية لبقايا اللايسين ويمكنه ربط البروتينات تساهميا بالقرب من بعضها البعض. عندما يتم تحضير شرائح الدماغ حديثا من منطقة ذات أهمية وتحضينها في مخزن مؤقت يحتوي على BS3 ، يتم ربط مستقبلات سطح الخلية مع البروتينات المجاورة ، وبالتالي تتحول إلى أنواع ذات وزن جزيئي أعلى ، في حين تظل المستقبلات المرتبطة بالغشاء الداخلي داخل الخلايا دون تعديل. لذلك ، يمكن فصل برك المستقبلات السطحية وداخل الخلايا عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وقياسه بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالمستقبل المراد دراسته.
الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع (UCMS) هو نموذج تجريبي راسخ لإحداث الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن في القوارض10. يثير UCMS الأنماط الظاهرية السلوكية الشبيهة بالقلق / الاكتئاب والعجز المعرفي من خلال تعديل مجموعة من أنظمة الناقلات العصبية ، بما في ذلك GABA ومستقبلاتها10,11. على وجه الخصوص ، فإن مستقبلات GABA A المحتوية على الوحدة الفرعية α5 (α5-GABAAR) متورطة في تنظيم الذاكرة والوظائف المعرفية12,13 ، مما يشير إلى احتمال مشاركة الوظائف المتغيرة لهذه الوحدة الفرعية في العجز المعرفي الناجم عن UCMS. في هذا البروتوكول ، استخدمنا مقايسة التشابك BS3 لتحديد مستويات α5-GABAAR المعبر عنها سطحيا في قشرة الفص الجبهي للفئران المعرضة ل UCMS مقارنة بالفئران الضابطة غير المجهدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الانتهاء من جميع الأعمال الحيوانية في هذا البروتوكول وفقا لقانون أونتاريو للحيوانات للبحوث (RSO 1990 ، الفصل A.22) والمجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية.
1. إعداد الحيوانات
- تحديد أعداد الحيوانات التي سيتم استخدامها في التجارب ، وتقسيمها إلى مجموعات مناسبة أو مجموعات تجريبية. راجع قسم المناقشة لمناقشة حجم المجموعة والجنس والقوة الإحصائية.
ملاحظة: تم تخصيص هذا البروتوكول للفئران (سلالة C57BL6 / J ؛ 2-4 أشهر من العمر ؛ عادة 20-30 جم من وزن الجسم ؛ أعداد مكافئة من الذكور والإناث لاستخدامها). - ضع الحيوانات تحت UCMS أو تحكم في الظروف غير المجهدة لمدة 5-8 أسابيع ، باتباع البروتوكول كما هو موضح سابقا14.
- بعد إجراء UCMS الأخير ، اسمح للحيوانات بالبقاء في أقفاصها المنزلية لمدة 1 يوم قبل استخدامها لمقايسة التشابك لتجنب تأثيرات الإجهاد الحادة على تعبير المستقبلات.
2. إعداد حلول الأسهم
- قم بإعداد وتخزين الحلول التالية وفقا للتعليمات قبل الفحص.
- تحضير 5 M كلوريد الصوديوم عن طريق إذابة 14.6 g من كلوريد الصوديوم في 40 mL من الماء منزوع الأيونات. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تحضير 1.08 M KCl عن طريق إذابة 3.22 g من KCl في 40 mL من الماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
- تحضير 400 mM MgCl 2 عن طريق إذابة 3.25 جم من MgCl 2 · 6H2 O في 40 مل منالماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
- تحضير 1 M الجلايسين عن طريق إذابة 3 غرام من الجلايسين في 40 مل من الماء منزوع الأيونات ، وتخزينها في 4 °C.
- تحضير 1 M ديثيوثريتول (DTT) عن طريق إذابة 1.54 غرام من DTT في 10 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتعقيمه من خلال مرشح بحجم مسام 0.2 ميكرومتر ، والقسمة إلى أنابيب سعة 2 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- تحضير 10٪ Nonidet-P40 (NP-40) عن طريق تخفيفه بنسبة 1:10 (v / v) في الماء منزوع الأيونات. متجر في RT.
- تحضير 0.5 M EDTA (درجة الحموضة = 8.0) ، وتخزينها في RT.
- تحضير 1 M HEPES العازلة (الرقم الهيدروجيني = 7.2-7.5) ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تحضير 2.5 م أو 45٪ (وزن / حجم) الجلوكوز ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
3. إعداد محطة العمل
- في يوم اختبار BS3 المتشابك ، اجمع المواد التالية في غرفة تشريح الحيوانات (الشكل 1) ، مع العديد من العناصر المبردة مسبقا على الجليد: دلو ثلج ، كتلة درجة حرارة معدنية (مبردة مسبقا على الجليد) ، برنامج تلفزيوني بارد بالجليد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل و PBS مجمد في طبق بتري ، ورق ترشيح مبلل ب PBS ويوضع على سطح مستو مبرد أو ثلج أزرق ، مصفوفة دماغية (فاصل 1 مم لإدخال شفرة الحلاقة) مبردة مسبقا على الجليد ، شفرات حلاقة (~ 10) مبردة مسبقا على الجليد ، أدوات تشريح (مقص ، ملقط ، مسبار منحني) ، لكمة أنسجة ، 70٪ رذاذ الإيثانول يمسح الورق والمناشف الورقية ، أطراف الماصة (200 ميكرولتر) ، ماصة (P200) ، ساعة توقيت ، لوحة مذكرات ، قلم ، وأنابيب طرد مركزي دقيقة (1.5 مل).
- قبل الفحص ، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بمعلومات العينة (على سبيل المثال ، رقم معرف الحيوان ، ونوع العلاج [UCMS مقابل عدم الإجهاد (NS)] ، ومنطقة الدماغ ، مع أو بدون BS3 ، وما إلى ذلك).
ملاحظة: بالنسبة لمقايسات التشابك BS3 ، يجب جمع عينتين من كل منطقة دماغية ؛ سيتم استخدام عينة واحدة للربط المتشابك (مع BS3) والأخرى للتفاعل غير المتشابك (بدون BS3) كعنصر تحكم. لذلك ، من أجل أخذ عينات من منطقتين في الدماغ (أي قشرة الفص الجبهي [PFC] والحصين [HPC]) في 12 فأرا ، قم بتسمية 48 أنبوبا لأخذ العينات الأولية (= عينتان × منطقتان × 12 فئران) (لاستخدامها في القسم 6). قم بتسمية مجموعتين إضافيتين من 48 أنبوبا للتخزين لاحقا (لتخزين مجلدين مختلفين [100 ميكرولتر ، 300 ميكرولتر] من كل عينة) (لاستخدامها في القسم 7). وبالتالي ، يلزم تسمية 144 أنبوبا إجمالا لحجم المجموعة هذا.
- قبل الفحص ، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بمعلومات العينة (على سبيل المثال ، رقم معرف الحيوان ، ونوع العلاج [UCMS مقابل عدم الإجهاد (NS)] ، ومنطقة الدماغ ، مع أو بدون BS3 ، وما إلى ذلك).
- بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من توفر المعدات التالية في المختبر: جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على سطح الطاولة ، وجهاز صوتي ، ودوار أنبوبي (يستخدم في الغرفة الباردة أو داخل الثلاجة [4 درجات مئوية]) ، ومجمد (-80 درجة مئوية) لتخزين العينات ، ودلو من الثلج الجاف للتخزين المؤقت للعينات (يستخدم في القسم 7)
4. إعداد حلول العمل والمخازن المؤقتة
ملاحظة: في صباح يوم الفحص ، قم بإعداد الحلول التالية. يعتمد هذا الحساب على الحلول اللازمة لمعالجة منطقتين في الدماغ (أي PFC و HPC) من 12 فأرا.
- تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF ، درجة الحموضة = 7.4) كما هو مذكور في الجدول 1. قم بتوزيع 750 ميكرولتر من aCSF في كل أنبوب أخذ عينات (الأنابيب ال 48 الموضحة في الخطوة 3.1.1) ، وضعها في كتلة درجة الحرارة المعدنية على الجليد لتبريد المخزن المؤقت مسبقا.
- تحضير المخزن المؤقت للتحلل كما هو مذكور في الجدول 2. يخزن على الثلج (400 ميكرولتر للاستخدام لكل عينة).
- قم بإعداد محلول مخزون BS3 52 مللي متر (26x) في محلول سترات الصوديوم 5 مللي مول (الرقم الهيدروجيني = 5.0).
- أولا ، تحضير 100 mM حامض الستريك (الأسهم A) و 100 mM سيترات الصوديوم (الأسهم B).
- تمييع الأسهم A والأسهم B بنسبة 1:20 مع الماء منزوع الأيونات. أضف 100 ميكرولتر لكل منهما إلى 1.9 مل من الماء لتحضير 5 مللي متر من حامض الستريك (المخزون C) و 5 مللي متر سترات الصوديوم (المخزون D) ، على التوالي.
- امزج 410 ميكرولتر من المخزون C و 590 ميكرولتر من المخزون D لتحضير مخزن سترات الصوديوم 5 مللي متر (الرقم الهيدروجيني = 5.0) (المحلول E ، 1 مل).
- تأكد من الأس الهيدروجيني للمحلول E باستخدام شريط مؤشر الأس الهيدروجيني.
- قم بإذابة 24 مجم من BS3 في 806.4 ميكرولتر من المحلول E عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية لتحضير محلول مخزون BS3 (26x).
- قم بإعداد 1 مل أخرى من المحلول E لاستخدامها كعنصر تحكم في السيارة للعينات غير المتشابكة.
ملاحظة: قم بإعداد حل مخزون BS3 عندما يكون كل شيء آخر جاهزا والتجربة على وشك البدء. يجب تخزين BS3 مجففا عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. بمجرد إعادة تشكيله ، يظل BS3 نشطا فقط لمدة ≤3 ساعة تقريبا. نظرا لأن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لسترات الصوديوم 5 مللي متر (المحلول E) يرتفع بمرور الوقت ، مما يتسبب في تسارع التحلل المائي BS3 ، فمن المستحسن تحضير المحلول E طازجا من محلولي المخزون A و B9. نظرا لقابلية الذوبان المحدودة ل BS3 في درجات حرارة منخفضة ، احتفظ ب BS3 المعاد تشكيله في RT. استخدم BS3 المعاد تشكيله في 3 ساعات ، ولا تجمد / تذوب أو تعيد استخدام BS3 المعاد تشكيله.
5. تشريح أنسجة المخ
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب أن يعمل شخصان على الأقل معا بطريقة منسقة. بينما يركز شخص واحد على تشريح الحيوانات (الخطوات 5.2-5.10 والخطوة 6.3) ، يجب أن يعمل الشخص الآخر كضابط للوقت ويساعد في تنسيق الفحص (الخطوة 5.1 والخطوة 6.1 والخطوة 6.2 والخطوة 6.4 والخطوة 6.5)
- أحضر أول للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح.
ملاحظة: نظرا لأن الضغوطات الحادة (على سبيل المثال ، بيئة جديدة ، رائحة الدم) قد تؤثر على ديناميكيات بروتين الدماغ ، يجب الاحتفاظ بالحيوانات في أقفاصها المنزلية الموضوعة بعيدا عن منطقة التشريح ثم يتم إحضارها بشكل فردي إلى غرفة التشريح لقطع الرأس الفوري. - القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم متبوعا بقطع الرأس. أخرج الدماغ بسرعة من الجمجمة ، واغمره في برنامج تلفزيوني بارد في طبق بتري لمدة 10-15 ثانية (الشكل 2).
ملاحظة: لا يتم تخدير الحيوانات لتجارب BS3 لأن أي عامل مخدر يمكن أن يؤثر على مستوى العرض السطحي لمستقبلات الناقل العصبي9. - ضع الدماغ المبرد في مصفوفة الدماغ على الجليد ، مع توجيه الجانب البطني من الدماغ لأعلى (الشكل 3).
- أدخل شفرة الحلاقة الأولى عبر الحدود بين البصلة الشمية والسويقة الشمية لقطع الدماغ إكليليا (الشكل 4). باستخدام ثلاث إلى أربع شفرات حلاقة إضافية ، قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل بفواصل زمنية 1 مم.
- ارفع الشرائح الإكليلية عن مصفوفة الدماغ عن طريق تثبيت جميع شفرات الحلاقة المدرجة معا ، تاركا الجزء الخلفي من الدماغ خلفه في مصفوفة الدماغ. استخدم الملقط لفصل شفرات الحلاقة عن بعضها البعض ، وضعها على سطح مستو ومبرد مع توجيه شريحة الدماغ لأعلى (الشكل 5).
- حدد الشرائح التي تحتوي على منطقة الاهتمام. لأخذ عينات من PFC ، اختر الشريحتين الثانية والثالثة خلف الشريحة الأولى التي تحتوي على السويقة الشمية.
- قم بإزالة المنطقة محل الاهتمام باستخدام لكمة الأنسجة (الفيديو 1) ، وضعها جانبا على شفرة الحلاقة المبردة ، وقسم الأنسجة بالتساوي إلى قسمين (على سبيل المثال ، الأنسجة من نصف الكرة الأيسر مقابل نصف الكرة الأيمن ، مع استخدام نصفها لتفاعل التشابك BS3 والنصف الآخر للتحكم في عدم التشابك إذا تم التعبير عن البروتين المستهدف محل الاهتمام بالتساوي في نصفي الكرة الأرضية).
- قم بفرم كل منديل إلى قطع على شفرة الحلاقة باستخدام الطرف الرفيع للملقط بحركات رأسية متعددة ضد الشفرة (فيديو 2) بدلا من هرس الأنسجة أو طحنها. سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة BS3 دون المساس بشدة بسلامة غشاء الخلايا. مباشرة بعد الفرم ، انقل الأنسجة المفرومة إلى الأنابيب المناسبة (انظر الخطوة 6.3).
- لأخذ عينات من HPC ، أخرج الجزء الخلفي من الدماغ من المصفوفة ، وضع الدماغ على ورق ترشيح مبلل على السطح المسطح المبرد ، مع توجيه الجانب الظهري لأعلى (الشكل 6).
- باستخدام مسبار منحني وملقط ، والاقتراب من الجانب الظهري (فيديو 3) ، قم بتشريح HPC (النصف الظهري أو النصف البطني أو كليهما) من نصفي الكرة الأرضية (نصف للتشابك BS3 والنصف الآخر للتحكم ). فرم كل نسيج كما في الخطوة 5.8 ، وانقل الأنسجة إلى أنابيب مناسبة (انظر الخطوة 6.3).
ملاحظة: يجب الحفاظ على وقت التشريح الكامل لكل حيوان عند ~ 5 دقائق حتى تكون الظروف والنتائج التجريبية متسقة.
6. تفاعل التشابك
- أحضر الحيوان التالي للتشريح من منطقة السكن إلى غرفة التشريح عندما يكون تشريح دماغ الفأر السابق على وشك الانتهاء (الخطوة 5.10).
- قم برفع الأنبوب المبرد مسبقا على الثلج (من الخطوة 4.1) باستخدام 30 ميكرولتر من محلول BS3 (26x) أو محلول السيارة E مباشرة قبل أن تصبح المناديل المفرومة جاهزة للنقل إلى الأنابيب المناسبة. قم بتغيير أطراف الماصة بين الأنابيب لضمان عدم تلوث BS3 في أنابيب التحكم غير المتشابكة.
- انقل الأنسجة المفرومة (من الخطوة 5.8 والخطوة 5.10) إلى الأنابيب المناسبة ، ثم ابدأ في تشريح الحيوان التالي (الخطوة 5.2)
- اقلب الأنبوب واخلطه لتقسيم قطع الأنسجة إلى قطع أصغر (فيديو 4) ، وابدأ في احتضان العينات على دوار الأنبوب في الغرفة الباردة لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة. سجل وقت بدء حضانة BS3 لكل أنبوب. راجع قسم المناقشة لمعرفة وقت الحضانة الأمثل.
- قم بإخماد التفاعل عن طريق رفع الأنبوب ب 78 ميكرولتر من 1 M glycine ، واحتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع دوران ثابت. سجل وقت بدء ونهاية التبريد لكل أنبوب. استمر في مساعدة الشخص الذي يركز على تشريح الحيوان عن طريق إحضار الحيوان التالي (الخطوة 6.1) والمساعدة في التشابك (الخطوة 6.2).
ملاحظة: تعامل مع كل عينة بنفس التوقيت بالضبط عبر جميع العينات. إذا كانت غرفة التشريح بعيدة عن الغرفة الباردة ، فمن المستحسن بشدة تجنيد شخص ثالث للمشاركة في حضانة العينة والتبريد في الغرفة الباردة.
7. تحلل الأنسجة ، وإعداد البروتين ، واللطخة الغربية
- بعد 10 دقائق من التبريد (الخطوة 6.5) ، قم بتدوير العينات عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية. في حالة توفر شخص ثالث ، انتقل إلى الخطوة 7.2 ؛ خلاف ذلك ، قم بتجميد العينات على الثلج الجاف ، وأوقف الفحص هنا حتى يتم الانتهاء من تشريح الدماغ (القسم 5) والتشابك (القسم 6) لجميع الحيوانات.
- أضف 400 ميكرولتر من محلول تحلل الثلج البارد لكل أنبوب.
- قم بتقطيع العينات لمدة 1 ثانية خمس مرات مع فترات 5 ثوان بينهما ، مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد.
- قم بتدوير العينات عند 20000 × جم لمدة 2 دقيقة لتدوير بقايا الأنسجة غير القابلة للذوبان (الحبيبات) ، وحفظ المادة الطافية.
- استخدم 5 ميكرولتر من المادة الطافية لقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA).
- قسم بقية المادة الطافية إلى أنبوبين ؛ يحتوي أنبوب واحد على 100 ميكرولتر من المادة الطافية للبقعة الغربية اللاحقة ، ويحتوي الأنبوب الآخر على الباقي (~ 300 ميكرولتر) للتخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية. أضف كمية مناسبة من 4x SDS عينة عازلة (مكملة ب β2-mercaptoethanol) إلى العينات ، واحتضانها عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتشغيل 10-20 ميكروغرام من البروتين لكل بئر على هلام الأكريلاميد للرحلان الكهربائي (SDS-PAGE) ، ثم انقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) لتحليل اللطخة الغربية.
- سد غشاء PVDF في 5٪ (وزن / حجم) حليب خالي الدسم مذاب في محلول ملحي مخزن Tris يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة في RT.
- اغسل الغشاء لفترة وجيزة مرتين باستخدام TBS-T ، واحتضنه بالجسم المضاد الأساسي المخفف في TBS-T طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في TBS-T في RT.
- احتضان الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي المترافق بيروكسيديز الفجل المخفف في TBS-T لمدة 1 ساعة في RT.
- اغسل الجسم المضاد الثانوي ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في TBS-T في RT.
- احتضان الغشاء في كاشف التلألؤ الكيميائي المحسن ، وكشف الإشارة باستخدام جهاز توثيق الهلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات جدوى مقايسة التشابك BS3 لتقييم مستويات α5-GABA A R السطحيةفي الفأر PFC ، قمنا بتشغيل 10 ميكروغرام لكل من عينات البروتين المتشابكة وغير المتشابكة BS3 على SDS-PAGE وقمنا بتحليل البروتينات بواسطة اللطخة الغربية باستخدام جسم مضاد ل α5-GABAAR (متعدد النسيلة للأرانب) (الشكل 7). أعطت عينات البروتين غير المتشابكة الكمية الإجمالية ل α5-GABA A R عند ~ 55 كيلو دالتون ، بينما أعطت عينات البروتين المتشابكة BS3 كمية معينة من α5-GABAAR المرتبطة بالغشاء الداخلي (تهاجر عند ~ 55 كيلو دالتون) جنبا إلى جنب مع أنواع البروتين ذات الوزن الجزيئي الأعلى التي تمثل مجمعات البروتين المتشابكة تساهميا مع α5-GABAAR. من أجل القياس الكمي لمستويات α5-GABA AR السطحية ، يمكننا تقييم مدى استنفاد α5-GABAAR عند ~ 55 كيلو دالتون من إجمالي التجمع عند التشابك ، حيث تنتقل الوحدة الفرعية بعد ذلك إلى مواضع وزن جزيئي أعلى. عمليا ، يمكن حساب مستويات سطح α5-GABA A R عن طريق طرح كمية α5-GABA A R المرتبطة بالغشاء الداخلي (عند ~ 55 كيلو دالتونفي ممر العينة المتشابك) من إجمالي مستويات α5-GABAAR (عند ~ 55 كيلو دالتون فيممر العينة غير المتشابك).
قمنا بعد ذلك بتقييم تأثيرات UCMS (في 3 أسابيع و 5 أسابيع) على السطح وإجمالي مستويات α5-GABAAR في الماوس PFC. في هذه التجربة، من أجل اتباع المسار الزمني لتفاعل التشابك، أعددنا العينات عند 1 ساعات و2 ساعات و3 ساعات بعد إضافة BS3. نظرا لأن تفاعلات التشابك BS3 يبدو أنها تصل إلى هضبة بمقدار 2 h ، فقد تم استخدام البيانات عند النقطة الزمنية 1 h لرسم الرسم البياني. لاحظنا انخفاضا كبيرا وتدريجيا في مستويات α5-GABAAR السطحية في PFC في 3 أسابيع و 5 أسابيع من UCMS ، مقارنة بالفئران الخالية من الإجهاد (الشكل 8). أظهرت البيانات تغيرات ضئيلة أو معدومة في مستويات المستقبلات الكلية في ظل هذه الظروف التجريبية ، مما يشير إلى أن الإجهاد المزمن أثر بشكل خاص على تهريب α5-GABAAR إلى سطح الخلية.
الشكل 1: أدوات التشريح المستخدمة في مقايسة التشابك BS3. يتم ترطيب ورق الترشيح باستخدام برنامج تلفزيوني بارد الثلج ويوضع على سطح مستو من الثلج الأزرق. يتم وضع طبق بتري مملوء ب PBS ومخزن في -20 درجة مئوية قبل يوم واحد من الفحص على الثلج. يتم تبريد مصفوفة الدماغ وشفرات الحلاقة مسبقا على الجليد. يتم تنظيف المقص (واحد كبير ، واحد صغير) ، ملقط (واحد كبير ، عدد قليل من الصغير) ، وثقب الأنسجة قبل الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح دماغ الفأر بالكامل من الجمجمة ووضعه في برنامج تلفزيوني بارد الجليد. مباشرة بعد إزالة الدماغ بالكامل من الجمجمة ، تم غمره في برنامج تلفزيوني بارد لمدة 10-15 ثانية في طبق بتري على الجليد. هذا يبطئ عملية التمثيل الغذائي في الدماغ ويقلل من الاتجار بالبروتين وتدهوره بينما يساعد أيضا الأنسجة على أن تصبح أكثر صلابة ، مما يجعل تقطيع الدماغ اللاحق أسهل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: دماغ فأر يوضع في مصفوفة الدماغ. تم نقل دماغ الفأر المبرد المغمور في برنامج تلفزيوني بارد إلى مصفوفة الدماغ ووضعه مع توجيه الجانب البطني لأعلى. تم تبريد شفرات الحلاقة والمصفوفة مسبقا على الجليد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التقسيم الإكليلي لدماغ فأر في مصفوفة الدماغ. تم إدخال أول شفرة حلاقة مبردة مسبقا عبر الحدود بين البصلة الشمية والسويقة الشمية لبدء تقسيم الدماغ إكليليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الأجزاء الإكليلية التسلسلية لدماغ الفأر. تم قطع الجزء الأمامي من دماغ الفأر إكليليا عن طريق إدخال خمس شفرات حلاقة بشكل متسلسل في مصفوفة الدماغ (فترات 1 مم). تم تثبيت جميع الشفرات المدرجة معا ، ورفعها عن المصفوفة ، وفصلها عن بعضها البعض باستخدام ملقط ، ووضعها على السطح المسطح المبرد مع توجيه شريحة الدماغ لأعلى. (أعلى اليسار) المصباح الشمي (وسط اليسار) القسم الأول ؛ تم استخدام القسمين الثاني (أسفل اليسار) والثالث (أعلى اليمين) لأخذ عينات من أنسجة PFC. (أسفل اليمين) القسم الرابع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الجزء الخلفي من الدماغ لتشريح الحصين. بعد قطع الجزء الأمامي من الدماغ بشفرات حلاقة (يسار) ، تم إخراج الجزء الخلفي من الدماغ (الأوسط) من مصفوفة الدماغ ووضعه على ورق ترشيح مبلل ب PBS على السطح المبرد (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التشابك BS3 ل GABAAR على سطح الخلية. في وجود BS3 ، يتم ربط α5-GABA A R على سطح غشاء البلازما (XL) مع بروتينات مجهولة قريبة منه ، مثل الوحدات الفرعية الأخرى GABAAR داخل مجموعة GABAAR الخماسية أو البروتينات المجاورة الإضافية(X) ، ولكن ليس مع البروتينات (Y) بعيدا عنها. وهكذا ، يظهر α5-GABAAR كنوع بروتين عالي الوزن الجزيئي (HMW) على اللطخة. α5-GABAAR على الإندوسوم لا يزال سليما ويهاجر بالحجم المتوقع ~ 55 كيلو دالتون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مستويات السطح α5-GABAAR المتأثرة ب UCMS. تم تقييم كل من المستويات الكلية والسطحية ل α5-GABAAR في PFC للفئران تحت ظروف عدم الإجهاد و UCMS (3 أسابيع و 5 أسابيع). لمتابعة المسار الزمني لتفاعل التشابك ، تم تحضير العينات عند 1 h و 2 h و 3 h بعد إضافة BS3. تم استخدام إناث الفئران (2-3 أشهر ، N = 4 / مجموعة). تم تطبيع مستويات α5-GABAA R السليمة عند 55 كيلو دالتون لكل حالة أولا بواسطة مستويات αTubulin المقابلة ثم استخدمت لحساب مستويات α5-GABAAR المرتبطة بالغشاء الداخلي (من عينات [No Xlink] غير المتشابكة و [Xlink] المتشابكة ، على التوالي). بعد ذلك ، تم حساب مستويات المستقبلات السطحية عن طريق طرح الكمية المرتبطة بالغشاء الداخلي من المستويات الكلية. نظرا لأن تفاعلات التشابك BS3 يبدو أنها تصل إلى هضبة بمقدار 2 ساعة ، فقد تم استخدام البيانات عند النقطة الزمنية 1 h لرسم الرسم البياني (متوسط ± SEM). لوحظت تأثيرات كبيرة للإجهاد المزمن على مستوياتα5-GABA A R السطحية ، وكان هذا التأثير يعتمد على مدة UCMS ، حيث تم تحديد انخفاض تدريجي في مستويات α5-GABAAR السطحية خلال فترة UCMS. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 (اختبار Kruskal-Wallis مع مقارنات Dunn المتعددة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العمل conc. | حل الأسهم | كمية محلول المخزون للاستغناء |
| 1.2 مللي متر CaCl2 | 480 مللي متر (400 ضعف)* | 100 ميكرولتر |
| 20 مللي متر HEPES | 1 م (50x) | 800 ميكرولتر |
| 147 مللي متر كلوريد الصوديوم | 5 م (34x) | 1176.5 ميكرولتر |
| 2.7 ملليمتر كيلوكل | 1.08 م (400x) | 100 ميكرولتر |
| 1 مللي متر مغسل2 | 400 مللي متر (400x) | 100 ميكرولتر |
| 10 مللي متر جلوكوز | 2.5 م (250x) | 160 ميكرولتر |
| ماء منزوع الأيونات | 37.563 مل | |
| مجموع | 40 مل | |
| * يجب تحضير مخزون CaCl2 طازجا في يوم التجربة. | ||
الجدول 1: تكوين السائل النخاعي الاصطناعي.
| العمل conc. | حل الأسهم | كمية محلول المخزون للاستغناء |
| 25 مللي متر HEPES | 1 م (40x) | 500 ميكرولتر |
| 500 مللي متر كلوريد الصوديوم | 5 م (10x) | 2 مل |
| 2 مللي متر EDTA | 0.5 م (250x) | 80 ميكرولتر |
| 1 مللي متر DTT | 1 م (1000x) | 20 ميكرولتر |
| 0.1٪ NP-40 | 10٪ (100x) | 200 ميكرولتر |
| كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني | 100 ضعف | 200 ميكرولتر |
| ماء منزوع الأيونات | 17 مل | |
| مجموع | 20 مل |
الجدول 2: تكوين المخزن المؤقت للتحلل
فيديو 1: عزل PFC باستخدام لكمة الأنسجة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: فرم PFC باستخدام ملقط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: تشريح HPC باستخدام مسبار منحني وملقط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 4: الخلط العكسي لعينة الأنسجة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن تأثير الإجهاد النفسي والاجتماعي المزمن على السلوكيات (أي العجز العاطفي والمعرفي) والتغيرات الجزيئية (أي انخفاض التعبير عن جينات GABAergic والعجز المصاحب في النقل العصبي GABAergic) موثق جيدا10 ، فإن الآليات الكامنة وراء هذا العجز تحتاج إلى مزيد من التحقيق. على وجه الخصوص ، بالنظر إلى الدراسة الحديثة التي تظهر أن الإجهاد المزمن يؤثر بشكل كبير على البروتين العصبي من خلال الحمل الزائد على وظائف ER ، وبالتالي ، ارتفاع إجهاد ER15 ، يبقى سؤال حول ما إذا كان الإجهاد المزمن يؤثر على الاتجار ب GABA AR من خلال غشاء ER وكيف يمكن ربط الاتجار أو المستويات السطحية المتغيرة ل GABAAR سببيا بعلم النفس المرضي.
سيكون اختبار التشابك BS3 الموضح في هذا البروتوكول بمثابة نهج قوي للإجابة على بعض هذه الأسئلة. على سبيل المثال ، من المعروف أن UCMS تثير سلسلة من التغييرات السلوكية ، بما في ذلك العجز المعرفي ، والسلوك الشبيه بالقلق ، والأنماط الظاهرية اللامتعة، اعتمادا على مدة UCMS10. لذلك ، سيكون من الممكن دراسة الدورة الزمنية ودرجة التغيرات التي يسببها UCMS في مستويات α5-GABAAR السطحية عن طريق أخذ عينات من أدمغة الفئران في نقاط زمنية متتالية من بداية UCMS (على سبيل المثال ، أسبوع واحد ، 3 أسابيع ، 5 أسابيع) ، وسيكون من الممكن أيضا المقارنة مع الأنماط الظاهرية السلوكية التي لوحظت في كل نقطة زمنية. يمكن اختبار أنواع فرعية إضافية من GABAAR (على سبيل المثال ، α1 ، α2) ومستقبلات المعدلات العصبية المعروفة بأنها تتأثر بالإجهاد المزمن (على سبيل المثال ، مستقبلات TrkB لعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ [BDNF])10 في وقت واحد باستخدام نفس العينات. نظرا لأن بعض أنظمة المستقبلات والأنواع الفرعية هذه متورطة بشكل انتقائي في مجالات سلوكية محددة (على سبيل المثال ، التخدير والقلق والإدراك)11 ، يجدر ربط التغييرات السلوكية بنوع ودرجة المستقبلات المتأثرة ب UCMS في كل نقطة زمنية.
فيما يلي النقاط الحرجة التي يجب مراعاتها لعدة خطوات في البروتوكول. الخطوة الأولى هي تحديد الأعداد الضرورية والكافية من الحيوانات لاستخدامها بناء على التصميم التجريبي وتحليل الطاقة. على سبيل المثال ، لدراسة تأثير الإجهاد المزمن على مستويات مستقبلات GABAA السطحية ، نقوم بشكل روتيني بإعداد مجموعة واحدة من الفئران (N = 6 / sex) للتعرض ل UCMS لمدة 5 أسابيع ومجموعة أخرى (N = 6 / جنس) ليتم الاحتفاظ بها تحت ظروف خالية من الإجهاد. من المتوقع أن يعطي حجم المجموعة هذا (N = 24 في المجموع ، بما في ذلك كلا الجنسين) قوة إحصائية كافية للكشف عن اختلاف ~ 20٪ في مستويات المستقبلات ، مما يسمح بتقييم كل من آثار الإجهاد والآثار الجنسية. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن أن الإجهاد المزمن يسبب اختلافات تعتمد على الجنس في النتائج السلوكية والجزيئية10. على سبيل المثال ، تكون النساء بشكل عام أكثر عرضة للإصابة بأعراض الاكتئاب من الرجال. باستمرار ، تشير دراساتنا التي تستخدم أدمغة الإنسان بعد الوفاة والقوارض إلى مستويات أعلى من الأمراض السلوكية والجزيئية في الإناث الموضوعات. مستويات منخفضة التنظيم من السوماتوستاتين (SST) ، وهي علامة جزيئية للاكتئاب ، أكثر قوة في النساء بين مرضى الاكتئاب16 ، وزيادة الانفعالية أكثر قوة في نماذج الفئران الإناث التي تكرر جوانب علم الأمراض الاكتئابي من الذكور15،17. لذلك ، ينصح بأن أي تصميم تجريبي يعالج آثار الإجهاد المزمن على النتائج النفسية المرضية يجب أن يتضمن أعدادا كافية من كل من الذكور والإناث لضمان القوة الإحصائية في تحليل البيانات وتحديد الآثار المحتملة المعتمدة على الجنس.
يجب تحديد وقت الحضانة الأمثل مع BS3 في التجارب التجريبية لكل مستقبل يتم دراسته. وتفيد التقارير أن الاتجار بالمستقبلات قد يحدث ببطء، حتى في درجات الحرارة المنخفضة أثناء حضانة العينات9. لالتقاط مستويات دقيقة من المستقبلات السطحية في وقت تشريح الدماغ ، سيكون من المثالي تقليل وقت الحضانة واختيار النقطة الزمنية مباشرة قبل وصول تفاعل التشابك إلى الهضبة (30 دقيقة إلى 2 ساعة عند 4 درجات مئوية).
لاحظنا العديد من القيود التشغيلية المرتبطة بمقايسات التشابك BS3. (1) أولا ، نظرا لعمر النصف القصير نسبيا (2-3 ساعات) ل BS3 الناجم عن التحلل المائي التلقائي ضمن نطاق الأس الهيدروجيني الفسيولوجي ، يحتاج المرء إلى إكمال تشريح الحيوان وتفاعل التشابك خلال هذا الإطار الزمني. قادنا هذا إلى الحد من عدد الحيوانات التي يمكننا تشريحها في وقت واحد بحد أقصى 12. إذا كان المجرب يخطط لتشريح أكثر من 12 حيوانا ، ينصح بتقسيم المجموعة التجريبية إلى عدة مجموعات ، تحتوي كل منها على أقل من 12 حيوانا. بعد اكتمال الفحص لمجموعة واحدة ، يجب إعداد دفعة جديدة من BS3 حديثا لاستخدامها في فحوصات التشابك اللاحقة للمجموعة التالية. على نفس المنوال ، يجب أن يكون عدد المناطق ذات الأهمية التي سيتم تشريحها من واحد محدودا. نقوم بشكل روتيني بأخذ عينات من منطقتين في الدماغ (PFC ، HPC) لفحص التشابك ، وهذا هو الحد الأقصى لعدد مناطق الدماغ التي يمكننا تشريحها من أجل الحصول على نتائج متسقة مع الحد الأدنى من التباين عبر العينات. (2) ثانيا ، يجب تقييم خصوصية الأجسام المضادة المستخدمة في اللطخة الغربية بعناية. قد يكون لتفاعل التشابك الكيميائي BS3 تأثير غير متوقع على مستضد البروتينات المكتشفة بواسطة كل جسم مضاد. وجدنا أن واحد α5-GABAAR الأجسام المضادة (المحددة في جدول المواد) اكتشف عن طريق الخطأ نطاقا قويا ~ 50 كيلو دالتون على وجه التحديد في العينات المتشابكة BS3 ، بغض النظر عن وجود أو عدم وجود α5-GABAAبروتين R في العينة. شوهد هذا النطاق ~ 50 كيلو دالتون حتى في عينات الأنسجة من α5-GABAAR بالضربة القاضية الفئران ، مما يشير إلى أن هذا الجسم المضاد بدأ في التفاعل المتبادل مع مستضدات غير ذات صلة تم إنشاؤها عن طريق الخطأ بواسطة تفاعل التشابك BS3. ينصح بتحديد خصوصية الجسم المضاد بدقة مع وبدون تفاعلات BS3 المتشابكة ، من الناحية المثالية باستخدام عينات الأنسجة بالضربة القاضية ، إن وجدت ، لبروتين معين مهم. (3) لا يتناول البروتوكول الحالي الموصوف هنا أنواع الخلايا التي يكون فيها كل GABAAيتم التعبير عن النوع الفرعي R (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية والخلايا النجمية). بالنسبة لبعض GABAAالأنواع الفرعية R (على سبيل المثال ، α1 ، α5) التي يتم التعبير عنها في الغالب في الخلايا العصبية18، يجب أن توفر بيانات فحص التشابك التي تم الحصول عليها باستخدام أنسجة المخ السائبة، كما هو موضح في هذا البروتوكول، معلومات تعكس مستويات سطح الخلايا العصبية. ومع ذلك ، بالنسبة ل GABA الأخرىAالأنواع الفرعية R (على سبيل المثال ، α2) التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية18، من المهم دراسة مستويات سطح المستقبلات في الخلايا العصبية مقابل الخلايا النجمية بشكل منفصل. تحقيقا لهذه الغاية ، فرز الخلايا التقليدي (على سبيل المثال ، فرز الخلايا المنشط بالفلورة [FACS]19) في بروتوكول التوصيل المتشابك BS3؛ يمكن إجراء خطوة تفكك الخلايا لفرز الخلايا بعد خطوة التبريد BS3 ، ولكن يحتاج المرء إلى التحقق من أن جميع الإجراءات والشروط الخاصة ب FACS (على سبيل المثال ، المخازن المؤقتة للاستخدام ، ودرجة الحرارة ، ووقت الحضانة) متوافقة مع تلك الموجودة في مقايسة التشابك. وبالإضافة إلى ذلك، لا يجوز استخدام نهج نظام مراقبة الأصول الميدانية إلا في مجال إدارة الأعمال الخاضعة للإدارة العامة في أفريقيا.Aالأنواع الفرعية R المعروفة بأنها موضعية في المقصورة الخلوية المحيطية (على سبيل المثال ، α2) ولكن ليس للأنواع الفرعية المخصبة في التشعبات البعيدة (على سبيل المثال ، α5)18، لأنه من المحتمل أن تفقد حجرات الخلايا المحيطية أو البعيدة أثناء خطوة تفكك الخلايا الواسعة اللازمة لفرز الخلايا. (4) أخيرا ، وجدنا أن النتائج أكثر اتساقا عندما حسبنا مستويات المستقبلات السطحية عن طريق طرح كمية المستقبلات المرتبطة بالغشاء الداخلي من إجمالي كمية المستقبلات بدلا من التقييم المباشر لمستويات السطح بناء على قياس كثافة أنواع البروتين عالية الوزن الجزيئي. هذا على الأرجح لأن كفاءة نقل هذه الأنواع من البروتين عالية الوزن الجزيئي إلى غشاء PVDF أكثر تغيرا من البروتين الأصلي السليم ذي الحجم الأصغر (على سبيل المثال ، ~ 55 كيلو دالتون ل α5-GABAAR). لذلك ، يوصى باتباع الطريقة الموضحة في قسم النتائج ووسيلة إيضاح الشكل 8 لحساب مستويات مستقبلات السطح.
بصرف النظر عن آثار الإجهاد المزمن على GABAAR ، يمكن أيضا تطبيق اختبار BS3 المتشابك على الفئران المعدلة وراثيا أو نماذج القوارض مع التلاعب التجريبي للتحقيق في عدد من الحالات العصبية أو النفسية العصبية. تم استخدام هذا الفحص بنجاح لالتقاط التأثيرات التي يسببها الكوكايين على التعبير السطحي لمستقبلات الغلوتامات في النواة المتكئة لأدمغة الفئران20,21. كما تم استخدام الفحص لإظهار انخفاض التعبير السطحي ل α5-GABAAR في PFC للفئران القاضية BDNF غير المتجانسة22. في دراسة سابقة أخرى ، في نموذج اعتلال الدماغ الكبدي في الفئران ، ارتبط عجز التعلم المكاني المصاحب سببيا بالتعبير السطحي المتغير لمستقبلات الغلوتامات و GABAA بناء على هذا الفحصالمتشابك 23. باختصار ، يوفر اختبار التشابك الكيميائي BS3 أداة متعددة الاستخدامات لالتقاط التغيرات الخاصة بمنطقة الدماغ والمعتمدة على السياق في مجموعة من أنظمة المستقبلات في الدماغ ، وكذلك في أي أنسجة أو أعضاء محيطية أخرى تقريبا. يمكن أيضا إجراء هذا الفحص بالتوازي مع طرق أخرى لتقييم مستويات المستقبلات السطحية ، مثل التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لتثبيط المنشط (خاصة في حالة α5-GABAAR) ، والمجهر الإلكتروني المبرد ، والبيوتينيل السطحي ، لمقارنة النتائج والتحقق من صحتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون موظفي مرفق الحيوانات CAMH لرعاية الحيوانات خلال مدة الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR Project Grant #470458 to T.T.) ، وصندوق الاكتشاف من CAMH (إلى TP) ، والتحالف الوطني للبحوث حول الفصام والاكتئاب (جائزة NARSAD # 25637 إلى E.S.) ، ومعهد كامبل لأبحاث الصحة العقلية للأسرة (إلى E.S.). E.S. هو مؤسس Damona Pharmaceuticals ، وهي شركة أدوية حيوية مكرسة لجلب مركبات GABAergic الجديدة إلى العيادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
