Summary
Der BS3 Chemical Crosslinking Assay zeigt eine reduzierte Expression desGABA-A-Rezeptors auf der Zelloberfläche im Gehirn von Mäusen unter chronischen psychosozialen Stressbedingungen.
Abstract
Angst ist ein Gefühlszustand, der das Verhalten von Tieren, einschließlich der kognitiven Funktionen, variabel beeinflusst. Verhaltensauffällige Angstzustände werden im gesamten Tierreich beobachtet und können entweder als adaptive oder maladaptive Reaktionen auf eine Vielzahl von Stressmodalitäten erkannt werden. Nagetiere bieten ein bewährtes experimentelles Modell für translationale Studien, die sich mit den integrativen Mechanismen der Angst auf molekularer, zellulärer und Schaltkreisebene befassen. Insbesondere löst das Paradigma des chronischen psychosozialen Stresses maladaptive Reaktionen aus, die angst-/depressive Verhaltensphänotypen nachahmen, die zwischen Menschen und Nagetieren analog sind. Während frühere Studien signifikante Auswirkungen von chronischem Stress auf den Neurotransmittergehalt im Gehirn zeigen, ist die Wirkung von Stress auf den Neurotransmitterrezeptorspiegel nur unzureichend untersucht. In diesem Artikel stellen wir eine experimentelle Methode zur Quantifizierung der neuronalen Oberflächenniveaus von Neurotransmitterrezeptoren in Mäusen unter chronischem Stress vor, wobei wir uns insbesondere auf Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptoren konzentrieren, die an der Regulation von Emotionen und Kognition beteiligt sind. Mit Hilfe des membranundurchlässigen irreversiblen chemischen Vernetzers Bissulfosuccinimidylsuberat (BS3) zeigen wir, dass chronischer Stress die Oberflächenverfügbarkeit vonGABA-A-Rezeptoren im präfrontalen Kortex signifikant herunterreguliert. Die neuronalen Oberflächenniveaus von GABA-A-Rezeptoren sind der geschwindigkeitsbegrenzende Prozess für die GABA-Neurotransmission und könnten daher als molekularer Marker oder Proxy für den Grad angst-/depressiver Phänotypen in experimentellen Tiermodellen verwendet werden. Dieser Vernetzungsansatz ist auf eine Vielzahl von Rezeptorsystemen für Neurotransmitter oder Neuromodulatoren anwendbar, die in jeder Gehirnregion exprimiert werden, und soll zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen beitragen, die Emotionen und Kognition zugrunde liegen.
Introduction
Neurotransmitterrezeptoren sind entweder an der Oberfläche der neuronalen Plasmamembran oder intrazellulär auf den Endomembranen (z. B. dem Endosom, dem endoplasmatischen Retikulum [ER] oder dem trans-Golgi-Apparat) lokalisiert und pendeln dynamisch zwischen diesen beiden Kompartimenten, abhängig von intrinsischen physiologischen Zuständen in Neuronen oder als Reaktion auf extrinsische neuronale Netzwerkaktivitäten 1,2. Da neu sezernierte Neurotransmitter ihre physiologischen Funktionen in erster Linie über den oberflächenlokalisierten Rezeptorpool hervorrufen, sind die Oberflächenrezeptorspiegel für einen bestimmten Neurotransmitter eine der kritischen Determinanten seiner Signalkapazität innerhalb des neuronalen Schaltkreises3.
Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um den Oberflächenrezeptorspiegel in kultivierten Neuronen zu überwachen, darunter der Oberflächenbiotinylierungsassay4, der Immunfluoreszenz-Assay mit einem spezifischen Antikörper unter nicht-permeabilisierten Bedingungen5 oder die Verwendung eines Rezeptortransgens, das genetisch mit einem pH-empfindlichen fluoreszierenden optischen Indikator (z. B. pHluorin) fusioniert ist6. Im Gegensatz dazu sind diese Ansätze bei der Bestimmung von Oberflächenrezeptorspiegeln in vivo entweder begrenzt oder unpraktisch. Beispielsweise ist das Oberflächenbiotinylierungsverfahren aufgrund seines relativ hohen Preises und der nachfolgenden Schritte, die für die Reinigung der biotinylierten Proteine auf Avidin-konjugierten Beads erforderlich sind, möglicherweise nicht für die Verarbeitung großer Mengen und Probenzahlen von In-vivo-Hirngewebe geeignet. Für Neuronen, die in eine dreidimensionale Gehirnarchitektur eingebettet sind, können eine geringe Zugänglichkeit von Antikörpern oder Schwierigkeiten bei der mikroskopischen Quantifizierung eine erhebliche Einschränkung für die Beurteilung der Oberflächenrezeptorkonzentrationen in vivo darstellen. Um die Verteilung von Neurotransmitterrezeptoren in intakten Gehirnen sichtbar zu machen, könnten nicht-invasive Methoden, wie die Positronen-Emissions-Tomographie, verwendet werden, um die Rezeptorbelegung zu messen und die Oberflächenrezeptorspiegel abzuschätzen7. Dieser Ansatz hängt jedoch entscheidend von der Verfügbarkeit spezifischer Radioliganden, teurer Ausrüstung und speziellem Fachwissen ab, was ihn für den routinemäßigen Einsatz für die meisten Forscher weniger zugänglich macht.
Hier beschreiben wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung von Oberflächenrezeptorspiegeln in experimentellen Tiergehirnen ex vivo unter Verwendung eines wasserlöslichen, membranundurchlässigen chemischen Vernetzers, Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)8,9. BS3 zielt auf primäre Amine in der Seitenkette von Lysinresten ab und kann Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander kovalent vernetzen. Wenn Hirnschnitte aus einer Region von Interesse frisch präpariert und in einem BS3-haltigen Puffer inkubiert werden, werden die Rezeptoren auf der Zelloberfläche mit benachbarten Proteinen vernetzt und verwandeln sich so in Spezies mit höherem Molekulargewicht, während die intrazellulären Endomembran-assoziierten Rezeptoren unverändert bleiben. Daher können die Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorpools durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und mittels Western Blot unter Verwendung von Antikörpern, die für den zu untersuchenden Rezeptor spezifisch sind, quantifiziert werden.
Unpredictable chronic mild stress (UCMS) ist ein etabliertes experimentelles Paradigma zur Induktion von chronischem psychosozialem Stress bei Nagetieren10. UCMS löst angst-/depressive Verhaltensphänotypen und kognitive Defizite durch die Modulation einer Reihe von Neurotransmittersystemen aus, einschließlich GABA und seiner Rezeptoren10,11. Insbesondere der α5-Untereinheit-enthaltende GABA-A-Rezeptor (α5-GABAA R) ist an der Regulation des Gedächtnisses und der kognitiven Funktionen beteiligt12,13, was auf eine mögliche Beteiligung veränderter Funktionen dieser Untereinheit an UCMS-induzierten kognitiven Defiziten hindeutet. In diesem Protokoll haben wir den BS3-Crosslinking-Assay verwendet, um die Konzentrationen von oberflächenexprimiertem α5-GABAAR im präfrontalen Kortex von Mäusen, die UCMS ausgesetzt waren, im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollmäusen zu quantifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierarbeiten in diesem Protokoll wurden in Übereinstimmung mit dem Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, Kapitel A.22) und dem Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Tiere
- Bestimmen Sie die Anzahl der Tiere, die in den Versuchen verwendet werden sollen, und teilen Sie sie in geeignete Gruppen oder Versuchskohorten ein. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie eine Diskussion über die Gruppengröße, das Geschlecht und die statistische Aussagekraft.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist auf Mäuse zugeschnitten (Stamm C57BL6/J; Alter von 2-4 Monaten; typischerweise 20-30 g Körpergewicht; gleiche Anzahl von Männchen und Weibchen). - Setzen Sie die Tiere 5-8 Wochen lang unter UCMS oder kontrollieren Sie nicht gestresste Bedingungen, wobei Sie das zuvor beschriebene Protokoll befolgen14.
- Lassen Sie die Tiere nach dem letzten UCMS-Verfahren 1 Tag lang in ihren Heimkäfigen bleiben, bevor Sie sie für den Vernetzungstest verwenden, um akute Stresseffekte auf die Rezeptorexpression zu vermeiden.
2. Vorbereitung der Stammlösungen
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor und lagern Sie sie gemäß den Anweisungen vor dem Assay.
- Bereiten Sie 5 M NaCl vor, indem Sie 14,6 g NaCl in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
- Bereiten Sie 1,08 M KCl zu, indem Sie 3,22 g KCl in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen. Bei RT speichern.
- 400 mM MgCl2 werden hergestellt, indem 3,25 g MgCl2,6H2O in 40 ml deionisiertem Wasser aufgelöst werden. Bei RT speichern.
- Bereiten Sie 1 M Glycin vor, indem Sie 3 g Glycin in 40 ml deionisiertem Wasser auflösen, und lagern Sie es bei 4 °C.
- 1 M Dithiothreitol (DTT) wird hergestellt, indem 1,54 g DTT in 10 ml deionisiertem Wasser aufgelöst werden. Filtern Sie es durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm und aliquotieren Sie es in 2-ml-Röhrchen. Bei −20 °C lagern.
- Stellen Sie 10% Nonidet-P40 (NP-40) her, indem Sie es im Verhältnis 1:10 (v/v) in deionisiertem Wasser verdünnen. Bei RT speichern.
- 0,5 M EDTA (pH = 8,0) vorbereiten und bei RT lagern.
- 1 M HEPES-Puffer (pH = 7,2-7,5) vorbereiten und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 2,5 M oder 45 % (w/v) Glukose vor und lagern Sie sie bei 4 °C.
3. Vorbereitung des Arbeitsplatzes
- Sammeln Sie am Tag des BS3-Vernetzungstests die folgenden Materialien im Tiersezierraum (Abbildung 1), wobei mehrere Gegenstände auf Eis vorgekühlt sind: ein Eiskübel, ein Metalltemperaturblock (auf Eis vorgekühlt), eiskaltes PBS in einem konischen 50-ml-Röhrchen und gefrorenes PBS in einer Petrischale, mit PBS angefeuchtetes Filterpapier auf eine gekühlte ebene Oberfläche oder blaues Eis, eine Gehirnmatrix (1 mm Abstand zum Einführen der Rasierklinge), die auf Eis vorgekühlt ist, Rasierklingen (~10), die auf Eis vorgekühlt sind, Sezierwerkzeuge (Schere, Pinzette, eine gebogene Sonde), eine Taschentuchstanze, 70%iges Ethanol-Sprühwischpapier und Papiertücher, Pipettenspitzen (200 μl), eine Pipette (P200), eine Stoppuhr, ein Notizblock, ein Stift und Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml).
- Beschriften Sie die Mikrozentrifugenröhrchen vor dem Assay mit den Probeninformationen (z. B. Tier-ID-Nummer, Behandlungstyp [UCMS versus No Stress (NS)], Gehirnregion, mit oder ohne BS3 usw.).
HINWEIS: Für die BS3-Vernetzungsassays müssen zwei Proben aus jeder Hirnregion entnommen werden. Eine Probe wird für die Vernetzung (mit BS3) und die andere für die nicht-vernetzende Reaktion (ohne BS3) als Kontrolle verwendet. Um Proben aus zwei Hirnregionen (d. h. dem präfrontalen Kortex [PFC] und dem Hippocampus [HPC]) von 12 Mäusen zu entnehmen, beschriften Sie daher 48 Röhrchen für die erste Probenahme (= 2 Proben × 2 Regionen × 12 Mäusen) (zu verwenden in Abschnitt 6). Beschriften Sie zwei weitere Sätze von 48 Röhrchen für die spätere Lagerung (für die Lagerung von zwei verschiedenen Volumina [100 μl, 300 μl] jeder Probe) (in Abschnitt 7 zu verwenden). Somit ist es erforderlich, für diese Kohortengröße insgesamt 144 Röhrchen zu kennzeichnen.
- Beschriften Sie die Mikrozentrifugenröhrchen vor dem Assay mit den Probeninformationen (z. B. Tier-ID-Nummer, Behandlungstyp [UCMS versus No Stress (NS)], Gehirnregion, mit oder ohne BS3 usw.).
- Stellen Sie außerdem sicher, dass im Labor die folgenden Geräte vorhanden sind: eine gekühlte Tischmikrozentrifuge, ein Ultraschallgerät, ein Röhrchenrotator (für den Einsatz im Kühlraum oder im Kühlschrank [4 °C]), ein Gefrierschrank (−80 °C) für die Lagerung von Proben und ein Eimer Trockeneis für die vorübergehende Lagerung der Proben (in Abschnitt 7 zu verwenden)
4. Vorbereitung der Arbeitslösungen und Puffer
HINWEIS: Bereiten Sie am Morgen des Assays die folgenden Lösungen vor. Diese Berechnung basiert auf den notwendigen Lösungen, um zwei Gehirnregionen (d.h. PFC und HPC) von 12 Mäusen zu verarbeiten.
- Bereiten Sie künstlichen Liquor cerebrospinalis (aCSF, pH = 7,4) wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Geben Sie 750 μl aCSF in jedes Probenahmeröhrchen (die 48 Röhrchen, die in Schritt 3.1.1 beschriftet sind) und legen Sie sie in den Metalltemperaturblock auf Eis, um den Puffer vorzukühlen.
- Bereiten Sie den Lysepuffer wie in Tabelle 2 beschrieben vor. Auf Eis lagern (400 μl pro Probe).
- Bereiten Sie eine 52 mM BS3-Stammlösung (26x) in 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) vor.
- Bereiten Sie zunächst 100 mM Zitronensäure (Brühe A) und 100 mM Natriumcitrat (Brühe B) vor.
- Brühe A und Brühe B im Verhältnis 1:20 mit deionisiertem Wasser verdünnen. Fügen Sie jeweils 100 μl auf 1,9 ml Wasser hinzu, um 5 mM Zitronensäure (Brühe C) bzw. 5 mM Natriumcitrat (Brühe D) herzustellen.
- Mischen Sie 410 μl Brühe C und 590 μl Brühe D, um einen 5 mM Natriumcitratpuffer (pH = 5,0) herzustellen (Lösung E, 1 ml).
- Bestätigen Sie den pH-Wert der Lösung E mit einem pH-Indikatorstreifen.
- 24 mg BS3 werden in 806,4 μl Lösung E gelöst, indem man 30 s lang wirbelt, um die BS3-Stammlösung herzustellen (26x).
- Bereiten Sie weitere 1 ml Lösung E zur Verwendung als Vehikelkontrolle für die nicht vernetzenden Proben vor.
Anmerkungen: Bereiten Sie die BS3-Stammlösung vor, wenn alles andere fertig ist und das Experiment beginnt. Das BS3 sollte bis zur Verwendung getrocknet bei 4 °C gelagert werden. Nach der Rekonstitution bleibt BS3 nur noch ca. ≤3 h aktiv. Da der pH-Wert des 5 mM Natriumcitratpuffers (Lösung E) Berichten zufolge mit der Zeit ansteigt und eine beschleunigte BS3-Hydrolyse verursacht, wird empfohlen, Lösung E frisch aus den Stammlösungen A und B9 herzustellen. Aufgrund der begrenzten Löslichkeit von BS3 bei niedrigen Temperaturen wird das rekonstituierte BS3 bei RT aufbewahrt. Das rekonstituierte BS3 wird innerhalb von 3 Stunden verbraucht und das rekonstituierte BS3 nicht eingefroren/aufgetaut oder wiederverwendet.
5. Präparation von Hirngewebe
HINWEIS: Ab diesem Schritt sollten mindestens zwei Personen koordiniert zusammenarbeiten. Während sich eine Person auf die Sektion der Tiere konzentriert (Schritte 5.2-5.10 und Schritt 6.3), sollte die andere Person als Zeitnehmer fungieren und bei der Koordination des Assays helfen (Schritt 5.1, Schritt 6.1, Schritt 6.2, Schritt 6.4 und Schritt 6.5)
- Bringen Sie das erste Tier zum Sezieren aus dem Stallbereich in den Sezierraum.
HINWEIS: Da akute Stressoren (z. B. eine neue Umgebung, der Geruch von Blut) die Proteindynamik des Gehirns beeinträchtigen können, sollten die Tiere in ihren Käfigen fernab des Sezierbereichs gehalten und dann einzeln zur sofortigen Enthauptung in den Sezierraum gebracht werden. - Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation mit anschließender Enthauptung. Entfernen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel und tauchen Sie es für 10-15 s in eiskaltes PBS in eine Petrischale (Abbildung 2).
HINWEIS: Die Tiere werden für BS3-Experimente nicht anästhesiert, da jedes Anästhetikum potenziell die Oberflächenpräsentation der Neurotransmitterrezeptorenbeeinflussen könnte 9. - Legen Sie das gekühlte Gehirn mit der ventralen Seite des Gehirns nach oben in die Gehirnmatrix auf Eis (Abbildung 3).
- Führen Sie die erste Rasierklinge durch die Grenze zwischen dem Riechkolben und dem Riechstiel, um das Gehirn koronal zu schneiden (Abbildung 4). Schneiden Sie mit drei bis vier zusätzlichen Rasierklingen den vorderen Teil des Gehirns im Abstand von 1 mm nacheinander koronal durch.
- Hebe die koronalen Schnitte von der Hirnmatrix ab, indem du alle eingesetzten Rasierklingen zusammenhältst und den hinteren Teil des Gehirns in der Hirnmatrix zurücklässt. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Rasierklingen voneinander zu trennen, und legen Sie sie mit dem Hirnschnitt nach oben auf die flache, gekühlte Oberfläche (Abbildung 5).
- Identifizieren Sie die Slices, die den Interessenbereich enthalten. Wählen Sie für die Probenahme des PFC die zweite und dritte Scheibe hinter der ersten Scheibe, die den Riechstiel enthält.
- Entfernen Sie die interessierende Region mit einem Gewebestanzer (Video 1), legen Sie sie auf die gekühlte Rasierklinge und teilen Sie das Gewebe gleichmäßig in zwei Teile (z. B. Gewebe von der linken oder rechten Hemisphäre, wobei eine Hälfte für die BS3-Vernetzungsreaktion und die andere Hälfte für die Nicht-Vernetzungskontrolle verwendet wird, wenn das Zielprotein von Interesse in beiden Hemisphären gleichmäßig exprimiert wird).
- Zerkleinern Sie jedes Taschentuch auf der Rasierklinge mit der feinen Spitze der Pinzette mit mehreren vertikalen Bewegungen gegen die Klinge (Video 2), anstatt die Taschentücher zu zerdrücken oder zu zerkleinern. Dadurch wird die für BS3 zugängliche Oberfläche maximiert, ohne die Membranintegrität der Zellen stark zu beeinträchtigen. Unmittelbar nach dem Zerkleinern werden die zerkleinerten Gewebe in die entsprechenden Röhrchen umgefüllt (siehe Schritt 6.3).
- Nehmen Sie zur Probenahme des HPC den hinteren Teil des Gehirns aus der Matrix und legen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben auf angefeuchtetes Filterpapier auf die gekühlte flache Oberfläche (Abbildung 6).
- Untersuchen Sie mit einer gebogenen Sonde und einer Pinzette und nähern Sie sich von der dorsalen Seite (Video 3) die HPC (dorsale Hälfte, ventrale Hälfte oder beide) aus beiden Hemisphären (eine Hälfte für die BS3-Vernetzung und die andere Hälfte für die Kontrolle). Zerkleinern Sie jedes Gewebe wie in Schritt 5.8 und übertragen Sie das Gewebe in geeignete Röhrchen (siehe Schritt 6.3).
Anmerkungen: Die gesamte Sezierzeit für jedes Tier sollte bei ~5 Minuten gehalten werden, damit die Versuchsbedingungen und -ergebnisse konsistent sind.
6. Vernetzungsreaktion
- Bringen Sie das nächste Tier zur Sektion aus dem Stallbereich in den Sezierraum, wenn die Sektion des Gehirns der vorherigen Maus kurz vor dem Abschluss steht (Schritt 5.10).
- Das auf Eis vorgekühlte Röhrchen (aus Schritt 4.1) mit 30 μl BS3-Lösung (26x) oder Vehikellösung E aufspießen, kurz bevor das zerkleinerte Gewebe bereit ist, in die entsprechenden Röhrchen überführt zu werden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen den Röhrchen, um sicherzustellen, dass kein BS3 in den nicht vernetzenden Kontrollröhrchen verunreinigt ist.
- Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe (aus Schritt 5.8 und Schritt 5.10) in die entsprechenden Röhrchen und beginnen Sie dann mit der Präparation des nächsten Tieres (Schritt 5.2)
- Drehen Sie das Röhrchen um und mischen Sie es, um die Gewebestücke in kleinere Stücke zu zerlegen (Video 4), und beginnen Sie, die Proben auf dem Röhrchenrotator im Kühlraum 30 Minuten bis 2 Stunden lang zu inkubieren. Notieren Sie die Startzeit der BS3-Inkubation für jedes Röhrchen. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie Informationen zur optimalen Inkubationszeit.
- Die Reaktion wird abgeschreckt, indem das Röhrchen mit 78 μl 1 M Glycin versetzt wird, und die Probe wird 10 min lang bei 4 °C mit konstanter Rotation inkubiert. Notieren Sie die Start- und Endzeit des Abschreckens für jedes Rohr. Unterstützen Sie die Person weiterhin, indem Sie sich auf die Sektion des Tieres konzentrieren, indem Sie das nächste Tier mitbringen (Schritt 6.1) und bei der Vernetzung helfen (Schritt 6.2).
HINWEIS: Behandeln Sie jede Probe mit genau dem gleichen Timing für alle Proben. Wenn der Sezierraum weit vom Kühlraum entfernt ist, wird dringend empfohlen, eine dritte Person zu rekrutieren, die an der Probeninkubation und dem Abschrecken im Kühlraum teilnimmt.
7. Gewebelyse, Proteinpräparation und Western Blot
- Nach 10 min Abschrecken (Schritt 6.5) werden die Proben bei 20.000 x g bei 4 °C für 2 min gedreht und der Überstand verworfen. Wenn eine dritte Person verfügbar ist, fahren Sie mit Schritt 7.2 fort. Andernfalls frieren Sie die Proben auf Trockeneis ein und pausieren Sie den Test hier, bis die Gehirndissektion (Abschnitt 5) und die Vernetzung (Abschnitt 6) für alle Tiere abgeschlossen sind.
- Fügen Sie 400 μl eiskalten Lysepuffer pro Röhrchen hinzu.
- Beschallen Sie die Proben fünfmal für 1 s mit Intervallen von 5 s dazwischen, während Sie die Proben auf Eis halten.
- Schleudern Sie die Proben 2 Minuten lang bei 20.000 x g , um unlösliche Gewebetrümmer (Pellets) herauszuschleudern, und retten Sie den Überstand.
- Verwenden Sie 5 μl des Überstandes zur Messung der Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA).
- Teilen Sie den Rest des Überstands in zwei Röhrchen; Ein Röhrchen enthält 100 μl Überstand für den anschließenden Western Blot, das andere Röhrchen enthält den Rest (~300 μL) für die Langzeitlagerung bei −80 °C. Den Proben wird eine angemessene Menge 4x SDS-Probenpuffer (ergänzt mit β2-Mercaptoethanol) zugegeben und bei 70 °C für 10 min inkubiert.
- Lassen Sie 10-20 μg Protein pro Well auf einem Acrylamid-Gel für die Elektrophorese (SDS-PAGE) laufen und übertragen Sie dann Proteine zur Western-Blot-Analyse auf die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran.
- Blockieren Sie die PVDF-Membran in 5 % (w/v) Magermilch, die in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBS-T) gelöst ist, für 1 h bei RT.
- Waschen Sie die Membran zweimal kurz mit TBS-T und inkubieren Sie sie mit dem in TBS-T verdünnten Primärantikörper über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie den Primärantikörper dreimal für jeweils 10 Minuten in TBS-T bei RT ab.
- Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern, die in TBS-T verdünnt sind, für 1 h bei RT.
- Waschen Sie den Sekundärantikörper dreimal für jeweils 10 Minuten in TBS-T bei RT ab.
- Inkubieren Sie die Membran in einem verbesserten Chemilumineszenz-Reagenz und detektieren Sie das Signal mit dem Gel-Dokumentationsgerät.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Machbarkeit des BS3-Vernetzungsassays zur Bewertung des α5-GABA A R-Spiegels an der Oberfläche im PFC der Maus zu demonstrieren, ließen wir jeweils 10 μg BS3-vernetzte und unvernetzte Proteinproben auf SDS-PAGE laufen und analysierten die Proteine mittels Western Blot mit einem Anti-α5-GABAAR-Antikörper (polyklonales Kaninchen) (Abbildung 7). Die nicht vernetzten Proteinproben ergaben die Gesamtmenge an α5-GABA AR bei ~55 kDa, während die BS3-vernetzten Proteinproben eine bestimmte Menge an Endomembran-assoziiertem α5-GABA A R (migriert bei ~55 kDa) zusammen mit Proteinspezies mit höherem Molekulargewicht ergaben, die Proteinkomplexe repräsentierten, die kovalent mit α5-GABAAR vernetzt waren. Für die Quantifizierung des α5-GABA A R-Gehalts an der Oberfläche können wir das Ausmaß des Abbaus von α5-GABAAR bei ~55 kDa aus dem Gesamtpool nach der Vernetzung abschätzen, da sich die Untereinheit dann in Positionen mit höherem Molekulargewicht verschiebt. In der Praxis können die Oberflächengehalte von α5-GABAA R berechnet werden, indem die Menge an endomembranassoziiertem α5-GABA A R (bei ~55 kDa in der vernetzten Probenspur) von den gesamten α5-GABAAR-Werten (bei ~55 kDa in der unvernetzten Probenspur) subtrahiert wird.
Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von UCMS (nach 3 Wochen und 5 Wochen) auf die Oberfläche und den gesamten α5-GABAAR-Spiegel im PFC der Maus. In diesem Experiment präparierten wir die Proben 1 h, 2 h und 3 h nach der Zugabe von BS3, um den zeitlichen Verlauf der Vernetzungsreaktion zu verfolgen. Da die BS3-Vernetzungsreaktionen nach 2 h ein Plateau zu erreichen schienen, wurden die Daten zum 1-stündigen Zeitpunkt verwendet, um den Graphen zu zeichnen. Wir beobachteten eine signifikante und fortschreitende Verringerung des α5-GABA-A-R-Spiegels an der Oberfläche im PFC nach 3 Wochen und 5 Wochen UCMS im Vergleich zu den stressfreien Kontrollmäusen (Abbildung 8). Die Daten zeigten unter diesen experimentellen Bedingungen vernachlässigbare oder keine offensichtlichen Veränderungen der Gesamtrezeptorspiegel, was darauf hindeutet, dass chronischer Stress den Transport von α5-GABAAR zur Zelloberfläche spezifisch beeinflusst.
Abbildung 1: Dissektionswerkzeuge, die im BS3-Vernetzungsassay verwendet werden. Das Filterpapier wird mit eiskaltem PBS befeuchtet und auf die ebene Oberfläche des Blaueises gelegt. Eine mit PBS gefüllte Petrischale, die 1 Tag vor dem Test bei −20 °C gelagert wird, wird auf Eis gelegt. Die Gehirnmatrix und die Rasierklingen werden auf Eis vorgekühlt. Eine Schere (eine große, eine kleine), eine Pinzette (eine große, ein paar kleine) und eine Taschentuchstanze werden vor dem Assay gereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Das gesamte Mäusegehirn wurde aus dem Schädel herauspräpariert und in eiskaltes PBS gelegt. Unmittelbar nachdem das gesamte Gehirn aus dem Schädel entfernt worden war, wurde es für 10-15 s in eiskaltes PBS in eine Petrischale auf Eis getaucht. Dies verlangsamt den Stoffwechsel im Gehirn und minimiert den Proteintransport und -abbau, während gleichzeitig das Gewebe härter wird, was das anschließende Schneiden des Gehirns erleichtert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ein Mäusegehirn in der Hirnmatrix. Das gekühlte Mäusegehirn, das in eiskaltes PBS getaucht war, wurde in die Gehirnmatrix übertragen und mit der Bauchseite nach oben platziert. Die Rasierklingen und die Matrix wurden auf Eis vorgekühlt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Koronale Schnitte eines Mäusegehirns in der Hirnmatrix. Die erste vorgekühlte Rasierklinge wurde durch die Grenze zwischen dem Riechkolben und dem Riechstiel eingeführt, um mit der koronalen Durchtrennung des Gehirns zu beginnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Serielle koronale Schnitte eines Mäusegehirns. Der vordere Teil des Mäusegehirns wurde koronal durchtrennt, indem fünf Rasierklingen nacheinander in die Hirnmatrix eingeführt wurden (1 mm Abstand). Alle eingesetzten Klingen wurden zusammengehalten, von der Matrix abgehoben, mit einer Pinzette voneinander getrennt und mit dem Hirnschnitt nach oben auf die gekühlte flache Oberfläche gelegt. (Oben links) Der Riechkolben; (Mitte links) der erste Abschnitt; der zweite (unten links) und dritte (oben rechts) Abschnitt wurden für die Beprobung der PFC-Gewebe verwendet; (unten rechts) der vierte Abschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Hinterer Teil des Gehirns zur Präparation des Hippocampus. Nachdem der vordere Teil des Gehirns mit Rasierklingen koronal durchtrennt wurde (links), wurde der hintere Teil des Gehirns (Mitte) aus der Hirnmatrix entnommen und auf PBS-angefeuchtetes Filterpapier auf die gekühlte Oberfläche gelegt (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: BS3-Vernetzung von GABAAR auf der Zelloberfläche. In Gegenwart von BS3 wird α5-GABA A R auf der Oberfläche der Plasmamembran mit anonymen Proteinen in ihrer Nähe vernetzt (XL), wie z. B. ANDEREN GABAA R-Untereinheiten innerhalb der pentameren GABAAR-Anordnung oder zusätzlichen benachbarten Proteinen (X), jedoch nicht mit Proteinen (Y), die weit davon entfernt sind. So erscheint das α5-GABAAR als hochmolekulare (HMW) Proteinspezies auf dem Blot. α5-GABAAR auf dem Endosom bleibt intakt und wandert mit der erwarteten Größe von ~55 kDa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Oberflächen-α5-GABA-A-R-Konzentrationen, die von UCMS beeinflusst werden. Sowohl der Gesamt- als auch der Oberflächengehalt von α5-GABAAR im PFC von Mäusen unter den Bedingungen ohne Stress und UCMS (3 Wochen und 5 Wochen) wurden untersucht. Um den zeitlichen Verlauf der Vernetzungsreaktion zu verfolgen, wurden die Proben 1 h, 2 h und 3 h nach der Zugabe von BS3 präpariert. Es wurden weibliche Mäuse (2-3 Monate, N = 4/Gruppe) verwendet. Die intakten α5-GABAA R-Spiegel bei 55 kDa für jede Erkrankung wurden zunächst durch die entsprechenden αTubulin-Spiegel normalisiert und dann zur Berechnung der Gesamt- und Endomembran-assoziierten α5-GABAAR-Spiegel (aus den nicht vernetzten [No Xlink] bzw. den vernetzten [Xlink]-Proben) verwendet. Anschließend wurden die Oberflächenrezeptorspiegel berechnet, indem die Endomembran-assoziierte Menge von den Gesamtspiegeln subtrahiert wurde. Da die BS3-Vernetzungsreaktionen nach 2 h ein Plateau zu erreichen schienen, wurden die Daten zum 1-Stunden-Zeitpunkt verwendet, um den Graphen zu zeichnen (Mittelwert ± REM). Es wurden signifikante Auswirkungen von chronischem Stress auf die α5-GABA-A-R-Spiegel an der Oberfläche beobachtet, und dieser Effekt war von der UCMS-Dauer abhängig, da eine fortschreitende Abnahme der α5-GABA-A-R-Spiegel an der Oberfläche über den UCMS-Zeitraum festgestellt wurde. *p < 0,05, **p < 0,01 (Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleichen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Arbeitsschwerpunkt | Standard-Lösung | Menge der zu verabreichenden Stammlösung |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM Glukose | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Deionisiertes Wasser | 37.563 ml | |
| Gesamt | 40 ml | |
| * CaCl2-Brühe sollte am Tag des Versuchs frisch zubereitet werden. | ||
Tabelle 1: Die Zusammensetzung des künstlichen Liquors cerebrospinalis.
| Arbeitsschwerpunkt | Standard-Lösung | Menge der zu verabreichenden Stammlösung |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM DVB-T | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1 % NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Proteasehemmer-Cocktail | 100-fach | 200 μL |
| Deionisiertes Wasser | 17 ml | |
| Gesamt | 20 ml |
Tabelle 2: Die Zusammensetzung des Lysepuffers
Video 1: Isolierung des PFC mit einer Taschentuchstanze. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Zerkleinern der PFC mit einer Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Präparieren des HPC mit einer gebogenen Sonde und einer Pinzette. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Inversionsmischung einer Gewebeprobe. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obwohl die Auswirkungen von chronischem psychosozialem Stress auf Verhaltensweisen (d. h. Emotionalität und kognitive Defizite) und molekulare Veränderungen (d. h. reduzierte Expression von GABAergen Genen und damit einhergehende Defizite in der GABAergen Neurotransmission) gut dokumentiert sind10, müssen die Mechanismen, die diesen Defiziten zugrunde liegen, weiter untersucht werden. Insbesondere angesichts der kürzlich durchgeführten Studie, die zeigt, dass chronischer Stress das neuronale Proteom durch Überlastung der ER-Funktionen und damit erhöhten ER-Stress signifikant beeinflusst15, bleibt die Frage, ob chronischer Stress den Transport von GABA A R durch die ER-Membran beeinflusst und wie ein veränderter Transport oder Oberflächenspiegel von GABAAR kausal mit der Psychopathologie zusammenhängen könnte.
Der in diesem Protokoll gezeigte BS3-Vernetzungsassay wird als leistungsfähiger Ansatz zur Beantwortung einiger dieser Fragen dienen. Zum Beispiel ist bekannt, dass UCMS eine Reihe von Verhaltensänderungen hervorruft, darunter kognitive Defizite, angstähnliches Verhalten und anhedonische Phänotypen, abhängig von der Dauer von UCMS10. Daher wäre es möglich, den zeitlichen Verlauf und das Ausmaß der UCMS-induzierten Veränderungen der α5-GABAAR-Spiegel an der Oberfläche zu untersuchen, indem man Mäusegehirne zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nach Beginn des UCMS (z. B. 1 Woche, 3 Wochen, 5 Wochen) beprobt, und es wäre auch möglich, einen Kreuzvergleich mit den Verhaltensphänotypen durchzuführen, die zu jedem Zeitpunkt beobachtet wurden. Zusätzliche GABAAR-Subtypen (z. B. α1, α2) und der Rezeptor für Neuromodulatoren, von denen bekannt ist, dass sie von chronischem Stress beeinflusst werden (z. B. der TrkB-Rezeptor für den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor [BDNF])10 konnten gleichzeitig mit denselben Proben getestet werden. Da einige dieser Rezeptorsysteme und -subtypen selektiv an bestimmten Verhaltensbereichen (z. B. Sedierung, Angst, Kognition) beteiligt sind11, lohnt es sich, die Verhaltensänderungen mit der Art und dem Grad der Rezeptoren zu korrelieren, die zu jedem Zeitpunkt von UCMS betroffen sind.
Im Folgenden sind die kritischen Punkte aufgeführt, die bei mehreren Schritten im Protokoll zu berücksichtigen sind. Der erste Schritt besteht darin, die notwendige und ausreichende Anzahl von Tieren zu bestimmen, die auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der Leistungsanalyse verwendet werden sollen. Um beispielsweise die Auswirkungen von chronischem Stress auf den GABA-A-Rezeptorspiegel an der Oberfläche zu untersuchen, bereiten wir routinemäßig eine Gruppe von Mäusen (N = 6/Geschlecht) darauf vor, 5 Wochen lang UCMS ausgesetzt zu werden, und eine andere Gruppe (N = 6/Geschlecht), um sie unter stressfreien Bedingungen zu halten. Es wird erwartet, dass diese Gruppengröße (N = 24 insgesamt, einschließlich beider Geschlechter) genügend statistische Aussagekraft ergibt, um einen Unterschied von ~20% in den Rezeptorspiegeln zu erkennen, was eine Bewertung sowohl von Stresseffekten als auch von Geschlechtseffekten ermöglicht. Insbesondere wird berichtet, dass chronischer Stress geschlechtsabhängige Unterschiede im Verhalten und in den molekularen Ergebnissen verursacht10. So sind Frauen im Allgemeinen anfälliger für depressive Symptome als Männer. Übereinstimmend deuten unsere Studien mit menschlichen Post-Mortem- und Nagetiergehirnen auf ein höheres Maß an Verhaltens- und molekularen Pathologien bei weiblichen Probanden hin; Herunterregulierte Spiegel von Somatostatin (SST), einem molekularen Marker für Depressionen, sind bei Frauen unter depressiven Patienten robuster16, und eine erhöhte Emotionalität ist bei weiblichen Mausmodellen, die Aspekte der depressiven Pathologie replizieren, robuster als bei Männern15,17. Daher wird empfohlen, dass jedes experimentelle Design, das sich mit den Auswirkungen von chronischem Stress auf psychopathologische Ergebnisse befasst, eine ausreichende Anzahl von Männern und Frauen einbeziehen sollte, um eine statistische Aussagekraft bei der Analyse der Daten zu gewährleisten und mögliche geschlechtsabhängige Effekte zu identifizieren.
Die optimale Inkubationszeit mit BS3 sollte in Pilotversuchen für jeden zu untersuchenden Rezeptor ermittelt werden. Es wird berichtet, dass der Rezeptortransport langsam erfolgen kann, selbst bei niedrigen Temperaturen während der Probeninkubation9. Um die Oberflächenrezeptorspiegel zum Zeitpunkt der Hirndissektion genau zu erfassen, wäre es ideal, die Inkubationszeit zu minimieren und den Zeitpunkt kurz vor dem Erreichen des Plateaus durch die Vernetzungsreaktion zu wählen (30 min bis 2 h bei 4 °C).
Wir stellten mehrere betriebliche Einschränkungen im Zusammenhang mit BS3-Vernetzungsassays fest. (1) Erstens muss aufgrund der relativ kurzen Halbwertszeit (2-3 h) von BS3, die durch spontane Hydrolyse innerhalb des physiologischen pH-Bereichs verursacht wird, die Präparations- und Vernetzungsreaktion der Tiere innerhalb dieses Zeitrahmens abgeschlossen werden. Dies führte dazu, dass wir die Anzahl der Tiere, die wir gleichzeitig sezieren konnten, auf maximal 12 begrenzten. Wenn der Versuchsleiter plant, mehr als 12 Tiere zu sezieren, wird empfohlen, die Versuchskohorte in mehrere Gruppen mit jeweils weniger als 12 Tieren aufzuteilen. Nachdem der Assay für eine Gruppe abgeschlossen ist, sollte eine neue Charge BS3 frisch vorbereitet werden, um sie in nachfolgenden Vernetzungsassays für die nächste Gruppe zu verwenden. Ebenso sollte die Anzahl der zu untersuchenden Regionen eines Tieres begrenzt werden. Wir nehmen routinemäßig Proben aus zwei Gehirnregionen (PFC, HPC) für den Crosslinking-Assay, und dies ist die maximale Anzahl von Gehirnregionen, die wir sezieren können, um konsistente Ergebnisse mit minimaler Variabilität zwischen den Proben zu erhalten. (2) Zweitens sollte die Spezifität der Antikörper, die im Western Blot verwendet werden, sorgfältig bewertet werden. Die chemische Vernetzungsreaktion von BS3 kann einen unerwarteten Effekt auf die Antigenität der Proteine haben, die von jedem Antikörper nachgewiesen werden. Wir fanden heraus, dass ein α5-GABAEinR-Antikörper (spezifiziert in der Tabelle der Materialien) fälschlicherweise eine starke ~50 kDa-Bande speziell in BS3-vernetzten Proben nachgewiesen hat, unabhängig davon, ob die α5-GABA vorhanden ist oder nichtEinR-Protein in der Probe; Diese ~50 kDa-Bande wurde sogar in Gewebeproben von α5-GABA beobachtetEinR-Knockout-Mäuse, was darauf hindeutet, dass dieser Antikörper mit irrelevanten Antigenen zu reagieren begann, die versehentlich durch die BS3-Vernetzungsreaktion erzeugt wurden. Es wird empfohlen, die Antikörperspezifität mit und ohne BS3-Vernetzungsreaktionen gründlich zu bestimmen, idealerweise unter Verwendung von Knockout-Gewebeproben, falls verfügbar, für ein bestimmtes Protein von Interesse. (3) Das derzeit beschriebene Protokoll befasst sich nicht mit den Zelltypen, in denen jedes GABAEinDer Subtyp R wird exprimiert (z. B. Neuronen und Astrozyten). Für einige GABAEinR-Subtypen (z. B. α1, α5), die überwiegend in Neuronen exprimiert werden18sollten die in diesem Protokoll beschriebenen Daten des Vernetzungstests, die unter Verwendung von Hirngewebe gewonnen wurden, Informationen liefern, die die neuronalen Oberflächenebenen widerspiegeln. Für andere GABAEinR-Subtypen (z. B. α2), die sowohl in Neuronen als auch in Astrozyten stark exprimiert werden18ist es von Interesse, die Rezeptoroberflächenniveaus in Neuronen im Vergleich zu Astrozyten separat zu untersuchen. Zu diesem Zweck wird die konventionelle Zellsortierung (z.B. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung [FACS]19) kann in das BS3-Vernetzungsprotokoll integriert werden; Der Zelldissoziationsschritt für die Zellsortierung kann nach dem BS3-Quenching-Schritt durchgeführt werden, aber es muss überprüft werden, ob alle Verfahren und Bedingungen für FACS (z. B. die zu verwendenden Puffer, Temperatur, Inkubationszeit) mit denen im Vernetzungsassay kompatibel sind. Darüber hinaus darf der FACS-Ansatz nur für GABA verwendet werdenEinR-Subtypen, von denen bekannt ist, dass sie im perisomatischen Zellkompartiment lokalisiert sind (z. B. α2), jedoch nicht für die Subtypen, die mit distalen Dendriten angereichert sind (z. B. α5)18, da periphere oder distale Zellkompartimente wahrscheinlich während des umfangreichen Zelldissoziationsschritts verloren gehen, der für die Zellsortierung erforderlich ist. (4) Schließlich stellten wir fest, dass die Ergebnisse konsistenter waren, wenn wir die Oberflächenrezeptorniveaus berechneten, indem wir die Menge der Endomembran-assoziierten Rezeptoren von der Gesamtzahl der Rezeptoren subtrahierten, anstatt die Oberflächenniveaus direkt auf der Grundlage der Dichtemessung hochmolekularer Proteinspezies zu bewerten. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die Übertragungseffizienz dieser hochmolekularen Proteinspezies auf die PVDF-Membran variabler ist als die des ursprünglichen, intakten Proteins kleinerer Größe (z. B. ~55 kDa für α5-GABAEinEs wird daher empfohlen, die im Abschnitt "Ergebnisse" beschriebene Methode und die Legende von Abbildung 8 , um die Oberflächenrezeptor-Niveaus zu berechnen.
Abgesehen von den Auswirkungen von chronischem Stress auf GABAAR kann der BS3-Vernetzungstest auch auf genetisch veränderte Mäuse oder Nagetiermodelle mit experimentellen Manipulationen angewendet werden, um eine Reihe von neurologischen oder neuropsychiatrischen Erkrankungen zu untersuchen. Dieser Assay wurde erfolgreich eingesetzt, um Kokain-induzierte Effekte auf die Oberflächenexpression von Glutamatrezeptoren im Nucleus accumbens von Rattengehirnen zu erfassen20,21. Der Assay wurde auch verwendet, um eine reduzierte Oberflächenexpression von α5-GABAAR im PFC von heterozygoten BDNF-Knockout-Mäusen zu zeigen22. In einer anderen früheren Studie im Modell der hepatischen Enzephalopathie bei Ratten wurden die damit einhergehenden räumlichen Lerndefizite kausal mit einer veränderten Oberflächenexpression von Glutamat- und GABA-A-Rezeptoren auf der Grundlage dieses Vernetzungsassaysverknüpft 23. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der BS3-Test für die chemische Vernetzung ein vielseitiges Werkzeug zur Erfassung von hirnregionenspezifischen und kontextabhängigen Veränderungen in einer Reihe von Rezeptorsystemen im Gehirn sowie in praktisch allen anderen peripheren Geweben oder Organen darstellt. Dieser Assay kann auch parallel zu anderen Methoden zur Bewertung der Oberflächenrezeptorspiegel durchgeführt werden, wie z. B. der elektrophysiologischen Aufzeichnung der tonischen Hemmung (insbesondere im Fall von α5-GABAAR), der kryogenen Elektronenmikroskopie und der Oberflächenbiotinylierung, um die Ergebnisse zu vergleichen und zu validieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitarbeitern der CAMH-Tierklinik für die Betreuung der Tiere während der gesamten Studiendauer. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 an T.T.), dem Discovery Fund des CAMH (an T.P.), der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD Award #25637 an E.S.) und dem Campbell Family Mental Health Research Institute (an E.S.). E.S. ist die Gründerin von Damona Pharmaceuticals, einem Biopharmaunternehmen, das sich der Einführung neuartiger GABAerger Verbindungen in die Klinik verschrieben hat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
