Summary
BS3 kimyasal çapraz bağlama testi, kronik psikososyal stres koşulları altında fare beyinlerinde azalmış hücre yüzeyi GABAA reseptör ekspresyonunu ortaya koymaktadır.
Abstract
Anksiyete, bilişsel işlevler de dahil olmak üzere hayvan davranışlarını değişken olarak etkileyen bir duygu durumudur. Davranışsal anksiyete belirtileri hayvan krallığında gözlenir ve çok çeşitli stres modalitelerine uyarlanabilir veya uyumsuz tepkiler olarak kabul edilebilir. Kemirgenler, moleküler, hücresel ve devre seviyelerinde anksiyetenin bütünleştirici mekanizmalarını ele alan translasyonel çalışmalar için kanıtlanmış bir deneysel model sunmaktadır. Özellikle, kronik psikososyal stres paradigması, insanlar ve kemirgenler arasında benzer olan anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri taklit eden uyumsuz tepkileri ortaya çıkarır. Önceki çalışmalar, kronik stresin beyindeki nörotransmitter içeriği üzerinde önemli etkileri gösterirken, stresin nörotransmitter reseptör seviyeleri üzerindeki etkisi yeterince çalışılmamıştır. Bu makalede, kronik stres altındaki farelerde nörotransmitter reseptörlerinin nöronal yüzey seviyelerini ölçmek için deneysel bir yöntem sunuyoruz, özellikle duygu ve bilişin düzenlenmesinde rol oynayan gama-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerine odaklanıyoruz. Membran geçirimsiz geri dönüşümsüz kimyasal çapraz bağlayıcı bisülfosuccinimidyl suberat (BS3) kullanarak, kronik stresin prefrontal korteksteki GABAA reseptörlerinin yüzey mevcudiyetini önemli ölçüde azalttığını gösteriyoruz. GABAA reseptörlerinin nöronal yüzey seviyeleri, GABA nörotransmisyonu için hız sınırlayıcı bir süreçtir ve bu nedenle, deneysel hayvan modellerinde moleküler bir belirteç veya anksiyete / depresif benzeri fenotiplerin derecesinin bir vekili olarak kullanılabilir. Bu çapraz bağlama yaklaşımı, herhangi bir beyin bölgesinde ifade edilen nörotransmiterler veya nöromodülatörler için çeşitli reseptör sistemlerine uygulanabilir ve duygu ve bilişin altında yatan mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunması beklenir.
Introduction
Nörotransmitter reseptörleri ya nöronal plazma membran yüzeyinde ya da hücre içi olarak endomembranlarda (örneğin, endozom, endoplazmik retikulum [ER] veya trans-Golgi aparatı) lokalize olur ve nöronlardaki içsel fizyolojik durumlara bağlı olarak veya dışsal sinir ağı aktivitelerine yanıt olarak bu iki bölme arasında dinamik olarak mekik dokumaktadır 1,2. Yeni salgılanan nörotransmitterler fizyolojik fonksiyonlarını öncelikle yüzey-lokalize reseptör havuzu aracılığıyla ortaya çıkardığından, belirli bir nörotransmitter için yüzey reseptör seviyeleri, nöral devre3 içindeki sinyal kapasitesinin kritik belirleyicilerinden biridir.
Kültürlenmiş nöronlarda yüzey reseptör seviyelerini izlemek için, yüzey biyotinilasyon testi4, geçirgen olmayan koşullarda spesifik bir antikora sahip immünofloresan testi5 veya genetik olarak pH'a duyarlı floresan optik göstergeyle (örneğin, pHluorin) kaynaşmış bir reseptör transgeninin kullanımı dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Buna karşılık, bu yaklaşımlar in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirirken sınırlı veya pratik değildir. Örneğin, yüzey biyotinilasyon prosedürü, nispeten yüksek fiyatı ve avidin konjuge boncuklar üzerindeki biyotinile proteinlerin saflaştırılması için gerekli sonraki adımlar nedeniyle büyük miktarlarda ve in vivo beyin dokularının örnek sayılarını işlemek için pratik olmayabilir. Üç boyutlu beyin mimarisine gömülü nöronlar için, düşük antikor erişilebilirliği veya mikroskop tabanlı nicelemedeki zorluklar, in vivo yüzey reseptör seviyelerini değerlendirmek için önemli bir sınırlama oluşturabilir. Nörotransmitter reseptörlerinin bozulmamış beyinlerdeki dağılımını görselleştirmek için, pozitron emisyon tomografisi gibi non-invaziv yöntemler, reseptör doluluğunu ölçmek ve yüzey reseptör seviyelerini tahmin etmek için kullanılabilir7. Bununla birlikte, bu yaklaşım kritik olarak belirli radyo ligandlarının, pahalı ekipmanların ve özel uzmanlığın mevcudiyetine dayanır ve bu da çoğu araştırmacı tarafından rutin kullanım için daha az erişilebilir olmasını sağlar.
Burada, deneysel hayvan beyinlerindeki yüzey reseptör seviyelerini ex vivo olarak ölçmek için suda çözünür, membran geçirimsiz bir kimyasal çapraz bağlayıcı olan bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) 8,9 kullanarak basit, çok yönlü bir yöntem açıklıyoruz. BS3, lizin kalıntılarının yan zincirindeki birincil aminleri hedefler ve birbirine yakın proteinlere kovalent olarak çapraz bağlayabilir. Beyin dilimleri ilgilenilen bir bölgeden taze olarak hazırlandığında ve BS3 içeren bir tamponda inkübe edildiğinde, hücre yüzey reseptörleri komşu proteinlerle çapraz bağlanır ve böylece daha yüksek moleküler ağırlıklı türlere dönüşürken, hücre içi endomembran ile ilişkili reseptörler değiştirilmeden kalır. Bu nedenle, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılabilir ve incelenecek reseptöre özgü antikorlar kullanılarak batı lekesi ile ölçülebilir.
Öngörülemeyen kronik hafif stres (UCMS), kemirgenlerde kronik psikososyal stresi indüklemek için iyi kurulmuş bir deneysel paradigmadır10. KMYS, GABA ve reseptörleri10,11 dahil olmak üzere bir dizi nörotransmitter sisteminin modülasyonu yoluyla anksiyete / depresif benzeri davranışsal fenotipleri ve bilişsel eksiklikleri ortaya çıkarır. Özellikle, α5 alt birimi içeren GABA A reseptörü (α5-GABAAR), hafıza ve bilişsel işlevlerin düzenlenmesinde rol oynar12,13, bu alt birimin değiştirilmiş fonksiyonlarının UCMS kaynaklı bilişsel eksikliklere olası katılımını düşündürmektedir. Bu protokolde, BS3 çapraz bağlama testini, stressiz kontrol farelerine kıyasla UCMS'ye maruz kalan farelerin prefrontal korteksindeki yüzey eksprese α5-GABAAR seviyelerini ölçmek için kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoldeki tüm hayvan çalışmaları, Ontario Araştırma Hayvanları Yasası (RSO 1990, Bölüm A.22) ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) uyarınca tamamlanmış ve Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanların hazırlanması
- Deneylerde kullanılacak hayvan sayılarını belirleyin ve bunları uygun gruplara veya deney kohortlarına bölün. Grup büyüklüğü, cinsiyeti ve istatistiksel gücü hakkında bir tartışma için tartışma bölümüne bakın.
NOT: Bu protokol fareler için özelleştirilmiştir (C57BL6/J suşu; 2-4 aylık; tipik olarak 20-30 g vücut ağırlığı; kullanılacak eşdeğer sayıda erkek ve dişi). - Hayvanları UCMS altına yerleştirin veya daha önce14'te açıklandığı gibi protokolü izleyerek 5-8 hafta boyunca stresli olmayan koşulları kontrol edin.
- Son UCMS prosedüründen sonra, reseptör ekspresyonu üzerindeki akut stres etkilerinden kaçınmak için çapraz bağlama testi için kullanmadan önce hayvanların 1 gün boyunca ev kafeslerinde kalmalarına izin verin.
2. Stok çözümlerinin hazırlanması
- Aşağıdaki çözümleri tahlilden önce talimat verildiği şekilde hazırlayın ve saklayın.
- 14.6 g NaCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 5 M NaCl hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- 3.22 g KCl'yi 40 mL deiyonize suda çözerek 1.08 M KCl hazırlayın. RT'de depolayın.
- 3.25 g MgCl 2·6H 2O'yu 40 mL deiyonize suda çözerek 400 mM MgCl2 hazırlayın. RT'de depolayın.
- 3 g glisini 40 mL deiyonize suda çözerek 1 M glisin hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- 10 mL deiyonize suda 1.54 g DTT'yi çözerek 1 M ditiyotreitol (DTT) hazırlayın. Gözenek boyutu 0,2 μm olan bir filtreden geçirin ve 2 mL tüplere aliquot yapın. −20 °C'de saklayın.
- %10 Nonidet-P40 (NP-40) değerini deiyonize suda 1:10 (v/v) oranında seyrelterek hazırlayın. RT'de depolayın.
- 0,5 M EDTA (pH = 8,0) hazırlayın ve RT'de saklayın.
- 1 M HEPES tamponu (pH = 7.2-7.5) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
- 2,5 M veya %45 (w/v) glikoz hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
3. İş istasyonunun hazırlanması
- BS3 çapraz bağlama testi gününde, aşağıdaki malzemeleri hayvan diseksiyon odasında toplayın (Şekil 1), buz üzerinde önceden soğutulmuş birkaç öğe ile: bir buz kovası, bir metal sıcaklık bloğu (buz üzerinde önceden soğutulmuş), 50 mL'lik bir konik tüpte buz gibi soğuk PBS ve bir Petri kabında dondurulmuş PBS, PBS ile nemlendirilmiş ve soğutulmuş düz bir yüzeye veya mavi buza yerleştirilmiş filtre kağıdı, buz üzerinde önceden soğutulmuş bir beyin matrisi (tıraş bıçağı yerleştirme için 1 mm aralık), buz üzerinde önceden soğutulmuş tıraş bıçakları (~ 10), diseksiyon aletleri (makas, forseps, kavisli bir prob), bir doku zımbası,% 70 etanol sprey silme kağıdı ve kağıt havlular, pipet uçları (200 μL), bir pipetleyici (P200), bir kronometre, bir not defteri, bir kalem ve mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL).
- Tahlilden önce, mikrosantrifüj tüplerini numune bilgileriyle etiketleyin (örneğin, hayvan kimlik numarası, tedavi tipi [UCMS'ye karşı stressiz (NS)], beyin bölgesi, BS3'lü veya BS3'süz, vb.).
NOT: BS3 çapraz bağlama testleri için, her beyin bölgesinden iki örnek toplanmalıdır; bir numune çapraz bağlama (BS3 ile) ve diğeri çapraz bağlanma olmayan reaksiyon (BS3 olmadan) için bir kontrol olarak kullanılacaktır. Bu nedenle, 12 farede iki beyin bölgesinden (yani, prefrontal korteks [PFC] ve hipokampus [HPC]) örneklemek için, ilk örnekleme için 48 tüp etiketleyin (= 2 örnek × 2 bölge × 12 fare) (bölüm 6'da kullanılacaktır). Daha sonra depolamak üzere 48 tüpten oluşan ek iki seti etiketleyin (her numunenin iki farklı hacmini [100 μL, 300 μL] depolamak için) (bölüm 7'de kullanılacaktır). Bu nedenle, bu kohort boyutu için toplam 144 tüpün etiketlenmesi gerekmektedir.
- Tahlilden önce, mikrosantrifüj tüplerini numune bilgileriyle etiketleyin (örneğin, hayvan kimlik numarası, tedavi tipi [UCMS'ye karşı stressiz (NS)], beyin bölgesi, BS3'lü veya BS3'süz, vb.).
- Ek olarak, laboratuvarda aşağıdaki ekipmanların bulunduğundan emin olun: masa üstü soğutmalı mikrosantrifüj, bir sonikatör, bir tüp rotatör (soğuk odada veya buzdolabının içinde kullanılacak [4 °C]), numuneleri depolamak için bir dondurucu (-80 °C) ve numunelerin geçici olarak depolanması için bir kova kuru buz (bölüm 7'de kullanılacaktır)
4. Çalışma çözeltilerinin ve tamponların hazırlanması
NOT: Tahlil sabahında, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın. Bu hesaplama, 12 fareden iki beyin bölgesini (yani PFC ve HPC) işlemek için gerekli çözümlere dayanmaktadır.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF, pH = 7.4) hazırlayın. Her bir numune alma tüpüne (adım 3.1.1'de etiketlenen 48 tüp) 750 μL aCSF dağıtın ve tamponu önceden soğutmak için bunları buz üzerindeki metal sıcaklık bloğuna yerleştirin.
- Lizis tamponunu Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Buz üzerinde saklayın (numune başına 400 μL kullanılacaktır).
- 5 mM sodyum sitrat tamponunda (pH = 5.0) 52 mM BS3 stok çözeltisi (26x) hazırlayın.
- İlk olarak, 100 mM sitrik asit (stok A) ve 100 mM sodyum sitrat (stok B) hazırlayın.
- Stok A ve stok B'yi deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltin. Sırasıyla 5 mM sitrik asit (stok C) ve 5 mM sodyum sitrat (stok D) hazırlamak için her biri 1,9 mL suya 100 μL ekleyin.
- 5 mM sodyum sitrat tamponu (pH = 5.0) (çözelti E, 1 mL) hazırlamak için 410 μL stok C ve 590 μL stok D'yi karıştırın.
- Bir pH gösterge şeridi kullanarak E çözeltisinin pH'ını onaylayın.
- BS3 stok çözeltisini (26x) hazırlamak için 24 mg BS3'ü 806.4 μL E çözeltisi içinde 30 s boyunca vorteks yaparak çözün.
- Çapraz bağlanmayan numuneler için araç kontrolü olarak kullanmak üzere 1 mL'lik başka bir E çözeltisi hazırlayın.
NOT: Diğer her şey hazır olduğunda ve deney başlamak üzereyken BS3 stok çözeltisini hazırlayın. BS3, kullanılıncaya kadar 4 °C'de kurutularak saklanmalıdır. Yeniden yapılandırıldıktan sonra, BS3 sadece yaklaşık ≤3 saat boyunca aktif kalır. 5 mM sodyum sitrat tamponunun (çözelti E) pH'ının zamanla yükseldiği ve BS3 hidrolizinin hızlanmasına neden olduğu bildirildiğinden, E çözeltisinin stok çözeltileri A veB9'dan taze olarak hazırlanması önerilir. BS3'ün düşük sıcaklıklarda sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, yeniden yapılandırılmış BS3'ü RT'de tutun. yeniden yapılandırılmış BS3'ü 3 saatte kullanın ve yeniden yapılandırılmış BS3'ü dondurmayın / çözmeyin veya yeniden kullanmayın.
5. Beyin dokularının diseksiyonu
NOT: Bu adımdan itibaren, en az iki kişi koordineli bir şekilde birlikte çalışmalıdır. Bir kişi hayvan diseksiyonuna odaklanırken (adım 5.2-5.10 ve adım 6.3), diğer kişi zaman tutucu olarak çalışmalı ve tahlilin koordine edilmesine yardımcı olmalıdır (adım 5.1, adım 6.1, adım 6.2, adım 6.4 ve adım 6.5)
- Diseksiyon için ilk hayvanı konut alanından diseksiyon odasına getirin.
NOT: Akut stresörler (örneğin, yeni bir ortam, kan kokusu) beyin protein dinamiklerini etkileyebileceğinden, hayvanlar diseksiyon alanından uzağa yerleştirilmiş ev kafeslerinde tutulmalı ve daha sonra derhal dekapitasyon için diseksiyon odasına ayrı ayrı getirilmelidir. - Fareyi servikal çıkık ve ardından kafa kesme ile ötenazi yapın. Beyni kafatasından hızla çıkarın ve 10-15 s boyunca bir Petri kabında buz gibi PBS'ye batırın (Şekil 2).
NOT: Hayvanlar BS3 deneyleri için uyuşturulmamıştır, çünkü herhangi bir anestezik ajan nörotransmitter reseptörlerinin yüzey sunum seviyesini potansiyel olarak etkileyebilir9. - Soğutulmuş beyni, beynin ventral tarafı yukarı bakacak şekilde buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin (Şekil 3).
- Beyni koronal olarak kesmek için ilk tıraş bıçağını koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirin (Şekil 4). Üç ila dört ek tıraş bıçağı kullanarak, beynin ön kısmını 1 mm aralıklarla koronal olarak seri olarak kesin.
- Yerleştirilen tüm tıraş bıçaklarını bir arada tutarak koronal dilimleri beyin matrisinden kaldırın ve beynin arka kısmını beyin matrisinde geride bırakın. Tıraş bıçağını birbirinden ayırmak için forseps kullanın ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde düz, soğutulmuş yüzeye yerleştirin (Şekil 5).
- İlgilenilen bölgeyi içeren dilimleri tanımlayın. PFC'yi örneklemek için, koku alma pedinkülünü içeren ilk dilimin arkasındaki ikinci ve üçüncü dilimleri seçin.
- Bir doku zımbası kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi çıkarın (Video 1), soğutulmuş tıraş bıçağının üzerinde bir kenara koyun ve dokuyu eşit olarak ikiye bölün (örneğin; soldan sağ yarımküreye karşı dokular, bir yarısı BS3 çapraz bağlama reaksiyonu için ve diğer yarısı da ilgilenilen hedef protein her iki yarımkürede eşit olarak ifade edilirse, çapraz bağlanma kontrolü için kullanılacaktır).
- Dokuları ezmek veya taşlamak yerine forsepsin ince ucunu bıçağa karşı çoklu dikey hareketlerle kullanarak her dokuyu tıraş bıçağı üzerinde parçalara ayırın (Video 2). Bu, hücrelerin membran bütünlüğünden ciddi şekilde ödün vermeden BS3 tarafından erişilebilen yüzey alanını en üst düzeye çıkaracaktır. Kıymadan hemen sonra, kıyılmış dokuları uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3).
- HPC'yi örneklemek için, beynin arka kısmını matristen çıkarın ve beyni dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz yüzeydeki nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 6).
- Kavisli bir prob ve forseps kullanarak ve dorsal taraftan yaklaşarak (Video 3), HPC'yi (dorsal yarım, ventral yarı veya her ikisi) her iki yarımküreden (BS3 çapraz bağlama için bir yarısı ve diğer yarısı kontrol için) disseke edin. Her dokuyu adım 5.8'deki gibi kıyın ve dokuyu uygun tüplere aktarın (bkz. adım 6.3).
NOT: Deney koşullarının ve sonuçların tutarlı olması için her hayvan için tüm diseksiyon süresi ~ 5 dakika olarak tutulmalıdır.
6. Çapraz bağlama reaksiyonu
- Diseksiyon için bir sonraki hayvanı, önceki farenin beyninin diseksiyonu bitmek üzereyken barınma alanından diseksiyon odasına getirin (adım 5.10).
- Kıyılmış dokular uygun tüplere aktarılmaya hazır olmadan hemen önce buz üzerinde önceden soğutulmuş tüpü 30 μL BS3 çözeltisi (26x) veya araç çözeltisi E ile (adım 4.1'den itibaren) yükseltin. Çapraz bağlanmayan kontrol tüplerinde BS3'ün kirlenmediğinden emin olmak için borular arasındaki pipet uçlarını değiştirin.
- Kıyılmış dokuları (adım 5.8 ve adım 5.10'dan) uygun tüplere aktarın ve ardından bir sonraki hayvanı diseke etmeye başlayın (adım 5.2)
- Doku parçalarını daha küçük parçalara ayırmak için tüpü ters çevirin ve karıştırın (Video 4) ve numuneleri soğuk odadaki tüp rotatöründe 30 dakika ila 2 saat boyunca inkübe etmeye başlayın. Her tüp için BS3 inkübasyonunun başlangıç zamanını kaydedin. En uygun inkübasyon süresi için tartışma bölümüne bakın.
- Tüpü 78 μL 1 M glisin ile yükselterek reaksiyonu söndürün ve numuneyi sabit rotasyonla 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Her tüp için söndürmenin başlangıç ve bitiş zamanını kaydedin. Bir sonraki hayvanı getirerek (adım 6.1) ve çapraz bağlamaya yardımcı olarak (adım 6.2) hayvan diseksiyonuna odaklanan kişiye yardım etmeye devam edin.
NOT: Her numuneye, tüm numunelerde tam olarak aynı zamanlama ile muamele edin. Diseksiyon odası soğuk odadan uzaksa, numune inkübasyonuna katılmak ve soğuk odada söndürmek için üçüncü bir kişinin işe alınması şiddetle tavsiye edilir.
7. Doku lizisi, protein hazırlama ve batı lekesi
- 10 dakikalık söndürmeden sonra (adım 6.5), numuneleri 2 dakika boyunca 4 ° C'de 20.000 x g'de döndürün ve süpernatanı atın. Üçüncü bir kişi mevcutsa, adım 7.2'ye geçin; Aksi takdirde, numuneleri kuru buz üzerinde dondurun ve tüm hayvanlar için beyin diseksiyonu (bölüm 5) ve çapraz bağlama (bölüm 6) tamamlanana kadar tahlili burada duraklatın.
- Tüp başına 400 μL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.
- Örnekleri buz üzerinde tutarken, örnekleri aralarında 5 s aralıklarla 1 s beş kez sonikleştirin.
- Çözünmeyen doku kalıntılarını (pelet) dışarı atmak ve süpernatanı kurtarmak için numuneleri 2 dakika boyunca 20.000 x g'de döndürün.
- Bisinkonik asit (BCA) testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatantın 5 μL'sini kullanın.
- Süpernatantın geri kalanını iki tüpe bölün; Bir tüp sonraki batı lekesi için 100 μL süpernatant içerir ve diğer tüp -80 ° C'de uzun süreli depolama için geri kalanını (~ 300 μL) içerir. Numunelere uygun miktarda 4x SDS numune tamponu (β2-merkaptoetanol ile desteklenmiş) ekleyin ve 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin.
- Elektroforez için bir akrilamid jel (SDS-PAGE) üzerinde kuyucuk başına 10-20 μg protein çalıştırın ve daha sonra batı leke analizi için proteinleri poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
- PVDF membranını, RT'de 1 saat boyunca% 0.1 Ara-20 (TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 (w / v) yağsız sütte bloke edin.
- Membranı TBS-T ile iki kez kısaca yıkayın ve gece boyunca 4 ° C'de TBS-T'de seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
- Birincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Membranı, RT'de 1 saat boyunca TBS-T'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
- İkincil antikoru RT'de TBS-T'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Membranı gelişmiş kemilüminesans reaktifinde inkübe edin ve jel dokümantasyon aparatını kullanarak sinyali tespit edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare PFC'sindeki yüzey α5-GABA A R seviyelerini değerlendirmek için BS3 çapraz bağlama testinin fizibilitesini göstermek için, SDS-PAGE'de BS3-çapraz bağlı ve çapraz bağlı olmayan protein örneklerinin her biri 10 μg çalıştırdık ve proteinleri bir anti-α5-GABAAR antikoru (tavşan poliklonal) kullanarak batı lekesi ileanaliz ettik (Şekil 7). Çapraz bağlı olmayan protein örnekleri, ~ 55 kDa'da toplam α5-GABA A R miktarını verirken, BS3-çapraz bağlı protein örnekleri, α5-GABA A R 'ye kovalent olarak çapraz bağlı protein komplekslerini temsil eden dahayüksek moleküler ağırlıklı protein türleri ile birlikte belirli miktarda endomembran ile ilişkili α5-GABAAR (~55 kDa'da göç eden) verdi. Yüzey α5-GABAAR seviyelerinin nicelleştirilmesi için, alt birim daha sonra daha yüksek moleküler ağırlık konumlarına geçtiğinden, çapraz bağlama sırasında toplam havuzdan ~ 55 kDa'da α5-GABAAR'nin tükenme derecesini değerlendirebiliriz. Pratik olarak, α5-GABA A R'nin yüzeyseviyeleri, endomembranla ilişkili α5-GABA A R (çapraz bağlı numune şeridinde ~55 kDa'da) miktarının toplam α5-GABAAR seviyelerinden (çapraz bağlı olmayan numune şeridinde ~55 kDa'da) çıkarılmasıyla hesaplanabilir.
Daha sonra UCMS'nin (3 hafta ve 5 haftada) yüzey üzerindeki etkilerini ve fare PFC'sindeki toplam α5-GABAAR seviyelerini değerlendirdik. Bu deneyde, çapraz bağlama reaksiyonunun zaman seyrini takip etmek için, numuneleri BS3 ilavesinden sonra 1 saat, 2 saat ve 3 saatte hazırladık. BS3 çapraz bağlama reaksiyonları 2 saat kadar bir platoya ulaştığı için, grafiği çizmek için 1 saatlik zaman noktasındaki veriler kullanıldı. PFC'deki yüzey α5-GABAAR düzeylerinde, stressiz kontrol farelerine kıyasla, 3 hafta ve 5 haftalık UCMS'de anlamlı ve ilerleyici bir azalma gözlemledik (Şekil 8). Veriler, bu deneysel koşullar altında toplam reseptör seviyelerinde ihmal edilebilir veya belirgin bir değişiklik göstermedi, bu da kronik stresin özellikle hücre yüzeyine α5-GABAAR kaçakçılığını etkilediğini düşündürdü.
Şekil 1: BS3 çapraz bağlama testinde kullanılan diseksiyon aletleri. Filtre kağıdı buz gibi soğuk PBS ile nemlendirilir ve mavi buzun düz yüzeyine yerleştirilir. PBS ile doldurulmuş ve tahlilden 1 gün önce -20 ° C'de saklanan bir Petri kabı buz üzerine yerleştirilir. Beyin matrisi ve tıraş bıçağı buz üzerinde önceden soğutulur. Makas (bir büyük, bir küçük), forseps (bir büyük, birkaç küçük) ve bir doku zımbası, tahlilden önce temizlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tüm fare beyni kafatasından disseke edildi ve buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirildi. Tüm beyin kafatasından çıkarıldıktan hemen sonra, buz üzerindeki bir Petri kabında 10-15 saniye boyunca buz gibi PBS'ye batırıldı. Bu, beyin metabolizmasını yavaşlatır ve protein kaçakçılığını ve bozulmasını en aza indirirken, aynı zamanda dokunun zorlaşmasına yardımcı olur, bu da sonraki beyin dilimlemesini kolaylaştırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyin matrisine yerleştirilmiş bir fare beyni. Buz gibi soğuk PBS'ye batırılmış soğutulmuş fare beyni, beyin matrisine aktarıldı ve ventral taraf yukarı bakacak şekilde yerleştirildi. Jilet bıçakları ve matris buz üzerinde önceden soğutuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Beyin matrisinde bir fare beyninin koronal kesitlenmesi. İlk önceden soğutulmuş tıraş bıçağı, beynin koronal olarak bölümlenmesine başlamak için koku alma ampulü ile koku alma pedinkülü arasındaki sınırdan yerleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bir fare beyninin seri koronal bölümleri. Fare beyninin ön kısmı, beyin matrisine seri olarak beş jilet yerleştirilerek koronal olarak kesildi (1 mm aralıklarla). Yerleştirilen tüm bıçaklar bir arada tutuldu, matristen kaldırıldı, forseps kullanılarak birbirlerinden ayrıldı ve beyin dilimi yukarı bakacak şekilde soğutulmuş düz yüzeye yerleştirildi. (Sol üstte) Koku alma ampulü; (ortada solda) ilk bölüm; PFC dokularının örneklenmesi için ikinci (sol alt) ve üçüncü (sağ üst) bölümler kullanıldı; (sağ altta) dördüncü bölüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hipokampusun diseksiyonu için beynin arka kısmı. Beynin ön kısmı jiletle koronal olarak kesildikten sonra (solda), beynin arka kısmı (ortada) beyin matrisinden çıkarıldı ve soğutulmuş yüzeydeki PBS ile nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirildi (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: GABAAR'nin hücre yüzeyinde BS3 çapraz bağlanması. BS3 varlığında, plazma zarı yüzeyindeki α5-GABA A R, pentamerik GABAAR tertibatı içindeki diğer GABAAR alt birimleri veya ek komşu proteinler (X) gibi kendisine yakın anonim proteinlerle çapraz bağlanır (XL), ancak ondanuzaktaki proteinlerle (Y) değil. Böylece, α5-GABAAR, leke üzerinde yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) bir protein türü olarak görünür. Endozom üzerindeki α5-GABAAR bozulmadan kalır ve ~ 55 kDa'lık beklenen boyutta göç eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: UCMS'den etkilenen yüzey α5-GABAAR seviyeleri. Stressiz ve UCMS (3 hafta ve 5 hafta) koşulları altında farelerin PFC'sinde hem toplam hem de yüzey α5-GABAAR seviyeleri değerlendirildi. Çapraz bağlama reaksiyonunun zaman seyrini takip etmek için, numuneler BS3 ilavesinden sonra 1 saat, 2 saat ve 3 saatte hazırlandı. Dişi fareler (2-3 ay, N=4/grup) kullanıldı. Her koşul için 55 kDa'daki bozulmamış α5-GABA A R seviyeleri ilk önce karşılık gelen αTubulin seviyeleri tarafından normalleştirildi ve daha sonra toplam ve endomembranla ilişkili α5-GABAAR seviyelerini hesaplamak için kullanıldı (sırasıyla çapraz bağlı olmayan [Xlink Yok] ve çapraz bağlı [Xlink] örneklerinden). Daha sonra, yüzey reseptör seviyeleri, endomembran ile ilişkili miktarın toplam seviyelerden çıkarılmasıyla hesaplandı. BS3 çapraz bağlama reaksiyonları 2 saat kadar bir platoya ulaştığı için, grafiği çizmek için 1 saatlik zaman noktasındaki veriler kullanıldı (ortalama ± SEM). Kronik stresin yüzey α5-GABA A R düzeyleri üzerindeanlamlı etkileri gözlendi ve bu etki KMBS süresine bağlıydı, çünkü KMYS dönemi boyunca yüzey α5-GABAAR düzeylerinde ilerleyici bir azalma tespit edildi. *p < 0.05, **p < 0.01 (Dunn'ın çoklu karşılaştırmaları ile Kruskal-Wallis testi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Çalışma conc. | Stok çözümü | Dağıtılacak stok çözeltisi miktarı |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM Glikoz | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Deiyonize su | 37.563 mL | |
| Toplam | 40 mL | |
| * CaCl2 stoğu deney günü taze olarak hazırlanmalıdır. | ||
Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısının bileşimi.
| Çalışma conc. | Stok çözümü | Dağıtılacak stok çözeltisi miktarı |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10x) | 2 mL |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| %0.1 NP-40 | %10 (100x) | 200 μL |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | 100x | 200 μL |
| Deiyonize su | 17 mL | |
| Toplam | 20 mL |
Tablo 2: Lizis tamponunun bileşimi
Video 1: PFC'yi bir doku zımbası kullanarak izole etmek. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Forseps kullanarak PFC'yi kıyma. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: HPC'yi kavisli bir prob ve forseps kullanarak disseke etmek. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 4: Bir doku örneğini ters çevirme karıştırma. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronik psikososyal stresin davranışlar (yani, duygusallık ve bilişsel eksiklikler) ve moleküler değişiklikler (yani, GABAerjik genlerin ekspresyonunun azalması ve GABAerjik nörotransmisyonda eşlik eden eksiklikler) üzerindeki etkisi iyi belgelenmiş olmasına rağmen,10, bu tür eksikliklerin altında yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir. Özellikle, kronik stresin ER fonksiyonları üzerindeki aşırı yüklenme yoluyla nöronal proteomu önemli ölçüde etkilediğini ve dolayısıyla yüksek ER stresi15 olduğunu gösteren son çalışma göz önüne alındığında, kronik stresin ER membranı yoluyla GABAAR kaçakçılığını etkileyip etkilemediği ve GABAAR'nin değişen kaçakçılığı veya yüzey seviyelerinin psikopatoloji ile nedensel olarak nasıl bağlantılı olabileceği konusunda bir soru devam etmektedir.
Bu protokolde gösterilen BS3 çapraz bağlama testi, bu soruların bazılarını cevaplamak için güçlü bir yaklaşım olarak hizmet edecektir. Örneğin, UCMS'nin, UCMS10'un süresine bağlı olarak bilişsel eksiklikler, anksiyete benzeri davranışlar ve anhedonik fenotipler dahil olmak üzere bir dizi davranış değişikliğini ortaya çıkardığı bilinmektedir. Bu nedenle, UCMS'nin başlangıcından itibaren fare beyinlerini ardışık zaman noktalarında (örneğin, 1 hafta, 3 hafta, 5 hafta) örnekleyerek yüzey α5-GABAAR seviyelerindeki zaman seyrini ve UCMS kaynaklı değişikliklerin derecesini incelemek mümkün olacaktır ve ayrıca her zaman noktasında gözlemlenen davranışsal fenotiplerle çapraz karşılaştırma yapmak mümkün olacaktır. Ek GABAAR alt tipleri (örneğin, α1, α2) ve kronik stresten etkilendiği bilinen nöromodülatörlerin reseptörü (örneğin, beyin kaynaklı nörotrofik faktör [BDNF] için TrkB reseptörü)10 aynı örnekler kullanılarak aynı anda test edilebilir. Bu reseptör sistemlerinden ve alt tiplerinden bazıları seçici olarak belirli davranışsal alanlarda (örneğin, sedasyon, anksiyete, bilişsellik)11 ilişkilendirildiğinden, davranış değişikliklerini her zaman noktasında UCMS'den etkilenen reseptörlerin tipi ve derecesi ile ilişkilendirmeye değer.
Aşağıda, protokoldeki birkaç adım için göz önünde bulundurulması gereken kritik noktalar verilmiştir. İlk adım, deneysel tasarım ve güç analizine dayanarak kullanılacak gerekli ve yeterli sayıda hayvanın belirlenmesidir. Örneğin, kronik stresin yüzey GABAA reseptör seviyeleri üzerindeki etkisini incelemek için, rutin olarak bir grup fareyi (N = 6 / cinsiyet) 5 hafta boyunca UCMS'ye maruz kalmaya ve başka bir grubu (N = 6 / cinsiyet) stressiz koşullar altında tutulmaya hazırlıyoruz. Bu grup büyüklüğünün (her iki cinsiyet de dahil olmak üzere toplamda N = 24), reseptör seviyelerinde ~% 20'lik bir farkı tespit etmek için yeterli istatistiksel güç vermesi ve böylece hem stres etkilerinin hem de cinsiyet etkilerinin değerlendirilmesine izin vermesi beklenmektedir. Özellikle, kronik stresin davranışsal ve moleküler sonuçlarda cinsiyete bağlı farklılıklara neden olduğu bildirilmektedir10. Örneğin, kadınlar genellikle erkeklerden daha depresif belirtiler geliştirmeye daha yatkındır. Sürekli olarak, insan postmortem ve kemirgen beyinlerini kullanan çalışmalarımız, kadın deneklerde daha yüksek düzeyde davranışsal ve moleküler patolojilere işaret etmektedir; depresyon için moleküler bir belirteç olan somatostatinin (SST) aşağı regüle edilmiş seviyeleri, depresif hastalar arasında kadınlarda daha sağlamdır16 ve artan duygusallık, depresif patolojinin yönlerini çoğaltan dişi fare modellerinde erkeklerden daha sağlamdır15,17. Bu nedenle, kronik stresin psikopatolojik sonuçlar üzerindeki etkilerini ele alan herhangi bir deneysel tasarımın, verilerin analizinde istatistiksel gücü sağlamak ve olası cinsiyete bağlı etkileri tanımlamak için yeterli sayıda hem erkek hem de kadın içermesi önerilir.
BS3 ile optimal inkübasyon süresi, incelenecek her reseptör için pilot deneylerde belirlenmelidir. Reseptör kaçakçılığının, numune inkübasyonu sırasında düşük sıcaklıklarda bile yavaş yavaş gerçekleşebileceği bildirilmektedir9. Beyin diseksiyonu sırasında doğru yüzey reseptör seviyelerini yakalamak için, inkübasyon süresini en aza indirmek ve çapraz bağlama reaksiyonu platoya ulaşmadan hemen önce zaman noktasını seçmek ideal olacaktır (4 ° C'de 30 dakika ila 2 saat).
BS3 çapraz bağlama testleriyle ilişkili çeşitli operasyonel sınırlamalar fark ettik. (1) İlk olarak, fizyolojik pH aralığında spontan hidrolizin neden olduğu BS3'ün nispeten kısa yarı ömrü (2-3 saat) nedeniyle, hayvan diseksiyonunu ve çapraz bağlanma reaksiyonunu bu zaman dilimi içinde tamamlamak gerekir. Bu, bir seferde parçalara ayırabileceğimiz hayvan sayısını maksimum 12 ile sınırlamamıza neden oldu. Deneyci 12'den fazla hayvanı parçalara ayırmayı planlıyorsa, deney kohortunu her biri 12'den az hayvan içeren birkaç gruba ayırmanız önerilir. Bir grup için tahlil tamamlandıktan sonra, bir sonraki grup için sonraki çapraz bağlama tahlillerinde kullanılmak üzere yeni bir BS3 partisi taze olarak hazırlanmalıdır. Aynı şekilde, bir hayvandan disseke edilecek ilgi bölgelerinin sayısı sınırlandırılmalıdır. Çapraz bağlama testi için rutin olarak iki beyin bölgesinden (PFC, HPC) örnekleme yapıyoruz ve bu, örnekler arasında minimum değişkenlikle tutarlı sonuçlar elde etmek için inceleyebileceğimiz maksimum beyin bölgesi sayısıdır. (2) İkinci olarak, batı lekesinde kullanılan antikorların özgüllüğü dikkatle değerlendirilmelidir. BS3 kimyasal çapraz bağlanma reaksiyonu, her bir antikor tarafından tespit edilen proteinlerin antijenitesi üzerinde beklenmedik bir etkiye sahip olabilir. Bir α5-GABA buldukAR antikoru ( Malzeme Tablosu), α5-GABA'nın varlığına veya yokluğuna bakılmaksızın, özellikle BS3-çapraz bağlı numunelerde güçlü bir ~ 50 kDa bandını yanlışlıkla tespit ettiANumunedeki R proteini; Bu ~ 50 kDa bandı, α5-GABA'dan alınan doku örneklerinde bile görüldüAR nakavt fareleri, bu antikorun BS3 çapraz bağlama reaksiyonu tarafından yanlışlıkla üretilen alakasız antijenlerle çapraz reaksiyona girmeye başladığını düşündürmektedir. Antikor özgüllüğünün, BS3 çapraz bağlama reaksiyonları ile ve BS3 çapraz bağlama reaksiyonları olmadan, ideal olarak, eğer varsa, belirli bir protein için nakavt doku örnekleri kullanılarak iyice belirlenmesi önerilir. (3) Burada açıklanan mevcut protokol, her GABA'nın içinde bulunduğu hücre tiplerini ele almamaktadır.AR alt tipi ifade edilir (örneğin, nöronlar ve astrositler). Bazı GABA içinAAğırlıklı olarak nöronlarda eksprese edilen R alt tipleri (örneğin, α1, α5)18Toplu beyin dokuları kullanılarak elde edilen çapraz bağlama tahlil verileri, bu protokolde açıklandığı gibi, nöronal yüzey seviyelerini yansıtan bilgiler sağlamalıdır. Ancak, diğer GABA içinAHem nöronlarda hem de astrositlerde yüksek oranda eksprese edilen R alt tipleri (örneğin, α2)18, nöronlardaki reseptör yüzey seviyelerini astrositlere karşı ayrı ayrı incelemek ilgi çekicidir. Bu amaçla, geleneksel hücre sıralama (örneğin, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama [FACS]19) BS3 çapraz bağlama protokolüne entegre edilebilir; Hücre sıralama için hücre ayrışma adımı BS3 söndürme adımından sonra yapılabilir, ancak FACS için tüm prosedürlerin ve koşulların (örneğin, kullanılacak tamponlar, sıcaklık, inkübasyon süresi) çapraz bağlama tahlilindekilerle uyumlu olduğunu doğrulamak gerekir. Ek olarak, FACS yaklaşımı sadece GABA için kullanılabilirAR alt tiplerinin perisomatik hücresel bölmeye lokalize olduğu bilinmektedir (örneğin, α2), ancak distal dendritlerde zenginleştirilmiş alt tipler için lokalize değildir (örneğin, α5)18Çünkü periferik veya distal hücre bölmeleri, hücre sıralama için gerekli olan kapsamlı hücre ayrışması adımı sırasında muhtemelen kaybolur. (4) Son olarak, yüksek moleküler ağırlıklı protein türlerinin dansitometrisine dayanarak yüzey seviyelerini doğrudan değerlendirmek yerine, endomembranla ilişkili reseptörlerin miktarını toplam reseptör miktarından çıkararak yüzey reseptör seviyelerini hesapladığımızda sonuçların daha tutarlı olduğunu bulduk. Bunun nedeni, bu yüksek moleküler ağırlıklı protein türlerinin PVDF membranına transfer verimliliğinin, daha küçük boyuttaki orijinal, bozulmamış proteininkinden daha değişken olmasıdır (örneğin, α5-GABA için ~ 55 kDa).ABu nedenle, sonuçlar bölümünde açıklanan yöntemin ve açıklamanın izlenmesi önerilir. Şekil 8 Yüzey reseptör seviyelerini hesaplamak için.
Kronik stresin GABAAR üzerindeki etkilerinin yanı sıra, BS3 çapraz bağlama testi, bir dizi nörolojik veya nöropsikiyatrik durumu araştırmak için deneysel manipülasyonlarla genetiği değiştirilmiş farelere veya kemirgen modellerine de uygulanabilir. Bu tahlil, sıçan beyinlerinin çekirdek akümülatörlerindeki glutamat reseptörlerinin yüzey ekspresyonu üzerindeki kokain kaynaklı etkileri yakalamak için başarıyla kullanılmıştır20,21. Tahlil ayrıca, heterozigot BDNF nakavt fareleri22'nin PFC'sinde α5-GABAAR'nin azaltılmış yüzey ekspresyonunu göstermek için de kullanılmıştır. Önceki bir başka çalışmada, sıçanlarda hepatik ensefalopati modelinde, eşlik eden mekansal öğrenme eksiklikleri, bu çapraz bağlama testine dayanan glutamat ve GABAA reseptörlerinin değişmiş yüzey ekspresyonuna nedensel olarak bağlanmıştır23. Özetle, BS3 kimyasal çapraz bağlama testi, beyindeki bir dizi reseptör sisteminde ve hemen hemen tüm diğer periferik dokularda veya organlarda beyin bölgesine özgü ve bağlama bağlı değişiklikleri yakalamak için çok yönlü bir araç sağlar. Bu tahlil, sonuçları çapraz karşılaştırmak ve doğrulamak için tonik inhibisyonun elektrofizyolojik kaydı (özellikle α5-GABAA RDURUMUNDA), kriyojenik elektron mikroskobu ve yüzey biyotinilasyonu gibi yüzey reseptör seviyelerini değerlendirmek için diğer yöntemlerle paralel olarak da yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.
Acknowledgments
Yazarlar, çalışma süresi boyunca hayvanlara baktıkları için CAMH hayvan tesisi personeline teşekkür eder. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), CAMH'den Keşif Fonu (T.P.'ye), Ulusal Şizofreni ve Depresyon Araştırma İttifakı (NARSAD ödülü #25637 E.S.'ye) ve Campbell Aile Ruh Sağlığı Araştırma Enstitüsü (E.S.'ye) tarafından desteklenmiştir. E.S., kliniğe yeni GABAerjik bileşikler getirmeye adanmış bir biyofarma olan Damona Pharmaceuticals'ın kurucusudur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
