BS3 化学交联测定:评估慢性应激对啮齿动物大脑中细胞表面 GABAA 受体呈递的影响

Summary

BS3化学交联测定显示，在慢性社会心理应激条件下，小鼠大脑中细胞表面GABA_A 受体表达减少。

Abstract

焦虑是一种情绪状态，对动物的行为（包括认知功能）产生不同影响。在整个动物王国中观察到焦虑的行为迹象，并且可以被认为是对各种压力模式的适应性或适应不良反应。啮齿动物为转化研究提供了一个经过验证的实验模型，解决了分子、细胞和回路水平上焦虑的综合机制。特别是，慢性心理社会压力范式引发适应不良反应，模仿人类和啮齿动物之间的类似焦虑/抑郁样行为表型。虽然以前的研究表明慢性压力对大脑中神经递质内容物的显着影响，但压力对神经递质受体水平的影响尚未得到充分研究。在本文中，我们提出了一种实验方法来定量慢性应激下小鼠神经递质受体的神经元表面水平，特别是关注与情绪和认知调节有关的γ-氨基丁酸（GABA）受体。使用膜不可渗透的不可逆化学交联剂，双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），我们发现慢性压力显着下调前额叶皮层中GABA_A 受体的表面可用性。GABA_A 受体的神经元表面水平是GABA神经传递的限速过程，因此可以用作分子标志物或实验动物模型中焦虑/抑郁样表型程度的代表。这种交联方法适用于在任何大脑区域表达的神经递质或神经调节剂的各种受体系统，并有望有助于更深入地了解情绪和认知背后的机制。

Introduction

神经递质受体位于神经元质膜表面或细胞内内膜（例如，内体、内质网 [ER] 或反式高尔基体装置）上，并根据神经元的内在生理状态或对外在神经网络活动的响应在这两个隔室之间动态穿梭^1，2.由于新分泌的神经递质主要通过表面定位的受体池引发其生理功能，因此给定神经递质的表面受体水平是其在^{神经回路中}信号传导能力的关键决定因素之一3。

有几种方法可用于监测培养神经元中的表面受体水平，包括表面生物素化测定⁴，在非透^{化条件下使用}特异性抗体进行免疫荧光测定5，或使用与pH敏感荧光光学指示剂（例如pHluorin^）遗传融合的受体转基因6。相比之下，在评估 体内表面受体水平时，这些方法要么有限，要么不切实际。例如，表面生物素化程序可能不适用于处理大量和样品数量的 体内 脑组织，因为它的价格相对较高，并且需要后续步骤纯化亲和素偶联珠上的生物素化蛋白。对于嵌入三维大脑结构的神经元，低抗体可及性或基于显微镜的定量困难可能对评估 体内表面受体水平构成重大限制。为了可视化完整大脑中神经递质受体的分布，可以使用非侵入性方法（例如正电子发射断层扫描）来测....

Protocol

该协议中的所有动物工作均根据安大略省动物研究法（RSO 1990，第A.22章）和加拿大动物护理委员会（CCAC）完成，并得到机构动物护理委员会的批准。

1. 动物的制备

1. 确定实验中使用的动物数量，并将它们分成适当的组或实验队列。有关群体规模、性别和统计功效的讨论，请参阅讨论部分。
   注意:该协议是为小鼠（C57BL6 / J菌株;2-4个月大;通常为20-30克体重;等量使用的雄性和雌性）定制的。
2. 按照前面描述的方案将动物置于UCMS或控制非应激条件下5-8周¹⁴。
3. 在最后一次UCMS程序后，让动物在家笼中停留1天，然后再将它们用于交联测定，以避免对受体表达的急性应激影响。

2. 储备溶液的制备

1. 在测定前按照说明制备和储存以下溶液。
   1. 通过将 14.6 g NaCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 5 M NaCl。在室温 （RT） 下储存。
   2. 通过将 3.22 g KCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 1.08 M KCl。存放在RT。
   3. 通过将 3.25 g MgCl 2·6H 2 O 溶解在 40 mL 去离子水中来制....

Results

为了证明BS3交联测定法评估小鼠PFC中表面α5-GABA_AR水平的可行性，我们在SDS-PAGE上运行BS3交联和非交联蛋白质样品各10μg，并使用抗α5-GABA_AR抗体（兔多克隆）通过蛋白质印迹分析蛋白质（图7）。非交联蛋白质样品在~55 kDa处给出α5-GABA_aR的总量，而BS3交联蛋白质样品给出一定量的内膜相关α5-GABA_AR（在~55 kDa迁移）以及代表与α5-GABA_AR共价交联的蛋白质复合物的高分子量蛋白质物种。为了定量表面α5-GABA A R水平，我们可以评估交联时总池中α5-GABA_AR在~55 kDa处的消耗程度，因为亚基随后转移到更高的分子量位置。实际上，α5-GABA A_R的表面水平可以通过从总 α5-GABA A R 水平（在非交联样品泳道中的 ~55 kDa）中减去内膜相关的 α5-GABA_{A R}（在交联样品泳道中的 ~55 kDa）的量来计算.......

Discussion

尽管慢性社会心理压力对行为（即情绪和认知缺陷）和分子变化（即GABA能基因表达减少和伴随GABA能神经传递缺陷）的影响已有充分记录¹⁰，但这种缺陷的机制需要进一步研究。特别是，鉴于最近的研究表明，慢性压力通过ER功能的过载显着影响神经元蛋白质组，从而增加ER压力¹⁵，慢性压力是否影响通过ER膜的GABA_AR运输以及GABA_AR的改变或表面水平如何与精神病理学有因果关系仍然存在一个问题。

本协议中显示的BS3交联测定将作为回答其中一些问题的强大方法。例如，已知UCMS会引起一系列行为变化，包括认知缺陷，焦虑样行为和快感缺乏表型，具体取决于UCMS¹⁰的持续时间。因此，可以通过从UCMS开始的连续时间点（例如，1周，3周，5周）对小鼠大脑进行采样来研究UCMS诱导的表面α5-GABA_AR水平变化的时间过程和程度，并且还可以与在每个时间点观察到的行为表型进行交叉比较。可以使用相同的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M（45%，w/v）葡萄糖	Sigma	G8769
2-巯基乙醇	Sigma	M3148
4x SDS 样品缓冲液 （Laemmli）	Bio-Rad	1610747
二（磺基琥珀酰亚胺）辛酸酯 （BS3）	Pierce	A39266	No-Weigh 规格;10 x 2 mg
脑基质	Ted Pella	15003	用于小鼠，30 g 成年，冠状动脉，1 mm
氯化钙 （CaCl2）	Sigma	C4901
曲面探针	Fine Science Tools	10088-15	大体解剖探针;倾斜 45
去离子水	milli-Q	EQ 7000	超纯水 [电阻率 18.2 MΩ·cm @ 25 °C;总有机碳 （TOC） ≤5 ppb]
二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma	10197777001
滤纸 （3MM）	Whatman	3030-917
镊子（大）	精细科学工具	11152-10	超细镊
镊子（小）	精细科学工具	11251-10	Dumont #5 镊子
GABA-A R alpha 5 抗体	Invitrogen	PA5-31163	多克隆兔 IgG;在化学交联
GABA-A R α 5 C 端抗体	R& 上检测错误信号D Systems	PPS027	多克隆兔 IgG;与小鼠和大鼠
甘氨酸	Sigma	W328707
辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔 IgG （H+L）	Bio-Rad	1721019
氯化镁 （MgCl2·6H2O）	Sigma	M2670
Nonidet-P40，替代品 （NP-40）	SantaCruz	68412-54-4
氯化钾 （KCl）	Sigma	P9541
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340
PVDF 膜	Bio-Rad	1620177
（大）	精细科学工具	14007-14	手术剪刀 - 锯齿
状剪刀（小）	精细科学工具	14060-09	精细剪刀 - 锋利
的氯化钠 （NaCl）	Sigma	S9888
超声波仪 （Qsonica Sonicator Q55）	Qsonica	15338284
台式再离心机	Eppendorf	5425R
组织穿刺器（内径 1 mm）	Ted Pella	15110-10	Miltex 活检穿刺器，带柱塞，内径 1.0 mm，外径 1.27
mmTrans-Blot Turbo 5x 转移缓冲液	Bio-Rad	10026938
管旋转器 （LabRoller）	Labnet	H5000