Summary
BS3化学交联测定显示，在慢性社会心理应激条件下，小鼠大脑中细胞表面GABAA 受体表达减少。
Abstract
焦虑是一种情绪状态，对动物的行为（包括认知功能）产生不同影响。在整个动物王国中观察到焦虑的行为迹象，并且可以被认为是对各种压力模式的适应性或适应不良反应。啮齿动物为转化研究提供了一个经过验证的实验模型，解决了分子、细胞和回路水平上焦虑的综合机制。特别是，慢性心理社会压力范式引发适应不良反应，模仿人类和啮齿动物之间的类似焦虑/抑郁样行为表型。虽然以前的研究表明慢性压力对大脑中神经递质内容物的显着影响，但压力对神经递质受体水平的影响尚未得到充分研究。在本文中，我们提出了一种实验方法来定量慢性应激下小鼠神经递质受体的神经元表面水平，特别是关注与情绪和认知调节有关的γ-氨基丁酸（GABA）受体。使用膜不可渗透的不可逆化学交联剂，双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），我们发现慢性压力显着下调前额叶皮层中GABAA 受体的表面可用性。GABAA 受体的神经元表面水平是GABA神经传递的限速过程，因此可以用作分子标志物或实验动物模型中焦虑/抑郁样表型程度的代表。这种交联方法适用于在任何大脑区域表达的神经递质或神经调节剂的各种受体系统，并有望有助于更深入地了解情绪和认知背后的机制。
Introduction
神经递质受体位于神经元质膜表面或细胞内内膜（例如，内体、内质网 [ER] 或反式高尔基体装置）上，并根据神经元的内在生理状态或对外在神经网络活动的响应在这两个隔室之间动态穿梭1，2.由于新分泌的神经递质主要通过表面定位的受体池引发其生理功能，因此给定神经递质的表面受体水平是其在神经回路中信号传导能力的关键决定因素之一3。
有几种方法可用于监测培养神经元中的表面受体水平，包括表面生物素化测定4，在非透化条件下使用特异性抗体进行免疫荧光测定5，或使用与pH敏感荧光光学指示剂（例如pHluorin）遗传融合的受体转基因6。相比之下，在评估 体内表面受体水平时，这些方法要么有限，要么不切实际。例如，表面生物素化程序可能不适用于处理大量和样品数量的 体内 脑组织，因为它的价格相对较高，并且需要后续步骤纯化亲和素偶联珠上的生物素化蛋白。对于嵌入三维大脑结构的神经元，低抗体可及性或基于显微镜的定量困难可能对评估 体内表面受体水平构成重大限制。为了可视化完整大脑中神经递质受体的分布，可以使用非侵入性方法（例如正电子发射断层扫描）来测量受体占用并估计表面受体水平7。然而，这种方法严重依赖于特定无线电配体的可用性、昂贵的设备和特殊的专业知识，这使得大多数研究人员难以获得常规使用。
在这里，我们描述了一种简单，通用的方法，用于使用水溶性，膜不可渗透的化学交联剂双（磺基琥珀酰亚胺基）亚伯酸双（磺基琥珀酰亚胺基）俯二酸酯（BS3）离体测量实验动物大脑中的表面受体水平8，9。BS3靶向赖氨酸残基侧链中的伯胺，并且可以在彼此附近共价交联蛋白质。当从感兴趣的区域新鲜制备脑切片并在含有BS3的缓冲液中孵育时，细胞表面受体与邻近蛋白质交联，从而转化为更高分子量的物种，而细胞内膜相关受体保持未修饰。因此，表面和细胞内受体池可以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并使用对待研究受体特异性的抗体通过蛋白质印迹进行定量。
不可预测的慢性轻度应激（UCMS）是诱导啮齿动物慢性社会心理应激的成熟实验范式10。UCMS通过调节一系列神经递质系统（包括GABA及其受体10，11）来引发焦虑/抑郁样行为表型和认知缺陷。特别是，含有α5亚基的GABA A受体（α5-GABAAR）与记忆和认知功能的调节有关12，13，这表明该亚基的功能改变可能参与UCMS诱导的认知缺陷。在该协议中，我们使用BS3交联测定来定量暴露于UCMS的小鼠前额叶皮层中表面表达的α5-GABAAR的水平与非应激对照小鼠相比。
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Protocol
该协议中的所有动物工作均根据安大略省动物研究法（RSO 1990，第A.22章）和加拿大动物护理委员会（CCAC）完成，并得到机构动物护理委员会的批准。
1. 动物的制备
- 确定实验中使用的动物数量，并将它们分成适当的组或实验队列。有关群体规模、性别和统计功效的讨论，请参阅讨论部分。
注意：该协议是为小鼠（C57BL6 / J菌株;2-4个月大;通常为20-30克体重;等量使用的雄性和雌性）定制的。 - 按照前面描述的方案将动物置于UCMS或控制非应激条件下5-8周14。
- 在最后一次UCMS程序后，让动物在家笼中停留1天，然后再将它们用于交联测定，以避免对受体表达的急性应激影响。
2. 储备溶液的制备
- 在测定前按照说明制备和储存以下溶液。
- 通过将 14.6 g NaCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 5 M NaCl。在室温 （RT） 下储存。
- 通过将 3.22 g KCl 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 1.08 M KCl。存放在RT。
- 通过将 3.25 g MgCl 2·6H 2 O 溶解在 40 mL 去离子水中来制备 400 mM MgCl2。存放在RT。
- 通过将3g甘氨酸溶解在40mL去离子水中来制备1M甘氨酸，并储存在4°C。
- 通过将 1.54 g DTT 溶解在 10 mL 去离子水中来制备 1 M 二硫苏糖醇 （DTT）。通过孔径为 0.2 μm 的过滤器对其进行过滤灭菌，并分装到 2 mL 管中。储存在-20°C。
- 通过在去离子水中以 1：10 （v/v） 的比例稀释来制备 10% Nonidet-P40 （NP-40）。存放在RT。
- 制备0.5 M EDTA（pH = 8.0），并储存在室温下。
- 准备1M HEPES缓冲液（pH = 7.2-7.5），并储存在4°C。
- 准备2.5M或45%（w / v）葡萄糖，并储存在4°C。
3. 工作站的准备
- 在BS3交联测定当天，在动物解剖室（图1）中收集以下材料，在冰上预冷的几个物品：冰桶，金属温度块（在冰上预冷），50mL锥形管中的冰冷PBS和培养皿中的冷冻PBS，用PBS润湿滤纸并放置在冷却的平坦表面或蓝冰上， 在冰上预冷的脑基质（1 mm间隔用于剃须刀片插入），在冰上预冷的剃须刀片（~10），解剖工具（剪刀，镊子，弯曲探针），纸巾打孔器，70%乙醇喷雾擦拭纸和纸巾，移液器吸头（200μL），移液器（P200），秒表，记事本，笔和微量离心管（1.5 mL）。
- 在测定之前，用样品信息（例如，动物ID号，治疗类型[UCMS与无应激（NS）]，大脑区域，有或没有BS3等）标记微量离心管。
注意：对于BS3交联测定，必须从每个脑区域收集两个样品;一个样品将用于交联（使用BS3），另一个样品将用于非交联反应（无BS3）作为对照。因此，为了从12只小鼠的两个大脑区域（即前额叶皮层[PFC]和海马[HPC]）中采样，标记48个试管进行初始采样（= 2个样本×2个区域×12只小鼠）（用于第6节）。标记另外两组 48 个试管以供以后存储（用于存储每个样品的两个不同体积 [100 μL， 300 μL]）（用于第 7 节）。因此，需要为该队列大小总共标记 144 个管。
- 在测定之前，用样品信息（例如，动物ID号，治疗类型[UCMS与无应激（NS）]，大脑区域，有或没有BS3等）标记微量离心管。
- 此外，请确保实验室中提供以下设备：台式冷冻微量离心机，超声仪，管旋转器（用于冷藏室或冰箱内[4°C]），用于储存样品的冰箱（-80°C）和用于临时储存样品的一桶干冰（用于第7节）
4. 工作溶液和缓冲液的制备
注意：在测定的早晨，准备以下溶液。该计算基于处理来自12只小鼠的两个大脑区域（即PFC和HPC）的必要解决方案。
- 制备人工脑脊液（aCSF，pH = 7.4），如 表1所述。将 750 μL aCSF 分配到每个采样管（步骤 3.1.1 中标记的 48 个管）中，并将它们放入冰上的金属温度块中以预冷缓冲液。
- 如 表2所述制备裂解缓冲液。储存在冰上（每个样品使用 400 μL）。
- 在5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）中制备52 mM BS 3储备溶液（26x）。
- 首先，制备100mM柠檬酸（储备A）和100mM柠檬酸钠（储备B）。
- 用去离子水以 1：20 的比例稀释储备液 A 和储备液 B。将 100 μL 各加入 1.9 mL 水中，分别制备 5 mM 柠檬酸（储备液 C）和 5 mM 柠檬酸钠（储备液 D）。
- 混合 410 μL 储备液 C 和 590 μL 储备液 D，制备 5 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH = 5.0）（溶液 E，1 mL）。
- 使用pH指示条确认溶液E的pH值。
- 涡旋 30 秒，将 24 mg BS3 溶解在 806.4 μL 溶液 E 中，以制备 BS3 储备溶液 （26x）。
- 准备另外 1 mL 溶液 E，用作非交联样品的载体对照。
注意：当其他一切准备就绪且实验即将开始时，准备BS3储备溶液。BS3应在4°C干燥下储存直至使用。一旦重组，BS3仅保持活性约≤3小时。据报道，5mM柠檬酸钠缓冲液（溶液E）的pH值会随着时间的推移而升高，导致BS 3水解加速，因此建议从储备溶液A和B9中新鲜制备溶液E。由于BS3在低温下的溶解度有限，因此将重组的BS3保持在室温下。 在3小时内用完重组的BS3，并且不要冷冻/解冻或重复使用重组的BS3。
5. 脑组织解剖
注意：从此步骤开始，至少两个人应以协调的方式一起工作。当一个人专注于动物解剖（步骤5.2-5.10和步骤6.3）时，另一个人应该担任计时员并帮助协调测定（步骤5.1，步骤6.1，步骤6.2，步骤6.4和步骤6.5）
- 将第一只动物从住房区带到解剖室。
注意：由于急性应激源（例如，新的环境，血液气味）可能会影响大脑蛋白质动力学，因此应将动物饲养在远离解剖区域的家中笼子中，然后单独带入解剖室立即斩首。 - 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，然后斩首。将大脑迅速从颅骨中取出，并将其浸入培养皿中的冰冷PBS中10-15秒（图2）。
注意：动物没有被麻醉用于BS3实验，因为任何麻醉剂都可能影响神经递质受体9的表面呈递水平。 - 将冷却的大脑放入冰上的大脑基质中，大脑的腹侧朝上（图3）。
- 将第一个剃须刀片插入嗅球和嗅蒂之间的边界，以切开大脑冠状（图4）。使用三到四个额外的剃须刀片，以 1 mm 的间隔连续切割大脑的前部冠状动脉。
- 将所有插入的剃须刀片放在一起，将大脑的后部留在大脑基质中，从而将冠状切片从大脑基质中移除。使用镊子将剃须刀片彼此分开，并将它们放在平坦的冷却表面上，脑切片朝上（图5）。
- 标识包含感兴趣区域的切片。要对PFC进行采样，请选择包含嗅蒂的第一个切片后面的第二和第三切片。
- 使用组织冲头（视频 1）去除感兴趣的区域，将其放在冷却的剃须刀片上，并将组织均匀地分成两部分（例如，来自左半球和右半球的组织，一半用于 BS3 交联反应，另一半用于无交联对照，如果感兴趣的目标蛋白在两个半球中表达相同）。
- 使用镊子的细尖在刀片上将每张纸巾切成碎片，对刀片进行多次垂直运动（视频 2），而不是捣碎或研磨纸巾。这将最大限度地提高BS3可及的表面积，而不会严重损害细胞的膜完整性。切碎后，立即将切碎的组织转移到适当的管中（见步骤6.3）。
- 为了对HPC进行采样，将大脑的后部从基质中取出，然后将大脑放在冷却平坦表面上的湿滤纸上，背侧朝上（图6）。
- 使用弯曲的探针和镊子，从背侧接近（视频3），从两个半球（一半用于BS3交联，另一半用于对照）解剖HPC（背半，腹侧半或两者）。按照步骤5.8将每个组织切碎，并将组织转移到适当的管中（见步骤6.3）。
注意：每只动物的整个解剖时间应保持在~5分钟，以使实验条件和结果保持一致。
6. 交联反应
- 当前一只小鼠的大脑解剖即将完成时，将下一只动物从住房区带到解剖室（步骤5.10）。
- 在切碎的组织准备转移到适当的管中之前，用 30 μL BS3 溶液 （26x） 或载体溶液 E 加标在冰上预冷的试管（从步骤 4.1 开始）。更换管之间的移液器吸头，以确保无交联对照管中没有BS3污染。
- 将切碎的组织（从步骤5.8和步骤5.10）转移到适当的管中，然后开始解剖下一只动物（步骤5.2）
- 倒置并混合试管，将组织块分解成更小的碎片（视频4），并开始在冷藏室的试管旋转器上孵育样品30分钟至2小时。记录每个试管的BS3孵育开始时间。请参阅讨论部分，了解最佳孵育时间。
- 通过用78μL的1M甘氨酸加标试管来淬灭反应，并将样品在4°C下以恒定旋转进一步孵育10分钟。记录每个管子淬火的开始和结束时间。继续通过带来下一只动物（步骤6.1）和帮助交联（步骤6.2）来帮助专注于动物解剖的人。
注意：在所有样品中以完全相同的时间处理每个样品。如果解剖室离冷库较远，强烈建议招募第三人参加冷库样品孵化和淬火。
7. 组织裂解、蛋白质制备和蛋白质印迹
- 淬灭10分钟后（步骤6.5），将样品在4°C下以20，000× g 旋转2分钟，并弃去上清液。如果有第三人可用，请继续执行步骤 7.2;否则，将样品快速冷冻在干冰上，并在此处暂停测定，直到所有动物的脑解剖（第5节）和交联（第6节）完成。
- 每管加入 400 μL 冰冷的裂解缓冲液。
- 对样品进行超声处理 1 秒五次，中间间隔 5 秒，同时将样品保持在冰上。
- 以20，000× g 旋转样品2分钟以旋转出不溶性组织碎片（沉淀），并保存上清液。
- 使用 5 μL 上清液使用二辛可宁酸 （BCA） 测定法测量蛋白质浓度。
- 将上清液的其余部分分成两个管;一个管含有 100 μL 上清液用于随后的蛋白质印迹，另一个管包含剩余的 （~300 μL），用于在 −80 °C 下长期储存。 向样品中加入适量的4x SDS样品缓冲液（补充有β2-巯基乙醇），并在70°C下孵育10分钟。
- 在用于电泳的丙烯酰胺凝胶 （SDS-PAGE） 上每孔运行 10-20 μg 蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏氟乙烯 （PVDF） 膜上进行蛋白质印迹分析。
- 将PVDF膜封闭在5%（w / v）脱脂牛奶中，溶解在含有0.1%吐温-20（TBS-T）的Tris缓冲盐水中，在室温下1小时。
- 用TBS-T短暂洗涤膜两次，并将其与在TBS-T中稀释的一抗在4°C孵育过夜。
- 在室温下的TBS-T中洗掉一抗三次，每次10分钟。
- 将膜与在TBS-T中稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。
- 在室温下的TBS-T中洗掉二抗三次，每次10分钟。
- 在增强化学发光试剂中孵育膜，并使用凝胶记录装置检测信号。
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Representative Results
为了证明BS3交联测定法评估小鼠PFC中表面α5-GABAAR水平的可行性，我们在SDS-PAGE上运行BS3交联和非交联蛋白质样品各10μg，并使用抗α5-GABAAR抗体（兔多克隆）通过蛋白质印迹分析蛋白质（图7）。非交联蛋白质样品在~55 kDa处给出α5-GABAaR的总量，而BS3交联蛋白质样品给出一定量的内膜相关α5-GABAAR（在~55 kDa迁移）以及代表与α5-GABAAR共价交联的蛋白质复合物的高分子量蛋白质物种。为了定量表面α5-GABA A R水平，我们可以评估交联时总池中α5-GABAAR在~55 kDa处的消耗程度，因为亚基随后转移到更高的分子量位置。实际上，α5-GABA AR的表面水平可以通过从总 α5-GABA A R 水平（在非交联样品泳道中的 ~55 kDa）中减去内膜相关的 α5-GABAA R（在交联样品泳道中的 ~55 kDa）的量来计算。
接下来，我们评估了UCMS（3周和5周）对小鼠PFC表面和总α5-GABAAR水平的影响。 在该实验中，为了遵循交联反应的时间过程，我们在加入BS3后1小时，2小时和3小时制备样品。由于BS3交联反应似乎在2小时达到平台期，因此使用1小时时间点的数据绘制图表。与无应激对照小鼠相比，我们观察到在UCMS的3周和5周时PFC中的表面α5-GABAAR水平显着且逐渐降低（图8）。数据显示，在这些实验条件下，总受体水平的变化可以忽略不计或没有明显的变化，这表明慢性压力特别影响α5-GABAAR运输到细胞表面。
图 1：BS3 交联测定中使用的解剖工具。 滤纸用冰冷的PBS润湿，并放置在蓝冰的平坦表面上。将充满PBS的培养皿并在测定前1天储存在-20°C放在冰上。大脑基质和剃须刀片在冰上预先冷却。剪刀（一个大，一个小），镊子（一个大，几个小）和纸巾打孔器都在测定前清洁。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从头骨中解剖出整个小鼠大脑并放置在冰冷的PBS中。 从头骨中取出整个大脑后，立即将其浸没在冰冷的PBS中10-15秒，放在冰上的培养皿中。这减慢了大脑的新陈代谢，最大限度地减少了蛋白质的运输和降解，同时也帮助组织变得更硬，这使得随后的大脑切片更容易。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：放置在大脑矩阵中的小鼠大脑。 浸没在冰冷PBS中的冰冷小鼠大脑被转移到大脑基质中，并放置腹侧朝上。剃须刀片和基质在冰上预先冷却。 请点击此处查看此图的大图。
图4：大脑基质中小鼠大脑的冠状切片。 第一个预冷的剃须刀片通过嗅球和嗅蒂之间的边界插入，开始对大脑进行冠状切片。 请点击此处查看此图的大图。
图5：小鼠大脑的连续冠状切片。 通过将五个剃须刀片连续插入大脑基质（1mm间隔）来冠状切割小鼠大脑的前部。将所有插入的刀片固定在一起，从基质上抬起，用镊子彼此分开，并放置在冷却的平面上，脑切片朝上。（左上）嗅球;（左中）第一部分;第二（左下）和第三（右上）切片用于对PFC组织进行采样;（右下）第四部分。 请点击此处查看此图的大图。
图6：用于解剖海马体的大脑后部。 在用剃刀刀片（左）将大脑的前部（左）冠状切割后，将大脑的后部（中）从大脑基质中取出，放在冰冷表面上的PBS湿滤纸上（右）。 请点击此处查看此图的大图。
图7：GABAAR在细胞表面上的BS3交联。 在BS3存在下，质膜表面的α5-GABA A R与靠近它的匿名蛋白质交联（XL），例如五聚体GABA A R组装体中的其他GABAAR亚基或其他邻近蛋白质（X），但不与远离它的蛋白质（Y）交联。因此，α5-GABAAR在印迹上显示为高分子量（HMW）蛋白种类。内体上的α5-GABAAR保持完整并以~55kDa的预期大小迁移。请点击此处查看此图的大图。
图8：受UCMS影响的表面α5-GABAAR水平。 评估无应激和UCMS（3周和5周）条件下小鼠PFC中α5-GABAAR的总和表面水平。为了遵循交联反应的时间过程，在加入BS3后1 h，2 h和3 h制备样品。使用雌性小鼠（2-3个月，N = 4 /组）。首先通过相应的α微管蛋白水平对每种条件下55 kDa的完整α5-GABA A R水平进行归一化，然后用于计算总和膜相关的α5-GABAAR水平（分别来自无交联[无Xlink]和交联[Xlink]样品）。随后，通过从总水平中减去内膜相关量来计算表面受体水平。由于BS3交联反应似乎在2 h时达到平台期，因此使用1小时时间点的数据绘制图形（SEM平均值±）。观察到慢性应激对表面α5-GABA A R水平的显着影响，并且这种影响与UCMS持续时间有关，因为在整个UCMS期间发现表面α5-GABAAR水平逐渐降低。*p < 0.05，**p < 0.01（Kruskal-Wallis 检验与邓恩的多重比较）。请点击此处查看此图的大图。
| 工作重点 | 储备液 | 要分配的储备液量 |
| 1.2 毫米氯化钙2 | 480 毫米（400 倍）* | 100 微升 |
| 20毫米HEPES | 1 米 （50x） | 800 微升 |
| 147 毫米氯化钠 | 5 米 （34x） | 1176.5 微升 |
| 2.7 毫米氯化钾 | 1.08 米 （400x） | 100 微升 |
| 1 毫米氯化镁2 | 400 毫米（400 倍） | 100 微升 |
| 10 mM 葡萄糖 | 2.5 米 （250x） | 160 微升 |
| 去离子水 | 37.563毫升 | |
| 总 | 40毫升 | |
| * CaCl2 原液应在实验当天新鲜制备。 | ||
表1：人工脑脊液的组成。
| 工作重点 | 储备液 | 要分配的储备液量 |
| 25 毫米HEPES | 1 米 （40x） | 500 微升 |
| 500毫米氯化钠 | 5 米 （10x） | 2毫升 |
| 2 毫米乙二胺四乙酸 | 0.5 米 （250x） | 80 微升 |
| 1 毫米数字转换器 | 1 米 （1000x） | 20 微升 |
| 0.1% NP-40 | 10% （100x） | 200 微升 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | 100 倍 | 200 微升 |
| 去离子水 | 17毫升 | |
| 总 | 20毫升 |
表2：裂解缓冲液的组成
视频 1：使用组织打孔器隔离 PFC。请点击此处下载此视频。
视频 2：使用镊子切碎 PFC。请点击此处下载此视频。
视频 3：使用弯曲探头和镊子剖析 HPC。请点击此处下载此视频。
视频4：反转混合组织样品。请点击此处下载此视频。
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Discussion
尽管慢性社会心理压力对行为（即情绪和认知缺陷）和分子变化（即GABA能基因表达减少和伴随GABA能神经传递缺陷）的影响已有充分记录10，但这种缺陷的机制需要进一步研究。特别是，鉴于最近的研究表明，慢性压力通过ER功能的过载显着影响神经元蛋白质组，从而增加ER压力15，慢性压力是否影响通过ER膜的GABAAR运输以及GABAAR的改变或表面水平如何与精神病理学有因果关系仍然存在一个问题。
本协议中显示的BS3交联测定将作为回答其中一些问题的强大方法。例如，已知UCMS会引起一系列行为变化，包括认知缺陷，焦虑样行为和快感缺乏表型，具体取决于UCMS10的持续时间。因此，可以通过从UCMS开始的连续时间点（例如，1周，3周，5周）对小鼠大脑进行采样来研究UCMS诱导的表面α5-GABAAR水平变化的时间过程和程度，并且还可以与在每个时间点观察到的行为表型进行交叉比较。可以使用相同的样本同时测试其他GABAAR亚型（例如，α1，α2）和已知受慢性应激影响的神经调节剂的受体（例如，脑源性神经营养因子[BDNF]的TrkB受体）10 。由于这些受体系统和亚型中的一些选择性地与特定行为领域（例如，镇静，焦虑，认知）11有关，因此值得将行为变化与每个时间点受UCMS影响的受体的类型和程度相关联。
以下是协议中几个步骤需要考虑的关键点。第一步是根据实验设计和功效分析确定必要和足够的动物数量。例如，为了研究慢性压力对表面GABAA 受体水平的影响，我们常规地准备一组小鼠（N = 6 /性别）暴露于UCMS5周，另一组（N = 6 /性别）保持在无应激条件下。该组规模（N = 24，包括两性）预计将提供足够的统计功效来检测受体水平的~20%差异，从而可以评估压力效应和性别效应。值得注意的是，据报道，慢性压力会导致行为和分子结果的性别依赖性差异10。例如，女性通常比男性更容易出现抑郁症状。一致地，我们使用人类尸检和啮齿动物大脑的研究表明，女性受试者的行为和分子病理水平更高;生长抑素（SST）水平下调，这是一种抑郁症的分子标志物，在抑郁症患者中的女性中更强大16，并且在复制抑郁病理学方面的雌性小鼠模型中，情绪增加比男性更强烈15，17。因此，建议任何解决慢性压力对精神病理学结果影响的实验设计都应包括足够数量的男性和女性，以确保分析数据的统计能力并确定可能的性别依赖性影响。
BS3的最佳孵育时间应在要研究的每个受体的试点实验中确定。据报道，即使在样品孵育期间的低温下，受体运输也可能缓慢发生9。为了在脑解剖时捕获准确的表面受体水平，理想的做法是最小化孵育时间并选择交联反应到达平台之前的时间点（在4°C下30分钟至2小时）。
我们注意到与BS3交联测定相关的几个操作限制。（1）首先，由于BS3在生理pH范围内自发水解引起的半衰期相对较短（2-3 h），需要在此时间范围内完成动物解剖和交联反应。这导致我们将一次可以解剖的动物数量限制为最多 12 只。如果实验者计划解剖超过12只动物，建议将实验队列分成几组，每组包含少于12只动物。完成一组的测定后，应新鲜制备一批新批次的BS3，以用于下一组的后续交联测定。同样，应限制从一只动物身上解剖的感兴趣区域的数量。我们通常从两个大脑区域（PFC，HPC）中采样以进行交联测定，这是我们可以解剖的最大脑区域数，以便获得一致的结果，并且样品之间的变异性最小。（2）其次，应仔细评估蛋白质印迹中使用的抗体的特异性。BS3化学交联反应可能对每种抗体检测到的蛋白质的抗原性产生意想不到的影响。我们发现一个α5-GABA一个R 抗体（在 目录） 错误地在 BS3 交联样品中检测到强烈的 ~50 kDa 条带，无论是否存在 α5-GABA一个样品中的R蛋白;即使在α5-GABA的组织样品中也观察到这种~50 kDa条带一个R敲除小鼠，表明该抗体开始与BS3交联反应意外产生的无关抗原发生交叉反应。建议在有或没有BS3交联反应的情况下彻底确定抗体特异性，理想情况下使用敲除组织样品（如果有），用于给定的目标蛋白质。（3）此处描述的当前协议未解决每个GABA的细胞类型一个表达 R 亚型（例如神经元和星形胶质细胞）。对于一些 GABA一个主要在神经元中表达的 R 亚型（例如 α1、α5）18，如本协议所述，使用大量脑组织获得的交联测定数据应提供反映神经元表面水平的信息。但是，对于其他 GABA一个在神经元和星形胶质细胞中均高表达的 R 亚型（例如 α2）18，分别研究神经元与星形胶质细胞中的受体表面水平是有意义的。为此，常规细胞分选（例如荧光激活细胞分选[FACS]19）可以集成到BS3交联方案中;用于细胞分选的细胞解离步骤可以在BS3淬灭步骤之后完成，但需要验证FACS的所有程序和条件（例如，要使用的缓冲液，温度，孵育时间）是否与交联测定中的程序和条件兼容。此外，FACS方法可能仅用于GABA。一个已知定位于周体细胞区室的 R 亚型（例如 α2），但不适用于富含远端树突的亚型（例如 α5）18，因为在细胞分选所需的广泛细胞解离步骤中，外周或远端细胞区室可能会丢失。（4）最后，我们发现当我们通过从受体总量中减去内膜相关受体的量来计算表面受体水平时，结果更加一致，而不是直接根据高分子量蛋白质物种的密度测定来评估表面水平。这可能是因为这些高分子量蛋白质物质在PVDF膜上的转移效率比较小尺寸的原始完整蛋白质（例如，α5-GABA的~55 kDa）的转移效率更具可变性一个因此，建议遵循结果部分和图例中描述的方法。 图8 计算表面受体水平。
除了慢性应激对GABAaR的影响外，BS3交联测定还可以应用于转基因小鼠或啮齿动物模型，通过实验操作来研究许多神经或神经精神疾病。该测定已成功用于捕获可卡因诱导的大鼠大脑伏隔核中谷氨酸受体表面表达的影响20，21。该测定还用于显示杂合BDNF敲除小鼠PFC中α5-GABAAR的表面表达降低22。在另一项先前的研究中，在大鼠肝性脑病模型中，伴随的空间学习缺陷与基于该交联测定的谷氨酸和GABAA 受体表面表达改变有因果关系23。总之，BS3化学交联测定提供了一种多功能工具，用于捕获大脑中一系列受体系统以及几乎任何其他外周组织或器官中的大脑区域特异性和上下文依赖性变化。该测定也可以与其他评估表面受体水平的方法并行进行，例如强直抑制的电生理记录（特别是在α5-GABAAR的情况下），低温电子显微镜和表面生物素化，以交叉比较和验证结果。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢CAMH动物设施工作人员在研究期间照顾动物。这项工作得到了加拿大卫生研究所（CIHR项目赠款#470458给T.T.），CAMH的发现基金（到T.P.），全国精神分裂症和抑郁症研究联盟（NARSAD奖#25637给E.S.）和坎贝尔家庭心理健康研究所（给E.S.）的支持。E.S.是Damona Pharmaceuticals的创始人，Damona Pharmaceuticals是一家致力于将新型GABA能化合物推向临床的生物制药公司。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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