Summary
BS3 kemiske tværbindingsanalyse afslører reduceret celleoverflade GABA A-receptorekspression i musehjerner under kroniske psykosociale stresstilstande.
Abstract
Angst er en tilstand af følelser, der variabelt påvirker dyrs adfærd, herunder kognitive funktioner. Adfærdsmæssige tegn på angst observeres over hele dyreriget og kan genkendes som enten adaptive eller maladaptive reaktioner på en bred vifte af stressmodaliteter. Gnavere giver en gennemprøvet eksperimentel model til translationelle undersøgelser, der adresserer de integrerende mekanismer for angst på molekylære, cellulære og kredsløbsniveauer. Især fremkalder det kroniske psykosociale stressparadigme maladaptive reaktioner, der efterligner angst-/depressive-lignende adfærdsmæssige fænotyper, der er analoge mellem mennesker og gnavere. Mens tidligere undersøgelser viser betydelige virkninger af kronisk stress på neurotransmitterindhold i hjernen, er effekten af stress på neurotransmitterreceptorniveauer underundersøgt. I denne artikel præsenterer vi en eksperimentel metode til at kvantificere neuronoverfladeniveauerne af neurotransmitterreceptorer hos mus under kronisk stress, især med fokus på gamma-aminosmørsyre (GABA) receptorer, som er impliceret i reguleringen af følelser og kognition. Ved hjælp af den membran-uigennemtrængelige irreversible kemiske tværbinding, bissulfosuccinimidylsuberat (BS3), viser vi, at kronisk stress signifikant nedregulerer overfladetilgængeligheden af GABAA-receptorer i den præfrontale cortex. De neuronale overfladeniveauer af GABAA-receptorer er den hastighedsbegrænsende proces for GABA-neurotransmission og kan derfor anvendes som en molekylær markør eller en proxy for graden af angst-/depressive-lignende fænotyper i eksperimentelle dyremodeller. Denne tværbindingsmetode kan anvendes på en række receptorsystemer for neurotransmittere eller neuromodulatorer udtrykt i enhver hjerneregion og forventes at bidrage til en dybere forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for følelser og kognition.
Introduction
Neurotransmitterreceptorer er lokaliseret enten ved neuronal plasmamembranoverflade eller intracellulært på endomembranerne (fx endosomet, det endoplasmatiske retikulum [ER] eller trans-Golgi-apparatet) og pendler dynamisk mellem disse to rum afhængigt af iboende fysiologiske tilstande i neuroner eller som reaktion på ydre neurale netværksaktiviteter 1,2. Da nyligt udskillede neurotransmittere fremkalder deres fysiologiske funktioner primært gennem den overfladelokaliserede pulje af receptorer, er overfladereceptorniveauerne for en given neurotransmitter en af de kritiske determinanter for dens signalkapacitet inden for det neurale kredsløb3.
Flere metoder er tilgængelige til overvågning af overfladereceptorniveauer i dyrkede neuroner, herunder overfladebiotinyleringsassay4, immunofluorescensanalysen med et specifikt antistof under ikke-permeabiliserede tilstande5 eller brugen af et receptortransgen, der er genetisk smeltet sammen med en pH-følsom fluorescerende optisk indikator (f.eks. pHluorin)6. I modsætning hertil er disse tilgange enten begrænsede eller upraktiske ved vurdering af overfladereceptorniveauer in vivo. For eksempel er overfladebiotinyleringsproceduren muligvis ikke praktisk til behandling af store mængder og prøveantal in vivo-hjernevæv på grund af dens relativt høje pris og de efterfølgende trin, der er nødvendige for at rense de biotinylerede proteiner på avidinkonjugerede perler. For neuroner indlejret i tredimensionel hjernearkitektur kan lav antistoftilgængelighed eller vanskeligheder med mikroskopbaseret kvantificering udgøre en betydelig begrænsning for vurdering af overfladereceptorniveauerne in vivo. For at visualisere fordelingen af neurotransmitterreceptorer i intakte hjerner kan ikke-invasive metoder, såsom positronemissionstomografi, bruges til at måle receptorbelægning og estimere overfladereceptorniveauerne7. Denne tilgang er imidlertid kritisk afhængig af tilgængeligheden af specifikke radioligander, dyrt udstyr og særlig ekspertise, hvilket gør det mindre tilgængeligt for rutinemæssig brug af de fleste forskere.
Her beskriver vi en enkel, alsidig metode til måling af overfladereceptorniveauer i eksperimentelle dyrehjerner ex vivo ved hjælp af en vandopløselig, membranuigennemtrængelig kemisk tværbinding, bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)8,9. BS3 retter sig mod primære aminer i sidekæden af lysinrester og kan kovalent tværbinde proteiner i umiddelbar nærhed af hinanden. Når hjerneskiver frisklaves fra et område af interesse og inkuberes i en buffer indeholdende BS3, krydsbindes celleoverfladereceptorerne med naboproteiner og omdannes således til arter med højere molekylvægt, mens de intracellulære endomembranassocierede receptorer forbliver umodificerede. Derfor kan overflade- og intracellulære receptorpuljer adskilles ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og kvantiteres ved western blot ved anvendelse af antistoffer, der er specifikke for receptoren, der skal undersøges.
Uforudsigelig kronisk mild stress (UCMS) er et veletableret eksperimentelt paradigme til inducering af kronisk psykosocial stress hos gnavere10. UCMS fremkalder angst- / depressive-lignende adfærdsmæssige fænotyper og kognitive underskud via modulering af en række neurotransmittersystemer, herunder GABA og dets receptorer10,11. Især er α5-underenhedsholdig GABA A-receptor (α5-GABAA R) impliceret ireguleringenaf hukommelse og kognitive funktioner12,13, hvilket tyder på mulig involvering af ændrede funktioner i denne underenhed i UCMS-inducerede kognitive underskud. I denne protokol brugte vi BS3-tværbindingsanalysen til at kvantificere niveauer af overfladeudtrykt α5-GABAAR i den præfrontale cortex hos mus udsat for UCMS sammenlignet med ikke-stressede kontrolmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbejde i denne protokol blev afsluttet i overensstemmelse med Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, kapitel A.22) og Canadian Council on Animal Care (CCAC) og blev godkendt af Institutional Animal Care Committee.
1. Tilberedning af dyr
- Bestem de dyrenumre, der skal bruges i forsøgene, og opdel dem i passende grupper eller eksperimentelle kohorter. Se diskussionsafsnittet for en diskussion af gruppens størrelse, køn og statistiske styrke.
BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset mus (C57BL6/J-stamme; 2-4 måneders alderen; typisk 20-30 g kropsvægt; tilsvarende antal hanner og hunner, der skal anvendes). - Anbring dyrene under UCMS eller kontroller ikke-stressede forhold i 5-8 uger efter protokollen som beskrevet tidligere14.
- Efter den sidste UCMS-procedure skal dyrene have lov til at blive i deres hjemmebure i 1 dag, før de bruges til tværbindingsanalysen for at undgå akutte stresseffekter på receptorekspression.
2. Fremstilling af stamopløsningerne
- Forbered og opbevar følgende opløsninger som anvist før analysen.
- Der fremstilles 5 M NaCl ved at opløse 14,6 g NaCl i 40 ml deioniseret vand. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
- Forbered 1,08 M KCl ved at opløse 3,22 g KCl i 40 ml deioniseret vand. Opbevares hos RT.
- Der fremstilles 400 mM MgCl2 ved opløsning af 3,25 g MgCl2·6H2O i 40 ml deioniseret vand. Opbevares hos RT.
- Der fremstilles 1 M glycin ved opløsning af 3 g glycin i 40 ml deioniseret vand og opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 1 M dithiothreitol (DTT) ved at opløse 1,54 g DTT i 10 ml deioniseret vand. Filtrer det gennem et filter med en porestørrelse på 0,2 μm og alikvote i 2 ml rør. Opbevares ved -20 °C.
- Der fremstilles 10% Nonidet-P40 (NP-40) ved at fortynde det i forholdet 1:10 (v/v) i deioniseret vand. Opbevares hos RT.
- Forbered 0,5 M EDTA (pH = 8,0), og opbevar ved RT.
- Forbered 1 M HEPES-buffer (pH = 7,2-7,5), og opbevar ved 4 °C.
- Forbered 2,5 M eller 45% (w/v) glucose og opbevar ved 4 °C.
3. Forberedelse af arbejdsstationen
- På dagen for BS3-tværbindingsanalysen samles følgende materialer i dyredissektionsrummet (figur 1) med flere genstande forkølet på is: en isspand, en metaltemperaturblok (forkølet på is), iskold PBS i et 50 ml konisk rør og frosset PBS i en petriskål, filterpapir fugtet med PBS og anbragt på en kølet plan overflade eller blå is en hjernematrix (1 mm interval for indsættelse af barberblad) forkølet på is, barberblade (~ 10) forkølet på is, dissektionsværktøjer (saks, tang, en buet sonde), en vævsstans, 70% ethanolsprayaftørringspapir og papirhåndklæder, pipetspidser (200 μL), en pipetter (P200), et stopur, en memopude, en pen og mikrocentrifugerør (1,5 ml).
- Før analysen mærkes mikrocentrifugeglassene med prøveoplysningerne (f.eks. dyre-ID-nummer, behandlingstype [UCMS versus ingen stress (NS)], hjerneområde, med eller uden BS3 osv.).
BEMÆRK: Til BS3-tværbindingsassays skal der indsamles to prøver fra hvert hjerneområde; den ene prøve vil blive brugt til tværbinding (med BS3) og den anden til ikke-tværbindingsreaktionen (uden BS3) som kontrol. For at udtage prøver fra to hjerneområder (dvs. den præfrontale cortex [PFC] og hippocampus [HPC]) i 12 mus mærkes 48 rør til indledende prøveudtagning (= 2 prøver × 2 regioner × 12 mus) (anvendes i afsnit 6). Yderligere to sæt med 48 glas mærkes til senere opbevaring (til opbevaring af to forskellige volumener [100 μL, 300 μL] af hver prøve) (anvendes i afsnit 7). Det er således nødvendigt at mærke 144 rør i alt for denne kohortestørrelse.
- Før analysen mærkes mikrocentrifugeglassene med prøveoplysningerne (f.eks. dyre-ID-nummer, behandlingstype [UCMS versus ingen stress (NS)], hjerneområde, med eller uden BS3 osv.).
- Sørg desuden for, at følgende udstyr er tilgængeligt i laboratoriet: en nedkølet mikrocentrifuge til bordbrug, en sonikator, en rørrotator (til brug i kølerummet eller inde i køleskabet [4 °C]), en fryser (-80 °C) til opbevaring af prøver og en spand tøris til midlertidig opbevaring af prøverne (anvendes i afsnit 7)
4. Forberedelse af arbejdsopløsninger og buffere
BEMÆRK: Om morgenen af analysen skal du forberede følgende opløsninger. Denne beregning er baseret på de nødvendige løsninger til behandling af to hjerneområder (dvs. PFC og HPC) fra 12 mus.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF, pH = 7,4) som nævnt i tabel 1. Der hældes 750 μL aCSF i hvert prøvetagningsrør (de 48 rør mærket i trin 3.1.1), og de anbringes i metaltemperaturblokken på is for at forkøle bufferen.
- Lysisbufferen fremstilles som nævnt i tabel 2. Opbevares på is (der anvendes 400 μL pr. prøve).
- Der fremstilles en 52 mM BS3-stamopløsning (26x) i 5 mM natriumcitratbuffer (pH = 5,0).
- Forbered først 100 mM citronsyre (lager A) og 100 mM natriumcitrat (lager B).
- Stamolie A og stamme B fortyndes i forholdet 1:20 med deioniseret vand. Der tilsættes 100 μL hver til 1,9 ml vand for at fremstille henholdsvis 5 mM citronsyre (stam C) og 5 mM natriumcitrat (stamme D).
- 410 μL stam C og 590 μl stam D blandes for at fremstille en 5 mM natriumcitratbuffer (pH = 5,0) (opløsning E, 1 ml).
- Bekræft pH-værdien af opløsning E ved hjælp af en pH-indikatorstrimmel.
- 24 mg BS3 opløses i 806,4 μl opløsning E ved hvirvelstrøm i 30 s for at fremstille BS3-stamopløsningen (26x).
- Der fremstilles yderligere 1 ml opløsning E, der skal anvendes som køretøjskontrol til prøver, der ikke er tværbundne.
BEMÆRK: Forbered BS3-stamopløsning, når alt andet er klar, og eksperimentet er ved at begynde. BS3 skal opbevares tørret ved 4 °C indtil brug. Efter rekonstitution forbliver BS3 kun aktiv i ca. ≤3 timer. Da pH-værdien af 5 mM natriumcitratbufferen (opløsning E) rapporteres at stige over tid og forårsage accelereret BS3-hydrolyse, anbefales det, at opløsning E fremstilles frisk fra stamopløsning A og B9. På grund af BS3's begrænsede opløselighed ved lave temperaturer skal den rekonstituerede BS3 opbevares ved RT. Den rekonstituerede BS3 skal bruges på 3 timer, og du må ikke fryse/tø op eller genbruge den rekonstituerede BS3.
5. Dissektion af hjernevæv
BEMÆRK: Fra dette trin skal mindst to personer arbejde sammen på en koordineret måde. Mens en person fokuserer på dyredissektionen (trin 5.2-5.10 og trin 6.3), skal den anden person arbejde som tidtager og hjælpe med at koordinere analysen (trin 5.1, trin 6.1, trin 6.2, trin 6.4 og trin 6.5)
- Bring det første dyr til dissektion fra boligområdet til dissektionsrummet.
BEMÆRK: Da akutte stressfaktorer (f.eks. et nyt miljø, lugten af blod) kan påvirke hjernens proteindynamik, bør dyrene holdes i deres hjemmebure placeret langt fra dissektionsområdet og derefter bringes individuelt ind i dissektionsrummet til øjeblikkelig halshugning. - Aflive musen ved cervikal dislokation efterfulgt af halshugning. Fjern hjernen hurtigt ud af kraniet, og nedsænk den i iskold PBS i en petriskål i 10-15 s (figur 2).
BEMÆRK: Dyrene bedøves ikke til BS3-forsøg, da ethvert bedøvelsesmiddel potentielt kan påvirke overfladepræsentationsniveauet for neurotransmitterreceptorerne9. - Placer den afkølede hjerne i hjernematrixen på is med den ventrale side af hjernen opad (figur 3).
- Indsæt det første barberblad gennem grænsen mellem den olfaktoriske pære og den olfaktoriske peduncle for at skære hjernen koronalt (figur 4). Brug tre til fire ekstra barberblade til serielt at skære den forreste del af hjernen koronalt med 1 mm intervaller.
- Løft koronale skiver af hjernematrixen ved at holde alle de indsatte barberblade sammen og efterlade den bageste del af hjernen bagved i hjernematrixen. Brug pincet til at adskille barberbladene fra hinanden, og placer dem på den flade, afkølede overflade med hjerneskiven opad (figur 5).
- Identificer de udsnit, der indeholder det pågældende område. Til prøveudtagning af PFC skal du vælge den anden og tredje skive bagved den første skive, der indeholder den olfaktoriske peduncle.
- Fjern interesseområdet ved hjælp af en vævsstans (video 1), læg den til side på det afkølede barberblad, og del vævet jævnt i to (f.eks. væv fra venstre versus højre halvkugle, hvor den ene halvdel skal bruges til BS3-tværbindingsreaktionen og den anden halvdel til ikke-tværbindingskontrol, hvis målproteinet af interesse udtrykkes ligeligt i begge halvkugler).
- Hak hvert væv i stykker på barberbladet ved hjælp af den fine spids af pincet med flere lodrette bevægelser mod bladet (video 2) i stedet for at mose eller slibe vævene. Dette vil maksimere overfladearealet, der er tilgængeligt for BS3 uden alvorligt at kompromittere cellernes membranintegritet. Umiddelbart efter hakningen overføres det hakkede væv til de relevante glas (se trin 6.3).
- Til prøveudtagning af HPC skal du tage den bageste del af hjernen ud af matrixen og placere hjernen på fugtet filterpapir på den afkølede, flade overflade med den dorsale side opad (figur 6).
- Brug en buet sonde og tang og nærmer sig fra den dorsale side (video 3) og dissekere HPC (dorsal halvdel, ventral halvdel eller begge dele) fra begge halvkugler (den ene halvdel til BS3-tværbinding og den anden halvdel til kontrollen). Hvert væv hakkes som i trin 5.8, og vævet overføres til passende glas (se trin 6.3).
BEMÆRK: Hele dissektionstiden for hvert dyr skal holdes på ~ 5 minutter for at forsøgsbetingelserne og resultaterne skal være konsistente.
6. Tværbindingsreaktion
- Bring det næste dyr til dissektion fra boligområdet til dissektionsrummet, når dissektionen af hjernen hos den forrige mus er ved at afslutte (trin 5.10).
- Røret forkøles på is (fra trin 4.1) med 30 μL BS3-opløsning (26x) eller køretøjsopløsning E, lige før hakket væv er klar til at blive overført til de relevante rør. Skift pipetspidserne mellem rørene for at sikre, at ingen BS3 er forurenet i kontrolrørene uden tværbinding.
- Det hakkede væv overføres (fra trin 5.8 og trin 5.10) til de relevante rør, og derefter begynder at dissekere det næste dyr (trin 5.2)
- Vend og bland røret for at bryde vævsstykkerne fra hinanden i mindre stykker (video 4), og begynd at inkubere prøverne på rørrotatoren i kølerummet i 30 minutter til 2 timer. Registrer starttidspunktet for BS3-inkubationen for hvert rør. Se diskussionsafsnittet for den optimale inkubationstid.
- Reaktionen slukkes ved at spidse glasset med 78 μL 1 M glycin, og prøven inkuberes yderligere i 10 minutter ved 4 °C med konstant rotation. Registrer start- og sluttidspunktet for slukning for hvert rør. Fortsæt med at hjælpe personen med fokus på dyrets dissektion ved at bringe det næste dyr (trin 6.1) og hjælpe med tværbinding (trin 6.2).
BEMÆRK: Behandl hver prøve med nøjagtig samme timing på tværs af alle prøverne. Hvis dissektionsrummet er langt væk fra kølerummet, anbefales det stærkt, at der rekrutteres en tredje person til at deltage i prøveinkubationen og slukningen i kølerummet.
7. Vævslyse, proteinpræparation og western blot
- Efter 10 minutters slukning (trin 6.5) drejes prøverne ved 20.000 x g ved 4 °C i 2 min., og supernatanten kasseres. Hvis en tredje person er tilgængelig, skal du fortsætte til trin 7.2; Ellers snapfryses prøverne på tøris og sættes på pause her, indtil hjernedissektionen (afsnit 5) og tværbindingen (afsnit 6) for alle dyrene er afsluttet.
- Tilsæt 400 μL iskold lysisbuffer pr. rør.
- Soniker prøverne i 1 s fem gange med 5 s intervaller imellem, mens prøverne holdes på is.
- Centrifugeringsprøver ved 20.000 x g i 2 minutter for at spinde uopløselige vævsrester (pellet) ud, og gem supernatanten.
- Der anvendes 5 μl supernatant til måling af proteinkoncentrationen ved hjælp af bicinchoninsyre-assayet.
- Resten af supernatanten deles i to rør; det ene glas indeholder 100 μl supernatant til den efterfølgende western blot, og det andet glas indeholder resten (~300 μl) til langtidsopbevaring ved -80 °C. Der tilsættes en passende mængde 4x SDS-prøvebuffer (suppleret med β2-mercaptoethanol) til prøverne, og der inkuberes ved 70 °C i 10 minutter.
- Der køres 10-20 μg protein pr. brønd på en acrylamidgel til elektroforese (SDS-PAGE), og overfør derefter proteiner til polyvinylidenfluoridmembranen (PVDF) til western blot-analyse.
- Bloker PVDF-membranen i 5% (w / v) skummetmælk opløst i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (TBS-T) i 1 time ved RT.
- Membranen vaskes kortvarigt to gange med TBS-T, og den inkuberes med det primære antistof fortyndet i TBS-T natten over ved 4 °C.
- Det primære antistof vaskes af tre gange i 10 minutter hver i TBS-T ved RT.
- Membranen inkuberes med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof fortyndet i TBS-T i 1 time ved RT.
- Det sekundære antistof vaskes af tre gange i 10 minutter hver i TBS-T ved RT.
- Inkuber membranen i forbedret kemiluminescensreagens, og detekter signalet ved hjælp af geldokumentationsapparatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere gennemførligheden af BS3-tværbindingsanalysen til evaluering af overfladen α5-GABA A R-niveaueri musens PFC kørte vi 10 μg hver af BS3-tværbundne og ikke-tværbundne proteinprøver på SDS-PAGE og analyserede proteinerne ved western blot ved hjælp af et anti-α5-GABAAR-antistof (kaninpolyklonalt) (figur 7). De ikke-tværbundne proteinprøver gav den samlede mængde α5-GABA A R ved ~55 kDa, mens BS3-tværbundne proteinprøver gav en vis mængde endomembranassocierede α5-GABA A R (migrerende ved~55 kDa) sammen med proteinarter med højere molekylvægt, der repræsenterer proteinkomplekser, der er kovalent tværbundet til α5-GABAAR. Til kvantificering af overfladen α5-GABA A R-niveauer kan vi vurdere omfanget af udtømning af α5-GABAAR ved ~55 kDa fra den samlede pulje ved tværbinding, da underenheden derefter skifter til positioner med højere molekylvægt. I praksis kan overfladeniveauerne af α5-GABA A R beregnes ved at trække mængden af endomembranassocieret α5-GABA A R (ved ~55 kDai den tværbundne prøvebane) fra de samlede α5-GABAAR-niveauer (ved ~55 kDai den ikke-tværbundne prøvebane).
Vi evaluerede derefter virkningerne af UCMS (efter 3 uger og 5 uger) på overfladen og de totale α5-GABAAR-niveauer i musens PFC. I dette eksperiment forberedte vi prøverne 1 time, 2 timer og 3 timer efter tilsætning af BS3 for at følge tidsforløbet for tværbindingsreaktionen. Da BS3-tværbindingsreaktioner syntes at nå et plateau med 2 timer, blev dataene på 1 times tidspunkt brugt til at plotte grafen. Vi observerede en signifikant og progressiv reduktion i overflade α5-GABAAR-niveauer i PFC efter 3 uger og 5 ugers UCMS sammenlignet med mus uden stress (figur 8). Dataene viste ubetydelige eller ingen tilsyneladende ændringer i de samlede receptorniveauer under disse eksperimentelle forhold, hvilket tyder på, at kronisk stress specifikt påvirkede α5-GABAAR-handel til celleoverfladen.
Figur 1: Dissektionsværktøjer, der anvendes i BS3-tværbindingsassayet. Filterpapir fugtes med iskold PBS og placeres på den flade overflade af blå is. En petriskål fyldt med PBS og opbevaret ved -20 °C 1 dag før analysen lægges på is. Hjernematrixen og barberbladene forkøles på is. Saks (en stor, en lille), tang (en stor, et par små) og en vævsstans rengøres alle inden analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hele musehjernen dissekeret ud af kraniet og placeret i iskold PBS. Umiddelbart efter at hele hjernen blev fjernet fra kraniet, blev den nedsænket i iskold PBS i 10-15 s i en petriskål på is. Dette bremser hjernens stofskifte og minimerer proteinhandel og nedbrydning, samtidig med at vævet bliver hårdere, hvilket gør den efterfølgende hjerneskæring lettere. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: En musehjerne placeret i hjernematrixen. Den afkølede musehjerne nedsænket i iskold PBS blev overført til hjernematrixen og placeret med den ventrale side opad. Barberbladene og matrixen blev forkølet på is. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Koronal sektionering af en musehjerne i hjernematrixen. Det første forkølede barberblad blev indsat gennem grænsen mellem den olfaktoriske pære og den olfaktoriske peduncle for at begynde at sektionere hjernen koronalt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Serielle koronale sektioner af en musehjerne. Den forreste del af musehjernen blev skåret koronalt ved at indsætte fem barberblade serielt i hjernematrixen (1 mm intervaller). Alle de indsatte knive blev holdt sammen, løftet af matrixen, adskilt fra hinanden ved hjælp af tang og placeret på den afkølede flade overflade med hjerneskiven opad. (Øverst til venstre) Den olfaktoriske pære; (midt til venstre) den første sektion; den anden (nederst til venstre) og tredje (øverst til højre) sektion blev brugt til prøveudtagning af PFC-væv; (nederst til højre) det fjerde afsnit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Bageste del af hjernen til dissekering af hippocampus. Efter at den forreste del af hjernen blev koronalt skåret med barberblade (venstre), blev den bageste del af hjernen (midten) taget ud af hjernematrixen og anbragt på PBS-fugtet filterpapir på den afkølede overflade (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: BS3 tværbinding af GABAAR på celleoverfladen. I nærvær af BS3 er α5-GABA A R på plasmamembranoverfladen tværbundet (XL) med anonyme proteiner tæt på den, såsom andre GABA A R-underenheder indenfor den pentamere GABAAR-samling eller yderligere naboproteiner (X), men ikke med proteiner (Y) langt væk fra den. Således fremstår α5-GABAAR som en proteinart med høj molekylvægt (HMW) på blottet. α5-GABAAR på endosomet forbliver intakt og migrerer med den forventede størrelse på ~55 kDa. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Overflade α5-GABAAR-niveauer påvirket af UCMS. Både total- og overfladeniveauerne af α5-GABAAR i PFC hos mus under betingelserne uden stress og UCMS (3 uger og 5 uger) blev evalueret. For at følge tidsforløbet for tværbindingsreaktionen blev prøverne fremstillet 1 time, 2 timer og 3 timer efter tilsætning af BS3. Der blev anvendt hunmus (2-3 måneder, N = 4/gruppe). De intakte α5-GABA AR-niveauer ved 55 kDa for hver tilstand blev først normaliseret af de tilsvarende αTubulin-niveauer og derefter brugt til at beregne de samlede og endomembranassocierede α5-GABAAR-niveauer (fra henholdsvis de ikke-tværbundne [No Xlink] og tværbundne [Xlink] prøver). Derefter blev overfladereceptorniveauerne beregnet ved at trække den endomembranassocierede mængde fra de samlede niveauer. Da BS3-tværbindingsreaktionerne syntes at nå et plateau med 2 timer, blev dataene på 1 times tidspunkt brugt til at plotte grafen (gennemsnit ± SEM). Signifikante virkninger af kronisk stress på overflade α5-GABA AR-niveauer blev observeret, og denne effekt var UCMS-varighedsafhængig, da et progressivt fald i overfladen α5-GABAAR-niveauer blev identificeret i hele UCMS-perioden. *p < 0,05, **p < 0,01 (Kruskal-Wallis-test med Dunns mange sammenligninger). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Arbejdskonc. | Lager opløsning | Mængde stamopløsning, der skal dispenseres |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 m (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 m (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 m (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM glukose | 2,5 m (250x) | 160 μL |
| Deioniseret vand | 37.563 ml | |
| Total | 40 ml | |
| * CaCl2-bestanden skal være frisklavet på forsøgsdagen. | ||
Tabel 1: Sammensætningen af kunstig cerebrospinalvæske.
| Arbejdskonc. | Lager opløsning | Mængde stamopløsning, der skal dispenseres |
| 25 mM HEPES | 1 m (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 m (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 m (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 m (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Proteasehæmmer cocktail | 100x | 200 μL |
| Deioniseret vand | 17 ml | |
| Total | 20 ml |
Tabel 2: Sammensætningen af lysisbufferen
Video 1: Isolering af PFC ved hjælp af en vævsstans. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Hakning af PFC ved hjælp af pincet. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Dissekering af HPC ved hjælp af en buet sonde og tang. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Inversion-blanding af en vævsprøve. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom virkningen af kronisk psykosocial stress på adfærd (dvs. følelsesmæssighed og kognitive underskud) og molekylære ændringer (dvs. reduceret ekspression af GABAerge gener og ledsagende underskud i GABAerg neurotransmission) er veldokumenterede10, skal mekanismerne bag sådanne underskud undersøges yderligere. Især i betragtning af den nylige undersøgelse, der viser, at kronisk stress signifikant påvirker neuronproteomet gennem overbelastning på ER-funktionerne og dermed forhøjet ER-stress15, er der stadig et spørgsmål om, hvorvidt kronisk stress påvirker GABA A R-handel gennem ER-membranen, og hvordan ændret handel eller overfladeniveauer af GABAAR kunne værekausalt forbundet med psykopatologi.
BS3-tværbindingsanalysen vist i denne protokol vil tjene som en stærk tilgang til at besvare nogle af disse spørgsmål. For eksempel er UCMS kendt for at fremkalde en række adfærdsændringer, herunder kognitive underskud, angstlignende adfærd og anhedoniske fænotyper, afhængigt af varigheden af UCMS10. Derfor ville det være muligt at studere tidsforløbet og graden af UCMS-inducerede ændringer i overflade α5-GABAAR-niveauer ved at prøve musehjerner på successive tidspunkter fra starten af UCMS (f.eks. 1 uge, 3 uger, 5 uger), og det ville også være muligt at krydssammenligne med de adfærdsmæssige fænotyper, der observeres på hvert tidspunkt. Yderligere GABAAR-undertyper (f.eks. α1, α2) og receptoren for neuromodulatorer, der vides at være påvirket af kronisk stress (f.eks. TrkB-receptoren for hjerneafledt neurotrofisk faktor [BDNF])10 kunne testes samtidigt ved hjælp af de samme prøver. Da nogle af disse receptorsystemer og undertyper er selektivt impliceret i specifikke adfærdsmæssige domæner (f.eks. Sedation, angst, kognition)11, er det værd at korrelere adfærdsændringerne med typen og graden af receptorer, der påvirkes af UCMS på hvert tidspunkt.
Nedenfor er de kritiske punkter, du skal overveje for flere trin i protokollen. Det første skridt er at bestemme det nødvendige og tilstrækkelige antal dyr, der skal bruges, baseret på det eksperimentelle design og effektanalyse. For eksempel for at studere effekten af kronisk stress på overflade GABAA-receptorniveauer, forbereder vi rutinemæssigt en gruppe mus (N = 6 / køn) til at blive udsat for UCMS i 5 uger og en anden gruppe (N = 6 / køn) til at blive holdt under ikke-stressforhold. Denne gruppestørrelse (N = 24 i alt, inklusive begge køn) forventes at give tilstrækkelig statistisk styrke til at detektere en ~ 20% forskel i receptorniveauer, hvilket muliggør evaluering af både stresseffekter og kønseffekter. Især rapporteres det, at kronisk stress forårsager kønsafhængige forskelle i adfærdsmæssige og molekylære resultater10. For eksempel er kvinder generelt mere tilbøjelige til at udvikle depressive symptomer end mænd. Konsekvent indikerer vores undersøgelser ved hjælp af menneskelige postmortem- og gnaverhjerner højere niveauer af adfærdsmæssige og molekylære patologier hos kvindelige forsøgspersoner; nedregulerede niveauer af somatostatin (SST), en molekylær markør for depression, er mere robuste hos kvinder blandt deprimerede patienter16, og øget følelsesmæssighed er mere robust hos kvindelige musemodeller, der replikerer aspekter af depressiv patologi end hos mænd15,17. Derfor anbefales det, at ethvert eksperimentelt design, der adresserer virkningerne af kronisk stress på psykopatologiske resultater, bør omfatte et tilstrækkeligt antal både mænd og kvinder for at sikre statistisk styrke til at analysere dataene og identificere mulige kønsafhængige virkninger.
Den optimale inkubationstid med BS3 bør bestemmes i pilotforsøg for hver receptor, der skal undersøges. Det rapporteres, at receptorhandel kan forekomme langsomt, selv ved lave temperaturer under prøveinkubation9. For at fange nøjagtige overfladereceptorniveauer på tidspunktet for hjernedissektion ville det være ideelt at minimere inkubationstiden og vælge tidspunktet lige før tværbindingsreaktionen når plateauet (30 min til 2 timer ved 4 ° C).
Vi bemærkede flere operationelle begrænsninger forbundet med BS3-tværbindingsassays. (1) For det første er det på grund af BS3's relativt korte halveringstid (2-3 timer) forårsaget af spontan hydrolyse inden for det fysiologiske pH-område nødvendigt at afslutte dyredissektionen og tværbindingsreaktionen inden for denne tidsramme. Dette fik os til at begrænse antallet af dyr, vi kunne dissekere ad gangen, til maksimalt 12. Hvis eksperimentatoren planlægger at dissekere mere end 12 dyr, anbefales det at opdele den eksperimentelle kohorte i flere grupper, hvor hver indeholder mindre end 12 dyr. Når analysen for en gruppe er afsluttet, skal en ny batch BS3 være frisklavet til brug i efterfølgende tværbindingsassays for den næste gruppe. På samme måde bør antallet af interesseområder, der skal dissekeres fra et dyr, begrænses. Vi udtager rutinemæssigt prøver fra to hjerneområder (PFC, HPC) til tværbindingsanalysen, og dette er det maksimale antal hjerneområder, vi kan dissekere for at opnå konsistente resultater med minimal variabilitet på tværs af prøver. (2) For det andet bør specificiteten af de antistoffer, der anvendes i western blot, vurderes nøje. BS3 kemiske tværbindingsreaktion kan have en uventet effekt på antigeniciteten af de proteiner, der detekteres af hvert antistof. Vi konstaterede, at én α5-GABAEnR-antistof (specificeret i Tabel over materialer) fejlagtigt detekterede et stærkt ~50 kDa-bånd specifikt i BS3-tværbundne prøver, uanset tilstedeværelsen eller fraværet af α5-GABAEnR-protein i prøven dette ~50 kDa bånd blev set selv i vævsprøver fra α5-GABAEnR knockout-mus, hvilket tyder på, at dette antistof begyndte at krydsreagere med irrelevante antigener, der ved et uheld blev genereret af BS3-tværbindingsreaktionen. Det anbefales, at antistofspecificiteten bestemmes grundigt med og uden BS3-tværbindingsreaktioner, ideelt set ved hjælp af knockout-vævsprøver, hvis de er tilgængelige, for et givet protein af interesse. (3) Den nuværende protokol, der er beskrevet her, omhandler ikke de celletyper, hvori hver GABAEnR-subtype udtrykkes (fx neuroner og astrocytter). For nogle GABAEnR-undertyper (fx α1, α5), der overvejende udtrykkes i neuroner18, skal de tværbindingsassaydata, der er opnået ved hjælp af hjernevæv i bulk, som beskrevet i denne protokol, give oplysninger, der afspejler neuronoverfladeniveauerne. Men for andre GABAEnR-undertyper (f.eks. α2), der er stærkt udtrykt i både neuroner og astrocytter18, er det af interesse at studere receptoroverfladeniveauerne i neuroner versus astrocytter separat. Til dette formål er konventionel cellesortering (f.eks. fluorescensaktiveret cellesortering [FACS]19) kan integreres i BS3-tværbindingsprotokollen celledissociationstrinnet til cellesortering kan udføres efter BS3-slukningstrinnet, men man skal validere, at alle procedurer og betingelser for FACS (f.eks. de buffere, der skal bruges, temperatur, inkubationstid) er kompatible med dem i tværbindingsassayet. Desuden kan FACS-metoden kun anvendes til GABAEnR-undertyper, der vides at være lokaliseret til det perisomatiske cellerum (f.eks. α2), men ikke for undertyperne beriget med distale dendritter (f.eks. α5)18, fordi perifere eller distale cellerum sandsynligvis går tabt under det omfattende celledissociationstrin, der er nødvendigt for cellesortering. (4) Endelig fandt vi, at resultaterne var mere konsistente, når vi beregnede overfladereceptorniveauerne ved at trække mængden af endomembranassocierede receptorer fra den samlede mængde receptorer i stedet for direkte at evaluere overfladeniveauerne baseret på densitometri af proteinarter med høj molekylvægt. Dette skyldes sandsynligvis, at overførselseffektiviteten af disse proteinarter med høj molekylvægt til PVDF-membranen er mere variabel end for det oprindelige, intakte protein af mindre størrelse (f.eks. ~55 kDa for α5-GABAEnR). Det anbefales derfor at følge metoden beskrevet i resultatafsnittet og forklaringen om Figur 8 at beregne overfladereceptorniveauerne.
Bortset fra virkningerne af kronisk stress på GABAAR, BS3 tværbindingsanalysen kan også anvendes på genetisk modificerede mus eller gnavermodeller med eksperimentelle manipulationer til at undersøge en række neurologiske eller neuropsykiatriske tilstande. Dette assay er med succes blevet anvendt til at fange kokaininducerede virkninger på overfladeekspressionen af glutamatreceptorer i nucleus accumbens i rottehjerner20,21. Assayet er også blevet brugt til at vise reduceret overfladeekspression af α5-GABAAR i PFC hos heterozygote BDNF knockout-mus22. I en anden tidligere undersøgelse, i modellen af hepatisk encefalopati hos rotter, var de ledsagende rumlige læringsunderskud kausalt forbundet med ændret overfladeekspression af glutamat- og GABAA-receptorer baseret på dette tværbindingsassay23. Sammenfattende giver BS3 kemisk tværbindingsanalyse et alsidigt værktøj til at fange hjerneregionsspecifikke og kontekstafhængige ændringer i en række receptorsystemer i hjernen såvel som i stort set alle andre perifere væv eller organer. Dette assay kan også udføres parallelt med andre metoder til evaluering af overfladereceptorniveauerne, såsom elektrofysiologisk registrering af tonisk hæmning (især i tilfælde af α5-GABAAR), kryogen elektronmikroskopi og overfladebiotinylering, for at krydssammenligne og validere resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker CAMH dyrefacilitetspersonalet for at passe dyrene i løbet af undersøgelsens varighed. Dette arbejde blev støttet af Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 til T.T.), Discovery Fund fra CAMH (til T.P.), National Alliance for Research on Schizofreni and Depression (NARSAD award # 25637 til ES) og Campbell Family Mental Health Research Institute (til ES). E.S. er grundlæggeren af Damona Pharmaceuticals, et biofarmaceutisk lægemiddel dedikeret til at bringe nye GABAerge forbindelser til klinikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
