Summary
Il test di reticolazione chimica BS3 rivela una ridotta espressionedel recettore GABA A della superficie cellulare nel cervello dei topi in condizioni di stress psicosociale cronico.
Abstract
L'ansia è uno stato di emozione che influenza in modo variabile i comportamenti degli animali, comprese le funzioni cognitive. I segni comportamentali di ansia sono osservati in tutto il regno animale e possono essere riconosciuti come risposte adattive o disadattive a una vasta gamma di modalità di stress. I roditori forniscono un modello sperimentale collaudato per gli studi traslazionali che affrontano i meccanismi integrativi dell'ansia a livello molecolare, cellulare e circuitale. In particolare, il paradigma dello stress psicosociale cronico suscita risposte disadattive che imitano fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi che sono analoghi tra esseri umani e roditori. Mentre studi precedenti mostrano effetti significativi dello stress cronico sul contenuto dei neurotrasmettitori nel cervello, l'effetto dello stress sui livelli del recettore dei neurotrasmettitori è poco studiato. In questo articolo, presentiamo un metodo sperimentale per quantificare i livelli di superficie neuronale dei recettori dei neurotrasmettitori nei topi sottoposti a stress cronico, concentrandoci in particolare sui recettori dell'acido gamma-aminobutirrico (GABA), che sono implicati nella regolazione delle emozioni e della cognizione. Utilizzando il reticolante chimico irreversibile impermeabile alla membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), dimostriamo che lo stress cronico riduce significativamente la disponibilità superficiale dei recettori GABAA nella corteccia prefrontale. I livelli di superficie neuronale dei recettori GABAA sono il processo limitante per la neurotrasmissione GABA e potrebbero, quindi, essere utilizzati come marcatore molecolare o proxy del grado di fenotipi ansiosi / depressivi in modelli animali sperimentali. Questo approccio di crosslinking è applicabile a una varietà di sistemi recettoriali per neurotrasmettitori o neuromodulatori espressi in qualsiasi regione del cervello e ci si aspetta che contribuisca a una comprensione più profonda dei meccanismi alla base delle emozioni e della cognizione.
Introduction
I recettori dei neurotrasmettitori sono localizzati sulla superficie della membrana plasmatica neuronale o intracellulare sulle endomembrane (ad esempio, l'endosoma, il reticolo endoplasmatico [ER], o l'apparato trans-Golgi) e fanno la spola dinamica tra questi due compartimenti a seconda degli stati fisiologici intrinseci nei neuroni o in risposta alle attività estrinseche della rete neurale 1,2. Poiché i neurotrasmettitori appena secreti suscitano le loro funzioni fisiologiche principalmente attraverso il pool di recettori localizzato in superficie, i livelli di recettori di superficie per un dato neurotrasmettitore sono uno dei determinanti critici della sua capacità di segnalazione all'interno del circuito neurale3.
Sono disponibili diversi metodi per monitorare i livelli dei recettori di superficie nei neuroni in coltura, tra cui il saggio di biotinilazione superficiale4, il saggio di immunofluorescenza con un anticorpo specifico in condizioni non permeabilizzate5 o l'uso di un transgene recettore geneticamente fuso con un indicatore ottico fluorescente sensibile al pH (ad esempio, pHluorin)6. Al contrario, questi approcci sono limitati o poco pratici quando si valutano i livelli dei recettori di superficie in vivo. Ad esempio, la procedura di biotinilazione superficiale potrebbe non essere pratica per il trattamento di grandi quantità e numeri di campioni di tessuti cerebrali in vivo a causa del suo prezzo relativamente elevato e delle successive fasi necessarie per purificare le proteine biotinilate su perle coniugate con avidina. Per i neuroni incorporati nell'architettura cerebrale tridimensionale, la bassa accessibilità agli anticorpi o le difficoltà nella quantificazione basata sul microscopio possono rappresentare una limitazione significativa per valutare i livelli dei recettori di superficie in vivo. Per visualizzare la distribuzione dei recettori dei neurotrasmettitori nel cervello intatto, metodi non invasivi, come la tomografia ad emissione di positroni, potrebbero essere utilizzati per misurare l'occupazione dei recettori e stimarei livelli 7 del recettore di superficie. Tuttavia, questo approccio si basa in modo critico sulla disponibilità di leganti radio specifici, apparecchiature costose e competenze speciali, rendendolo meno accessibile per l'uso di routine da parte della maggior parte dei ricercatori.
Qui, descriviamo un metodo semplice e versatile per misurare i livelli di recettori di superficie in cervelli animali sperimentali ex vivo utilizzando un reticolante chimico solubile in acqua e impermeabile alla membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)8,9. BS3 prende di mira le ammine primarie nella catena laterale dei residui di lisina e può reticolare covalentemente le proteine in prossimità l'una dell'altra. Quando le fette di cervello sono appena preparate da una regione di interesse e incubate in un tampone contenente BS3, i recettori della superficie cellulare sono reticolati con le proteine vicine e, quindi, si trasformano in specie ad alto peso molecolare, mentre i recettori associati all'endomembrana intracellulare rimangono invariati. Pertanto, i pool di recettori di superficie e intracellulari possono essere separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quantificati mediante western blot utilizzando anticorpi specifici per il recettore da studiare.
Lo stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) è un paradigma sperimentale ben consolidato per indurre stress psicosociale cronico nei roditori10. UCMS suscita fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi e deficit cognitivi attraverso la modulazione di una serie di sistemi di neurotrasmettitori, tra cui GABA e i suoi recettori10,11. In particolare, il recettore GABA A contenente subunità α5 (α5-GABAAR) è implicato nella regolazione della memoria e delle funzioni cognitive12,13, suggerendo il possibile coinvolgimento di funzioni alterate di questa subunità nei deficit cognitivi indotti da UCMS. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test di crosslinking BS3 per quantificare i livelli di α5-GABAAR espressi in superficie nella corteccia prefrontale dei topi esposti a UCMS rispetto ai topi di controllo non stressati.
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Protocol
Tutto il lavoro sugli animali in questo protocollo è stato completato in conformità con l'Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, capitolo A.22) e il Canadian Council on Animal Care (CCAC) ed è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali.
1. Preparazione degli animali
- Determinare il numero di animali da utilizzare negli esperimenti e dividerli in gruppi appropriati o coorti sperimentali. Vedi la sezione di discussione per una discussione sulle dimensioni del gruppo, il sesso e il potere statistico.
NOTA: Questo protocollo è personalizzato per i topi (ceppo C57BL6/J; 2-4 mesi di età; tipicamente 20-30 g di peso corporeo; numero equivalente di maschi e femmine da utilizzare). - Porre gli animali sotto UCMS o controllare condizioni non stressate per 5-8 settimane, seguendo il protocollo come descritto in precedenza14.
- Dopo l'ultima procedura UCMS, consentire agli animali di rimanere nelle loro gabbie domestiche per 1 giorno prima di utilizzarli per il test di reticolazione per evitare effetti di stress acuto sull'espressione del recettore.
2. Preparazione delle soluzioni stock
- Preparare e conservare le seguenti soluzioni come indicato prima del test.
- Preparare 5 M NaCl sciogliendo 14,6 g di NaCl in 40 ml di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente (RT).
- Preparare 1,08 M KCl sciogliendo 3,22 g di KCl in 40 ml di acqua deionizzata. Negozio su RT.
- Preparare 400 mM MgCl 2 sciogliendo 3,25 g di MgCl 2·6H 2 O in 40 mL di acqua deionizzata. Negozio su RT.
- Preparare 1 M di glicina sciogliendo 3 g di glicina in 40 ml di acqua deionizzata e conservare a 4 °C.
- Preparare 1 M ditiotreitolo (DTT) sciogliendo 1,54 g di DTT in 10 mL di acqua deionizzata. Filtrare-sterilizzarlo attraverso un filtro con una dimensione dei pori di 0,2 μm e aliquote in tubi da 2 ml. Conservare a -20 °C.
- Preparare il 10% di Nonidet-P40 (NP-40) diluendolo in un rapporto di 1:10 (v / v) in acqua deionizzata. Negozio su RT.
- Preparare 0,5 M EDTA (pH = 8,0) e conservare a RT.
- Preparare 1 M tampone HEPES (pH = 7,2-7,5) e conservare a 4 °C.
- Preparare 2,5 M o 45% (p/v) di glucosio e conservare a 4 °C.
3. Preparazione della postazione di lavoro
- Il giorno del test di reticolazione BS3, raccogliere i seguenti materiali nella sala di dissezione animale (Figura 1), con diversi oggetti pre-raffreddati su ghiaccio: un secchiello per il ghiaccio, un blocco di temperatura metallica (pre-raffreddato su ghiaccio), PBS ghiacciato in un tubo conico da 50 ml e PBS congelato in una capsula di Petri, carta da filtro inumidita con PBS e posta su una superficie piana refrigerata o ghiaccio blu, una matrice cerebrale (intervallo di 1 mm per l'inserimento della lama di rasoio) pre-raffreddata su ghiaccio, lamette da barba (~10) pre-raffreddata su ghiaccio, strumenti di dissezione (forbici, pinze, una sonda curva), un punzone di tessuto, carta spray al 70% di etanolo e asciugamani di carta, punte di pipetta (200 μL), un pipettor (P200), un cronometro, un blocco appunti, una penna e tubi per microcentrifuga (1,5 ml).
- Prima del test, etichettare le provette della microcentrifuga con le informazioni del campione (ad esempio, numero ID animale, tipo di trattamento [UCMS versus no stress (NS)], regione del cervello, con o senza BS3, ecc.).
NOTA: Per i saggi di reticolazione BS3, devono essere raccolti due campioni da ciascuna regione del cervello; un campione sarà utilizzato per la reticolazione (con BS3) e l'altro per la reazione di non reticolazione (senza BS3) come controllo. Pertanto, per campionare da due regioni del cervello (cioè la corteccia prefrontale [PFC] e l'ippocampo [HPC]) in 12 topi, etichettare 48 provette per il campionamento iniziale (= 2 campioni × 2 regioni × 12 topi) (da utilizzare nella sezione 6). Etichettare altre due serie di 48 provette per la successiva conservazione (per conservare due volumi diversi [100 μL, 300 μL] di ciascun campione) (da utilizzare nella sezione 7). Pertanto, è necessario etichettare 144 tubi in totale per questa dimensione di coorte.
- Prima del test, etichettare le provette della microcentrifuga con le informazioni del campione (ad esempio, numero ID animale, tipo di trattamento [UCMS versus no stress (NS)], regione del cervello, con o senza BS3, ecc.).
- Inoltre, assicurarsi che le seguenti apparecchiature siano disponibili in laboratorio: una microcentrifuga refrigerata da tavolo, un sonicatore, un rotatore a tubi (da utilizzare nella cella frigorifera o all'interno del frigorifero [4 °C]), un congelatore (-80 °C) per la conservazione dei campioni e un secchio di ghiaccio secco per la conservazione temporanea dei campioni (da utilizzare nella sezione 7)
4. Preparazione delle soluzioni di lavoro e dei tamponi
NOTA: La mattina del test, preparare le seguenti soluzioni. Questo calcolo si basa sulle soluzioni necessarie per elaborare due regioni del cervello (cioè PFC e HPC) da 12 topi.
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF, pH = 7,4) come indicato nella Tabella 1. Erogare 750 μL di aCSF in ciascuna provetta di campionamento (le 48 provette etichettate al punto 3.1.1) e metterle nel blocco di temperatura metallica su ghiaccio per pre-raffreddare il tampone.
- Preparare il tampone di lisi come indicato nella tabella 2. Conservare su ghiaccio (400 μL da utilizzare per campione).
- Preparare una soluzione madre di 52 mM BS3 (26x) in tampone citrato di sodio da 5 mM (pH = 5,0).
- In primo luogo, preparare 100 mM di acido citrico (stock A) e 100 mM di citrato di sodio (stock B).
- Diluire il brodo A e il brodo B in rapporto a 1:20 con acqua deionizzata. Aggiungere 100 μL ciascuno a 1,9 ml di acqua per preparare rispettivamente 5 mM di acido citrico (stock C) e 5 mM di citrato di sodio (stock D).
- Mescolare 410 μL di stock C e 590 μL di stock D per preparare un tampone citrato di sodio da 5 mM (pH = 5,0) (soluzione E, 1 mL).
- Confermare il pH della soluzione E utilizzando una striscia indicatrice di pH.
- Sciogliere 24 mg di BS3 in 806,4 μL di soluzione E mediante vortice per 30 s per preparare la soluzione madre di BS3 (26x).
- Preparare un altro 1 mL di soluzione E da utilizzare come controllo del veicolo per i campioni non reticolanti.
NOTA: preparare la soluzione madre BS3 quando tutto il resto è pronto e l'esperimento sta per iniziare. Il BS3 deve essere conservato essiccato a 4 °C fino all'uso. Una volta ricostituito, BS3 rimane attivo solo per circa ≤3 ore. Poiché il pH del tampone citrato di sodio da 5 mM (soluzione E) aumenta nel tempo, causando un'idrolisi accelerata di BS3, si raccomanda di preparare la soluzione E fresca dalle soluzioni madre A e B9. A causa della limitata solubilità di BS3 a basse temperature, mantenere il BS3 ricostituito a RT. Utilizzare il BS3 ricostituito in 3 ore e non congelare/scongelare o riutilizzare il BS3 ricostituito.
5. Dissezione dei tessuti cerebrali
NOTA: Da questo passaggio in poi, almeno due persone dovrebbero lavorare insieme in modo coordinato. Mentre una persona si concentra sulla dissezione animale (passi 5.2-5.10 e step 6.3), l'altra persona dovrebbe lavorare come cronometrista e aiutare a coordinare il test (step 5.1, step 6.1, step 6.2, step 6.4 e step 6.5)
- Porta il primo animale per la dissezione dall'area abitativa alla stanza di dissezione.
NOTA: Poiché i fattori di stress acuti (ad esempio, un nuovo ambiente, l'odore del sangue) possono influenzare la dinamica delle proteine cerebrali, gli animali dovrebbero essere tenuti nelle loro gabbie domestiche poste lontano dall'area di dissezione e quindi essere portati individualmente nella stanza di dissezione per la decapitazione immediata. - Eutanasia del topo per dislocazione cervicale seguita da decapitazione. Rimuovere rapidamente il cervello dal cranio e immergerlo in PBS ghiacciato in una capsula di Petri per 10-15 s (Figura 2).
NOTA: Gli animali non sono anestetizzati per gli esperimenti BS3 poiché qualsiasi agente anestetico potrebbe potenzialmente influenzare il livello di presentazione superficiale dei recettori dei neurotrasmettitori9. - Posizionare il cervello raffreddato nella matrice cerebrale sul ghiaccio, con il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto (Figura 3).
- Inserire la prima lama di rasoio attraverso il bordo tra il bulbo olfattivo e il peduncolo olfattivo per tagliare il cervello coronalmente (Figura 4). Utilizzando tre o quattro lamette da barba aggiuntive, tagliare in serie la parte anteriore del cervello coronalmente con intervalli di 1 mm.
- Sollevare le fette coronali dalla matrice cerebrale tenendo insieme tutte le lamette inserite, lasciando la parte posteriore del cervello nella matrice cerebrale. Utilizzare una pinza per separare le lamette l'una dall'altra e posizionarle sulla superficie piana e fredda con la fetta di cervello rivolta verso l'alto (Figura 5).
- Identificare le sezioni contenenti la regione di interesse. Per il campionamento del PFC, scegliere la seconda e la terza fetta posteriore alla prima fetta contenente il peduncolo olfattivo.
- Rimuovere la regione di interesse usando un punzone tissutale (Video 1), metterla da parte sulla lama di rasoio refrigerata e dividere uniformemente il tessuto in due (ad esempio, tessuti dell'emisfero sinistro rispetto a quello destro, con una metà da utilizzare per la reazione di reticolazione BS3 e l'altra metà per il controllo di non reticolazione se la proteina bersaglio di interesse è ugualmente espressa in entrambi gli emisferi).
- Tritare ogni tessuto in pezzi sulla lama del rasoio usando la punta sottile della pinza con più movimenti verticali contro la lama (Video 2) invece di schiacciare o macinare i tessuti. Ciò massimizzerà la superficie accessibile a BS3 senza compromettere gravemente l'integrità della membrana delle cellule. Immediatamente dopo la tritatura, trasferire i tessuti tritati nelle provette appropriate (vedere punto 6.3).
- Per il campionamento dell'HPC, estrarre la parte posteriore del cervello dalla matrice e posizionare il cervello su carta da filtro inumidita sulla superficie piana refrigerata, con il lato dorsale rivolto verso l'alto (Figura 6).
- Utilizzando una sonda curva e una pinza, e avvicinandosi dal lato dorsale (Video 3), sezionare l'HPC (metà dorsale, metà ventrale o entrambi) da entrambi gli emisferi (una metà per la reticolazione BS3 e l'altra metà per il controllo). Tritare ogni tessuto come al punto 5.8 e trasferire il tessuto in tubi appropriati (vedere punto 6.3).
NOTA: L'intero tempo di dissezione per ciascun animale deve essere mantenuto a ~ 5 minuti affinché le condizioni sperimentali e i risultati siano coerenti.
6. Reazione di reticolazione
- Portare l'animale successivo per la dissezione dall'area abitativa alla stanza di dissezione quando la dissezione del cervello del topo precedente sta per terminare (passo 5.10).
- Picchiettare il tubo pre-raffreddato su ghiaccio (dal punto 4.1) con 30 μL di soluzione BS3 (26x) o soluzione veicolo E subito prima che i tessuti tritati siano pronti per essere trasferiti nelle provette appropriate. Cambiare le punte dei pipetti tra i tubi per assicurarsi che nessun BS3 sia contaminato nei tubi di controllo senza reticolazione.
- Trasferire i tessuti tritati (dal punto 5.8 al punto 5.10) nelle provette appropriate, quindi iniziare a sezionare l'animale successivo (punto 5.2)
- Capovolgere e mescolare il tubo per rompere i pezzi di tessuto in pezzi più piccoli (Video 4) e iniziare a incubare i campioni sul rotatore del tubo nella cella frigorifera per 30 minuti a 2 ore. Registrare l'ora di inizio dell'incubazione BS3 per ogni provetta. Vedi la sezione di discussione per il tempo di incubazione ottimale.
- Estinguere la reazione facendo spuntare il tubo con 78 μL di glicina 1 M e incubare ulteriormente il campione per 10 minuti a 4 °C con rotazione costante. Registrare l'ora di inizio e fine della tempra per ciascun tubo. Continuare ad assistere la persona che si concentra sulla dissezione dell'animale portando l'animale successivo (passo 6.1) e aiutando con la reticolazione (passo 6.2).
NOTA: trattare ogni campione con la stessa identica tempistica per tutti i campioni. Se la sala di dissezione è lontana dalla cella frigorifera, si consiglia vivamente di reclutare una terza persona per prendere parte all'incubazione del campione e alla tempra nella cella frigorifera.
7. Lisi tissutale, preparazione proteica e western blot
- Dopo 10 minuti di tempra (fase 6.5), ruotare i campioni a 20.000 x g a 4 °C per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Se è disponibile una terza persona, procedere al passaggio 7.2; Altrimenti, congelare i campioni su ghiaccio secco e mettere in pausa il test qui fino a quando la dissezione cerebrale (sezione 5) e la reticolazione (sezione 6) per tutti gli animali sono completate.
- Aggiungere 400 μL di tampone di lisi ghiacciato per provetta.
- Sonicare i campioni per 1 s cinque volte con intervalli di 5 s in mezzo, mantenendo i campioni sul ghiaccio.
- Spin i campioni a 20.000 x g per 2 minuti per far uscire i detriti tissutali insolubili (pellet) e salvare il surnatante.
- Utilizzare 5 μL di surnatante per misurare la concentrazione proteica utilizzando il test dell'acido bicinconinico (BCA).
- Dividere il resto del surnatante in due tubi; una provetta contiene 100 μL di surnatante per la successiva western blot, e l'altra provetta contiene il resto (~300 μL) per la conservazione a lungo termine a -80 °C. Aggiungere una quantità appropriata di tampone campione 4x SDS (integrato con β2-mercaptoetanolo) ai campioni e incubare a 70 °C per 10 minuti.
- Eseguire 10-20 μg di proteine per pozzetto su un gel di acrilammide per elettroforesi (SDS-PAGE), quindi trasferire le proteine alla membrana del fluoruro di polivinilidene (PVDF) per l'analisi western blot.
- Bloccare la membrana PVDF in latte scremato al 5% (p/v) sciolto in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,1% Tween-20 (TBS-T) per 1 ora a RT.
- Lavare brevemente la membrana due volte con TBS-T e incubarla con l'anticorpo primario diluito in TBS-T durante la notte a 4 °C.
- Lavare via l'anticorpo primario tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS-T a RT.
- Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano diluito in TBS-T per 1 ora a RT.
- Lavare via l'anticorpo secondario tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS-T a RT.
- Incubare la membrana in un reagente a chemiluminescenza potenziato e rilevare il segnale utilizzando l'apparato di documentazione del gel.
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Representative Results
Per dimostrare la fattibilità del test di reticolazione BS3 per valutare i livelli di α5-GABA A Rdi superficie nel PFC del topo, abbiamo eseguito 10 μg ciascuno di campioni di proteina reticolata BS3 e non reticolata su SDS-PAGE e analizzato le proteine mediante western blot utilizzando un anticorpo anti-α5-GABAAR (policlonale di coniglio) (Figura 7). I campioni di proteine non reticolate hanno fornito la quantità totale di α5-GABA A R a ~ 55 kDa, mentre i campioni di proteina reticolata BS3 hanno dato una certa quantità di α5-GABA AR associata all'endomembrana (migrando a ~ 55 kDa) insieme a specie proteiche ad alto peso molecolare che rappresentano complessi proteici covalentemente reticolati a α5-GABAAR. Per la quantificazione dei livelli di α5-GABAA R di superficie, possiamo valutare l'entità della deplezione di α5-GABAAR a ~ 55 kDa dal pool totale dopo la reticolazione, poiché la subunità si sposta quindi in posizioni di peso molecolare più elevato. In pratica, i livelli superficiali di α5-GABAA R possono essere calcolati sottraendo la quantità di α5-GABA A R associata all'endomembrana (a ~55 kDa nella corsia del campione reticolato) dai livelli totali di α5-GABAAR (a ~55 kDa nella corsia del campione non reticolato).
Abbiamo quindi valutato gli effetti dell'UCMS (a 3 settimane e 5 settimane) sulla superficie e sui livelli totali di α5-GABAAR nel PFC del topo. In questo esperimento, al fine di seguire il corso temporale della reazione di reticolazione, abbiamo preparato i campioni a 1 ora, 2 ore e 3 ore dopo l'aggiunta di BS3. Poiché le reazioni di reticolazione BS3 sembravano raggiungere un plateau di 2 ore, i dati al punto temporale di 1 ora sono stati utilizzati per tracciare il grafico. Abbiamo osservato una riduzione significativa e progressiva dei livelli di α5-GABAAR di superficie nel PFC a 3 settimane e 5 settimane di UCMS, rispetto ai topi di controllo senza stress (Figura 8). I dati hanno mostrato cambiamenti trascurabili o assenti nei livelli totali del recettore in queste condizioni sperimentali, suggerendo che lo stress cronico ha avuto un impatto specifico sul traffico di α5-GABAAR sulla superficie cellulare.
Figura 1: Strumenti di dissezione utilizzati nel saggio di reticolazione BS3. La carta da filtro viene inumidita con PBS ghiacciato e posta sulla superficie piana del ghiaccio blu. Una capsula di Petri riempita con PBS e conservata a -20 °C 1 giorno prima del test viene posta su ghiaccio. La matrice cerebrale e le lamette da barba sono pre-raffreddate sul ghiaccio. Le forbici (una grande, una piccola), le pinze (una grande, alcune piccole) e un punzone di tessuto vengono tutti puliti prima del test. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: L'intero cervello di topo sezionato dal cranio e posto in PBS ghiacciato. Immediatamente dopo che l'intero cervello è stato rimosso dal cranio, è stato immerso in PBS ghiacciato per 10-15 s in una capsula di Petri sul ghiaccio. Questo rallenta il metabolismo cerebrale e riduce al minimo il traffico e la degradazione delle proteine, aiutando anche il tessuto a diventare più duro, il che rende più facile il successivo taglio del cervello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Un cervello di topo inserito nella matrice cerebrale. Il cervello di topo raffreddato immerso in PBS ghiacciato è stato trasferito nella matrice cerebrale e posizionato con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Le lamette e la matrice sono state pre-raffreddate su ghiaccio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Sezionamento coronale di un cervello di topo nella matrice cerebrale. La prima lama di rasoio pre-raffreddata è stata inserita attraverso il confine tra il bulbo olfattivo e il peduncolo olfattivo per iniziare a sezionare il cervello coronalmente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Sezioni coronali seriali del cervello di un topo. La parte anteriore del cervello del topo è stata tagliata coronalmente inserendo cinque lamette serialmente nella matrice cerebrale (intervalli di 1 mm). Tutte le lame inserite sono state tenute insieme, sollevate dalla matrice, separate l'una dall'altra usando una pinza e posizionate sulla superficie piatta refrigerata con la fetta di cervello rivolta verso l'alto. (In alto a sinistra) Il bulbo olfattivo; (al centro a sinistra) la prima sezione; la seconda (in basso a sinistra) e la terza (in alto a destra) sono state utilizzate per il campionamento dei tessuti PFC; (in basso a destra) la quarta sezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Parte posteriore del cervello per sezionare l'ippocampo. Dopo che la parte anteriore del cervello è stata tagliata coronalmente con lamette da barba (a sinistra), la parte posteriore del cervello (al centro) è stata estratta dalla matrice cerebrale e posizionata su carta da filtro inumidita con PBS sulla superficie refrigerata (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Crosslinking BS3 di GABAAR sulla superficie cellulare. In presenza di BS3, α5-GABA AR sulla superficie della membrana plasmatica è reticolato (XL) con proteine anonime vicine ad esso, come altre subunità GABA A R all'interno dell'assemblaggio pentamerico GABAAR o proteine vicine aggiuntive (X), ma non con proteine (Y) lontane da esso. Pertanto, l'α5-GABAAR appare come una specie proteica ad alto peso molecolare (HMW) sulla macchia. α5-GABAAR sull'endosoma rimane intatto e migra alla dimensione prevista di ~ 55 kDa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Livelli di α5-GABAAR di superficie influenzati da UCMS. Sono stati valutati sia i livelli totali che quelli superficiali di α5-GABAAR nella PFC dei topi in condizioni di no-stress e UCMS (3 settimane e 5 settimane). Per seguire il corso temporale della reazione di reticolazione, i campioni sono stati preparati a 1 ora, 2 ore e 3 ore dopo l'aggiunta di BS3. Sono stati utilizzati topi femmina (2-3 mesi, N = 4 / gruppo). I livelli intatti di α5-GABA A R a 55 kDa per ciascuna condizione sono stati prima normalizzati dai corrispondenti livelli di αtubulina e quindi utilizzati per calcolare i livelli totali e associati all'endomembrana α5-GABAAR (rispettivamente dai campioni non reticolati [No Xlink] e [Xlink] reticolati). Successivamente, i livelli del recettore di superficie sono stati calcolati sottraendo la quantità associata all'endomembrana dai livelli totali. Poiché le reazioni di reticolazione BS3 sembravano raggiungere un plateau di 2 ore, i dati al punto temporale di 1 ora sono stati utilizzati per tracciare il grafico (media ± SEM). Sono stati osservati effetti significativi dello stress cronico sui livelli di α5-GABA A R di superficie, e questo effetto dipendeva dalla durata dell'UCMS, poiché è stata identificata una progressiva diminuzionedei livelli di α5-GABAAR di superficie durante il periodo UCMS. *p < 0,05, **p < 0,01 (test di Kruskal-Wallis con confronti multipli di Dunn). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Conc. di lavoro | Soluzione madre | Quantità di soluzione madre da erogare |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 m (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM di glucosio | 2,5 m (250x) | 160 μL |
| Acqua deionizzata | 37,563 ml | |
| Totale | 40 ml | |
| * Le scorte di CaCl2 devono essere preparate il giorno dell'esperimento. | ||
Tabella 1: La composizione del liquido cerebrospinale artificiale.
| Conc. di lavoro | Soluzione madre | Quantità di soluzione madre da erogare |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 m (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 m (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Cocktail inibitore della proteasi | 100x | 200 μL |
| Acqua deionizzata | 17 ml | |
| Totale | 20 ml |
Tabella 2: La composizione del tampone di lisi
Video 1: Isolare il PFC usando un punzone tissutale. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Tritare il PFC usando una pinza. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: Dissezione dell'HPC utilizzando una sonda curva e una pinza. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 4: Inversione-miscelazione di un campione di tessuto. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Sebbene l'impatto dello stress psicosociale cronico sui comportamenti (cioè emotività e deficit cognitivi) e sui cambiamenti molecolari (cioè ridotta espressione dei geni GABAergici e deficit di accompagnamento nella neurotrasmissione GABAergica) siano ben documentati10, i meccanismi alla base di tali deficit necessitano di ulteriori indagini. In particolare, dato il recente studio che dimostra che lo stress cronico influenza significativamente il proteoma neuronale attraverso il sovraccarico sulle funzioni di ER e, quindi, lo stress ER elevato15, rimane una domanda sul fatto che lostress cronico influenzi il traffico di GABA A R attraverso la membrana ER e come il traffico alterato o i livelli superficiali di GABAAR potrebbero essere collegati causalmente alla psicopatologia.
Il test di crosslinking BS3 mostrato in questo protocollo servirà come un approccio potente per rispondere ad alcune di queste domande. Ad esempio, UCMS è noto per suscitare una serie di cambiamenti comportamentali, tra cui deficit cognitivi, comportamento ansioso e fenotipi anedonici, a seconda della durata di UCMS10. Pertanto, sarebbe possibile studiare il decorso temporale e il grado di cambiamenti indotti da UCMS nei livelli di superficie di α5-GABAAR campionando cervelli di topo in punti temporali successivi dall'inizio dell'UCMS (ad esempio, 1 settimana, 3 settimane, 5 settimane), e sarebbe anche possibile confrontare con i fenotipi comportamentali osservati in ciascun punto temporale. Ulteriori sottotipi di GABAAR (ad esempio, α1, α2) e il recettore per neuromodulatori noti per essere affetti da stress cronico (ad esempio, il recettore TrkB per il fattore neurotrofico derivato dal cervello [BDNF])10 potrebbero essere testati simultaneamente utilizzando gli stessi campioni. Poiché alcuni di questi sistemi e sottotipi recettoriali sono selettivamente implicati in specifici domini comportamentali (ad esempio, sedazione, ansia, cognizione)11, vale la pena correlare i cambiamenti comportamentali con il tipo e il grado di recettori interessati dall'UCMS in ogni punto temporale.
Di seguito sono riportati i punti critici da considerare per diversi passaggi del protocollo. Il primo passo è determinare il numero necessario e sufficiente di animali da utilizzare in base al disegno sperimentale e all'analisi della potenza. Ad esempio, per studiare l'effetto dello stress cronico sui livelli di superficie del recettore GABAA, prepariamo regolarmente un gruppo di topi (N = 6 / sesso) da esporre a UCMS per 5 settimane e un altro gruppo (N = 6 / sesso) da mantenere in condizioni di non stress. Questa dimensione del gruppo (N = 24 in totale, inclusi entrambi i sessi) dovrebbe fornire abbastanza potenza statistica per rilevare una differenza di ~ 20% nei livelli dei recettori, consentendo così la valutazione sia degli effetti dello stress che degli effetti sessuali. In particolare, è stato riferito che lo stress cronico causa differenze dipendenti dal sesso nei risultati comportamentali e molecolari10. Ad esempio, le donne sono generalmente più inclini a sviluppare sintomi depressivi rispetto agli uomini. Coerentemente, i nostri studi che utilizzano cervelli umani postmortem e roditori indicano livelli più elevati di patologie comportamentali e molecolari nei soggetti di sesso femminile; i livelli sottoregolati di somatostatina (SST), un marcatore molecolare per la depressione, sono più robusti nelle donne tra i pazienti depressi16, e l'aumento dell'emotività è più robusto nei modelli murini femminili che replicano aspetti della patologia depressiva rispetto ai maschi15,17. Pertanto, si consiglia che qualsiasi disegno sperimentale che affronti gli effetti dello stress cronico sugli esiti psicopatologici dovrebbe includere un numero adeguato di maschi e femmine per garantire il potere statistico nell'analisi dei dati e per identificare possibili effetti dipendenti dal sesso.
Il tempo di incubazione ottimale con BS3 deve essere determinato in esperimenti pilota per ciascun recettore da studiare. È stato riportato che il traffico dei recettori può avvenire lentamente, anche a basse temperature durante l'incubazione del campione9. Per catturare livelli accurati del recettore di superficie al momento della dissezione cerebrale, sarebbe ideale ridurre al minimo il tempo di incubazione e scegliere il punto temporale giusto prima che la reazione di reticolazione raggiunga il plateau (da 30 minuti a 2 ore a 4 °C).
Abbiamo notato diverse limitazioni operative associate ai saggi di reticolazione BS3. (1) In primo luogo, a causa dell'emivita relativamente breve (2-3 ore) di BS3 causata dall'idrolisi spontanea all'interno dell'intervallo di pH fisiologico, è necessario completare la dissezione animale e la reazione di reticolazione entro questo lasso di tempo. Questo ci ha portato a limitare il numero di animali che potevamo sezionare alla volta a un massimo di 12. Se lo sperimentatore prevede di sezionare più di 12 animali, si consiglia di dividere la coorte sperimentale in diversi gruppi, ciascuno contenente meno di 12 animali. Dopo aver completato il test per un gruppo, un nuovo lotto di BS3 deve essere preparato per l'uso nei successivi test di reticolazione per il gruppo successivo. Allo stesso modo, il numero di regioni di interesse da sezionare da un animale dovrebbe essere limitato. Campioniamo regolarmente da due regioni cerebrali (PFC, HPC) per il test di reticolazione, e questo è il numero massimo di regioni cerebrali che possiamo sezionare al fine di ottenere risultati coerenti con una variabilità minima tra i campioni. (2) In secondo luogo, la specificità degli anticorpi utilizzati nel western blot deve essere attentamente valutata. La reazione di reticolazione chimica BS3 può avere un effetto inaspettato sull'antigenicità delle proteine rilevate da ciascun anticorpo. Abbiamo scoperto che un α5-GABAUnR (specificato nel Tabella dei materiali) ha erroneamente rilevato una forte banda ~50 kDa specificamente nei campioni reticolati BS3, indipendentemente dalla presenza o meno dell'α5-GABAUnProteina R nel campione; questa banda ~50 kDa è stata osservata anche in campioni di tessuto da α5-GABAUnTopi knockout R, suggerendo che questo anticorpo ha iniziato a reagire in modo incrociato con antigeni irrilevanti generati accidentalmente dalla reazione di reticolazione BS3. Si consiglia di determinare accuratamente la specificità dell'anticorpo con e senza reazioni di reticolazione BS3, idealmente utilizzando campioni di tessuto knockout, se disponibili, per una data proteina di interesse. (3) L'attuale protocollo qui descritto non affronta i tipi di cellule in cui ogni GABAUnIl sottotipo R è espresso (ad esempio, neuroni e astrociti). Per alcuni GABAUnSottotipi R (ad esempio, α1, α5) che sono prevalentemente espressi nei neuroni18, i dati del test di reticolazione ottenuti utilizzando tessuti cerebrali bulk, come descritto nel presente protocollo, dovrebbero fornire informazioni che riflettano i livelli di superficie neuronale. Tuttavia, per altri GABAUnSottotipi R (ad esempio, α2) che sono altamente espressi sia nei neuroni che negli astrociti18, è interessante studiare separatamente i livelli superficiali dei recettori nei neuroni rispetto agli astrociti. A tal fine, la selezione cellulare convenzionale (ad esempio, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza [FACS]19) possono essere integrati nel protocollo di reticolazione BS3; la fase di dissociazione cellulare per lo smistamento cellulare può essere eseguita dopo la fase di tempra BS3, ma è necessario convalidare che tutte le procedure e le condizioni per FACS (ad esempio, i tamponi da utilizzare, la temperatura, il tempo di incubazione) siano compatibili con quelle del saggio di reticolazione. Inoltre, l'approccio FACS può essere utilizzato solo per GABAUnSottotipi R noti per essere localizzati nel compartimento cellulare perisomatico (ad esempio, α2) ma non per i sottotipi arricchiti in dendriti distali (ad esempio, α5)18, perché è probabile che i compartimenti cellulari periferici o distali vengano persi durante l'estesa fase di dissociazione cellulare necessaria per l'ordinamento cellulare. (4) Infine, abbiamo trovato i risultati più coerenti quando abbiamo calcolato i livelli dei recettori di superficie sottraendo la quantità di recettori associati all'endomembrana dalla quantità totale di recettori piuttosto che valutare direttamente i livelli superficiali basati sulla densitometria di specie proteiche ad alto peso molecolare. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che l'efficienza di trasferimento di queste specie proteiche ad alto peso molecolare sulla membrana PVDF è più variabile di quella della proteina originale intatta di dimensioni più piccole (ad esempio, ~ 55 kDa per α 5-GABAUnR). Si raccomanda pertanto di seguire il metodo descritto nella sezione dei risultati e la legenda di Grafico 8 per calcolare i livelli del recettore di superficie.
Oltre agli effetti dello stress cronico su GABAAR, il test di reticolazione BS3 può essere applicato anche a topi geneticamente modificati o modelli di roditori con manipolazioni sperimentali per indagare una serie di condizioni neurologiche o neuropsichiatriche. Questo test è stato utilizzato con successo per catturare gli effetti indotti dalla cocaina sull'espressione superficiale dei recettori del glutammato nel nucleo accumbens del cervello di ratto20,21. Il test è stato utilizzato anche per mostrare una ridotta espressione superficiale di α5-GABAAR nella PFC di topi knockout BDNF eterozigoti22. In un altro studio precedente, nel modello di encefalopatia epatica nei ratti, i deficit di apprendimento spaziale che li accompagnano erano causalmente legati all'alterata espressione superficiale dei recettori del glutammato e del GABAA sulla base di questo saggio di reticolazione23. In sintesi, il test di reticolazione chimica BS3 fornisce uno strumento versatile per catturare i cambiamenti specifici della regione cerebrale e dipendenti dal contesto in una serie di sistemi recettoriali nel cervello, così come praticamente in qualsiasi altro tessuto o organo periferico. Questo test può anche essere condotto in parallelo con altri metodi per valutare i livelli dei recettori di superficie, come la registrazione elettrofisiologica dell'inibizione tonica (specialmente nel caso di α5-GABAAR), microscopia elettronica criogenica e biotinilazione di superficie, per confrontare e convalidare i risultati.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il personale della struttura per animali CAMH per essersi preso cura degli animali per tutta la durata dello studio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), dal Discovery Fund del CAMH (a T.P.), dalla National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (premio NARSAD #25637 a E.S.) e dal Campbell Family Mental Health Research Institute (a E.S.). E.S. è il fondatore di Damona Pharmaceuticals, una biofarmaceutica dedicata a portare nuovi composti GABAergici alla clinica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
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