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Neuroscience

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABAA dans le cerveau des rongeurs

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65063
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,2,3, 1,3
1Centre for Addiction and Mental Health (CAMH), Campbell Family Mental Health Research Institute, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Psychiatry, University of Toronto

Summary

Le test de réticulation chimique BS3 révèle une réduction de l’expression du récepteur GABAA de surface cellulaire dans le cerveau de souris dans des conditions de stress psychosocial chronique.

Abstract

L’anxiété est un état d’émotion qui affecte de manière variable les comportements des animaux, y compris les fonctions cognitives. Des signes comportementaux d’anxiété sont observés dans tout le règne animal et peuvent être reconnus comme des réponses adaptatives ou inadaptées à un large éventail de modalités de stress. Les rongeurs fournissent un modèle expérimental éprouvé pour les études translationnelles portant sur les mécanismes intégratifs de l’anxiété aux niveaux moléculaire, cellulaire et des circuits. En particulier, le paradigme du stress psychosocial chronique suscite des réponses inadaptées imitant des phénotypes comportementaux de type anxiété / dépression qui sont analogues entre les humains et les rongeurs. Alors que des études antérieures montrent des effets significatifs du stress chronique sur le contenu des neurotransmetteurs dans le cerveau, l’effet du stress sur les niveaux de récepteurs des neurotransmetteurs est sous-étudié. Dans cet article, nous présentons une méthode expérimentale pour quantifier les niveaux de surface neuronale des récepteurs des neurotransmetteurs chez les souris soumises à un stress chronique, en nous concentrant particulièrement sur les récepteurs de l’acide gamma-aminobutyrique (GABA), qui sont impliqués dans la régulation des émotions et de la cognition. En utilisant le réticulant chimique irréversible imperméable à la membrane, le sous-érate de bissulfosuccinimidyle (BS3), nous montrons que le stress chronique régule significativement à la baisse la disponibilité de surface des récepteurs GABAA dans le cortex préfrontal. Les niveaux de surface neuronale des récepteurs GABAA sont le processus limitant le taux de neurotransmission GABA et pourraient donc être utilisés comme marqueur moléculaire ou proxy du degré de phénotypes anxieux / dépressifs dans des modèles animaux expérimentaux. Cette approche de réticulation est applicable à une variété de systèmes récepteurs pour les neurotransmetteurs ou les neuromodulateurs exprimés dans n’importe quelle région du cerveau et devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’émotion et à la cognition.

Introduction

Les récepteurs des neurotransmetteurs sont localisés soit à la surface de la membrane plasmique neuronale, soit intracellulaire sur les endomembranes (p. ex. l’endosome, le réticulum endoplasmique [ER] ou l’appareil trans-Golgi) et font la navette dynamique entre ces deux compartiments en fonction des états physiologiques intrinsèques des neurones ou en réponse aux activités extrinsèques du réseau neuronal 1,2. Étant donné que les neurotransmetteurs nouvellement sécrétés suscitent leurs fonctions physiologiques principalement par le biais du pool localisé de récepteurs localisés en surface, les niveaux de récepteurs de surface pour un neurotransmetteur donné sont l’un des déterminants critiques de sa capacité de signalisation dans le circuit neuronal3.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour surveiller les niveaux de récepteurs de surface dans les neurones en culture, y compris le test de biotinylationde surface 4, le test d’immunofluorescence avec un anticorps spécifique dans des conditions non perméabilisées5, ou l’utilisation d’un transgène récepteur génétiquement fusionné avec un indicateur optique fluorescent sensible au pH (par exemple, pHluorin)6. En revanche, ces approches sont limitées ou peu pratiques lors de l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Par exemple, la procédure de biotinylation de surface peut ne pas être pratique pour traiter de grandes quantités et un grand nombre d’échantillons de tissus cérébraux in vivo en raison de son prix relativement élevé et des étapes ultérieures nécessaires pour purifier les protéines biotinylées sur des billes conjuguées à l’avidine. Pour les neurones intégrés dans une architecture cérébrale tridimensionnelle, la faible accessibilité des anticorps ou les difficultés de quantification au microscope peuvent constituer une limitation importante pour l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Pour visualiser la distribution des récepteurs des neurotransmetteurs dans les cerveaux intacts, des méthodes non invasives, telles que la tomographie par émission de positrons, pourraient être utilisées pour mesurer l’occupation des récepteurs et estimer les niveaux de récepteursde surface 7. Cependant, cette approche repose essentiellement sur la disponibilité de ligands radio spécifiques, d’équipements coûteux et d’une expertise spéciale, ce qui la rend moins accessible pour une utilisation régulière par la plupart des chercheurs.

Ici, nous décrivons une méthode simple et polyvalente pour mesurer les niveaux de récepteurs de surface dans des cerveaux d’animaux expérimentaux ex vivo à l’aide d’un agent de réticulation chimique soluble dans l’eau et imperméable à la membrane, le bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 cible les amines primaires dans la chaîne latérale des résidus de lysine et peut réticuler de manière covalente les protéines à proximité les unes des autres. Lorsque les tranches de cerveau sont fraîchement préparées à partir d’une région d’intérêt et incubées dans un tampon contenant BS3, les récepteurs de surface cellulaire sont réticulés avec des protéines voisines et, par conséquent, se transforment en espèces de poids moléculaire plus élevé, tandis que les récepteurs associés à l’endomembrane intracellulaire restent inchangés. Par conséquent, les pools de récepteurs de surface et intracellulaires peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et quantifiés par transfert Western à l’aide d’anticorps spécifiques au récepteur à étudier.

Le stress chronique léger imprévisible (UCMS) est un paradigme expérimental bien établi pour induire un stress psychosocial chronique chez les rongeurs10. UCMS provoque des phénotypes comportementaux anxieux / dépressifs et des déficits cognitifs via la modulation d’un éventail de systèmes de neurotransmetteurs, y compris le GABA et ses récepteurs10,11. En particulier, le récepteur GABA A contenant la sous-unité α5 (α5-GABAAR) est impliqué dans la régulation de la mémoire et des fonctions cognitives12,13, suggérant l’implication possible de fonctions altérées de cette sous-unité dans les déficits cognitifs induits par UCMS. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test de réticulation BS3 pour quantifier les niveaux d’α5-GABAAR exprimé en surface dans le cortex préfrontal des souris exposées à l’UCMS par rapport aux souris témoins non stressées.

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Protocol

Tous les travaux sur les animaux prévus dans ce protocole ont été effectués conformément à la Loi sur les animaux destinés à la recherche de l’Ontario (L.R.O. 1990, chapitre A.22) et au Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’établissement.

1. Préparation des animaux

  1. Déterminez le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences et divisez-les en groupes ou cohortes expérimentales appropriés. Voir la section de discussion pour une discussion sur la taille du groupe, le sexe et la puissance statistique.
    REMARQUE : Ce protocole est personnalisé pour les souris (souche C57BL6/J; âge de 2 à 4 mois; généralement 20 à 30 g de poids corporel; nombre équivalent de mâles et de femelles à utiliser).
  2. Placer les animaux sous UCMS ou contrôler des conditions non stressées pendant 5 à 8 semaines, en suivant le protocole décrit précédemment14.
  3. Après la dernière procédure UCMS, laissez les animaux rester dans leurs cages domestiques pendant 1 jour avant de les utiliser pour le test de réticulation afin d’éviter les effets de stress aigus sur l’expression des récepteurs.

2. Préparation des solutions mères

  1. Préparez et conservez les solutions suivantes comme indiqué avant l’essai.
    1. Préparer 5 M de NaCl en dissolvant 14,6 g de NaCl dans 40 mL d’eau désionisée. Conserver à température ambiante (RT).
    2. Préparer 1,08 M de KCl en dissolvant 3,22 g de KCl dans 40 mL d’eau désionisée. Magasin chez RT.
    3. Préparer 400 mM de MgCl2en dissolvant 3,25 g de MgCl2.6H2O dans 40 mL d’eau désionisée. Magasin chez RT.
    4. Préparer 1 M de glycine en dissolvant 3 g de glycine dans 40 mL d’eau désionisée et conserver à 4 °C.
    5. Préparer 1 M dithiothréitol (DTT) en dissolvant 1,54 g de DTT dans 10 mL d’eau désionisée. Filtrez-stérilisez à travers un filtre avec une taille de pores de 0,2 μm, et aliquote dans des tubes de 2 mL. Conserver à −20 °C.
    6. Préparer 10% de Nonidet-P40 (NP-40) en le diluant dans un rapport de 1:10 (v/v) dans de l’eau désionisée. Magasin chez RT.
    7. Préparer 0,5 M d’EDTA (pH = 8,0) et conserver à TA.
    8. Préparer un tampon HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) et conserver à 4 °C.
    9. Préparer 2,5 M ou 45 % (p/v) de glucose et conserver à 4 °C.

3. Préparation du poste de travail

  1. Le jour de l’essai de réticulation BS3, rassembler les matériaux suivants dans la salle de dissection des animaux (figure 1), avec plusieurs éléments prérefroidis sur glace : un seau à glace, un bloc de température métallique (prérefroidi sur de la glace), du PBS glacé dans un tube conique de 50 ml et du PBS congelé dans une boîte de Pétri, du papier filtre humidifié avec du PBS et placé sur une surface plane réfrigérée ou de la glace bleue, une matrice cérébrale (intervalle de 1 mm pour l’insertion de la lame de rasoir) prérefroidie sur de la glace, des lames de rasoir (~10) prérefroidies sur de la glace, des outils de dissection (ciseaux, pinces, sonde incurvée), un poinçon en tissu, du papier d’essuyage et des essuie-tout à l’éthanol à 70 %, des embouts de pipette (200 μL), une pipette (P200), un chronomètre, un bloc-notes, un stylo et des tubes de microcentrifugation (1,5 mL).
    1. Avant l’essai, étiquetez les tubes de microcentrifugation avec les renseignements sur l’échantillon (p. ex., numéro d’identification de l’animal, type de traitement [SMCU versus absence de stress (NS)], région du cerveau, avec ou sans BS3, etc.).
      REMARQUE : Pour les essais de réticulation BS3, deux échantillons de chaque région du cerveau doivent être prélevés; un échantillon sera utilisé pour la réticulation (avec BS3) et l’autre pour la réaction de non-réticulation (sans BS3) comme témoin. Par conséquent, afin d’échantillonner deux régions du cerveau (c.-à-d. le cortex préfrontal [PFC] et l’hippocampe [HPC]) chez 12 souris, étiqueter 48 tubes pour l’échantillonnage initial (= 2 échantillons × 2 régions × 12 souris) (à utiliser dans la section 6). Étiqueter deux autres ensembles de 48 tubes pour un stockage ultérieur (pour stocker deux volumes différents [100 μL, 300 μL] de chaque échantillon) (à utiliser à la section 7). Ainsi, il est nécessaire d’étiqueter 144 tubes au total pour cette taille de cohorte.
  2. De plus, assurez-vous que l’équipement suivant est disponible dans le laboratoire : une microcentrifugeuse réfrigérée de table, un sonicateur, un rotateur tubulaire (à utiliser dans la chambre froide ou à l’intérieur du réfrigérateur [4 °C]), un congélateur (−80 °C) pour stocker les échantillons et un seau de glace sèche pour le stockage temporaire des échantillons (à utiliser dans la section 7)

4. Préparation des solutions de travail et des tampons

NOTE: Le matin de l’essai, préparer les solutions suivantes. Ce calcul est basé sur les solutions nécessaires pour traiter deux régions du cerveau (c.-à-d. le PFC et le HPC) de 12 souris.

  1. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (aLCR, pH = 7,4) comme mentionné dans le tableau 1. Distribuer 750 μL d’aLCR dans chaque tube de prélèvement (les 48 tubes étiquetés à l’étape 3.1.1) et les placer dans le bloc de température métallique sur de la glace pour prérefroidir le tampon.
  2. Préparez le tampon de lyse comme mentionné dans le tableau 2. Conserver sur de la glace (400 μL à utiliser par échantillon).
  3. Préparer une solution mère BS3 de 52 mM (26x) dans un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0).
    1. Tout d’abord, préparez 100 mM d’acide citrique (stock A) et 100 mM de citrate de sodium (stock B).
    2. Diluer le stock A et le stock B dans un rapport de 1:20 avec de l’eau désionisée. Ajouter 100 μL chacun à 1,9 mL d’eau pour préparer 5 mM d’acide citrique (stock C) et 5 mM de citrate de sodium (stock D), respectivement.
    3. Mélanger 410 μL de C brut et 590 μL de bloc D pour préparer un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0) (solution E, 1 mL).
    4. Confirmer le pH de la solution E à l’aide d’une bandelette indicateur de pH.
    5. Dissoudre 24 mg de BS3 dans 806,4 μL de solution E en tourbillonnant pendant 30 s pour préparer la solution mère de BS3 (26x).
    6. Préparer encore 1 mL de solution E à utiliser comme témoin du véhicule pour les échantillons non réticulants.
      REMARQUE: Préparez la solution mère BS3 lorsque tout le reste est prêt et que l’expérience est sur le point de commencer. Le BS3 doit être conservé desséché à 4 °C jusqu’à utilisation. Une fois reconstitué, BS3 ne reste actif que pendant environ ≤3 h. Comme le pH du tampon de citrate de sodium de 5 mM (solution E) augmente avec le temps, provoquant une hydrolyse accélérée de BS3, il est recommandé de préparer la solution E fraîche à partir des solutions mères A et B9. En raison de la solubilité limitée de BS3 à basse température, conserver le BS3 reconstitué à RT. Utiliser le BS3 reconstitué en 3 h, et ne pas congeler/décongeler ou réutiliser le BS3 reconstitué.

5. Dissection des tissus cérébraux

REMARQUE: À partir de cette étape, au moins deux personnes doivent travailler ensemble de manière coordonnée. Pendant qu’une personne se concentre sur la dissection animale (étapes 5.2-5.10 et étape 6.3), l’autre personne doit travailler comme chronométreur et aider à coordonner l’essai (étape 5.1, étape 6.1, étape 6.2, étape 6.4 et étape 6.5).

  1. Amenez le premier animal à dissection de la zone de logement à la salle de dissection.
    REMARQUE : Comme les facteurs de stress aigus (p. ex. un nouvel environnement, l’odeur du sang) peuvent affecter la dynamique des protéines cérébrales, les animaux doivent être gardés dans leurs cages situées loin de la zone de dissection, puis amenés individuellement dans la salle de dissection pour une décapitation immédiate.
  2. Euthanasier la souris par luxation cervicale suivie d’une décapitation. Retirez rapidement le cerveau du crâne et immergez-le dans du PBS glacé dans une boîte de Pétri pendant 10 à 15 s (Figure 2).
    REMARQUE: Les animaux ne sont pas anesthésiés pour les expériences BS3 car tout agent anesthésique pourrait potentiellement influencer le niveau de présentation de surface des récepteurs des neurotransmetteurs9.
  3. Placez le cerveau refroidi dans la matrice cérébrale sur de la glace, avec la face ventrale du cerveau tournée vers le haut (Figure 3).
  4. Insérez la première lame de rasoir à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif pour couper le cerveau coronalement (Figure 4). À l’aide de trois à quatre lames de rasoir supplémentaires, coupez en série la partie antérieure du cerveau coronalement avec des intervalles de 1 mm.
  5. Soulevez les tranches coronales de la matrice cérébrale en maintenant toutes les lames de rasoir insérées ensemble, laissant la partie postérieure du cerveau dans la matrice cérébrale. Utilisez des pinces pour séparer les lames de rasoir les unes des autres et placez-les sur la surface plane et refroidie, la tranche de cerveau tournée vers le haut (Figure 5).
  6. Identifiez les tranches contenant la région d’intérêt. Pour échantillonner le PFC, choisir les deuxième et troisième tranches postérieures à la première tranche contenant le pédoncule olfactif.
  7. Retirez la région d’intérêt à l’aide d’un poinçon tissulaire (vidéo 1), mettez-la de côté sur la lame de rasoir réfrigérée et divisez uniformément le tissu en deux (p. ex., les tissus de l’hémisphère gauche par rapport à l’hémisphère droit, une moitié devant être utilisée pour la réaction de réticulation BS3 et l’autre moitié pour le contrôle sans réticulation si la protéine cible d’intérêt est exprimée également dans les deux hémisphères).
  8. Habillez chaque tissu en morceaux sur la lame de rasoir à l’aide de la pointe fine de la pince avec de multiples mouvements verticaux contre la lame (Vidéo 2) au lieu d’écraser ou de broyer les mouchoirs. Cela maximisera la surface accessible à BS3 sans compromettre gravement l’intégrité de la membrane des cellules. Immédiatement après le hachage, transférer les tissus hachés dans les tubes appropriés (voir étape 6.3).
  9. Pour prélever le HPC, retirer la partie postérieure du cerveau de la matrice et placer le cerveau sur du papier filtre humidifié sur la surface plane refroidie, la face dorsale tournée vers le haut (Figure 6).
  10. À l’aide d’une sonde incurvée et d’une pince, et en s’approchant du côté dorsal (vidéo 3), disséquez le HPC (moitié dorsale, moitié ventrale ou les deux) des deux hémisphères (une moitié pour la réticulation BS3 et l’autre moitié pour le contrôle). Hacher chaque tissu comme à l’étape 5.8 et transférer le tissu dans les tubes appropriés (voir étape 6.3).
    REMARQUE : Le temps de dissection total pour chaque animal doit être maintenu à ~5 min pour que les conditions expérimentales et les résultats soient cohérents.

6. Réaction de réticulation

  1. Amener l’animal suivant pour la dissection de la zone de logement à la salle de dissection lorsque la dissection du cerveau de la souris précédente est sur le point de se terminer (étape 5.10).
  2. Piquez le tube prérefroidi sur de la glace (à partir de l’étape 4.1) avec 30 μL de solution BS3 (26x) ou de solution E du véhicule juste avant que les tissus hachés ne soient prêts à être transférés dans les tubes appropriés. Changez les embouts de pipette entre les tubes pour vous assurer qu’aucun BS3 n’est contaminé dans les tubes de commande sans réticulation.
  3. Transférer les tissus hachés (à partir des étapes 5.8 et 5.10) dans les tubes appropriés, puis commencer à disséquer l’animal suivant (étape 5.2)
  4. Retourner et mélanger le tube pour séparer les morceaux de tissu en morceaux plus petits (vidéo 4) et commencer à incuber les échantillons sur le rotateur tubulaire en chambre froide pendant 30 minutes à 2 h. Notez l’heure de début de l’incubation BS3 pour chaque tube. Voir la section discussion pour connaître le temps d’incubation optimal.
  5. Éteindre la réaction en ajoutant 78 μL de glycine 1 M au tube et incuber l’échantillon pendant 10 min à 4 °C à rotation constante. Notez l’heure de début et de fin de la trempe pour chaque tube. Continuez d’aider la personne qui se concentre sur la dissection animale en amenant l’animal suivant (étape 6.1) et en aidant à la réticulation (étape 6.2).
    REMARQUE: Traiter chaque échantillon avec exactement le même moment sur tous les échantillons. Si la salle de dissection est éloignée de la chambre froide, il est fortement recommandé de recruter une troisième personne pour participer à l’incubation et à la trempe des échantillons dans la chambre froide.

7. Lyse tissulaire, préparation de protéines et transfert Western

  1. Après 10 min de trempe (étape 6.5), faire tourner les échantillons à 20 000 x g à 4 °C pendant 2 min et jeter le surnageant. Si une tierce personne est disponible, passez à l’étape 7.2; Sinon, congelez les échantillons sur de la glace sèche et suspendez le test ici jusqu’à ce que la dissection cérébrale (section 5) et la réticulation (section 6) de tous les animaux soient terminées.
  2. Ajouter 400 μL de tampon de lyse glacée par tube.
  3. Soniquer les échantillons pendant 1 s cinq fois avec des intervalles de 5 s entre les deux, tout en gardant les échantillons sur la glace.
  4. Faites tourner les échantillons à 20 000 x g pendant 2 minutes pour essorer les débris tissulaires insolubles (pastille) et économiser le surnageant.
  5. Utilisez 5 μL du surnageant pour mesurer la concentration de protéines à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
  6. Diviser le reste du surnageant en deux tubes; un tube contient 100 μL de surnageant pour le transfert Western subséquent, et l’autre tube contient le reste (~300 μL) pour un stockage à long terme à −80 °C. Ajouter une quantité appropriée de 4x tampon d’échantillon SDS (complété par du β2-mercaptoéthanol) aux échantillons et incuber à 70 °C pendant 10 min.
  7. Exécutez 10 à 20 μg de protéines par puits sur un gel d’acrylamide pour l’électrophorèse (SDS-PAGE), puis transférez les protéines dans la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) pour l’analyse par transfert Western.
  8. Bloquer la membrane PVDF dans du lait écrémé à 5 % (p/v) dissous dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBS-T) pendant 1 h à TA.
  9. Lavez brièvement la membrane deux fois avec TBS-T et incuber avec l’anticorps primaire dilué dans TBS-T pendant une nuit à 4 °C.
  10. Laver l’anticorps primaire trois fois pendant 10 minutes chacun dans TBS-T à RT.
  11. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort dilué dans TBS-T pendant 1 h à TA.
  12. Laver l’anticorps secondaire trois fois pendant 10 minutes chacun dans TBS-T à RT.
  13. Incuber la membrane dans un réactif de chimiluminescence amélioré et détecter le signal à l’aide de l’appareil de documentation du gel.

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Representative Results

Pour démontrer la faisabilité du test de réticulation BS3 pour évaluer les niveaux d’α5-GABA A R de surface dans le PFC de souris, nous avons analysé 10 μg chacun des échantillons de protéines réticulées et non réticulées BS3 sur SDS-PAGE et analysé les protéines par transfert Western à l’aide d’un anticorps anti-α5-GABAAR (polyclonal de lapin) (Figure 7). Les échantillons de protéines non réticulées ont donné la quantité totale d’α5-GABA A R à ~55 kDa, tandis que les échantillons de protéines réticulées BS3 ont donné une certaine quantité d’α5-GABA A R associée à l’endomembrane (migrant à ~55 kDa) ainsi que des espèces de protéines de poids moléculaire plus élevé représentant des complexes protéiquesréticulés de manière covalente à α5-GABAAR. Pour la quantification des niveaux de surface α5-GABA A R, nous pouvons évaluer l’étendue de la déplétion de α5-GABAAR à ~55 kDa du pool total lors de la réticulation, car la sous-unité se déplace ensuite vers des positions de poids moléculaire plus élevé. En pratique, les niveaux superficiels d’α5-GABA A R peuvent être calculés en soustrayant la quantité d’α5-GABAAR associée à l’endomembrane (à ~55 kDa dans la voie d’échantillonnage réticulée) des niveaux totaux d’α5-GABAAR (à ~55 kDa dans la voie d’échantillonnage non réticulée).

Nous avons ensuite évalué les effets de l’UCMS (à 3 semaines et 5 semaines) sur la surface et les niveaux totaux d’α5-GABAAR dans le PFC de souris. Dans cette expérience, afin de suivre le cours temporel de la réaction de réticulation, nous avons préparé les échantillons 1 h, 2 h et 3 h après l’ajout de BS3. Étant donné que les réactions de réticulation BS3 semblaient atteindre un plateau à 2 heures, les données au point temporel de 1 h ont été utilisées pour tracer le graphique. Nous avons observé une réduction significative et progressive des niveaux d’α5-GABAAR en surface dans le PFC à 3 semaines et 5 semaines d’UCMS, par rapport aux souris témoins sans stress (Figure 8). Les données ont montré des changements négligeables ou inexistants dans les niveaux de récepteurs totaux dans ces conditions expérimentales, ce qui suggère que le stress chronique a spécifiquement affecté le trafic α5-GABAAR à la surface cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Outils de dissection utilisés dans le test de réticulation BS3. Le papier filtre est humidifié avec du PBS glacé et placé sur la surface plane de la glace bleue. Une boîte de Petri remplie de PBS et conservée à −20 °C 1 jour avant l’essai est placée sur de la glace. La matrice cérébrale et les lames de rasoir sont pré-refroidies sur de la glace. Les ciseaux (un grand, un petit), les pinces (un grand, quelques petits) et un poinçon en tissu sont tous nettoyés avant le test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Cerveau entier de souris disséqué hors du crâne et placé dans du PBS glacé. Immédiatement après que tout le cerveau a été retiré du crâne, il a été immergé dans du PBS glacé pendant 10-15 s dans une boîte de Petri sur de la glace. Cela ralentit le métabolisme cérébral et minimise le trafic et la dégradation des protéines tout en aidant les tissus à devenir plus durs, ce qui facilite le découpage ultérieur du cerveau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Un cerveau de souris placé dans la matrice cérébrale. Le cerveau de souris refroidi immergé dans du PBS glacé a été transféré dans la matrice cérébrale et placé avec le côté ventral tourné vers le haut. Les lames de rasoir et la matrice ont été pré-refroidies sur de la glace. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Coupe coronale d’un cerveau de souris dans la matrice cérébrale. La première lame de rasoir pré-refroidie a été insérée à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif pour commencer à sectionner le cerveau coronallement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Coupes coronales en série d’un cerveau de souris. La partie antérieure du cerveau de la souris a été coupée coronalement en insérant cinq lames de rasoir en série dans la matrice cérébrale (intervalles de 1 mm). Toutes les lames insérées ont été maintenues ensemble, soulevées de la matrice, séparées les unes des autres à l’aide de forceps et placées sur la surface plane refroidie avec la tranche de cerveau tournée vers le haut. (En haut à gauche) Le bulbe olfactif; (au milieu à gauche) la première section; les deuxième sections (en bas à gauche) et troisième (en haut à droite) ont été utilisées pour l’échantillonnage des tissus PFC; (en bas à droite) la quatrième section. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Partie postérieure du cerveau pour disséquer l’hippocampe. Après que la partie antérieure du cerveau ait été coupée coronalement avec des lames de rasoir (à gauche), la partie postérieure du cerveau (au milieu) a été retirée de la matrice cérébrale et placée sur du papier filtre humidifié au PBS sur la surface refroidie (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Réticulation BS3 du GABAAR à la surface de la cellule. En présence de BS3, α5-GABA AR sur la surface de la membrane plasmique est réticulé (XL) avec des protéines anonymes proches de celle-ci, telles que d’autres sous-unités GABA A R au sein de l’assemblage pentamère GABAAR ou des protéines voisines supplémentaires (X), mais pas avec des protéines (Y) éloignées de celui-ci. Ainsi, l’α5-GABAAR apparaît comme une espèce de protéine de haut poids moléculaire (HMW) sur le blot. α5-GABAAR sur l’endosome reste intact et migre à la taille attendue de ~55 kDa. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Niveaux de surface α5-GABAAR affectés par UCMS. Les niveaux totaux et superficiels d’α5-GABAAR dans le PFC de souris dans les conditions sans stress et UCMS (3 semaines et 5 semaines) ont été évalués. Pour suivre le cours temporel de la réaction de réticulation, les échantillons ont été préparés 1 h, 2 h et 3 h après l’ajout de BS3. Des souris femelles (2-3 mois, N = 4/groupe) ont été utilisées. Les niveaux intacts d’α5-GABA A R à 55 kDa pour chaque condition ont d’abord été normalisés par les niveaux d’αTubuline correspondants, puis utilisés pour calculer les niveaux totaux et associésà l’endomembrane α5-GABAAR (à partir des échantillons sans réticulation [No Xlink] et réticulés [Xlink], respectivement). Par la suite, les niveaux de récepteurs de surface ont été calculés en soustrayant la quantité associée à l’endomembrane des niveaux totaux. Étant donné que les réactions de réticulation BS3 semblaient atteindre un plateau à 2 heures, les données au point temporel de 1 h ont été utilisées pour tracer le graphique (moyenne ± SEM). Des effets significatifs du stress chronique sur les niveaux de surface d’α5-GABA A R ont été observés, et cet effet dépendait de la durée de l’UCMS, car une diminutionprogressive des niveaux d’α5-GABAAR en surface a été identifiée tout au long de la période UCMS. *p < 0,05, **p < 0,01 (test de Kruskal-Wallis avec comparaisons multiples de Dunn). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Conc. de travail Solution mère Quantité de solution mère à distribuer
1,2 mM CaCl2  480 mM (400x)* 100 μL
20 mM HEPES 1 M (50x) 800 μL
147 mM NaCl 5 M (34x) 1176,5 μL
2,7 mM KCl 1,08 M (400x) 100 μL
1 mM MgCl2 400 mM (400x) 100 μL
10 mM de glucose 2,5 M (250x) 160 μL
Désionisée 37,563 mL
Total 40 mL
* Le stock de CaCl2 doit être fraîchement préparé le jour de l’expérience.

Tableau 1: Composition du liquide céphalorachidien artificiel.

Conc. de travail Solution mère Quantité de solution mère à distribuer
HEPES 25 mM 1 M (40x) 500 μL
500 mM NaCl 5 M (10x) 2 mL
2 mM d’EDTA 0,5 M (250x) 80 μL
1 mM TNT 1 M (1000x) 20 μL
0,1 % NP-40 10 % (100x) 200 μL
Cocktail d’inhibiteurs de protéase 100x 200 μL
Désionisée 17 mL
Total 20 mL

Tableau 2 : Composition du tampon de lyse

Vidéo 1 : Isoler le PFC à l’aide d’un poinçon tissu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Hacher le PFC à l’aide de forceps. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Dissection du HPC à l’aide d’une sonde incurvée et d’une pince. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Inversion-mélange d’un échantillon de tissu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Bien que l’impact du stress psychosocial chronique sur les comportements (c.-à-d. l’émotivité et les déficits cognitifs) et les changements moléculaires (c.-à-d. l’expression réduite des gènes GABAergiques et les déficits qui l’accompagnent dans la neurotransmission GABAergique) soient bien documentés10, les mécanismes sous-jacents à ces déficits doivent être étudiés plus avant. En particulier, compte tenu de l’étude récente montrant que le stress chronique affecte de manière significative le protéome neuronal par surcharge sur les fonctions RE et, par conséquent, un stress ER élevé15, une question demeure quant à savoir si le stress chronique affecte le trafic de GABA A R à travers la membrane ER et comment letrafic altéré ou les niveaux superficiels de GABAAR pourraient être causalement liés à la psychopathologie.

Le test de réticulation BS3 présenté dans ce protocole servira d’approche puissante pour répondre à certaines de ces questions. Par exemple, UCMS est connu pour provoquer une série de changements de comportement, y compris des déficits cognitifs, un comportement anxieux et des phénotypes anhédoniques, en fonction de la durée de UCMS10. Par conséquent, il serait possible d’étudier l’évolution temporelle et le degré des changements induits par la SMCU dans les niveaux de surface α5-GABAAR en échantillonnant des cerveaux de souris à des moments successifs depuis le début de l’UCMS (par exemple, 1 semaine, 3 semaines, 5 semaines), et il serait également possible de comparer les phénotypes comportementaux observés à chaque point temporel. D’autres sous-types de GABAAR (p. ex. α1, α2) et le récepteur des neuromodulateurs connus pour être affectés par le stress chronique (p. ex. le récepteur TrkB du facteur neurotrophique dérivé du cerveau [BDNF])10 pourraient être testés simultanément à l’aide des mêmes échantillons. Étant donné que certains de ces systèmes et sous-types récepteurs sont impliqués de manière sélective dans des domaines comportementaux spécifiques (par exemple, sédation, anxiété, cognition)11, il convient de corréler les changements de comportement avec le type et le degré de récepteurs affectés par UCMS à chaque point temporel.

Vous trouverez ci-dessous les points critiques à prendre en compte pour plusieurs étapes du protocole. La première étape consiste à déterminer le nombre nécessaire et suffisant d’animaux à utiliser en fonction de la conception expérimentale et de l’analyse de puissance. Par exemple, pour étudier l’effet du stress chronique sur les niveaux de surface des récepteurs GABAA, nous préparons systématiquement un groupe de souris (N = 6 / sexe) à être exposé à UCMS pendant 5 semaines et un autre groupe (N = 6 / sexe) à être maintenu dans des conditions sans stress. Cette taille de groupe (N = 24 au total, y compris les deux sexes) devrait donner suffisamment de puissance statistique pour détecter une différence de ~20% dans les niveaux de récepteurs, permettant ainsi d’évaluer à la fois les effets du stress et les effets sexuels. Notamment, il est rapporté que le stress chronique entraîne des différences dépendantes du sexe dans les résultats comportementaux et moléculaires10. Par exemple, les femmes sont généralement plus sujettes à développer des symptômes dépressifs que les hommes. De manière cohérente, nos études utilisant des cerveaux humains post-mortem et de rongeurs indiquent des niveaux plus élevés de pathologies comportementales et moléculaires chez les sujets féminins; les niveaux de somatostatine (SST), un marqueur moléculaire de la dépression, sont plus robustes chez les femmes parmi les patients déprimés16, et l’augmentation de l’émotivité est plus robuste chez les modèles murins femelles reproduisant des aspects de la pathologie dépressive que chez les hommes15,17. Par conséquent, il est conseillé que tout plan expérimental portant sur les effets du stress chronique sur les résultats psychopathologiques inclue un nombre suffisant d’hommes et de femmes afin d’assurer la puissance statistique dans l’analyse des données et d’identifier les effets possibles dépendants du sexe.

Le temps d’incubation optimal avec BS3 doit être déterminé dans des expériences pilotes pour chaque récepteur à étudier. Il est rapporté que le trafic de récepteurs peut se produire lentement, même à basse température pendant l’incubation de l’échantillon9. Pour capturer des niveaux précis de récepteurs de surface au moment de la dissection cérébrale, il serait idéal de minimiser le temps d’incubation et de choisir le point de temps juste avant que la réaction de réticulation n’atteigne le plateau (30 min à 2 h à 4 °C).

Nous avons remarqué plusieurs limitations opérationnelles associées aux tests de réticulation BS3. (1) Premièrement, en raison de la demi-vie relativement courte (2-3 h) de BS3 causée par l’hydrolyse spontanée dans la plage de pH physiologique, il faut terminer la dissection animale et la réaction de réticulation dans ce laps de temps. Cela nous a amenés à limiter le nombre d’animaux que nous pouvions disséquer à la fois à un maximum de 12. Si l’expérimentateur prévoit de disséquer plus de 12 animaux, il est conseillé de diviser la cohorte expérimentale en plusieurs groupes, chacun contenant moins de 12 animaux. Une fois l’essai pour un groupe terminé, un nouveau lot de BS3 doit être fraîchement préparé pour être utilisé dans les essais de réticulation ultérieurs pour le groupe suivant. Dans le même ordre d’idées, le nombre de régions d’intérêt à disséquer d’un animal devrait être limité. Nous échantillonnons régulièrement deux régions du cerveau (PFC, HPC) pour le test de réticulation, et c’est le nombre maximum de régions cérébrales que nous pouvons disséquer afin d’obtenir des résultats cohérents avec une variabilité minimale entre les échantillons. (2) Deuxièmement, la spécificité des anticorps utilisés dans le transfert Western doit être soigneusement évaluée. La réaction de réticulation chimique BS3 peut avoir un effet inattendu sur l’antigénicité des protéines détectées par chaque anticorps. Nous avons constaté qu’un α5-GABAUnR (spécifié dans le Tableau des matériaux) a détecté par erreur une forte bande ~50 kDa spécifiquement dans des échantillons réticulés BS3, indépendamment de la présence ou de l’absence de α5-GABAUnProtéine R dans l’échantillon; cette bande ~50 kDa a été observée même dans des échantillons de tissus d’α5-GABAUnSouris knockout R, suggérant que cet anticorps a commencé à réagir de manière croisée avec des antigènes non pertinents générés accidentellement par la réaction de réticulation BS3. Il est conseillé de déterminer minutieusement la spécificité de l’anticorps avec et sans réactions de réticulation BS3, idéalement à l’aide d’échantillons de tissu knockout, si disponibles, pour une protéine d’intérêt donnée. (3) Le protocole actuel décrit ici ne traite pas des types de cellules dans lesquels chaque GABAUnLe sous-type R est exprimé (p. ex., neurones et astrocytes). Pour certains GABAUnSous-types R (p. ex. α1, α5) qui sont principalement exprimés dans les neurones18, les données d’essai de réticulation obtenues à l’aide de tissus cérébraux en vrac, telles que décrites dans le présent protocole, devraient fournir des informations reflétant les niveaux de surface neuronale. Cependant, pour d’autres GABAUnSous-types R (p. ex., α2) fortement exprimés dans les neurones et les astrocytes18, il est intéressant d’étudier séparément les niveaux de surface des récepteurs dans les neurones par rapport aux astrocytes. À cette fin, le tri cellulaire conventionnel (p. ex., tri cellulaire activé par fluorescence [FACS]19) peut être intégré dans le protocole de réticulation BS3; l’étape de dissociation cellulaire pour le tri cellulaire peut être effectuée après l’étape de trempe BS3, mais il faut valider que toutes les procédures et conditions pour FACS (par exemple, les tampons à utiliser, la température, le temps d’incubation) sont compatibles avec celles du test de réticulation. En outre, l’approche FACS ne peut être utilisée que pour le GABAUnSous-types R connus pour être localisés dans le compartiment cellulaire périsomatique (p. ex., α2), mais pas pour les sous-types enrichis en dendrites distales (p. ex. α5)18, parce que les compartiments cellulaires périphériques ou distaux sont probablement perdus au cours de l’étape de dissociation cellulaire étendue nécessaire au tri cellulaire. (4) Enfin, nous avons constaté que les résultats étaient plus cohérents lorsque nous avons calculé les niveaux de récepteurs de surface en soustrayant la quantité de récepteurs associés à l’endomembrane de la quantité totale de récepteurs plutôt que d’évaluer directement les niveaux de surface en fonction de la densitométrie des espèces de protéines de haut poids moléculaire. Cela est probablement dû au fait que l’efficacité de transfert de ces espèces de protéines de poids moléculaire élevé sur la membrane PVDF est plus variable que celle de la protéine intacte originale d’une taille plus petite (par exemple, ~55 kDa pour α5-GABAUnR). Il est donc recommandé de suivre la méthode décrite dans la section des résultats et la légende de Graphique 8 pour calculer les niveaux de récepteurs de surface.

Outre les effets du stress chronique sur GABAAR, le test de réticulation BS3 peut également être appliqué à des souris génétiquement modifiées ou à des modèles de rongeurs avec des manipulations expérimentales pour étudier un certain nombre de conditions neurologiques ou neuropsychiatriques. Ce test a été utilisé avec succès pour capturer les effets induits par la cocaïne sur l’expression de surface des récepteurs du glutamate dans le noyau accumbens du cerveau de rat20,21. Le test a également été utilisé pour montrer une expression de surface réduite de α5-GABAAR dans le PFC de souris hétérozygotes BDNFknockout 22. Dans une autre étude antérieure, dans le modèle de l’encéphalopathie hépatique chez le rat, les déficits d’apprentissage spatial qui les accompagnaient étaient causalement liés à une altération de l’expression superficielle des récepteurs du glutamate et du GABAA sur la base de ce test de réticulation23. En résumé, le test de réticulation chimique BS3 fournit un outil polyvalent pour capturer les changements spécifiques à la région du cerveau et dépendants du contexte dans une gamme de systèmes récepteurs dans le cerveau, ainsi que dans pratiquement tous les autres tissus ou organes périphériques. Ce test peut également être mené en parallèle avec d’autres méthodes d’évaluation des niveaux de récepteurs de surface, telles que l’enregistrement électrophysiologique de l’inhibition tonique (en particulier dans le cas de α5-GABAAR), la microscopie électronique cryogénique et la biotinylation de surface, pour comparer et valider les résultats.

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Disclosures

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le personnel de l’animalerie de CAMH d’avoir pris soin des animaux pendant toute la durée de l’étude. Ces travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC Project Grant #470458 à T.T.), le Fonds de découverte du CAMH (à T.P.), la National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD award #25637 à E.S.) et le Campbell Family Mental Health Research Institute (à E.S.). E.S. est le fondateur de Damona Pharmaceuticals, une société biopharmaceutique dédiée à l’introduction de nouveaux composés GABAergiques à la clinique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
1 M HEPES Gibco 15630080
10x TBS Bio-Rad 1706435
2.5 M (45%, w/v) Glucose Sigma G8769
2-mercaptoethanol Sigma M3148
4x SDS sample buffer (Laemmli) Bio-Rad 1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) Pierce A39266 No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrix Ted Pella 15003 For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C4901
Curved probe Fine Science Tools 10088-15 Gross Anatomy Probe; angled 45
Deionized water milli-Q EQ 7000 Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001
Filter paper (3MM) Whatman 3030-917
Forceps (large) Fine Science Tools 11152-10 Extra Fine Graefe Forceps
Forceps (small) Fine Science Tools 11251-10 Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibody Invitrogen PA5-31163 Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody R&D Systems PPS027 Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat
Glycine Sigma W328707
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Bio-Rad 1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma M2670
Nonidet-P40, substitute (NP-40) SantaCruz 68412-54-4
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
PVDF membrane Bio-Rad 1620177
Scissors (large) Fine Science Tools 14007-14 Surgical Scissors - Serrated
Scissors (small) Fine Science Tools 14060-09 Fine Scissors - Sharp
Sodium chloride (NaCl) Sigma S9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)  Qsonica 15338284
Table-top refregerated centrifuge Eppendorf 5425R
Tissue punch (ID 1 mm) Ted Pella 15110-10 Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer Bio-Rad 10026938
Tube rotator (LabRoller) Labnet H5000

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References

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Neurosciences numéro 195 réticulant chimique BS3 stress chronique cognition sous-unité α5 du récepteur GABAA expression de surface
BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABA<sub>A</sub> dans le cerveau des rongeurs
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Sumitomo, A., Zhou, R., Prevot, T., Sibille, E., Tomoda, T. BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (195), e65063, doi:10.3791/65063 (2023).

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