Summary
बीएस 3 रासायनिक क्रॉसलिंकिंग परख पुरानी मनोसामाजिक तनाव स्थितियों के तहत माउस दिमाग में कम सेल सतह जीएबीएए रिसेप्टर अभिव्यक्ति का खुलासा करती है।
Abstract
चिंता भावनाओं की एक स्थिति है जो संज्ञानात्मक कार्यों सहित जानवरों के व्यवहार को प्रभावित करती है। चिंता के व्यवहार संबंधी संकेत जानवरों के साम्राज्य में देखे जाते हैं और तनाव के तौर-तरीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूली या दुर्भावनापूर्ण प्रतिक्रियाओं के रूप में पहचाने जा सकते हैं। कृंतक आणविक, सेलुलर और सर्किट स्तरों पर चिंता के एकीकृत तंत्र को संबोधित करने वाले ट्रांसलेशनल अध्ययनों के लिए एक सिद्ध प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, क्रोनिक मनोसामाजिक तनाव प्रतिमान चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे व्यवहार फेनोटाइप की नकल करते हुए दुर्भावनापूर्ण प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करता है जो मनुष्यों और कृन्तकों के बीच अनुरूप होते हैं। जबकि पिछले अध्ययन मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री पर पुराने तनाव के महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाते हैं, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर स्तरों पर तनाव का प्रभाव कम अध्ययन किया जाता है। इस लेख में, हम क्रोनिक तनाव के तहत चूहों में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के न्यूरोनल सतह के स्तर को मात्रात्मक करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि प्रस्तुत करते हैं, विशेष रूप से गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो भावना और अनुभूति के नियमन में फंसे हुए हैं। झिल्ली-अभेद्य अपरिवर्तनीय रासायनिक क्रॉसलिंकर, बिस्सल्फोसुसिनिमिडिल सबरेट (बीएस 3) का उपयोग करते हुए, हम दिखाते हैं कि क्रोनिक तनाव प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में जीएबीएए रिसेप्टर्स की सतह की उपलब्धता को काफी कम कर देता है। जीएबीएए रिसेप्टर्स के न्यूरोनल सतह स्तर जीएबीए न्यूरोट्रांसमिशन के लिए दर-सीमित प्रक्रिया हैं और इसलिए, प्रयोगात्मक पशु मॉडल में चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे फेनोटाइप की डिग्री के आणविक मार्कर या प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किया जा सकता है। यह क्रॉसलिंकिंग दृष्टिकोण किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में व्यक्त न्यूरोट्रांसमीटर या न्यूरोमोड्यूलेटर के लिए विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर सिस्टम पर लागू होता है और भावना और अनुभूति के अंतर्निहित तंत्र की गहरी समझ में योगदान करने की उम्मीद है।
Introduction
न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स को या तो न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली की सतह पर या एंडोमेम्ब्रेन (जैसे, एंडोसोम, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम [ईआर], या ट्रांस-गोल्गी तंत्र) पर इंट्रासेल्युलर रूप से स्थानीयकृत किया जाता है और न्यूरॉन्स में आंतरिक शारीरिक अवस्थाओं के आधार पर या बाह्य तंत्रिकानेटवर्क गतिविधियों के जवाब में इन दो डिब्बों के बीच गतिशील रूप से शटल किया जाता है।. चूंकि नए स्रावित न्यूरोट्रांसमीटर मुख्य रूप से रिसेप्टर्स के सतह-स्थानीयकृत पूल के माध्यम से अपने शारीरिक कार्यों को प्राप्त करते हैं, इसलिए किसी दिए गए न्यूरोट्रांसमीटर के लिए सतह रिसेप्टर स्तर तंत्रिका सर्किट3 के भीतर इसकी सिग्नलिंग क्षमता के महत्वपूर्ण निर्धारकों में से एक हैं।
सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में सतह रिसेप्टर स्तरों की निगरानी के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें सतह बायोटिनाइलेशन परख4, गैर-परमेबिलाइज्ड स्थितियों में एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख5, या पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल संकेतक (जैसे, पीएचलुओरिन) 6 के साथ आनुवंशिक रूप से जुड़े रिसेप्टर ट्रांसजेन का उपयोग शामिल है। इसके विपरीत, विवो में सतह रिसेप्टर स्तरों का आकलन करते समय ये दृष्टिकोण या तो सीमित या अव्यावहारिक होते हैं। उदाहरण के लिए, सतह बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया विवो मस्तिष्क के ऊतकों में बड़ी मात्रा और नमूना संख्या को संसाधित करने के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है क्योंकि इसकी अपेक्षाकृत उच्च कीमत और एविडिन-संयुग्मित मोतियों पर बायोटिनीलेटेड प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आवश्यक बाद के कदम हैं। त्रि-आयामी मस्तिष्क वास्तुकला में एम्बेडेड न्यूरॉन्स के लिए, कम एंटीबॉडी पहुंच या माइक्रोस्कोप-आधारित परिमाणीकरण में कठिनाइयां विवो में सतह रिसेप्टर स्तरों का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा पैदा कर सकती हैं। बरकरार दिमाग में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के वितरण की कल्पना करने के लिए, गैर-इनवेसिव तरीकों, जैसे कि पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी, का उपयोग रिसेप्टर अधिभोग को मापने और सतह रिसेप्टर स्तर7 का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण गंभीर रूप से विशिष्ट रेडियो लिगेंड, महंगे उपकरण और विशेष विशेषज्ञता की उपलब्धता पर निर्भर करता है, जिससे यह अधिकांश शोधकर्ताओं द्वारा नियमित उपयोग के लिए कम सुलभ हो जाता है।
यहां, हम प्रयोगात्मक पशु दिमाग में सतह रिसेप्टर के स्तर को मापने के लिए एक सरल, बहुमुखी विधि का वर्णन करते हैं, जो पानी में घुलनशील, झिल्ली-अभेद्य रासायनिक क्रॉसलिंकर, बीआईएस (सल्फोसुसिनिमिडिल) सबरेट (बीएस 3) 8,9 का उपयोग करके विवो है। बीएस 3 लाइसिन अवशेषों की साइड चेन में प्राथमिक अमाइन को लक्षित करता है और एक दूसरे के करीब के क्षेत्र में प्रोटीन को सहसंयोजक रूप से क्रॉसलिंक कर सकता है। जब मस्तिष्क के स्लाइस को रुचि के क्षेत्र से ताजा तैयार किया जाता है और बीएस 3 युक्त बफर में इनक्यूबेट किया जाता है, तो सेल सतह रिसेप्टर्स पड़ोसी प्रोटीन के साथ क्रॉसलिंक होते हैं और इस प्रकार, उच्च-आणविक भार प्रजातियों में बदल जाते हैं, जबकि इंट्रासेल्युलर एंडोमेम्ब्रेन से जुड़े रिसेप्टर्स अपरिवर्तित रहते हैं। इसलिए, सतह और इंट्रासेल्युलर रिसेप्टर पूल को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया जा सकता है और अध्ययन किए जाने वाले रिसेप्टर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा मात्रात्मक किया जा सकता है।
अप्रत्याशित क्रोनिक हल्के तनाव (यूसीएमएस) कृन्तकों में पुरानी मनोसामाजिक तनाव को प्रेरित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक प्रतिमानहै। यूसीएमएस जीएबीए और इसके रिसेप्टर्स10,11 सहित न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम की एक सरणी के मॉड्यूलेशन के माध्यम से चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे व्यवहार फेनोटाइप और संज्ञानात्मक घाटे को प्राप्त करता है। विशेष रूप से, ए 5 सबयूनिट युक्त जीएबीए ए रिसेप्टर (ए 5-जीएबीएएआर) को स्मृति और संज्ञानात्मक कार्यों12,13 के विनियमन में फंसाया गया है, जो यूसीएमएस-प्रेरित संज्ञानात्मक घाटे में इस सबयूनिट के परिवर्तित कार्यों की संभावित भागीदारी का सुझाव देता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने गैर-तनावग्रस्त नियंत्रण चूहों की तुलना में यूसीएमएस के संपर्क में आने वाले चूहों के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में सतह-व्यक्त अल्फा 5-जीएबीएएआर के स्तर को मात्रात्मक करने के लिए बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख का उपयोग किया।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी जानवरों के काम ओंटारियो एनिमल्स फॉर रिसर्च एक्ट (आरएसओ 1990, अध्याय ए.22) और कैनेडियन काउंसिल ऑन एनिमल केयर (सीसीएसी) के अनुसार पूरा किया गया था और संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. जानवरों की तैयारी
- प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या निर्धारित करें, और उन्हें उपयुक्त समूहों या प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित करें। समूह के आकार, लिंग और सांख्यिकीय शक्ति की चर्चा के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
नोट: यह प्रोटोकॉल चूहों के लिए अनुकूलित है (सी 57बीएल 6 / जे स्ट्रेन; 2-4 महीने की उम्र; आमतौर पर 20-30 ग्राम शरीर का वजन; उपयोग किए जाने वाले पुरुषों और महिलाओं की बराबर संख्या)। - जानवरों को यूसीएमएस के तहत रखेंया 5-8 सप्ताह के लिए गैर-तनावग्रस्त स्थितियों को नियंत्रित करें, जैसा कि पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन किया गया है।
- अंतिम यूसीएमएस प्रक्रिया के बाद, जानवरों को रिसेप्टर अभिव्यक्ति पर तीव्र तनाव प्रभाव से बचने के लिए क्रॉसलिंकिंग परख के लिए उपयोग करने से पहले 1 दिन के लिए अपने घर के पिंजरों में रहने की अनुमति दें।
2. स्टॉक समाधान की तैयारी
- परख से पहले दिए गए निर्देशों के अनुसार निम्नलिखित समाधान तैयार करें और संग्रहीत करें।
- 40 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 14.6 ग्राम एनएसीएल को घोलकर 5 एम एनएसीएल तैयार करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें।
- 40 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 3.22 ग्राम केसीएल घोलकर 1.08 एम केसीएल तैयार करें। आरटी पर स्टोर करें।
- 40 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 3.25 ग्राम MgCl 2.6H2 O घोलकर 400 mM MgCl2 तैयार करें। आरटी पर स्टोर करें।
- 40 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 3 ग्राम ग्लाइसिन घोलकर 1 एम ग्लाइसिन तैयार करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 1.54 ग्राम डीटीटी को घोलकर 1 एम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) तैयार करें। इसे 0.2 μm के छिद्र आकार के साथ एक फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, और 2 एमएल ट्यूबों में एलिकोट करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- विआयनीकृत पानी में 1:10 (v/v) के अनुपात में पतला करके 10% Nonidet-P40 (NP-40) तैयार करें। आरटी पर स्टोर करें।
- 0.5 एम ईडीटीए (पीएच = 8.0) तैयार करें, और आरटी पर स्टोर करें।
- 1 एम एचईपीईएस बफर (पीएच = 7.2-7.5) तैयार करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 2.5 M या 45% (w / v) ग्लूकोज तैयार करें, और 4 °C पर स्टोर करें।
3. वर्कस्टेशन की तैयारी
- बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख के दिन, पशु विच्छेदन कक्ष (चित्रा 1) में निम्नलिखित सामग्रियों को इकट्ठा करें, जिसमें बर्फ पर कई आइटम पहले से ठंडे हैं: एक बर्फ की बाल्टी, एक धातु तापमान ब्लॉक (बर्फ पर पूर्व-ठंडा), 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ-ठंडा पीबीएस और पेट्री डिश में जमे हुए पीबीएस, पीबीएस के साथ गीला फिल्टर पेपर और एक ठंडी सपाट सतह या नीली बर्फ पर रखा गया है, एक मस्तिष्क मैट्रिक्स (रेजर ब्लेड सम्मिलन के लिए 1 मिमी अंतराल) बर्फ पर पूर्व-ठंडा किया जाता है, रेजर ब्लेड (~ 10) बर्फ पर पूर्व-ठंडा किया जाता है, विच्छेदन उपकरण (कैंची, बल, एक घुमावदार जांच), एक ऊतक पंच, 70% इथेनॉल स्प्रे पोंछने वाला कागज और पेपर तौलिए, पिपेट टिप्स (200 μL), एक पिपेटर (P200), एक स्टॉपवॉच, एक मेमो पैड, एक पेन और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (1.5 एमएल)।
- परख से पहले, नमूना जानकारी के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें (जैसे, पशु आईडी नंबर, उपचार प्रकार [यूसीएमएस बनाम कोई तनाव (एनएस)], मस्तिष्क क्षेत्र, बीएस 3 के साथ या बिना, आदि)।
नोट: बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख के लिए, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र से दो नमूने एकत्र किए जाने चाहिए; एक नमूना क्रॉसलिंकिंग (बीएस 3 के साथ) और दूसरे का उपयोग नियंत्रण के रूप में गैर-क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया (बीएस 3 के बिना) के लिए किया जाएगा। इसलिए, 12 चूहों में दो मस्तिष्क क्षेत्रों (यानी, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स [पीएफसी] और हिप्पोकैम्पस [एचपीसी]) से नमूना लेने के लिए, प्रारंभिक नमूने के लिए 48 ट्यूबों × लेबल करें (= 2 नमूने 2 क्षेत्रों × 12 चूहों) (खंड 6 में उपयोग किया जाना है)। बाद के भंडारण के लिए 48 ट्यूबों के एक अतिरिक्त दो सेट लेबल करें (प्रत्येक नमूने के दो अलग-अलग संस्करणों [100 μL, 300 μL] को संग्रहीत करने के लिए) (अनुभाग 7 में उपयोग किया जा सकता है)। इस प्रकार, इस कॉहोर्ट आकार के लिए कुल 144 ट्यूबों को लेबल करना आवश्यक है।
- परख से पहले, नमूना जानकारी के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें (जैसे, पशु आईडी नंबर, उपचार प्रकार [यूसीएमएस बनाम कोई तनाव (एनएस)], मस्तिष्क क्षेत्र, बीएस 3 के साथ या बिना, आदि)।
- इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला में निम्नलिखित उपकरण उपलब्ध हैं: एक टेबल-टॉप प्रशीतित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज, एक सोनिकेटर, एक ट्यूब रोटेटर (ठंडे कमरे में या रेफ्रिजरेटर के अंदर [4 डिग्री सेल्सियस]), नमूने संग्रहीत करने के लिए एक फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस), और नमूनों के अस्थायी भंडारण के लिए सूखी बर्फ की एक बाल्टी (धारा 7 में उपयोग किया जाना है)।
4. काम करने वाले समाधान और बफर की तैयारी
नोट: परख की सुबह, निम्नलिखित समाधान तैयार करें। यह गणना 12 चूहों से दो मस्तिष्क क्षेत्रों (यानी, पीएफसी और एचपीसी) को संसाधित करने के लिए आवश्यक समाधानों पर आधारित है।
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ, पीएच = 7.4) तैयार करें जैसा कि तालिका 1 में बताया गया है। प्रत्येक नमूना ट्यूब (चरण 3.1.1 में लेबल किए गए 48 ट्यूब) में एसीएसएफ के 750 μL वितरित करें, और उन्हें बफर को पूर्व-ठंडा करने के लिए बर्फ पर धातु के तापमान ब्लॉक में रखें।
- तालिका 2 में उल्लिखित लाइसिस बफर तैयार करें। बर्फ पर स्टोर करें (प्रति नमूना उपयोग करने के लिए 400 μL)।
- 5 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर (पीएच = 5.0) में 52 एमएम बीएस 3 स्टॉक समाधान (26 x) तैयार करें।
- सबसे पहले, 100 एमएम साइट्रिक एसिड (स्टॉक ए) और 100 एमएम सोडियम साइट्रेट (स्टॉक बी) तैयार करें।
- विआयनीकृत पानी के साथ स्टॉक ए और स्टॉक बी को 1: 20 के अनुपात में पतला करें। क्रमशः 5 एमएम साइट्रिक एसिड (स्टॉक सी) और 5 एमएम सोडियम साइट्रेट (स्टॉक डी) तैयार करने के लिए 1.9 एमएल पानी में 100 μL जोड़ें।
- 5 mM सोडियम साइट्रेट बफर (pH = 5.0) (समाधान E, 1 mL) तैयार करने के लिए स्टॉक C के 410 μL और स्टॉक D के 590 μL को मिलाएं।
- पीएच संकेतक पट्टी का उपयोग करके समाधान ई के पीएच की पुष्टि करें।
- बीएस 3 स्टॉक समाधान (26x) तैयार करने के लिए 30 सेकंड के लिए भंवर द्वारा घोल E के 806.4 μL में बीएस 3 के 24 मिलीग्राम घोलें।
- गैर-क्रॉसलिंकिंग नमूनों के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए समाधान ई का एक और 1 एमएल तैयार करें।
नोट: बीएस 3 स्टॉक समाधान तैयार करें जब बाकी सब कुछ तैयार हो और प्रयोग शुरू होने वाला हो। उपयोग तक बीएस 3 को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। एक बार पुनर्गठित होने के बाद, बीएस 3 केवल लगभग ≤3 घंटे तक सक्रिय रहता है। चूंकि 5 एमएम सोडियम साइट्रेट बफर (समाधान ई) का पीएच समय के साथ बढ़ने की सूचना है, जिससे त्वरित बीएस 3 हाइड्रोलिसिस होता है, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि समाधान ई स्टॉक समाधान ए और बी9 से ताजा तैयार किया जाए। कम तापमान पर बीएस 3 की सीमित घुलनशीलता के कारण, पुनर्गठित बीएस 3 को आरटी पर रखें। पुनर्गठित बीएस 3 का उपयोग 3 घंटे में करें, और पुनर्गठित बीएस 3 को फ्रीज / पिघलाएं या पुन: उपयोग न करें।
5. मस्तिष्क के ऊतकों का विच्छेदन
नोट: इस कदम से, कम से कम दो लोगों को समन्वित तरीके से एक साथ काम करना चाहिए। जबकि एक व्यक्ति पशु विच्छेदन (चरण 5.2-5.10 और चरण 6.3) पर केंद्रित है, दूसरे व्यक्ति को टाइमकीपर के रूप में काम करना चाहिए और परख (चरण 5.1, चरण 6.1, चरण 6.2, चरण 6.4, और चरण 6.5) के समन्वय में मदद करनी चाहिए।
- आवास क्षेत्र से विच्छेदन कक्ष में विच्छेदन के लिए पहला जानवर लाएं।
नोट: चूंकि तीव्र तनाव (जैसे, एक नया वातावरण, रक्त की गंध) मस्तिष्क प्रोटीन गतिशीलता को प्रभावित कर सकता है, जानवरों को विच्छेदन क्षेत्र से दूर रखे गए उनके घर के पिंजरों में रखा जाना चाहिए और फिर तत्काल विच्छेदन के लिए विच्छेदन कक्ष में व्यक्तिगत रूप से लाया जाना चाहिए। - गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें और उसके बाद डिकैपिटेशन करें। खोपड़ी से मस्तिष्क को तेजी से बाहर निकालें, और इसे 10-15 सेकंड के लिए पेट्री डिश में बर्फ-ठंडे पीबीएस में डुबोएं (चित्रा 2)।
नोट: जानवरों को बीएस 3 प्रयोगों के लिए एनेस्थेटाइज्ड नहीं किया जाता है क्योंकि कोई भी एनेस्थेटिक एजेंट संभावित रूप से न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स9 की सतह प्रस्तुति स्तर को प्रभावित कर सकता है। - ठंडा मस्तिष्क को बर्फ पर मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखें, जिसमें मस्तिष्क का उदर पक्ष ऊपर की ओर है (चित्रा 3)।
- मस्तिष्क को कोरोनल रूप से काटने के लिए घ्राण बल्ब और घ्राण पेडुनकल के बीच की सीमा के माध्यम से पहला रेजर ब्लेड डालें (चित्रा 4)। तीन से चार अतिरिक्त रेजर ब्लेड का उपयोग करके, मस्तिष्क के पूर्ववर्ती भाग को 1 मिमी अंतराल के साथ कोरोनल रूप से काट दें।
- सभी सम्मिलित रेजर ब्लेड को एक साथ पकड़कर मस्तिष्क मैट्रिक्स से कोरोनल स्लाइस उठाएं, मस्तिष्क मैट्रिक्स में मस्तिष्क के पीछे के हिस्से को पीछे छोड़ दें। रेजर ब्लेड को एक दूसरे से अलग करने के लिए बल का उपयोग करें, और उन्हें सपाट, ठंडी सतह पर रखें, जिसमें मस्तिष्क का टुकड़ा ऊपर की ओर हो (चित्रा 5)।
- रुचि के क्षेत्र वाले स्लाइस की पहचान करें। पीएफसी के नमूने के लिए, घ्राण पेडुनकल युक्त पहले स्लाइस के पीछे दूसरे और तीसरे स्लाइस चुनें।
- ऊतक पंच (वीडियो 1) का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र को हटा दें, इसे ठंडा रेजर ब्लेड पर एक तरफ रखें, और समान रूप से ऊतक को दो में विभाजित करें (उदाहरण के लिए, बाएं बनाम दाएं गोलार्ध के ऊतक, जिसमें से एक आधे का उपयोग बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है और दूसरा आधा नो-क्रॉसलिंकिंग नियंत्रण के लिए होता है यदि रुचि का लक्ष्य प्रोटीन दोनों गोलार्धों में समान रूप से व्यक्त किया जाता है)।
- ऊतकों को मैश करने या पीसने के बजाय ब्लेड के खिलाफ कई ऊर्ध्वाधर गतियों के साथ बल की बारीक नोक का उपयोग करके रेजर ब्लेड पर प्रत्येक ऊतक को टुकड़ों में काट लें (वीडियो 2)। यह कोशिकाओं की झिल्ली अखंडता से गंभीर रूप से समझौता किए बिना बीएस 3 के लिए सुलभ सतह क्षेत्र को अधिकतम करेगा। मालिश करने के तुरंत बाद, कीमा ऊतकों को उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें (चरण 6.3 देखें)।
- एचपीसी के नमूने के लिए, मस्तिष्क के पीछे के हिस्से को मैट्रिक्स से बाहर निकालें, और मस्तिष्क को ठंडी सपाट सतह पर नम फिल्टर पेपर पर रखें, जिसमें पृष्ठीय पक्ष ऊपर की ओर है (चित्रा 6)।
- एक घुमावदार जांच और बल का उपयोग करके, और पृष्ठीय पक्ष (वीडियो 3) से आते हुए, दोनों गोलार्धों से एचपीसी (पृष्ठीय आधा, उदर आधा, या दोनों) को विच्छेदित करें (एक आधा बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग के लिए और दूसरा आधा नियंत्रण के लिए)। चरण 5.8 में प्रत्येक ऊतक को कीमा करें, और ऊतक को उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें (चरण 6.3 देखें)।
नोट: प्रयोगात्मक स्थितियों और परिणामों के सुसंगत होने के लिए प्रत्येक जानवर के लिए संपूर्ण विच्छेदन समय ~ 5 मिनट रखा जाना चाहिए।
6. क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया
- अगले जानवर को आवास क्षेत्र से विच्छेदन कक्ष में लाएं जब पिछले माउस के मस्तिष्क का विच्छेदन समाप्त होने वाला हो (चरण 5.10)।
- ट्यूब को बर्फ पर प्री-चिल्ड (चरण 4.1 से) बीएस 3 समाधान (26x) या वाहन समाधान E के 30 μL के साथ स्पाइक करें, इससे पहले कि कीमा किए गए ऊतक उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित होने के लिए तैयार हों। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों के बीच में पाइप टिप्स बदलें कि नो-क्रॉसलिंकिंग कंट्रोल ट्यूबों में कोई बीएस 3 दूषित नहीं है।
- कीमा ऊतकों (चरण 5.8 और चरण 5.10 से) को उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और फिर अगले जानवर (चरण 5.2) को विच्छेदित करना शुरू करें।
- ऊतक के टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में तोड़ने के लिए ट्यूब को इनवर्ट और मिक्स करें (वीडियो 4), और 30 मिनट से 2 घंटे के लिए ठंडे कमरे में घूमने वाले ट्यूब रोटेटर पर नमूने को इंजेक्ट करना शुरू करें। प्रत्येक ट्यूब के लिए बीएस 3 इनक्यूबेशन के प्रारंभ समय को रिकॉर्ड करें। इष्टतम इनक्यूबेशन समय के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
- ट्यूब को 1 एम ग्लाइसिन के 78 μL के साथ स्पाइक करके प्रतिक्रिया को बुझाएं, और लगातार रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को आगे बढ़ाएं। प्रत्येक ट्यूब के लिए शमन के प्रारंभ और समाप्ति समय को रिकॉर्ड करें। अगले जानवर (चरण 6.1) को लाकर और क्रॉसलिंकिंग (चरण 6.2) के साथ मदद करके पशु विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित करने वाले व्यक्ति की सहायता करना जारी रखें।
नोट: सभी नमूनों में प्रत्येक नमूने को ठीक उसी समय के साथ इलाज करें। यदि विच्छेदन कक्ष ठंडे कमरे से बहुत दूर है, तो यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि ठंडे कमरे में नमूना इनक्यूबेशन और शमन में भाग लेने के लिए एक तीसरे व्यक्ति को भर्ती किया जाए।
7. ऊतक लाइसिस, प्रोटीन तैयार करना, और पश्चिमी धब्बा
- शमन के 10 मिनट (चरण 6.5) के बाद, नमूने को 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 x g पर घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। यदि कोई तीसरा व्यक्ति उपलब्ध है, तो चरण 7.2 पर आगे बढ़ें; अन्यथा, सूखी बर्फ पर नमूनों को स्नैप-फ्रीज करें, और सभी जानवरों के लिए मस्तिष्क विच्छेदन (धारा 5) और क्रॉसलिंकिंग (धारा 6) पूरा होने तक परख को यहां रोक दें।
- प्रति ट्यूब बर्फ-ठंडा लाइसिस बफर के 400 μL जोड़ें।
- नमूने को बर्फ पर रखते हुए, बीच में 5 सेकंड के अंतराल के साथ 1 सेकंड के लिए पांच बार सोनिकेट करें।
- अघुलनशील ऊतक मलबे (पेलेट) को बाहर निकालने और सतह पर तैरने वाले को बचाने के लिए 2 मिनट के लिए 20,000 x g पर स्पिन नमूने।
- बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए सतह पर तैरनेवाला के 5 μL का उपयोग करें।
- बाकी सुपरनैटेंट को दो ट्यूबों में विभाजित करें; एक ट्यूब में बाद के पश्चिमी धब्बे के लिए 100 μL सतह पर तैरनेवाला होता है, और दूसरी ट्यूब में -80 °C पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए शेष (~ 300 μL) होता है। नमूनों में 4x SDS नमूना बफर (2-मर्कैप्टोइथेनॉल के साथ पूरक) की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) के लिए एक एक्रिलामाइड जेल पर प्रति अच्छी तरह से प्रोटीन के 10-20 μg चलाएं, और फिर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रोटीन को पॉलीविनाइलडिडेन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
- पीवीडीएफ झिल्ली को 5% (डब्ल्यू /वी) स्किम दूध में घोलकर 0.1% ट्वीन-20 (टीबीएस-टी) युक्त ट्रिस-बफर्ड सलाइन में आरटी पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध करें।
- संक्षेप में टीबीएस-टी के साथ झिल्ली को दो बार धोएं, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर टीबीएस-टी में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
- आरटी पर टीबीएस-टी में प्रत्येक में 10 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को तीन बार धोएं।
- आरटी पर 1 घंटे के लिए टीबीएस-टी में पतला हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
- आरटी पर टीबीएस-टी में प्रत्येक में 10 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी को तीन बार धोएं।
- एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस अभिकर्मक में झिल्ली को इनक्यूबेट करें, और जेल-प्रलेखन तंत्र का उपयोग करके सिग्नल का पता लगाएं।
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Representative Results
माउस पीएफसी में सतह अल्फा5-जीएबीए एआर स्तरों के मूल्यांकन के लिए बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख कीव्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए, हमने एसडीएस-पेज पर बीएस 3-क्रॉसलिंक्ड और गैर-क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन नमूनों में से प्रत्येक को 10 μg चलाया और एंटी-5-जीएबीएएआरएंटीबॉडी (खरगोश पॉलीक्लोनल) का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन का विश्लेषण किया (चित्रा 7)। गैर-क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन नमूनों ने ~ 55 केडीए पर अल्फा 5-जीएबीएएआरकी कुल मात्रा दी, जबकि बीएस 3-क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन नमूनों ने एंडोमेम्ब्रेन से जुड़े अल्फा 5-जीएबीएएआर (~ 55 केडीए पर माइग्रेन) की एक निश्चित मात्रा दी, साथ ही उच्च-आणविक भार प्रोटीन प्रजातियों के साथ प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का प्रतिनिधित्व किया। सतह के अल्फा5-जीएबीए ए आर स्तरों की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए, हम क्रॉसलिंकिंग पर कुल पूल से ~ 55केडीए पर ए5-जीएबीएएआर की कमी की सीमा का आकलन कर सकते हैं, क्योंकि सबयूनिट तब उच्च-आणविक भार की स्थिति में बदल जाता है। व्यावहारिक रूप से, अल्फा5-जीएबीए एआर के सतह स्तर की गणना कुल 5-जीएबीएएआरस्तरों (गैर-क्रॉसलिंक्ड नमूना लेन में ~ 55 केडीए पर) से एंडोमेम्ब्रेन-संबद्ध अल्फा5-जीएबीएएआर (क्रॉसलिंक्ड नमूना लेन में ~ 55 केडीएपर) की मात्रा को घटाकर की जा सकती है।
हमने अगली बार सतह पर UCMS (3 सप्ताह और 5 सप्ताह में) के प्रभावों और माउस पीएफसी में कुल a5-GABAAR स्तरों का मूल्यांकन किया। इस प्रयोग में, क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए, हमने बीएस 3 को जोड़ने के बाद 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे पर नमूने तैयार किए। चूंकि बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियाएं 2 घंटे तक एक पठार तक पहुंचती दिखाई दीं, इसलिए ग्राफ को प्लॉट करने के लिए 1 घंटे के समय बिंदु पर डेटा का उपयोग किया गया था। हमने नो-स्ट्रेस कंट्रोल चूहों की तुलना में यूसीएमएस के 3 सप्ताह और 5 सप्ताह में पीएफसी में सतह अल्फा 5-जीएबीएएआर स्तरों में महत्वपूर्ण और प्रगतिशील कमी देखी (चित्रा 8)। डेटा ने इन प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत कुल रिसेप्टर स्तरों में नगण्य या कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि क्रोनिक तनाव ने विशेष रूप से सेल की सतह पर अल्फा 5-जीएबीएएआर तस्करी को प्रभावित किया।
चित्रा 1: बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख में उपयोग किए जाने वाले विच्छेदन उपकरण। फिल्टर पेपर को बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ नम किया जाता है और नीली बर्फ की सपाट सतह पर रखा जाता है। पीबीएस से भरा एक पेट्री डिश और परख से 1 दिन पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बर्फ पर रखा जाता है। मस्तिष्क मैट्रिक्स और रेजर ब्लेड बर्फ पर पूर्व-ठंडा होते हैं। कैंची (एक बड़ी, एक छोटी), बल (एक बड़ी, कुछ छोटी), और एक ऊतक पंच सभी परख से पहले साफ किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पूरे माउस मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर निकाला गया और बर्फ-ठंडे पीबीएस में रखा गया। खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क को हटाने के तुरंत बाद, यह बर्फ पर पेट्री डिश में 10-15 सेकंड के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस में डूबा हुआ था। यह मस्तिष्क चयापचय को धीमा कर देता है और प्रोटीन तस्करी और गिरावट को कम करता है, जबकि ऊतक को कठोर होने में भी मदद करता है, जिससे बाद के मस्तिष्क के टुकड़े करना आसान हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखा गया एक माउस मस्तिष्क। बर्फ-ठंडे पीबीएस में डूबे ठंडे माउस मस्तिष्क को मस्तिष्क मैट्रिक्स में स्थानांतरित कर दिया गया और उदर पक्ष के साथ रखा गया। रेजर ब्लेड और मैट्रिक्स को बर्फ पर पहले से ठंडा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: मस्तिष्क मैट्रिक्स में एक माउस मस्तिष्क का कोरोनल सेक्शनिंग। पहले प्री-चिल्ड रेजर ब्लेड को घ्राण बल्ब और घ्राण पेडुनकल के बीच की सीमा के माध्यम से डाला गया था ताकि मस्तिष्क को कोरोनल रूप से विभाजित करना शुरू किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: माउस मस्तिष्क के सीरियल कोरोनल सेक्शन। मस्तिष्क मैट्रिक्स (1 मिमी अंतराल) में क्रमिक रूप से पांच रेजर ब्लेड डालकर माउस मस्तिष्क के पूर्ववर्ती भाग को कोरोनियल रूप से काटा गया था। सभी सम्मिलित ब्लेड को एक साथ रखा गया था, मैट्रिक्स से उठाया गया था, बल का उपयोग करके एक दूसरे से अलग किया गया था, और मस्तिष्क के टुकड़े के साथ ठंडी सपाट सतह पर रखा गया था। (ऊपर बाएं) घ्राण बल्ब; (मध्य बाएं) पहला खंड; पीएफसी ऊतकों के नमूने के लिए दूसरे (नीचे बाएं) और तीसरे (शीर्ष दाएं) वर्गों का उपयोग किया गया था; (नीचे दाएं) चौथा खंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन के लिए मस्तिष्क का पिछला भाग। मस्तिष्क के पूर्ववर्ती भाग को रेजर ब्लेड (बाएं) के साथ कोरोनल रूप से काटने के बाद, मस्तिष्क के पीछे के हिस्से (मध्य) को मस्तिष्क मैट्रिक्स से बाहर निकाला गया और ठंडी सतह (दाएं) पर पीबीएस-नम फिल्टर पेपर पर रखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: सेल की सतह पर जीएबीएएआर का बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग। बीएस 3 की उपस्थिति में, प्लाज्मा झिल्ली की सतह पर अल्फा 5-जीएबीए ए आर को इसके करीब अनाम प्रोटीन के साथ क्रॉसलिंक (एक्सएल) किया जाता है, जैसे कि पेंटामेरिक जीएबीए ए आर असेंबली या अतिरिक्त पड़ोसी प्रोटीन (एक्स)के भीतर अन्य जीएबीएएआर सबयूनिट्स, लेकिन इससे दूर प्रोटीन (वाई) के साथ नहीं। इस प्रकार, अल्फा 5-जीएबीएएआर धब्बे पर एक उच्च-आणविक भार (एचएमडब्ल्यू) प्रोटीन प्रजाति के रूप में दिखाई देता है। एंडोसोम पर a5-GABAAR बरकरार रहता है और ~ 55 kDA के अपेक्षित आकार पर माइग्रेट होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8: सतह 5-जीएबीएएआर स्तर यूसीएमएस से प्रभावित है। नो-स्ट्रेस और यूसीएमएस (3 सप्ताह और 5 सप्ताह) स्थितियों के तहत चूहों के पीएफसी में ए5-जीएबीएएआर के कुल और सतह स्तर दोनों का मूल्यांकन किया गया था। क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए, बीएस 3 को जोड़ने के बाद नमूने 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे पर तैयार किए गए थे। मादा चूहों (2-3 महीने, एन = 4 / समूह) का उपयोग किया गया था। प्रत्येक स्थिति के लिए 55 केडीएपर बरकरार ए5-जीएबीए ए आर स्तरों को पहले संबंधित ट्यूबलिन स्तरों द्वारा सामान्यीकृत किया गया था और फिर कुल और एंडोमेम्ब्रेन से जुड़े अल्फा 5-जीएबीएएआर स्तरों की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था (क्रमशः नो-क्रॉसलिंक[नो एक्सलिंक] और क्रॉसलिंक्ड [एक्सलिंक] नमूनों से)। इसके बाद, सतह रिसेप्टर स्तरों की गणना कुल स्तरों से एंडोमेम्ब्रेन से जुड़ी राशि को घटाकर की गई थी। चूंकि बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियाएं 2 घंटे तक एक पठार तक पहुंचती दिखाई दीं, इसलिए 1 घंटे के समय बिंदु पर डेटा का उपयोग ग्राफ (एसईएम का औसत) को प्लॉट करने ± लिए किया गया था। सतह पर क्रोनिक तनाव के महत्वपूर्ण प्रभाव देखे गए, और यह प्रभावयूसीएमएस अवधि-निर्भर था, क्योंकि यूसीएमएस अवधि के दौरान सतह अल्फा 5-जीएबीएएआरस्तरों में प्रगतिशील कमी की पहचान की गई थी। * पी < 0.05, ** पी < 0.01 (डन की कई तुलनाओं के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| काम करने वाला शंख। | स्टॉक समाधान | वितरण के लिए स्टॉक समाधान की मात्रा |
| 1.2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 मीटर (34x) | 1176.5 μL |
| 2.7 mM KCl | 1.08 मीटर (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM ग्लूकोज | 2.5 मीटर (250x) | 160 μL |
| विआयनीकृत पानी | 37.563 एमएल | |
| कुल | 40 एमएल | |
| * प्रयोग के दिन सीएसीएल2 स्टॉक को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। | ||
तालिका 1: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की संरचना।
| काम करने वाला शंख। | स्टॉक समाधान | वितरण के लिए स्टॉक समाधान की मात्रा |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 मीटर (10x) | 2 मिलीलीटर |
| 2 mM EDTA | 0.5 मीटर (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 मीटर (1000x) | 20 μL |
| 0.1% एनपी-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल | 100x | 200 μL |
| विआयनीकृत पानी | 17 एमएल | |
| कुल | 20 एमएल |
तालिका 2: लाइसिस बफर की संरचना
वीडियो 1: एक ऊतक पंच का उपयोग करके पीएफसी को अलग करना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 2: बल का उपयोग करके पीएफसी को कम करना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 3: एक घुमावदार जांच और बल का उपयोग करके एचपीसी का विच्छेदन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
वीडियो 4: उलटा-मिश्रण एक ऊतक नमूना। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
यद्यपि व्यवहार (यानी, भावनात्मकता और संज्ञानात्मक घाटे) और आणविक परिवर्तनों पर पुरानी मनोसामाजिक तनाव का प्रभाव (यानी, जीएबीर्जिक जीन की कम अभिव्यक्ति और जीएबीर्जिक न्यूरोट्रांसमिशन में कमी) अच्छी तरहसे प्रलेखित हैं, इस तरह के घाटे के अंतर्निहित तंत्र को आगे की जांच की आवश्यकता है। विशेष रूप से, हाल के अध्ययन से पता चलता है कि क्रोनिक तनाव ईआर कार्यों पर अधिभार के माध्यम से न्यूरोनल प्रोटिओम को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है और इस प्रकार, ऊंचा ईआर तनाव15, एक सवाल बना हुआ हैकि क्या क्रोनिक तनाव ईआर झिल्ली के माध्यम से जीएबीए ए आर तस्करी को प्रभावित करता है और जीएबीएएआर के परिवर्तित तस्करी या सतह स्तर को साइकोपैथोलॉजी से कैसे जोड़ा जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख इनमें से कुछ सवालों के जवाब देने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में काम करेंगे। उदाहरण के लिए, यूसीएमएस को यूसीएमएस10 की अवधि के आधार पर संज्ञानात्मक घाटे, चिंता जैसे व्यवहार और एनोदोनिक फेनोटाइप सहित व्यवहार परिवर्तनों की एक श्रृंखला को प्राप्त करने के लिए जाना जाता है। इसलिए, यूसीएमएस की शुरुआत (जैसे, 1 सप्ताह, 3 सप्ताह, 5 सप्ताह) से लगातार समय बिंदुओं पर माउस दिमाग का नमूना लेकर सतह अल्फा 5-जीएबीएएआर स्तरों में समय पाठ्यक्रम और यूसीएमएस-प्रेरित परिवर्तनों की डिग्री का अध्ययन करना संभव होगा, और प्रत्येक समय बिंदु पर देखे गए व्यवहार फेनोटाइप के साथ क्रॉस-तुलना करना भी संभव होगा। अतिरिक्त जीएबीए ए आर उपप्रकार (जैसे, ए 1,ए2) और क्रोनिक तनाव से प्रभावित होने वाले न्यूरोमोड्यूलेटर के लिए रिसेप्टर (उदाहरण के लिए, मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक [बीडीएनएफ]) के लिए टीआरकेबी रिसेप्टर 10 को एक ही नमूने का उपयोग करके एक साथ परीक्षण किया जा सकता है। चूंकि इनमें से कुछ रिसेप्टर सिस्टम और उपप्रकारों को विशिष्ट व्यवहार डोमेन (जैसे, बेहोश करने की क्रिया, चिंता, अनुभूति) 11 में चुनिंदा रूप से फंसाया जाता है, इसलिए यह प्रत्येक समय बिंदु पर यूसीएमएस से प्रभावित रिसेप्टर्स के प्रकार और डिग्री के साथ व्यवहार परिवर्तनों को सहसंबंधित करने के लायक है।
प्रोटोकॉल में कई चरणों के लिए विचार करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदु नीचे दिए गए हैं। पहला कदम प्रयोगात्मक डिजाइन और शक्ति विश्लेषण के आधार पर उपयोग करने के लिए जानवरों की आवश्यक और पर्याप्त संख्या निर्धारित करना है। उदाहरण के लिए, सतह जीएबीएए रिसेप्टर स्तरों पर क्रोनिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम नियमित रूप से चूहों के एक समूह (एन = 6 / सेक्स) को 5 सप्ताह के लिए यूसीएमएस के संपर्क में आने के लिए तैयार करते हैं और दूसरे समूह (एन = 6 / सेक्स) को नो-स्ट्रेस स्थितियों के तहत रखा जाता है। इस समूह का आकार (एन = कुल मिलाकर 24, दोनों लिंगों सहित) रिसेप्टर स्तरों में ~ 20% अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति देने की उम्मीद है, इस प्रकार तनाव प्रभाव और सेक्स प्रभाव दोनों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, यह बताया गया है कि क्रोनिक तनाव व्यवहार औरआणविक परिणामों में सेक्स-निर्भर अंतर का कारण बनता है। उदाहरण के लिए, महिलाओं को आमतौर पर पुरुषों की तुलना में अवसादग्रस्तता के लक्षण विकसित होने का अधिक खतरा होता है। लगातार, मानव पोस्टमॉर्टम और कृंतक दिमाग का उपयोग करने वाले हमारे अध्ययन महिला विषयों में व्यवहार और आणविक विकृति के उच्च स्तर का संकेत देते हैं; अवसाद के लिए एक आणविक मार्कर सोमाटोस्टैटिन (एसएसटी) के डाउनरेगुलेटेड स्तर, अवसादग्रस्तरोगियों के बीच महिलाओं में अधिक मजबूत होते हैं, और15,17 पुरुषों की तुलना में अवसादग्रस्तता विकृति के पहलुओं की नकल करने वाले महिला माउस मॉडल में बढ़ी हुई भावनात्मकता अधिक मजबूत होती है। इसलिए, यह सलाह दी जाती है कि साइकोपैथोलॉजिकल परिणामों पर पुराने तनाव के प्रभावों को संबोधित करने वाले किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन में डेटा का विश्लेषण करने और संभावित सेक्स-निर्भर प्रभावों की पहचान करने में सांख्यिकीय शक्ति सुनिश्चित करने के लिए पुरुषों और महिलाओं दोनों की पर्याप्त संख्या शामिल होनी चाहिए।
बीएस 3 के साथ इष्टतम इनक्यूबेशन समय प्रत्येक रिसेप्टर के अध्ययन के लिए पायलट प्रयोगों में निर्धारित किया जाना चाहिए। यह बताया गया है कि रिसेप्टर तस्करी धीरे-धीरे हो सकती है, यहां तक कि नमूना इनक्यूबेशन9 के दौरान कम तापमान पर भी। मस्तिष्क विच्छेदन के समय सटीक सतह रिसेप्टर स्तरों को पकड़ने के लिए, इनक्यूबेशन समय को कम करना और क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया के पठार तक पहुंचने से ठीक पहले समय बिंदु चुनना आदर्श होगा (30 मिनट से 2 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस पर)।
हमने बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख से जुड़ी कई परिचालन सीमाओं को देखा। (1) सबसे पहले, शारीरिक पीएच सीमा के भीतर सहज हाइड्रोलिसिस के कारण बीएस 3 के अपेक्षाकृत कम आधे जीवन (2-3 घंटे) के कारण, किसी को इस समय सीमा के भीतर पशु विच्छेदन और क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को पूरा करने की आवश्यकता है। इसने हमें उन जानवरों की संख्या को सीमित करने के लिए प्रेरित किया जिन्हें हम एक समय में अधिकतम 12 तक विच्छेदित कर सकते थे। यदि प्रयोगकर्ता 12 से अधिक जानवरों को विच्छेदित करने की योजना बनाता है, तो प्रयोगात्मक समूह को कई समूहों में विभाजित करने की सलाह दी जाती है, जिनमें से प्रत्येक में 12 से कम जानवर होते हैं। एक समूह के लिए परख पूरी होने के बाद, बीएस 3 के एक नए बैच को अगले समूह के लिए बाद के क्रॉसलिंकिंग परख में उपयोग करने के लिए ताजा तैयार किया जाना चाहिए। इसी तरह, एक जानवर से विच्छेदित किए जाने वाले रुचि के क्षेत्रों की संख्या सीमित होनी चाहिए। हम नियमित रूप से क्रॉसलिंकिंग परख के लिए दो मस्तिष्क क्षेत्रों (पीएफसी, एचपीसी) से नमूना लेते हैं, और यह मस्तिष्क क्षेत्रों की अधिकतम संख्या है जिसे हम नमूनों में न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए विच्छेदित कर सकते हैं। (2) दूसरा, पश्चिमी धब्बा में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की विशिष्टता का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। बीएस 3 रासायनिक क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया का प्रत्येक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाए गए प्रोटीन की एंटीजेनिसिटी पर अप्रत्याशित प्रभाव पड़ सकता है। हमने पाया कि एक a5-GABAएकआर एंटीबॉडी (में निर्दिष्ट) सामग्री की तालिका) गलती से विशेष रूप से बीएस 3-क्रॉसलिंक्ड नमूनों में एक मजबूत ~ 50 केडीए बैंड का पता लगाया, भले ही अल्फा 5-जीएबीए की उपस्थिति या अनुपस्थिति की परवाह किए बिना।एकनमूने में आर प्रोटीन; यह ~ 50 केडीए बैंड को ए 5-जीएबीए से ऊतक के नमूनों में भी देखा गया था।एकआर नॉकआउट चूहों, यह सुझाव देते हुए कि इस एंटीबॉडी ने बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया द्वारा गलती से उत्पन्न अप्रासंगिक एंटीजन के साथ क्रॉस-प्रतिक्रिया करना शुरू कर दिया। यह सलाह दी जाती है कि एंटीबॉडी विशिष्टता को बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रियाओं के साथ और बिना पूरी तरह से निर्धारित किया जाए, आदर्श रूप से नॉकआउट ऊतक के नमूनों का उपयोग करके, यदि उपलब्ध हो, तो किसी दिए गए प्रोटीन के लिए। (3) यहां वर्णित वर्तमान प्रोटोकॉल सेल प्रकारों को संबोधित नहीं करता है जिसमें प्रत्येक जीएबीएएकआर उपप्रकार व्यक्त किया जाता है (जैसे, न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स)। कुछ लोगों के लिए GABAएकआर उपप्रकार (जैसे, ए 1, ए 5) जो मुख्य रूप से न्यूरॉन्स में व्यक्त किए जाते हैं18, थोक मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करके प्राप्त क्रॉसलिंकिंग परख डेटा, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, न्यूरोनल सतह के स्तर को दर्शाते हुए जानकारी प्रदान करनी चाहिए। हालांकि, अन्य GABA के लिएएकआर उपप्रकार (जैसे, ए 2) जो न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स दोनों में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं18, न्यूरॉन्स बनाम एस्ट्रोसाइट्स में रिसेप्टर सतह के स्तर का अलग से अध्ययन करना दिलचस्प है। इसके लिए, पारंपरिक सेल सॉर्टिंग (उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग [एफएसीएस]।19) बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग प्रोटोकॉल में एकीकृत किया जा सकता है; सेल सॉर्टिंग के लिए सेल पृथक्करण चरण बीएस 3 शमन चरण के बाद किया जा सकता है, लेकिन किसी को यह सत्यापित करने की आवश्यकता है कि एफएसीएस के लिए सभी प्रक्रियाएं और शर्तें (जैसे, उपयोग करने के लिए बफर, तापमान, इनक्यूबेशन समय) क्रॉसलिंकिंग परख में उन लोगों के साथ संगत हैं। इसके अलावा, FACS दृष्टिकोण का उपयोग केवल GABA के लिए किया जा सकता है।एकआर उपप्रकारों को पेरिसोमैटिक सेलुलर कम्पार्टमेंट (जैसे, ए 2) के लिए स्थानीयकृत होने के लिए जाना जाता है, लेकिन डिस्टल डेंड्राइट (जैसे, ए 5) में समृद्ध उपप्रकारों के लिए नहीं।18, क्योंकि सेल सॉर्टिंग के लिए आवश्यक व्यापक सेल पृथक्करण चरण के दौरान परिधीय या डिस्टल सेल डिब्बे खो जाते हैं। (4) अंत में, हमने परिणामों को अधिक सुसंगत पाया जब हमने उच्च-आणविक भार प्रोटीन प्रजातियों के डेंसिटोमेट्री के आधार पर सतह के स्तर का सीधे मूल्यांकन करने के बजाय रिसेप्टर्स की कुल मात्रा से एंडोमेम्ब्रेन से जुड़े रिसेप्टर्स की मात्रा को घटाकर सतह रिसेप्टर स्तरों की गणना की। यह संभावना है क्योंकि पीवीडीएफ झिल्ली पर इन उच्च-आणविक भार प्रोटीन प्रजातियों की हस्तांतरण दक्षता एक छोटे आकार के मूल, बरकरार प्रोटीन की तुलना में अधिक परिवर्तनशील है (उदाहरण के लिए, ~ 55 केडीए के लिए ए 5-जीएबीएएकइसलिए, परिणाम अनुभाग में वर्णित विधि और किंवदंती का पालन करने की सिफारिश की जाती है। चित्र 8 सतह रिसेप्टर स्तरों की गणना करने के लिए।
जीएबीएएआर पर पुराने तनाव के प्रभावों के अलावा, बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख को आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों या कृंतक मॉडल पर प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के साथ कई न्यूरोलॉजिकल या न्यूरोसाइकिएट्रिक स्थितियों की जांच के लिए भी लागू किया जा सकता है। इस परख का उपयोग चूहे के दिमाग20,21 के न्यूक्लियस अक्युमबेंस में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति पर कोकीन-प्रेरित प्रभावों को पकड़ने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस परख का उपयोग विषम बीडीएनएफ नॉकआउट चूहों22 के पीएफसी में अल्फा5-जीएबीएएआर की कम सतह अभिव्यक्ति को दिखाने के लिए भी किया गया है। एक अन्य पिछले अध्ययन में, चूहों में हेपेटिक एन्सेफैलोपैथी के मॉडल में, स्थानिक सीखने की कमी को इस क्रॉसलिंकिंग परख23 के आधार पर ग्लूटामेट और जीएबीएए रिसेप्टर्स की परिवर्तित सतह अभिव्यक्ति से जोड़ा गया था। सारांश में, बीएस 3 रासायनिक क्रॉसलिंकिंग परख मस्तिष्क में रिसेप्टर सिस्टम की एक श्रृंखला में मस्तिष्क क्षेत्र-विशिष्ट और संदर्भ-निर्भर परिवर्तनों को पकड़ने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है, साथ ही साथ लगभग किसी भी अन्य परिधीय ऊतकों या अंगों में। इस परख को सतह रिसेप्टर स्तरों के मूल्यांकन के लिए अन्य तरीकों के समानांतर भी आयोजित किया जा सकता है, जैसे कि टॉनिक निषेध की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (विशेष रूप से ए 5-जीएबीएएआर के मामले में), क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और सतह बायोटिनाइलेशन, परिणामों की तुलना और मान्य करने के लिए।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं दी है।
Acknowledgments
लेखक अध्ययन अवधि में जानवरों की देखभाल के लिए सीएएमएच पशु सुविधा कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को कैनेडियन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर प्रोजेक्ट ग्रांट # 470458 टीटी), सीएएमएच से डिस्कवरी फंड (टीपी को), नेशनल एलायंस फॉर रिसर्च ऑन स्किज़ोफ्रेनिया एंड डिप्रेशन (एनएआरएसएडी अवार्ड # 25637 टू ई.एस.), और कैंपबेल फैमिली मेंटल हेल्थ रिसर्च इंस्टीट्यूट (ई.एस.) द्वारा समर्थित किया गया था। ई.एस. डेमोना फार्मास्यूटिकल्स के संस्थापक हैं, जो एक बायोफार्मा है जो क्लिनिक में नए जीएबीर्जिक यौगिकों को लाने के लिए समर्पित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
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