Summary
Ce protocole introduit une cartographie optique à double colorant des cœurs de souris obtenus à partir d’animaux de type sauvage et knock-in atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, y compris des mesures électrophysiologiques de la tension transmembranaire et des transitoires intracellulaires Ca2+ avec une haute résolution temporelle et spatiale.
Abstract
La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’un défi aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Le cœur de souris est une espèce répandue pour modéliser les maladies arythmiques cardiaques héréditaires, y compris la TVPC. La cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire (Vm) et des transitoires calciques (CaT) à partir de cœurs de souris perfusés par Langendorff a le potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents à l’arythmogenèse. Par rapport à l’étude au niveau cellulaire, la technique de cartographie optique peut tester certains paramètres électrophysiologiques, tels que la détermination de l’activation, de la vitesse de conduction, de la durée du potentiel d’action et de la durée du CaT. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie optique à haut débit du CaT et de la Vm dans des cœurs murins de type sauvage et hétérozygote RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et pendant le défi isoprotérénol. Cette approche a démontré une méthode réalisable et fiable pour étudier mécanistiquement la maladie CPVT dans une préparation ex vivo de cœur de souris.
Introduction
La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique héréditaire (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe (TVP) à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’une provocation aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle 1,2,3,4 . Des preuves récentes à la suite de son premier rapport en tant que syndrome clinique en 1995 ont impliqué des mutations dans sept gènes, tous impliqués dans la libération de Ca 2+ dans le stockage réticulaire sarcoplasmique (SR) dans cette condition : le récepteur RYR2 codant pour la ryanodine 2 (RyR2) le plus fréquemment rapporté des canaux de libération de Ca2+5,6, FKBP12.67, CASQ2 codant pour la calséquestrinecardiaque 8, TRDN codant pour la protéine jonctionnelle SR triadine 9, et CALM1 9, CALM2 10 et CALM3 codant de manière identique pour la calmoduline11,12. Ces profils génotypiques attribuent les événements arythmiques à la libération pathologique non régulée de SR stock Ca2+12.
La libération spontanée de Ca 2+ par SR peut être détectée sous forme d’étincelles de Ca 2+ ou d’ondes de Ca 2+, ce qui active l’échangeur Na+/Ca 2+ (NCX). L’échangeur d’un Ca2+ pour trois Na+ génère un courant entrant, qui accélère la dépolarisation diastolique et conduit la tension membranaire jusqu’au seuil du potentiel d’action (PA). Chez les souris knock-in RyR2, l’activité accrue de RyR2R4496C dans le nœud sino-auriculaire (SAN) conduit à une diminution inattendue de l’automaticité du SAN par une diminution dépendante du Ca 2+ de l’épuisement de l’ICa,L et du SR Ca2+ pendant la diastole, identifiant des altérations physiopathologiques subcellulaires contribuant au dysfonctionnement du SAN chez les patients atteints de CPVT13,14. L’apparition des ondes cytosoliques Ca 2+ cardiomyocytaires associées est plus probable après l’augmentation du cytosolique de fond [Ca2+] à la suite de la sensibilisation RyR par la catécholamine, y compris l’isoprotérénol (ISO).
Les changements cinétiques détaillés dans la signalisation du Ca 2+ après la libération de Ca2+ médiée par RyR2 en réponse à l’activation du potentiel d’action (PA) qui pourrait être la cause des arythmies ventriculaires observées dans les modèles de CPVT cardiaque intacts restent à déterminer pour l’ensemble des génotypes RyR2 rapportés12. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie à haut débit des signaux Ca2+ et des potentiels transmembranaires (Vm) dans les cœurs murins de type sauvage (WT) et hétérozygotes RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et après le défi isoprotérénol. Ce protocole fournit une méthode pour l’étude mécanistique de la maladie CPVT dans des cœurs de souris isolés.
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Protocol
Des souris mâles de type sauvage âgées de 10 à 14 semaines ou des souris RyR2-R2474S/+ (fond C57BL/6) pesant 20 à 25 g sont utilisées pour les expériences. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Sud-Ouest, Sichuan, Chine (approbation NO :20160930) conformément aux directives nationales en vertu desquelles l’institution fonctionne.
1. Préparation
- Solutions de gestion des stocks
- Solution mère de blebbistatine : Ajouter 1 mL de diméthylsulfoxyde à 100 % (DMSO) dans le flacon d’origine contenant 2,924 mg de (-) poudre de blebbistatine pour atteindre une concentration de 10 mM.
- Indicateur de tension RH237 solution mère : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans le flacon d’origine avec 1 mg de poudre RH237 pour obtenir une concentration de 2,01 mM.
- Solution mère Rhod-2 AM pour indicateur de calcium : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 1 mg de poudre Rhod-2 AM pour atteindre une concentration de 0,89 mM.
- Solution mère de Pluronic F127 : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 200 mg de Pluronic F127 pour atteindre une concentration de 20 % p/v (0,66 mM).
- Aliquotez les solutions mères dans des tubes PCR de 200 μL dans des tubes de 21 à 51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM et 51 μL de blebbistatine) à usage simple ou double afin d’éviter la congélation et la décongélation répétées. Ensuite, enveloppez les solutions dans du papier d’aluminium et conservez-les à -20 °C, à l’exception de la solution mère Pluronic F127 placée dans une pièce sombre à température ambiante.
- Solution de perfusion
- Solution de Krebs (en mM) : Préparer 1 L de solution de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 et glucose 10).
- Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à aiguille aseptique de 0,22 μm et oxygéner avec 95 % d’O 2/5 % de CO2.
- Prélever 40 mL de solution de Krebs dans un tube centrifuge de 50 mL et le conserver à 4 °C pour un isolement cardiaque de suivi.
- Le système de perfusion Langendorff et le dispositif de cartographie optique
- Mise en place du système de perfusion Langendorff.
- Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C.
- Lavez le système de perfusion Langendorff avec 1 L d’eau déminéralisée.
- Perfuser la solution à partir du conduit d’admission et ajuster le débit de sortie à 3,5-4 mL/min. Ensuite, oxygéner le perfusat avec du gaz O 2/CO2 (95%/5%) à 37 °C.
REMARQUE : Une bulle n’est jamais autorisée dans le système de perfusion.
- Préparez le système de cartographie optique.
- Installez la caméra EMCCD (dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons) (512 × 512 pixels), l’objectif (grossissement 40x), les diodes électroluminescentes (LED) séparatrices de longueur d’onde, le moniteur d’électrocardiogramme (ECG) et l’électrode de stimulation (Figure 1).
- Ajustez la distance de travail appropriée entre la lentille et la position du cœur.
- Placez deux LED en position diagonale du bain thermostatique pour un éclairage uniforme, fournissant une longueur d’onde de 530 nm pour générer une lumière d’excitation. Utilisez un filtre à revêtement pulvérisé ET525/50 pour éliminer toute lumière hors bande pour les LED.
- Ajustez l’interrupteur de la poignée pour obtenir un carré égal de la surface cible, ce qui permet aux images de tension et de calcium d’apparaître correctement sur l’interface d’acquisition.
- Tournez l’ouverture de l’objectif au diamètre maximum pour éviter toute fuite de signaux de tension ou de calcium.
- Ajustez l’objectif de la caméra à une hauteur appropriée, car il sert une bonne distance de travail par rapport au bain thermostatique, 10 cm sont généralement utilisés.
- Allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à -50 °C.
- Mise en place du système de perfusion Langendorff.
2. Procédures
- Prélèvement, canulation et perfusion du cœur de souris
- Injecter par voie intrapéritonéale aux animaux une solution d’avertin (1,2 %, 0,5 à 0,8 ml) et de l’héparine (200 unités) pour minimiser la souffrance et le réflexe de douleur et prévenir la formation de caillots sanguins. Au bout de 15 minutes, sacrifiez les animaux par luxation cervicale.
- Ouvrez le coffre avec des ciseaux, prélevez soigneusement le cœur et placez-le dans la solution froide de Krebs (4 °C, 95 % d’O 2, 5 % de CO2) pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur.
- Prélevez le tissu environnant de l’aorte, canulez l’aorte à l’aide d’une aiguille de canule sur mesure (diamètre extérieur : 0,8 mm, diamètre intérieur : 0,6 mm, longueur : 27 mm) et fixez-la avec une suture en soie 4-0.
- Perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5-4,0 mL/min et maintenez la température à 37 ± 1 °C.
REMARQUE : Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans cette condition. - Insérez un petit tube en plastique (0,7 mm de diamètre, 20 mm de longueur) dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge.
- Découplage de l’excitation-contraction et de la charge à double colorant
- Insérez deux sondes dans le perfusat dans le bain, allumez les alimentations du boîtier d’amplification ECG et du contrôleur de stimulation électrique, puis démarrez le logiciel ECG référencé et surveillez l’ECG en continu.
- Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable (le cœur bat rythmiquement à ~400 bpm).
- Mélanger 50 μL de solution mère de blébbistatine à 10 mM avec 50 mL de solution de Krebs pour atteindre une concentration de 10 μM. Perfuser constamment le mélange de solution de blebbistatine-Krebs dans le cœur pendant 10 minutes pour dissocier la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage.
- Utilisez une lampe de poche rouge pour vérifier si la contraction cardiaque s’arrête totalement, car la contraction influencera la qualité de la charge du colorant.
- Après le découplage excitation-contraction, mélanger 15 μL de solution mère de Rhod-2 AM avec 15 μL de solution mère de Pluronic F127 dans 50 mL de solution de Krebs pour obtenir les concentrations finales de 0,267 μM Rhod-2 AM et 0,198 μM de Pluronic F127. Ensuite, perfusez le cœur en continu avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff.
- Maintenez l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire du colorant calcique. Étant donné que les bulles se forment facilement dans le Pluronic F127, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion pour éviter l’embolisation gazeuse des coronaires.
- Diluer 10 μL de solution mère RH237 dans 50 mL de perfusat pour atteindre la concentration finale à 0,402 μM et effectuer le chargement pendant 10 minutes.
- À la fin de la charge à double colorant, prenez une séquence de photos pour vous assurer que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse (pas d’interaction entre deux signaux).
- Cartographie optique et induction de l’arythmie
REMARQUE : La cartographie optique commence après l’arrêt de la contraction et une charge de colorant appropriée, et le cœur est perfusé consécutivement comme dans les étapes décrites ci-dessus à la section 2.1 (4).- Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée (assez forte pour l’éclairage et un tournage relativement simple, mais pas trop robuste pour la surexposition).
- Placez le cœur sous le dispositif de détection, assurez-vous qu’il est suffisamment éclairé par deux LED et ajustez le diamètre du point lumineux à 2 cm.
- Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur sur 10 cm, ce qui donne un taux d’échantillonnage de près de 500 Hz et une résolution spatiale de 120 x 120 μm par pixel.
- Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler numériquement la caméra afin de capturer simultanément les signaux de tension et de calcium.
- Démarrez le stimulateur de champ myopacer et réglez le modèle de stimulation sur Transistor Transistor Logic (TTL), une durée de stimulation de 2 ms pour chaque impulsion et 0,3 V comme intensité initiale.
- Utilisez 30 stimuli S1 consécutifs à 10 Hz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur piloté par le logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture 1 :1 soit réalisée (vérifiez l’onde QRS du moniteur ECG, le potentiel d’action (AP) et les signaux transitoires calciques (CaT)).
- Après avoir déterminé le seuil de tension, stimulez le cœur à une intensité de 2 fois le seuil de tension diastolique avec une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicarde de l’apex du ventricule gauche (VG) (ELVA).
- Mettre en œuvre le protocole S1S1 pour mesurer le calcium ou le potentiel d’action des alternans et les propriétés de restitution. Rythmez le cœur consécutivement à une durée de cycle de base de 100 ms, en diminuant de 10 ms de la durée du cycle chaque séquence suivante jusqu’à ce que 50 ms soient atteints. Chaque épisode comprend 30 stimuli consécutifs avec une largeur d’impulsion de 2 ms. Dans le même temps, commencez la cartographie optique avant la stimulation (le temps d’échantillonnage comprend ~10 rythmes sinusaux et la durée de stimulation).
- Pour mesurer la période réfractaire effective ventriculaire (PAR) à l’aide du protocole de stimulus S1S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1S1 de 100 ms avec un S2 couplé à 60 ms avec un décrément par pas de 2 ms jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique.
- Pour l’induction de l’arythmie, effectuez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 Hz (50 stimulations électriques continues avec une largeur d’impulsion de 2 ms) et effectuez le même épisode de stimulation après un intervalle de repos de 2 s.
- Observez attentivement les enregistrements ECG pendant la période de stimulation continue à haute fréquence afin que les enregistrements de cartographie optique simultanés puissent commencer rapidement lorsqu’une onde ECG arythmique intéressante se génère (étant donné que la plupart des arythmies cardiaques sont induites par la stimulation électrique, les signaux optiques sont échantillonnés 2 à 3 s avant la stimulation en rafale en cas de perte d’événements cardiaques importants).
- Image à l’aide d’une caméra EMCCD (fréquence d’échantillonnage : 500 Hz, taille des pixels : 64 x 64).
- Analyse des données
- Chargement d’images et traitement du signal
- Appuyez sur Select Folder et Load Images pour charger les images dans le logiciel d’acquisition d’images pour une analyse semi-automatique des données vidéo massives selon la configuration et le protocole décrits précédemment15,16.
- Entrez les paramètres d’échantillonnage corrects (tels que la taille des pixels et la fréquence d’images).
- Définissez le seuil d’image par saisie manuelle et sélectionnez la région d’intérêt (ROI).
- Implémentez un filtre spatial gaussien de 3 x 3 pixels, un filtre Savitzky-Goaly et une correction de ligne de base de type chapeau.
- Appuyez sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques, tels que APD80 et CaTD50.
- Analyse des paramètres électrophysiologiques
- Réglez le temps d’initiation de l’APD au pic et le point terminal à 80% de repolarisation (APD80) pour le calcul de l’APD80. De même, l’heure de début du CaTD est définie comme le pic et le point terminal est défini comme la relaxation de 80 %.
- La mesure de la vitesse de conduction (CV) dépend de la taille des pixels et du temps de conduction du potentiel d’action entre deux pixels ou plus. Calculez la vitesse moyenne de tous les pixels choisis, c’est-à-dire la vitesse de conduction moyenne de la région sélectionnée. Générez simultanément des cartes isochrones correspondantes pour une vue claire de la direction de la conduction.
NOTE : O’Shea et al.15 ont rapporté la mesure CV en détail. - Pour l’analyse des alternanes et de l’arythmie, les alternanes calciques sont définis comme une amplitude de crête continue de grande et de petite taille apparaissant alternativement. Utilisez le rapport d’amplitude de crête pour évaluer la gravité des alternants dépendants de la fréquence (1-A2/A1). Appliquez des cartes de phase pour analyser les arythmies complexes comme la tachycardie ventriculaire (TV). Recherchez les rotors apparaissant distinctement dans une région spécifique lorsque les rotors se déplacent.
- Chargement d’images et traitement du signal
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Representative Results
La cartographie optique a été une approche populaire dans l’étude des arythmies cardiaques complexes au cours de la dernière décennie. La configuration de cartographie optique se compose d’une caméra EMCCD, offrant un taux d’échantillonnage allant jusqu’à 1 000 Hz et une résolution spatiale de 74 x 74 μm pour chaque pixel. Il permet d’obtenir un rapport signal/bruit assez élevé lors de l’échantillonnage du signal (Figure 1). Une fois que le cœur perfusé par Langendorff atteint un état stable et que la charge du colorant est terminée, le cœur est placé dans la chambre homéothermique sous l’éclairage de deux LED de 530 nm, qui sont utilisées pour l’excitation de l’indicateur de tension RH237 et de l’indicateur Ca2+ Rhod-2 AM. La lumière d’émission est divisée en deux longueurs d’onde de 600 nm (pour Ca2+) et 670 nm (pour Vm), qui sont détectées simultanément à l’aide de la caméra EMCCD. Après une perfusion d’avertin et d’héparine pendant 15 minutes, utiliser les instruments chirurgicaux (Figure 2A) pour ouvrir le thorax et extraire rapidement le cœur, puis le transférer dans la solution froide de Krebs (4 °C, 95 % d’O 2, 5 % de CO2) (Figure 2B). Nettoyez soigneusement les tissus environnants, fixez l’aorte avec une suture 4-0 et un tube en plastique de 0,7 mm est inséré dans le ventricule gauche (Figure 2C) pour libérer la congestion du perfusat dans la chambre ventriculaire gauche. Insérez les sondes ECG dans le perfusat (Figure 2D) et assurez-vous que le cœur bat rythmiquement selon la surveillance ECG pilotée par le logiciel d’enregistrement ECG. Ensuite, effectuez un chargement à double colorant dans l’obscurité (Figure 2E).
Une fois que les artefacts de contraction ont été minimisés par la blebbistatine (10 μM) et qu’une charge de colorant adéquate a été complétée, le tournage a commencé pendant environ 10 battements sinusaux avant le protocole de stimulation S1S1 pour évaluer les propriétés de restitution des paramètres électrophysiologiques dépendants de la fréquence et les alternanes calciques après provocation à l’isoprotérénol (1 μM ISO) (Figure 3A). La figure 3B montre un front d’onde ECG représentatif de VT et de traces de potentiel d’action (AP) et de CaT correspondantes induites par une séquence de stimulation en rafale de 50 Hz chez une souris CPVT. Un logiciel d’imagerie de signaux optiques est utilisé pour effectuer une analyse semi-automatique de données vidéo massives.
Les figures 4A et B montrent des traces et des cartes thermiques typiques de l’APD80 et du CaTD80, respectivement. L’ISO raccourcit l’APD80 chez les souris WT et CPVT, mais aucune différence n’a été trouvée entre les souris WT et CPVT avant et après le test ISO (Figure 4C, **P < 0,01. n = 5/6). La figure 4D indique que le CaTD80 chez les souris CPVT est plus long que chez le WT après le test ISO, alors qu’il n’y avait pas de signification avant le traitement ISO (**P < 0,01. n = 6.).
Pour la mesure de conduction, la figure 5A présente un algorithme à vecteur unique pour la quantification de CV. Selon les signaux de tension, les cœurs WT et CPVT possèdent la même capacité de conduction à travers l’épicarde au départ et après l’intervention ISO (Figure 5B). Les figures 5C, D montrent les cartes d’activation représentatives de la tension et du calcium dans les cœurs WT et CPVT avant et après le défi ISO.
Le calcium alternatif est un paramètre critique de l’arythmie. L’amplitude calcique alternante est calculée selon la formulation illustrée à la figure 6A. Les signaux calciques dans les cœurs WT restent stables à l’inclusion pendant la stimulation consécutive de S1S1 à 14,29 et 16,67 Hz (Figure 6B), tandis que les cœurs CPVT montrent des alternants dépendants de la fréquence (Figure 6C). Après le défi ISO, les cœurs CPVT présentent des alternants dépendants de la fréquence dans le signal calcique pendant la stimulation S1S1, tandis que les cœurs WT ne sont pas influencés (Figure 6D,E). Après une stimulation continue de S1S1, un protocole de stimulation en rafale est effectué pour induire des arythmies mortelles. Les cœurs WT et CPVT présentent une conduction normale pendant une stimulation en rafale de 50 Hz à l’inclusion (Figure 7A). Après perfusion avec ISO, les cœurs CPVT présentent des rotors à haute fréquence après une stimulation en rafale de 50 Hz, tandis que les cœurs WT maintiennent une conduction normale (Figure 7B).
Figure 1 : Appareil de cartographie optique. Le système comprend une caméra EMCCD conçue sur mesure avec une haute résolution spatio-temporelle (fréquence d’échantillonnage jusqu’à 1 000 Hz, pixel d’échantillonnage minimal 74 x 74 μm). Un contrôleur de stimulation électrique est utilisé pour l’échantillonnage et le protocole de stimulation électrique de sortie. Deux LED vertes sont utilisées pour la lumière d’excitation des sondes de fluorescence. Un miroir dichroïque à long passage (610 nm) et les émetteurs correspondants séparent les lumières d’émission de tension et de fluorescence de calcium. RH237, le colorant sensible à la tension, a une lumière d’émission à une longueur d’onde maximale de 670 nm, tandis que Rhod-2 AM, le colorant sensible au calcium, possède une lumière d’émission à une longueur d’onde maximale de 600 nm. Des changements mineurs dans les deux signaux de fluorescence pourraient être capturés simultanément par la caméra en raison de la fréquence d’échantillonnage et de la sensibilité élevées du capteur de la caméra. Abréviations : EMCCD = dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons ; LED = diode électroluminescente ; ECG = électrocardiogramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation et chargement du double colorant. (A) Les instruments chirurgicaux. (B) Récolte du cœur de la souris. (C) Coupez soigneusement le tissu inutile pour une vue claire de l’aorte et insérez un tube en plastique de 0,7 mm de l’aorte dans le ventricule gauche. (D) Le cœur est rapidement acheminé vers le système de perfusion de Langendorff. (E) Chargement à double colorant et arrêt de l’excitation-contraction dans l’obscurité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Protocole S1S1 et protocole d’induction de l’arythmie. (A) Front d’onde ECG représentatif et traces de signaux AP et calcique correspondants à l’aide du protocole de stimulation S1S1 après provocation ISO. (B) Induction VT par une séquence de stimulation en rafale de 50 Hz après perfusion d’ISO dans une souris CPVT. Abréviations : ECG = électrocardiogramme ; PA = potentiel d’action ; ISO = isoprotérénol ; VT = tachycardie ventriculaire ; CPVT = tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de l’APD80 et du CaTD80 à 10 Hz avant et après le test ISO. (A) Traces AP représentatives et cartes thermiques APD80 des cœurs WT et CPVT avant et après traitement ISO. (B) Traces typiques de CaT et cartes thermiques CaTD80 des cœurs WT et CPVT avant et après le défi ISO. (C) L’ISO raccourcit l’APD80 chez les souris WT et CPVT, mais aucune différence n’est trouvée entre les souris WT et CPVT avant et après le test ISO. (D) Le CaTD80 chez les souris CPVT est plus long que chez le WT après le test ISO, alors qu’il n’y avait pas de signification avant le traitement ISO. (* P < 0,05, **P < 0,01. n = 5/6.) Abréviations : AP = potentiel d’action ; APD80 = pic à 80 % de repolarisation ; ISO = isoprotérénol ; CPVT = tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse de la vitesse de conduction à 10 Hz. (A) L’algorithme à vecteur unique de la vitesse de conduction. (B) Il n’y a pas de différence dans le CV de l’AP chez les souris WT et CPVT. (C) Des cartes thermiques représentatives démontrent que les souris CPVT ont la même capacité de conduction que les souris WT avant et après le défi ISO en fonction des signaux de tension. (D) Aucune différence significative n’a été constatée dans les deux groupes pour les isochrones CaT80 induites par le potentiel d’action avant et après la provocation ISO. Abréviations : AP = potentiel d’action ; ISO = isoprotérénol ; CPVT = tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique ; WT = type sauvage ; AT = temps d’activation ; CV = vitesse de conduction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyse de l’amplitude calcique alternante. (A) L’algorithme de calcul de l’amplitude calcique alternante. (B) Les signaux calciques dans les cœurs WT restent stables à l’inclusion pendant la stimulation consécutive de S1S1 à 14,29 et 16,67 Hz, tandis que (C) les cœurs CPVT montrent des alternants dépendants de la fréquence. (D) Les cœurs WT ne sont pas influencés par le défi ISO, tandis que (E) après le défi ISO, les cœurs CPVT présentent des alternants dépendants de la fréquence dans le signal calcique pendant la stimulation S1S1. Abréviations : ISO = isoprotérénol ; CPVT = tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse de la tachyarythmie à l’aide de cartes de phase. (A) Les cœurs WT et CPVT présentent une conduction normale pendant la stimulation en rafale de 50 Hz à l’inclusion. (B) Après perfusion avec ISO, les cœurs CPVT montrent des rotors à haute fréquence après une stimulation en rafale de 50 Hz, tandis que les cœurs WT maintiennent une conduction normale. Abréviations : ISO = isoprotérénol ; CPVT = tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Sur la base de notre expérience, les clés d’une cartographie optique à double colorant réussie d’un cœur de souris comprennent une solution et un cœur bien préparés, la charge du colorant, l’obtention du meilleur rapport signal/bruit et la réduction de l’artefact de mouvement.
Préparation de la solution
La solution de Krebs est essentielle pour la réussite d’une expérience cardiaque. Les solutions mères de MgCl 2 et de CaCl2 (1 mol/L) sont préparées à l’avance en tenant compte de leur absorption d’eau et ajoutées à la solution de Krebs après que tous les autres composants ont été dissous dans de l’eau pure, car le Mg 2+ et le Ca 2+ peuvent facilement précipiter avec le CO3 2+. La solution de Krebs est mélangée à 95 % d’O, 2/5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes pour assurer l’oxygénation. Étant donné que le cœur de la souris est particulièrement sensible au pH, le pH de la solution doit être d’environ 7,4 après oxygénation. Même si de minuscules particules se trouvent dans la solution, les résultats expérimentaux peuvent être affectés car ces particules peuvent bloquer les capillaires et affecter l’effet de perfusion. Par conséquent, la solution est filtrée à l’aide d’un filtre à aiguille aseptique de 0,22 μm avant utilisation.
Préparation du cœur
Avant que les cœurs ne soient prélevés, les souris sont d’abord héparinées pour éviter la formation de caillots dans le système de l’artère coronaire, empêchant ainsi une mauvaise perfusion de colorant causée par la congestion cardiaque d’affecter l’imagerie ultérieure. Plus le temps ischémique du cœur est court, meilleur est l’état du cœur. Par conséquent, le temps ischémique est contrôlé dans les 2 à 3 minutes entre le prélèvement des cœurs et la canulation via l’aorte sur le système de Langendorff. De plus, une pression de perfusion bien maintenue est également essentielle. Par conséquent, un mince tube en silicone (plastique) est inséré dans la cavité ventriculaire gauche pour éviter que la pression ventriculaire gauche ne soit trop élevée lors de la contraction ventriculaire après la ligature de la sortie ventriculaire gauche, ce qui pourrait entraîner une mauvaise perfusion myocardique et une acidification du tissu anoxique.
Chargement du colorant
Ces expériences effectuent une charge de colorant en perfusant le cœur dans le système de Langendorff. Il est crucial de surveiller le rythme cardiaque car une mauvaise charge de colorant se produira lorsque le rythme anormal est causé par des opérations chirurgicales ou des lésions d’ischémie-reperfusion. Le cœur doit être en assez bonne santé pour effectuer les étapes suivantes. Rhod-2 AM, un colorant sensible au Ca2+, est un dérivé de l’ester acétylméthylique de Rhod 2, qui est facilement chargé dans les cellules sous sa forme AM. Une multiplication par 100 de l’intensité de fluorescence de la molécule résulte de la chélation du Ca2+ 17. Le Pluronic F127 est incorporé dans la solution de chargement Rhod-2 AM pour empêcher le Rhod-2 AM de polymériser dans le tampon et l’aider à pénétrer dans les cellules. Pluronic F127 peut réduire la stabilité de Rhod-2 AM, il est donc recommandé de ne l’ajouter que lors de la préparation de la solution de travail, mais pas dans la solution de stockage pour un stockage à long terme. Le colorant sensible à la tension RH237 est utilisé dans cette étude en raison de ses propriétés spectrales favorables pour une utilisation avec l’indicateur Ca2+ Rhod-2 AM.
Obtenir le meilleur rapport signal/bruit
L’obtention d’images avec des rapports signal/bruit élevés est la cible de l’imagerie, mais le bruit est comme un fantôme obscur qui cause toujours des problèmes. En raison de la faiblesse des signaux, la réduction du bruit est particulièrement importante dans certaines applications d’imagerie microscopique à grande vitesse, telles que la cartographie optique. Le rapport signal/bruit (SNR) est calculé comme le rapport d’amplitude quadratique moyenne à la racine moyenne du bruit quadratique, où l’amplitude du bruit est évaluée au potentiel de repos18. Certains facteurs, tels que la source lumineuse, les filtres optiques, les optiques de focalisation et les photodétecteurs, sont essentiels pour obtenir le meilleur rapport signal/bruit. Dans l’étude, la région de fond de l’échantillon est examinée pour le bruit, qui fluctue souvent à un niveau minuscule. Le signal optique détecté par chaque pixel est la moyenne de la lumière émise à partir de sa surface. Les activités AP et calcique oscillent pendant l’arythmie, et l’amplitude des deux signaux est relativement faible. Même des interférences mineures peuvent entraîner une distorsion des signaux optiques et entraîner des erreurs dans l’analyse des données. Par conséquent, l’interprétation des signaux optiques doit être prudente lorsque l’hétérogénéité locale est causée par la fonction électrique lors d’arythmies comme la TV.
Réduire l’artefact de mouvement
Par rapport à l’enregistrement à l’électrode, les signaux optiques sont souvent influencés par l’activité de contraction des cœurs perfusés de Langendorff en raison d’un artefact de mouvement. Pour capturer des signaux optiques précis, des inhibiteurs pharmacologiques de l’excitation-contraction sont principalement utilisés. Pour minimiser l’artefact de mouvement pendant l’imagerie, la blebbistatine est adoptée pour arrêter les battements du cœur. Il s’agit d’un inhibiteur sélectif de l’activité ATPase de la myosine II non musculaire et découple efficacement le processus d’excitation-contraction du cœur 19,20,21. Bien que certaines études impliquent certains effets secondaires en utilisant le composé22, nous utilisons la concentration de travail la plus faible à 10 μM pour minimiser les dommages possibles au cœur.
Logiciel ElectroMap pour l’analyse des jeux de données de cartographie optique cardiaque
ElectroMap est un logiciel open source à haut débit pour l’analyse d’ensembles de données de cartographie optique cardiaque. Il fournit une analyse des principaux paramètres de l’électrophysiologie cardiaque, y compris la morphologie AP et CaT, le CV, l’intervalle diastolique, la fréquence dominante, le temps de pic et la constante de relaxation (τ) 15,23. Le logiciel permet plusieurs options de filtrage, y compris le filtre gaussien, le filtre Savitzky-Goaly et la correction de la ligne de base Top-hat. Le filtre gaussien est un lissage bidimensionnel en calculant le lissage moyen pondéré de chaque canal et des canaux adjacents. Il est couramment utilisé pour le bruit glitch de pointe. Le filtre de Savitzky-Goaly s’ajuste à un sous-ensemble polynomial inférieur et continu de jeux de données adjacents par la méthode des moindres carrés, ce qui répond au besoin de divers filtrages lisses et est également efficace pour traiter des ensembles de données non périodiques et non linéaires dérivés du bruit. La correction de la ligne de base peut ajuster les signaux optiques à la même hauteur en fonction des pics des traces, en calculant des paramètres tels que la durée du potentiel d’action (APD) et la durée transitoire calcique (CaTD) avec beaucoup plus de précision. Une dérive de la ligne de base se produit parfois lors de l’échantillonnage de signaux de tension et de fluorescence de calcium. Il est également utile lors du calcul des alternans et de l’amplitude du calcium. Les deux ventricules ont été sélectionnés pour une étude électrophysiologique.
Avantages et inconvénients de la cartographie à double colorant et méthodes pour limiter les interférences
Ces dernières années, on s’est rendu compte qu’il est essentiel de clarifier la dépolarisation ou la repolarisation cellulaire et l’hétérogénéité de la conduction intercellulaire dans l’ensemble du cœur, ainsi que le couplage de l’horloge membranaire et de l’horloge calcique, ce qui est essentiel pour comprendre le mécanisme de maladies telles que l’arythmie24,25. La cartographie optique a une haute résolution spatio-temporelle pour déterminer les propriétés d’activation et de repolarisation ventriculaire du cœur des souris transgéniques26,27,28,29. Il peut également détecter l’imagerie multiparamétrique, par exemple, la mesure du potentiel membranaire et du calcium intracellulaire d’un même cœur24,30 ou d’un tissu31,32 chargé de tension et d’un colorant sensible au calcium. L’imagerie à double colorant est bénéfique pour étudier la relation entre le potentiel d’action et le calcium, comme la relation entre l’horloge membranaire (M) et l’horloge Ca2+ (C) ou la libération spontanée et retardée de calcium après la dépolarisation (DAD). L’excitation cardiaque normale nécessite alors que les événements cycliques des deux horloges soient alignés. La perturbation de cet alignement entraîne une arythmie25. La relation entre la libération spontanée de calcium et la DAD est le mécanisme de déclenchement des activités dans l’insuffisance cardiaque 33. Cependant, la combinaison de colorants doit être soigneusement sélectionnée. La combinaison de RH-237/Rhod-2 ou di-4-ANEPPS/Indo-1 permet un enregistrement simultané, tandis que Fluo-3/4/di-4-ANEPPS entraînera des erreurs dues au chevauchement des spectres d’émission de deux colorants30,34,35. Cette expérience a sélectionné RH237 et Rhod-2 AM pour charger le cœur et a acquis une bonne qualité d’imagerie.
De plus, la caméra utilisée dans ce protocole dispose de deux surfaces cibles, ce qui lui permet de capturer les signaux divisés sur une interface d’échantillonnage et permet à une seule caméra de détecter deux longueurs d’onde d’émission différentes. Une telle cartographie simultanée de l’AP et du CaT optiques combinant divers protocoles de spectroscopie photoélectronique (PES) nous permettra de déterminer l’interrelation entre l’anormalisation [Ca2+]i et l’instabilité électrique dans des conditions de contrainte et l’effet de la potentialisation post-activation sur ces anomalies. La nature spatialement hétérogène du cycle SR Ca2+ et la façon dont cela affecte l’émergence, la gravité et la concordance des alternants électriques et du comportement arythmogène, tels que les alternants spatialement discordants et les VT conséquents, seront étudiés dans le cœur intact dans différents groupes. Les alternatifs SR Ca 2+, la réfractarité RyR2 et leur rôle dans les alternatifs SR Ca2+ et APD seront explorés.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700308 à XO et 31871181 à ML, et 82270334 à XT), le Programme de soutien à la science et à la technologie (CN) de la province du Sichuan (2021YJ0206 à XO, 23ZYZYTS0433 et 2022YFS0607 à XT et 2022NSFSC1602 à TC) et le Laboratoire d’État clé pour la chimie et l’ingénierie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi) (CMEMR2017-B08 à XO), MRC (G10031871181 à ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE à Oxford (ML) subventions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
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