Summary
Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Abstract
De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.
Introduction
Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 die codeert voor ryanodinereceptor 2 (RyR2) van Ca2+ afgiftekanalen5,6, FKBP12.67, CASQ2 codeert voor cardiale calsequestrine8, TRDN codeert voor het junctionele SR-eiwit triadine 9, en CALM19, CALM2 10 en CALM3 codeert identiek voor calmoduline11,12. Deze genotypische patronen schrijven de aritmische gebeurtenissen toe aan de ongereguleerde pathologische afgifte van SR-opslag Ca2+12.
Spontane Ca 2+ afgifte van SR kan worden gedetecteerd als Ca 2+ vonken of Ca 2+ golven, die de Na+/Ca 2+ wisselaar (NCX) activeert. De wisselaar van één Ca2+ voor drie Na+ genereert een inwaartse stroom, die de diastolische depolarisatie versnelt en de membraanspanning naar de actiepotentiaaldrempel (AP) drijft. Bij RyR2 knock-in muizen leidt de verhoogde activiteit van RyR2R4496C in de sinusknoop (SAN) tot een onverwachte afname van de SAN-automaticiteit door Ca 2+-afhankelijke afname van I Ca,L en SRCa 2+ depletie tijdens diastole, waarbij subcellulaire pathofysiologische veranderingen worden geïdentificeerd die bijdragen aan de SAN-disfunctie bij CPVT-patiënten13,14. Het optreden van de verwante cardiomyocyt cytosolischeCa 2+ golven is waarschijnlijker na verhogingen van het cytosolische [Ca2+] op de achtergrond na RyR-sensibilisatie door catecholamine, waaronder isoproterenol (ISO), provocatie.
Gedetailleerde kinetische veranderingen in Ca 2+-signalering na RyR2-gemedieerde Ca2+-afgifte als reactie op activering van actiepotentiaal (AP) die de oorzaak kunnen zijn van de waargenomen ventriculaire aritmieën in intacte cardiale CPVT-modellen moeten nog worden bepaald voor het volledige bereik van gerapporteerde RyR2-genotypen12. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput mapping van Ca2+ signalen en transmembraanpotentialen (Vm) in muizen wild-type (WT) en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en na isoproterenol provocatie. Dit protocol biedt een methode voor de mechanistische studie van CPVT-ziekte in geïsoleerde muizenharten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor de experimenten worden mannelijke 10 tot 14 weken oude wildtype muizen of RyR2-R2474S/+ muizen (C57BL/6 achtergrond) met een gewicht van 20-25 g gebruikt. Alle procedures zijn goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Southwest Medical University, Sichuan, China (goedkeuring nr.20160930) in overeenstemming met de nationale richtlijnen waaronder de instelling opereert.
1. Voorbereiding
- Voorraad oplossingen
- Blebbistatine-stockoplossing: Voeg 1 ml 100% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de oorspronkelijke kolf met 2,924 mg (-) blebbistatinepoeder om een concentratie van 10 mM te bereiken.
- Spanningsindicator RH237 voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan de originele kolf met 1 mg RH237-poeder om een concentratie van 2,01 mM te bereiken.
- Calciumindicator Rhod-2 AM voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 1 mg Rhod-2 AM-poeder om een concentratie van 0,89 mM te bereiken.
- Pluronic F127 stockoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 200 mg Pluronic F127 om een concentratie van 20% w/v (0,66 mM) te bereiken.
- Aliquot de stockoplossingen in PCR-buisjes van 200 μl in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM en 51 μl blebbistatine) voor eenmalig of dubbel gebruik om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien te voorkomen. Wikkel de oplossingen vervolgens in aluminiumfolie en bewaar ze bij -20 °C, behalve de Pluronic F127-voorraadoplossing die in een donkere kamer bij kamertemperatuur wordt geplaatst.
- Perfusie oplossing
- Krebs-oplossing (in mM): Bereid 1 L Krebs-oplossing (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 en glucose 10).
- Filtreer de oplossing met een aseptisch naaldfilter van 0,22 μm en oxygeneer met 95% O 2/5% CO2.
- Neem 40 ml Krebs-oplossing in een centrifugaalbuis van 50 ml en bewaar deze bij 4 °C voor follow-up hartisolatie.
- Het Langendorff-perfusiesysteem en het optische kaartapparaat
- Stel het Langendorff-perfusiesysteem in.
- Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C.
- Was het Langendorff-perfusiesysteem met 1 L gedeïoniseerd water.
- Perfuseer de oplossing uit het inlaatkanaal en stel het uitstroomdebiet in op 3,5-4 ml/min. Zuurstof het perfusaat vervolgens met O 2/CO2 (95%/5%) gas bij 37 °C.
OPMERKING: Een luchtbel is nooit toegestaan in het perfusiesysteem.
- Bereid het optische mappingsysteem voor.
- Installeer de EMCCD-camera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (512 × 512 pixels), lens (40x vergroting), golflengtesplitter light-emitting diodes (LED's), elektrocardiogram (ECG)-monitor en stimulatie-elektrode (Afbeelding 1).
- Stel de juiste werkafstand van de lens naar de hartpositie in.
- Plaats twee LED's op de diagonale positie van het thermostatische bad voor een gelijkmatige verlichting, waardoor een golflengte van 530 nm ontstaat voor het genereren van excitatielicht. Gebruik een ET525/50 sputterfilter om out-of-band licht voor de LED's te verwijderen.
- Pas de handgreepschakelaar aan om een gelijk vierkant van het doeloppervlak te bereiken, waardoor de spannings- en calciumbeelden adequaat op de verwervingsinterface verschijnen.
- Draai het diafragma van de lens naar de maximale diameter om te voorkomen dat spannings- of calciumsignalen lekken.
- Stel de cameralens op de juiste hoogte af, want deze heeft een fijne werkafstand tot het thermostatische bad, meestal wordt 10 cm gebruikt.
- Schakel de camera in voor een stabiele bemonsteringstemperatuur bij -50 °C.
- Stel het Langendorff-perfusiesysteem in.
2. Werkwijze
- Oogst, canulatie en perfusie van muizenhart
- Injecteer de dieren intraperitoneaal met avertine-oplossing (1,2%, 0,5-0,8 ml) en heparine (200 eenheden) om lijden en pijnreflex te minimaliseren en de vorming van bloedstolsels te voorkomen. Offert de dieren na 15 minuten door cervicale dislocatie.
- Open de kist met een schaar, oogst het hart voorzichtig en plaats het in de koude Krebs-oplossing (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) om de stofwisseling te vertragen en het hart te beschermen.
- Verwijder het omringende weefsel van de aorta, kanunneer de aorta met een op maat gemaakte canulerende naald (buitendiameter: 0,8 mm, binnendiameter: 0,6 mm, lengte: 27 mm) en fixeer deze met een 4-0 zijden hechtdraad.
- Doordrenk het hart met het Langendorff-systeem met een constante snelheid van 3,5-4,0 ml/min en houd de temperatuur op 37 ± 1 °C.
OPMERKING: Alle volgende procedures worden in deze toestand uitgevoerd. - Steek een klein plastic buisje (0,7 mm diameter, 20 mm lengte) in de linker hartkamer om de congestie van de oplossing in de kamer te verminderen om overbelasting te voorkomen.
- Ontkoppelaar van excitatie-contractie en dual-dye belasting
- Plaats twee draden in het parfum in het bad, schakel de stroomvoorziening van de ECG-versterkerbox en de elektrische stimulatieregelaar in en start vervolgens de ECG-software waarnaar wordt verwezen en controleer het ECG continu.
- Voer de volgende stappen in het donker uit wanneer het hart een stabiele toestand bereikt (het hart klopt ritmisch met ~400 slagen per minuut).
- Meng 50 μL 10 mM blebbistatine-stockoplossing met 50 ml Krebs-oplossing om een concentratie van 10 μM te bereiken. Laat het mengsel van blebbistatine en Krebs-oplossing gedurende 10 minuten constant in het hart doordringen om contractie los te koppelen van excitatie en contractieartefacten tijdens het filmen te voorkomen.
- Gebruik een rode zaklamp om te controleren of de samentrekking van het hart volledig stopt, omdat samentrekking de kwaliteit van het laden van de kleurstof zal beïnvloeden.
- Meng na het ontkoppelen van excitatie-contractie 15 μL Rhod-2 AM-voorraadoplossing met 15 μL Pluronic F127-stockoplossing in 50 ml Krebs-oplossing om de eindconcentraties van 0,267 μM Rhod-2 AM en 0,198 μM Pluronic F127 te bereiken. Doordrenk het hart vervolgens continu met Rhod-2 AM werkoplossing gedurende 15 minuten in het Langendorff-perfusiesysteem.
- Houd de zuurstoftoevoer op peil tijdens het laden van intracellulaire calciumkleurstoffen. Aangezien bellen gemakkelijk worden gevormd in Pluronic F127, moet u een bellenvanger in het perfusiesysteem plaatsen om gasembolisatie van de kransslagaders te voorkomen.
- Verdun 10 μL RH237-stockoplossing in 50 ml perfusaat om de uiteindelijke concentratie van 0,402 μM te bereiken en laad gedurende 10 minuten.
- Maak aan het einde van het laden met dubbele kleurstof een reeks foto's om er zeker van te zijn dat zowel de spannings- als de calciumsignalen voldoende zijn voor analyse (geen interactie tussen twee signalen).
- Optische mapping en aritmie-inductie
OPMERKING: Het optisch in kaart brengen begint na het stoppen van de contractie en een geschikte kleurstofbelasting, en het hart wordt achtereenvolgens geperfundeerd zoals in de hierboven beschreven stappen in 2.1 (4).- Schakel de twee LED's in voor excitatielichten en pas hun intensiteit aan op het juiste bereik (sterk genoeg voor verlichting en relatief eenvoudig filmen, maar niet te robuust voor overbelichting).
- Plaats het hart onder het detectieapparaat, zorg ervoor dat het voldoende verlicht wordt door twee LED's en stel de diameter van de lichtvlek in op 2 cm.
- Stel de werkafstand van de lens tot het hart in op 10 cm, wat een bemonsteringsfrequentie van bijna 500 Hz en een ruimtelijke resolutie van 120 x 120 μm per pixel oplevert.
- Open de signaalbemonsteringssoftware om de camera digitaal te bedienen om tegelijkertijd spannings- en calciumsignalen vast te leggen.
- Start de myopacer-veldstimulator en stel het stimulatiepatroon in op Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms stimulatieduur voor elke puls en 0.3 V als initiële intensiteit.
- Gebruik 30 opeenvolgende 10 Hz S1-stimuli om de diastolische spanningsdrempel van het hart te testen die wordt aangedreven door de ECG-opnamesoftware. Verhoog geleidelijk de spanningsamplitude totdat 1:1 opname is gerealiseerd (controleer QRS-golf van de ECG-monitor, actiepotentiaal (AP) en calciumtransiënten (CaT)-signalen).
- Na het bepalen van de spanningsdrempel, loopt u het hart met een intensiteit van 2x de diastolische spanningsdrempel met een paar platina-elektroden die zijn bevestigd aan de epicardiale apex van de linker hartkamer (LV) (ELVA).
- Implementeer het S1S1-protocol om calcium- of actiepotentiaalalternanen en restitutie-eigenschappen te meten. Versnel het hart achtereenvolgens met een basiscycluslengte van 100 ms, waarbij u elke volgende reeks 10 ms van de cycluslengte verlaagt totdat 50 ms is bereikt. Elke aflevering bevat 30 opeenvolgende stimuli met een pulsbreedte van 2 ms. Begin tegelijkertijd met het optisch in kaart brengen vóór stimulatie (de bemonsteringstijd omvat ~10 sinusritmes en pacingduur).
- Om de ventriculaire effectieve refractaire periode (ERP) te meten met behulp van het S1S2-stimulusprotocol, begint u met een S1S1-stimulatiecycluslengte van 100 ms met een S2 gekoppeld aan 60 ms met een stapafname van 2 ms totdat S2 er niet in slaagt het ectopische QRS-complex vast te leggen.
- Voer voor aritmie-inductie eeuwigdurende burst-stimulatie van 50 Hz uit (50 continue elektrische stimulaties met een pulsbreedte van 2 ms) en voer dezelfde stimulatie-episode uit na een rustinterval van 2 s.
- Observeer ECG-opnames zorgvuldig tijdens de continue hoogfrequente pacing-periode, zodat de gelijktijdige optische mapping-opnames onmiddellijk kunnen beginnen wanneer een interessante aritmische ECG-golf wordt gegenereerd (aangezien de meeste hartritmestoornissen worden veroorzaakt door elektrische stimulatie, worden de optische signalen 2-3 s vóór burst-stimulatie bemonsterd in geval van verlies van belangrijke cardiale gebeurtenissen).
- Beeld met EMCCD-camera (bemonsteringsfrequentie: 500 Hz, pixelgrootte: 64 x 64).
- Data-analyse
- Laden van beelden en signaalverwerking
- Druk op Map selecteren en Afbeeldingen laden om de afbeeldingen in de beeldacquisitiesoftware te laden voor semi-automatische massale videogegevensanalyse volgens de eerder beschreven instellingen en protocollen15,16.
- Voer de juiste samplingparameters in (zoals pixelgrootte en framerate).
- Stel de afbeeldingsdrempel in door handmatige invoer en selecteer het interessegebied (ROI).
- Implementeer een Gaussiaans ruimtelijk filter van 3 x 3 pixels, een Savitzky-Goaly-filter en een basislijncorrectie met een hoge hoed.
- Druk op Afbeeldingen verwerken om de basislijn te verwijderen en de elektrofysiologische parameters te berekenen, zoals APD80 en CaTD50.
- Analyse van elektrofysiologische parameters
- Stel de initiatietijd van APD in op de piek en het eindpunt op 80% repolarisatie (APD80) voor de berekening van APD80. Evenzo wordt de starttijd van CaTD gedefinieerd als de piek en het eindpunt als de ontspanning van 80%.
- De meting van de geleidingssnelheid (CV) is afhankelijk van de pixelgrootte en de actiepotentiaalgeleidingstijd tussen twee pixels of meer. Bereken de gemiddelde snelheid van alle gekozen pixels - dit is de gemiddelde geleidingssnelheid van het geselecteerde gebied. Genereer tegelijkertijd overeenkomstige isochronale afbeeldingen voor een duidelijk beeld van de geleidingsrichting.
OPMERKING: O'Shea et al.15 rapporteerden de CV-meting in detail. - Voor de analyse van alternanen en aritmieën worden calciumalternanen gedefinieerd als een continue grote en kleine piekamplitude die afwisselend verschijnen. Gebruik de piekamplitudeverhouding om de ernst van frequentieafhankelijke alternanen te beoordelen (1-A2/A1). Pas fasekaarten toe om complexe aritmieën zoals ventriculaire tachycardie (VT) te analyseren. Zoek naar de rotoren die duidelijk in een specifiek gebied verschijnen terwijl de rotors verschuiven.
- Laden van beelden en signaalverwerking
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optical mapping is de afgelopen tien jaar een populaire benadering geweest bij het bestuderen van complexe hartritmestoornissen. De optische mapping-opstelling bestaat uit een EMCCD-camera, die een bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz en een ruimtelijke resolutie van 74 x 74 μm voor elke pixel oplevert. Het maakt een vrij hoge signaal-ruisverhouding mogelijk tijdens signaalbemonstering (Figuur 1). Zodra het met Langendorff doorbloede hart een stabiele toestand bereikt en het laden van de kleurstof is voltooid, wordt het hart in de homeothermische kamer geplaatst onder verlichting van twee 530 nm LED's, die worden gebruikt voor de excitatie van de spanningsindicator RH237 en Ca2+ indicator Rhod-2 AM. Het emissielicht wordt gesplitst in twee golflengten van 600 nm (voor Ca2+) en 670 nm (voor Vm), die gelijktijdig worden gedetecteerd met behulp van de EMCCD-camera. Na perfusie van avertine en heparine gedurende 15 minuten, gebruikt u de chirurgische instrumenten (Figuur 2A) om de borstkas te openen en snel het hart te verwijderen, en brengt u het vervolgens over in de koude Krebs-oplossing (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) (Figuur 2B). Reinig de omliggende weefsels zorgvuldig, fixeer de aorta met een 4-0 hechting en een plastic buis van 0,7 mm wordt in de linker hartkamer ingebracht (Figuur 2C) om de congestie van het perfusaat in de linker ventrikelkamer op te heffen. Plaats de ECG-afleidingen in het parfum (Figuur 2D) en zorg ervoor dat het hart ritmisch klopt volgens de ECG-monitoring die wordt aangestuurd door de ECG-opnamesoftware. Voer vervolgens dual-dye laden uit in het donker (Figuur 2E).
Nadat contractieartefacten zijn geminimaliseerd door blebbistatine (10 μM) en een adequate kleurstofbelasting is voltooid, begon het filmen ongeveer 10 sinusslagen vóór het S1S1-stimulatieprotocol om frequentieafhankelijke elektrofysiologische parameterrestitutie-eigenschappen en calciumalternanen na isoproterenol (1 μM ISO) uitdaging te evalueren (Figuur 3A). Figuur 3B toont een representatief ECG-golffront van VT en bijbehorende actiepotentiaal (AP) en CaT-sporen geïnduceerd door een burst-pacingsequentie van 50 Hz in een CPVT-muis. Optische signaalbeeldvormingssoftware wordt gebruikt om een semi-automatische analyse van enorme videogegevens uit te voeren.
Figuur 4A,B toont typische sporen en warmtekaarten van respectievelijk APD80 en CaTD80. ISO verkort APD80 bij WT- en CPVT-muizen, maar er werd geen verschil gevonden tussen WT- en CPVT-muizen voor en na de ISO-provocatie (Figuur 4C, **P < 0,01. n = 5/6). Figuur 4D geeft aan dat CaTD80 in CPVT-muizen langer is dan in WT na de ISO-provocatie, terwijl er geen significantie was vóór ISO-behandeling (**P < 0,01. n =6.).
Voor geleidingsmeting presenteert figuur 5A een enkel vectoralgoritme voor de kwantificering van CV. Volgens de spanningssignalen bezitten de WT- en CPVT-harten hetzelfde geleidingsvermogen over het epicardium bij baseline en na ISO-interventie (Figuur 5B). Figuur 5C,D toont de representatieve activeringskaarten van spanning en calcium in WT- en CPVT-harten voor en na de ISO-uitdaging.
Calciumalternanen zijn een kritische parameter voor aritmie. Calciumamplitude-alternanen worden berekend volgens de formulering zoals weergegeven in figuur 6A. Calciumsignalen in WT-harten blijven stabiel bij baseline tijdens opeenvolgende S1S1-stimulatie op 14,29 en 16,67 Hz (Figuur 6B), terwijl CPVT-harten frequentieafhankelijke alternanen vertonen (Figuur 6C). Na de ISO-uitdaging vertonen CPVT-harten frequentieafhankelijke alternanen in het calciumsignaal tijdens S1S1-pacing, terwijl WT-harten niet worden beïnvloed (Figuur 6D,E). Na continue S1S1-stimulatie wordt een burst-pacingprotocol uitgevoerd om dodelijke aritmieën te induceren. WT- en CPVT-harten vertonen normale geleiding tijdens 50 Hz burst-stimulatie bij baseline (Figuur 7A). Na perfusie met ISO vertonen CPVT-harten hoogfrequente rotoren na 50 Hz burst-pacing, terwijl WT-harten een normale geleiding behouden (Figuur 7B).
Figuur 1: Optische karteringsapparatuur. Het systeem omvat een speciaal ontworpen EMCCD-camera met een hoge ruimtelijk-temporele resolutie (bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz, minimale bemonsteringspixel 74 x 74 μm). Een elektrische stimulatiecontroller wordt gebruikt voor bemonstering en output elektrische stimulatieprotocol. Twee groene LED's worden gebruikt voor het excitatielicht van fluorescentiesondes. Een dichroïsche langdoorlaatspiegel (610 nm) en bijbehorende stralers splitsen de spannings- en calciumfluorescentie-emissielampen. RH237, de spanningsgevoelige kleurstof, heeft een emissielicht met een piekgolflengte van 670 nm, terwijl Rhod-2 AM, de calciumgevoelige kleurstof, een emissielicht heeft met een piekgolflengte van 600 nm. Kleine veranderingen in beide fluorescentiesignalen konden tegelijkertijd door de camera worden vastgelegd vanwege de hoge bemonsteringsfrequentie en gevoeligheid van de camerasensor. Afkortingen: EMCCD = electron-multiplying charge-coupled device; LED = lichtgevende diode; ECG = elektrocardiogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbereiding en laden met dubbele kleurstof . (A) De chirurgische instrumenten. (B) Oogst van het muizenhart. (C) Snijd het onnodige weefsel zorgvuldig af voor een duidelijk zicht op de aorta en steek een plastic buisje van 0,7 mm van de aorta in de linker hartkamer. (D) Het hart wordt snel afgevoerd naar het Langendorff-perfusiesysteem. (E) Laden met dubbele kleurstof en stoppen met excitatie-contractie in het donker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: S1S1-protocol en aritmie-inductieprotocol. (A) Representatief ECG-golffront en bijbehorende AP- en calciumsignaalsporen met behulp van het S1S1-stimulatieprotocol na ISO-uitdaging. (B) VT-inductie door een burst-pacing-sequentie van 50 Hz na perfusie van ISO in een CPVT-muis. Afkortingen: ECG = elektrocardiogram; AP = actiepotentiaal; ISO = isoproterenol; VT = ventriculaire tachycardie; CPVT = catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: APD80- en CaTD80-analyse bij 10 Hz voor en na ISO-uitdaging. (A) Representatieve AP-sporen en APD80-heatmaps van WT- en CPVT-harten voor en na ISO-behandeling. (B) Typische CaT-sporen en CaTD80-heatmaps van WT- en CPVT-harten voor en na de ISO-uitdaging. (C) ISO verkort APD80 bij WT- en CPVT-muizen, maar er wordt geen verschil gevonden tussen WT- en CPVT-muizen voor en na de ISO-challenge. (D) CaTD80 in CPVT-muizen zijn langer dan in WT na ISO-provocatie, terwijl er geen significantie was vóór ISO-behandeling. (* P < 0,05, **P < 0,01. n = 5/6.) Afkortingen: AP = actiepotentiaal; APD80 = piek bij 80% repolarisatie; ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie; WT = wildtype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van de geleidingssnelheid bij 10 Hz. (A) Het enkelvoudige vectoralgoritme van geleidingssnelheid. (B) Geen verschil in de CV van AP bij WT- en CPVT-muizen. (C) Representatieve warmtekaarten tonen aan dat CPVT-muizen hetzelfde geleidingsvermogen hebben als WT-muizen voor en na de ISO-uitdaging volgens spanningssignalen. (D) Er wordt geen significant verschil gevonden in de twee groepen voor actiepotentiaalgeïnduceerde CaT80-isochronen voor en na de ISO-provocatie. Afkortingen: AP = actiepotentiaal; ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie; WT = wildtype; AT = activeringstijd; CV = geleidingssnelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Analyse van calciumamplitudealternanen. (A) Het algoritme voor het berekenen van calciumamplitude-alternanen. (B) Calciumsignalen in WT-harten blijven stabiel bij baseline tijdens opeenvolgende S1S1-pacing op 14.29 en 16.67 Hz, terwijl (C) CPVT-harten frequentieafhankelijke alternanen vertonen. (D) WT-harten worden niet beïnvloed door de ISO-uitdaging, terwijl (E) na de ISO-provocatie CPVT-harten frequentieafhankelijke alternanen vertonen in het calciumsignaal tijdens S1S1-stimulatie. Afkortingen: ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie; WT = wildtype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Analyse van tachyaritmie met behulp van fasekaarten . (A) WT- en CPVT-harten vertonen normale geleiding tijdens 50 Hz burst-stimulatie bij baseline. (B) Na perfusie met ISO vertonen CPVT-harten hoogfrequente rotoren na 50 Hz burst-stimulatie, terwijl WT-harten een normale geleiding behouden. Afkortingen: ISO = isoproterenol; CPVT = catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie; WT = wildtype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.
Bereiding van de oplossing
De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houdend met hun waterabsorptie en toegevoegd aan de Krebs-oplossing nadat alle andere componenten zijn opgelost in zuiver water, omdat Mg 2+ en Ca 2+ gemakkelijk kunnen neerslaan met CO 3 2+. De Krebs-oplossing wordt gedurende ten minste 30 minuten geborreld met 95% O 2/5% CO2 om zuurstofvoorziening te garanderen. Omdat het hart van de muis bijzonder gevoelig is voor de pH, moet de pH van de oplossing na oxygenatie rond de 7,4 liggen. Zelfs als er kleine deeltjes in de oplossing zitten, kunnen de experimentele resultaten worden beïnvloed omdat deze deeltjes de haarvaten kunnen blokkeren en het perfusie-effect kunnen beïnvloeden. Daarom wordt de oplossing voor gebruik gefilterd met behulp van een aseptisch naaldfilter van 0,22 μm.
Voorbereiding van het hart
Voordat harten worden geoogst, worden de muizen eerst gehepariniseerd om stolselvorming in het kransslagadersysteem te voorkomen, waardoor wordt voorkomen dat een slechte kleurstofperfusie veroorzaakt door hartcongestie de daaropvolgende beeldvorming beïnvloedt. Hoe korter de ischemische tijd van het hart, hoe beter de conditie van het hart. Daarom wordt de ischemische tijd binnen 2-3 minuten gecontroleerd vanaf het oogsten van harten tot canulatie via de aorta op het Langendorff-systeem. Daarnaast is ook een goed gehandhaafde perfusiedruk essentieel. Daarom wordt een dunne siliconen (plastic) buis in de linkerventrikelholte ingebracht om te voorkomen dat de linkerventrikeldruk te hoog wordt tijdens ventriculaire contractie nadat de linkerventrikeluitgang is afgebonden, wat kan leiden tot slechte myocardperfusie en anoxische weefselverzuring.
Kleurstof laden
Deze experimenten voeren kleurstofbelasting uit door het hart in het Langendorff-systeem te perfuseren. Het is van cruciaal belang om het hartritme te controleren, omdat er een slechte kleurstofbelasting optreedt wanneer het abnormale ritme wordt veroorzaakt door chirurgische ingrepen of ischemie-reperfusieschade. Het hart moet gezond genoeg zijn om de volgende stappen uit te voeren. Rhod-2 AM, een Ca2+-gevoelige kleurstof, is een acetylmethylesterderivaat van Rhod 2, dat gemakkelijk in zijn AM-vorm in cellen kan worden geladen. Een 100-voudige toename van de fluorescentie-intensiteit van het molecuul is het gevolg van Ca2+ chelatie17. Pluronic F127 is opgenomen in de Rhod-2 AM-laadoplossing om te voorkomen dat Rhod-2 AM polymeriseert in de buffer en om het te helpen de cellen binnen te dringen. Pluronic F127 kan de stabiliteit van Rhod-2 AM verminderen, dus het wordt alleen aanbevolen om het toe te voegen bij het bereiden van de werkoplossing, maar niet in de opslagoplossing voor langdurige opslag. De spanningsgevoelige kleurstof RH237 wordt in dit onderzoek gebruikt vanwege de gunstige spectrale eigenschappen voor gebruik met Ca2+ indicator Rhod-2 AM.
De beste signaal-ruisverhouding bereiken
Het verkrijgen van beelden met hoge signaal-ruisverhoudingen is het doel van beeldvorming, maar ruis is als een schimmige geest die altijd problemen veroorzaakt. Vanwege zwakke signalen is minder ruis vooral belangrijk in sommige microscopische beeldvormingstoepassingen met hoge snelheid, zoals optische mapping. De signaal-ruisverhouding (SNR) wordt berekend als de gemiddelde kwadratische amplitudeverhouding van de wortel tot de gemiddelde kwadratische ruis, waarbij de ruisamplitude wordt geëvalueerd bij rustpotentiaal18. Sommige factoren, zoals lichtbron, optische filters, focusseringsoptica en fotodetectoren, zijn essentieel om de beste SNR te bereiken. In het onderzoek wordt het achtergrondgebied van het monster onderzocht op ruis, die vaak op een klein niveau fluctueert. Het optische signaal dat door elke pixel wordt gedetecteerd, is het gemiddelde van het uitgezonden licht van het oppervlak. AP- en calciumactiviteiten oscilleren tijdens aritmie en de amplitude van beide signalen is relatief laag. Zelfs kleine interferentie kan leiden tot vervorming van optische signalen en leiden tot fouten in de gegevensanalyse. Daarom moet de interpretatie van optische signalen voorzichtig zijn wanneer de lokale heterogeniteit wordt veroorzaakt door elektrische functie tijdens aritmieën zoals VT.
Het bewegingsartefact verminderen
Vergeleken met elektrode-opname worden optische signalen vaak beïnvloed door de samentrekkingsactiviteit van de Langendorff-geperfuseerde harten als gevolg van bewegingsartefacten. Om nauwkeurige optische signalen op te vangen, worden meestal farmacologische remmers van excitatie-contractie gebruikt. Om het bewegingsartefact tijdens beeldvorming te minimaliseren, wordt blebbistatine gebruikt om het kloppen van het hart te stoppen. Het is een selectieve remmer van de ATPase-activiteit van niet-spiermyosine II en ontkoppelt effectief het excitatie-contractieproces van het hart 19,20,21. Hoewel sommige onderzoeken enkele bijwerkingen impliceren bij het gebruik van de verbinding22, gebruiken we de laagste werkconcentratie van 10 μM om de mogelijke schade aan het hart te minimaliseren.
ElectroMap-software voor analyse van cardiale optische mapping-datasets
ElectroMap is een high-throughput open-source software voor de analyse van cardiale optische mapping datasets. Het biedt een analyse van de belangrijkste cardiale elektrofysiologische parameters, waaronder AP- en CaT-morfologie, CV, diastolisch interval, dominante frequentie, time-to-peak en relaxatieconstante (τ) 15,23. De software biedt meerdere filteropties, waaronder het Gaussian-filter, het Savitzky-Goaly-filter en de Top-hat-basislijncorrectie. Gaussiaans filter is een tweedimensionale afvlakking door de gewogen gemiddelde afvlakking van elk kanaal en aangrenzende kanalen te berekenen. Het wordt vaak gebruikt voor spike-glitch-geluid. Het Savitzky-Goaly-filter past op een lagere polynoom en continue subset van aangrenzende datasets via de kleinste kwadratenmethode, die voldoet aan de behoefte aan verschillende soepele filtering en ook effectief is voor het verwerken van niet-periodieke en niet-lineaire datasets die zijn afgeleid van ruis. Top-hat basislijncorrectie kan de optische signalen op dezelfde hoogte aanpassen aan de pieken van de sporen, waardoor parameters zoals actiepotentiaalduur (APD) en calciumtransiëntduur (CaTD) veel nauwkeuriger worden berekend. Baseline-drift treedt af en toe op bij het bemonsteren van spannings- en calciumfluorescentiesignalen. Het is ook nuttig bij het berekenen van calciumalternanen en amplitude. Beide ventrikels werden geselecteerd voor elektrofysiologisch onderzoek.
Voor- en nadelen van dual-dye mapping en methoden om interferentie te beperken
In de afgelopen jaren is men zich ervan bewust geworden dat het van vitaal belang is om celdepolarisatie of -repolarisatie en intercellulaire geleidingsheterogeniteit in het hele hart op te helderen, evenals koppeling van de membraanklok en calciumklok, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van het mechanisme van ziekten zoals aritmie24,25. Optische mapping heeft een hoge spatiotemporele resolutie om de ventriculaire activerings- en repolarisatie-eigenschappen van het hart van transgene muizen te bepalen26,27,28,29. Het kan ook multiparameterbeeldvorming detecteren, bijvoorbeeld meting van membraanpotentiaal en intracellulair calcium van hetzelfde hart24,30 of weefsel31,32 geladen met spanning en calciumgevoelige kleurstof. Dual-dye beeldvorming is gunstig voor het bestuderen van de relatie tussen actiepotentiaal en calcium, zoals de relatie tussen de membraan (M) klok en Ca2+ (C)-klok of spontane calciumafgifte en vertraagd na depolarisatie (DAD). Normale cardiale excitatie vereist dan dat de cyclische gebeurtenissen in de twee klokken op elkaar zijn afgestemd. Verstoring van deze uitlijning leidt tot aritmie25. De relatie tussen spontane calciumafgifte en DAD is het mechanisme van het uitlokken van activiteiten bij hartfalen 33. De combinatie van kleurstoffen moet echter zorgvuldig worden geselecteerd. De combinatie van RH-237/Rhod-2 of di-4-ANEPPS/Indo-1 maakt gelijktijdige opname mogelijk, terwijl Fluo-3/4/di-4-ANEPPS tot fouten zal leiden als gevolg van overlappende emissiespectra van twee kleurstoffen30,34,35. Dit experiment selecteerde RH237 en Rhod-2 AM om het hart te laden en verkreeg een goede beeldkwaliteit.
Bovendien heeft de camera die in dit protocol wordt gebruikt twee doeloppervlakken, waardoor de gesplitste signalen op één bemonsteringsinterface kunnen worden vastgelegd en een enkele camera twee verschillende emissiegolflengten kan detecteren. Een dergelijke gelijktijdige mapping van optische AP en CaT die verschillende foto-elektronenspectroscopie (PES)-protocollen combineren, zal ons in staat stellen om de onderlinge relatie tussen abnormale [Ca2+]i en elektrische instabiliteit onder stressomstandigheden en het effect van post-activatie potentiëring op deze anomalieën te bepalen. De ruimtelijk heterogene aard van SRCa 2+ cycli en hoe dit het ontstaan, de ernst en de concordantie van elektrische alternanen en aritmogeen gedrag, zoals ruimtelijk discordante alternanen en daaruit voortvloeiende VT's, beïnvloedt, zal in verschillende groepen in het intacte hart worden bestudeerd. SRCa 2+ alternanen, RyR2 refractoriteit en hun rol in SR Ca2+ en APD alternanen zullen worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
