Summary
Denne protokollen introduserer dual-dye optisk kartlegging av musehjerter oppnådd fra villtype og knock-in dyr påvirket av katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi, inkludert elektrofysiologiske målinger av transmembranspenning og intracellulære Ca2+ transienter med høy temporal og romlig oppløsning.
Abstract
Den proarytmiske hjerteforstyrrelsen katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorfe ventrikulære takykardiepisoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer. Musehjertet er en utbredt art for modellering av arvelige hjertearytmiske sykdommer, inkludert CPVT. Samtidig optisk kartlegging av transmembranpotensiale (Vm) og kalsiumtransienter (CaT) fra Langendorff-perfuserte musehjerter har potensial til å belyse mekanismer som ligger til grunn for arytmogenesen. Sammenlignet med undersøkelsen på cellenivå kan den optiske kartleggingsteknikken teste noen elektrofysiologiske parametere, for eksempel bestemmelse av aktivering, ledningshastighet, aksjonspotensiell varighet og CaT-varighet. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for optisk kartlegging av CaT og Vm i villtype og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og under isoproterenolutfordringen. Denne tilnærmingen har vist en gjennomførbar og pålitelig metode for mekanistisk å studere CPVT-sykdom i en ex vivo musehjertepreparasjon.
Introduction
Arvelig hjertesykdom katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorf ventrikulær takykardi (PVT) episoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer 1,2,3,4 . Nyere bevis etter sin første rapport som et klinisk syndrom i 1995 impliserte mutasjoner i syv gener, alle involvert i sarkoplasmatisk retikulær (SR) lagre Ca 2 + utgivelse i denne tilstanden: den hyppigst rapporterte RYR2 koding ryanodin reseptor 2 (RyR2) av Ca2 + utgivelseskanaler5,6, FKBP12.67, CASQ2 koding hjerte calsequestrin8, TRDN koding av det kryssende SR-proteinet triadin 9, og CALM1 9, CALM2 10 og CALM3 identisk kodende calmodulin11,12. Disse genotypiske mønstrene tilskriver de arytmiske hendelsene den uregulerte patologiske frigjøringen av SR-lager Ca2+12.
Spontan Ca 2+-frigjøring fra SR kan detekteres som Ca 2+ gnister eller Ca 2+ bølger, som aktiverer Na+/Ca 2+ veksleren (NCX). Veksleren til en Ca2 + for tre Na + genererer en innadgående strøm, noe som øker den diastoliske depolariseringen og driver membranspenningen til terskelen for handlingspotensial (AP). I RyR2-innslagsmus fører den økte aktiviteten til RyR2R4496C i sinoatrialknuten (SAN) til en uventet reduksjon i SAN-automatikk ved Ca 2+-avhengig reduksjon av I Ca,L og SR Ca2+-uttømming under diastol, identifisering av subcellulære patofysiologiske endringer som bidrar til SAN-dysfunksjon hos CPVT-pasienter 13,14. Forekomst av de relaterte kardiomyocytt-cytosoliske Ca 2+-bølgene er mer sannsynlig etter økning i bakgrunnscytosolisk [Ca2+] etter RyR-sensibilisering av katekolamin, inkludert isoproterenol (ISO), utfordring.
Detaljerte kinetiske endringer i Ca 2+-signalering etter RyR2-mediert Ca2+-frigjøring som respons på aktivering av aksjonspotensial (AP) som kan være årsaken til de observerte ventrikulære arytmiene i intakte hjerte-CPVT-modeller, gjenstår å bestemme for hele spekteret av rapporterte RyR2-genotyper12. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for kartlegging av høy gjennomstrømning av Ca2+ signaler og transmembrane potensialer (Vm) i murine wild-type (WT) og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og etter isoproterenol utfordring. Denne protokollen gir en metode for den mekanistiske studien av CPVT-sykdom i isolerte musehjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hannmus 10 til 14 uker gamle villtypemus eller RyR2-R2474S/+ mus (C57BL/6 bakgrunn) som veier 20-25 g brukes til forsøkene. Alle prosedyrer er godkjent av dyrepleie- og brukskomiteen ved Southwest Medical University, Sichuan, Kina (godkjenning nr. 20160930) i samsvar med de nasjonale retningslinjene som institusjonen opererer under.
1. Forberedelse
- Lagerløsninger
- Blebbistatin stamløsning: Tilsett 1 ml 100 % dimetylsulfoksid (DMSO) i originalkolben inneholdende 2,924 mg (-) blebbistatinpulver for å oppnå en konsentrasjon på 10 mM.
- Spenningsindikator RH237 stamløsning: Tilsett 1 ml 100% DMSO i originalkolben med 1 mg RH237 pulver for å oppnå en konsentrasjon på 2,01 mM.
- Kalsiumindikator Rhod-2 AM stamløsning: Tilsett 1 ml 100% DMSO i 1 mg Rhod-2 AM pulver for å nå en konsentrasjon på 0,89 mM.
- Pluronic F127 stamløsning: Tilsett 1 ml 100 % DMSO i 200 mg Pluronic F127 for å oppnå en konsentrasjon på 20 % w/v (0,66 mM).
- Aliquot stamoppløsningene i 200-μL PCR-rør i 21-51 μL (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 AM og 51 μL blebbistatin) for enkel eller dobbel bruk for å unngå gjentatt frysing og tining. Pakk deretter løsningene inn med aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 °C, bortsett fra Pluronic F127-stamløsningen plassert i et mørkt rom ved omgivelsestemperatur.
- Perfusjonsløsning
- Krebs løsning (i mM): Forbered 1 liter Krebs-løsning (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO4 1.0, KCl 4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 og glukose 10).
- Filtrer oppløsningen med et 0,22 mikrom aseptisk kanylefilter og oksygener med 95 %O2/5 % CO2.
- Ta 40 ml Krebs-oppløsning i et 50 ml sentrifugalrør og oppbevar det ved 4 °C for oppfølging av hjerteisolasjon.
- Langendorff perfusjonssystem og optisk kartleggingsenhet
- Sett opp perfusjonssystemet Langendorff.
- Slå på vannbadet og sett temperaturen på 37 °C.
- Vask Langendorff perfusjonssystem med 1 liter avionisert vann.
- Perfus oppløsningen fra inntakskanalen og juster utstrømningshastigheten til 3,5-4 ml / min. Deretter oksygenerer du parfysatet medO2/CO2 (95 %/5 %) gass ved 37 °C.
MERK: En boble er aldri tillatt i perfusjonssystemet.
- Forbered det optiske kartleggingssystemet.
- Installer EMCCD-kameraet (elektronmultiplikerende ladekoblet enhet) (512 × 512 piksler), objektiv (40x forstørrelse), bølgelengdesplitter lysdioder (LED), elektrokardiogram (EKG) og stimuleringselektrode (figur 1).
- Juster riktig arbeidsavstand fra linsen til hjerteposisjonen.
- Sett to lysdioder i den diagonale posisjonen til det termostatiske badet for jevn belysning, noe som gir en bølgelengde på 530 nm for å generere eksitasjonslys. Bruk et ET525/50 sputter-belagt filter for å fjerne alt out-of-band-lys for lysdiodene.
- Juster håndtaksbryteren for å oppnå en lik firkant av målflaten, slik at spennings- og kalsiumbildene vises tilstrekkelig på innløsningsgrensesnittet.
- Vri blenderåpningen på linsen til maksimal diameter for å unngå lekkasje av spenning eller kalsiumsignaler.
- Juster kameralinsen i riktig høyde, da den tjener en fin arbeidsavstand til termostatbadet, 10 cm brukes mest.
- Slå på kameraet for stabil prøvetakingstemperatur ved -50 °C.
- Sett opp perfusjonssystemet Langendorff.
2. Prosedyrer
- Mus hjerte høsting, kanylering og perfusjon
- Intraperitonealt injiser dyrene med avertinoppløsning (1,2%, 0,5-0,8 ml) og heparin (200 enheter) for å minimere lidelse og smerterefleks og forhindre blodproppdannelse. Etter 15 minutter, ofre dyrene ved livmorhalsforstyrrelse.
- Åpne brystet med saks, høst hjertet forsiktig og legg det i den kalde Krebs-løsningen (4 ° C, 95%O2, 5% CO2) for å senke stoffskiftet og beskytte hjertet.
- Fjern det omkringliggende vevet i aorta, kanylere aorta ved hjelp av en skreddersydd kanyleringsnål (ytre diameter: 0,8 mm, indre diameter: 0,6 mm, lengde: 27 mm) og fest den med en 4-0 silkeutur.
- Perfuser hjertet med Langendorff-systemet med en konstant hastighet på 3,5-4,0 ml / min og hold temperaturen på 37 ± 1 ° C.
MERK: Alle påfølgende prosedyrer utføres i denne tilstanden. - Sett inn et lite plastrør (0,7 mm diameter, 20 mm lengde) inn i venstre ventrikkel for å frigjøre overbelastning av oppløsning i kammeret for å unngå overbelastning.
- Frakobling av eksitasjon-sammentrekning og dual-dye lasting
- Sett to ledninger i perfusatet i badekaret, slå på kreftene til EKG-forsterkerboksen og den elektriske stimuleringskontrolleren, og start deretter den refererte EKG-programvaren og overvåk EKG kontinuerlig.
- Utfør de påfølgende trinnene i mørket når hjertet når en stabil tilstand (hjertet slår rytmisk ved ~ 400 bpm).
- Bland 50 μL av 10 mM blebbistatin stamløsning med 50 ml Krebs løsning for å nå en konsentrasjon på 10 μM. Perfus kontinuerlig blebbistatin-Krebs-løsningsblandingen inn i hjertet i 10 minutter for å koble sammentrekning fra eksitasjon og unngå sammentrekningsartefakter under filmingen.
- Bruk en rød lommelykt for å sjekke om hjertekontraksjonen stopper helt fordi sammentrekning vil påvirke fargestoffbelastningskvaliteten.
- Etter utkobling av eksitasjonskontraksjon, bland 15 μL Rhod-2 AM-stamløsning med 15 μL Pluronic F127-stamløsning i 50 ml Krebs-løsning for å oppnå de endelige konsentrasjonene på 0,267 μM Rhod-2 AM og 0,198 μM Pluronic F127. Deretter perfuserer du hjertet kontinuerlig med Rhod-2 AM arbeidsløsning i 15 minutter i Langendorff perfusjonssystem.
- Hold oksygenforsyningen under intracellulær kalsiumfargestoffbelastning. Siden bobler lett dannes i Pluronic F127, sett inn en boblefelle i perfusjonssystemet for å unngå gassembolisering av koronarene.
- Fortynn 10 μL RH237 stamoppløsning til 50 ml av perfusatet for å nå den endelige konsentrasjonen ved 0,402 μM og utfør lasting i 10 minutter.
- På slutten av dual-dye lasting, ta en sekvens av bilder for å sikre at både spenning og kalsium signaler er tilstrekkelig for analyse (ingen interaksjon mellom to signaler).
- Optisk kartlegging og arytmiinduksjon
MERK: Optisk kartlegging starter etter avslutning av rien og en passende fargebelastning, og hjertet er fortløpende perfundert som i trinnene beskrevet ovenfor ved 2,1 (4).- Slå på de to lysdiodene for eksitasjonslys og juster intensiteten på riktig område (sterk nok til belysning og relativt enkel filming, men ikke for robust for overeksponering).
- Sett hjertet under deteksjonsenheten, sørg for at det er tilstrekkelig belysning av to lysdioder, og juster lyspunktdiameteren til 2 cm.
- Sett arbeidsavstanden fra objektivet til hjertet til 10 cm, noe som gir en samplingsfrekvens på nesten 500 Hz og en romlig oppløsning på 120 x 120 μm per piksel.
- Åpne programvaren for signalprøvetaking for å styre kameraet digitalt for å fange spennings- og kalsiumsignaler samtidig.
- Start myopacerfeltstimulatoren, og sett tempomønsteret ved Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms pacing varighet for hver puls og 0,3 V som en innledende intensitet.
- Bruk 30 påfølgende 10 Hz S1-stimuli for å teste den diastoliske spenningsterskelen til hjertet drevet av EKG-opptaksprogramvaren. Øk spenningsamplituden gradvis til 1: 1-fangst er realisert (sjekk QRS-bølge fra EKG-monitoren, aksjonspotensial (AP) og kalsiumtransienter (CaT) signaler).
- Etter å ha bestemt spenningsterskelen, tempo hjertet med en intensitet på 2x den diastoliske spenningsterskelen med et par platinaelektroder festet til epikardial av venstre ventrikkel (LV) apex (ELVA).
- Implementere S1S1-protokollen for å måle kalsium eller aksjonspotensielle alternans og restitusjonsegenskaper. Tempo hjertet fortløpende med en grunnleggende sykluslengde på 100 ms, og reduser 10 ms av sykluslengden hver påfølgende sekvens til 50 ms er nådd. Hver episode inneholder 30 påfølgende stimuli med en pulsbredde på 2 ms. Start samtidig optisk kartlegging før stimulering (prøvetakingstid inkluderer ~10 sinusrytmer og tempovarighet).
- For å måle den ventrikulære effektive ildfaste perioden (ERP) ved hjelp av S1S2-stimulusprotokollen, begynn med en S1S1-temposykluslengde på 100 ms med en S2 koblet til 60 ms med en trinnreduksjon på 2 ms til S2 ikke klarer å fange ektopisk QRS-kompleks.
- For arytmiinduksjon, utfør evigvarende 50 Hz burst pacing (50 kontinuerlige elektriske stimuleringer med 2 ms pulsbredde), og utfør samme tempoepisode etter et hvileintervall på 2 s.
- Observer EKG-registreringer nøye under den kontinuerlige høyfrekvente pacingperioden, slik at de samtidige optiske kartleggingsopptakene kan starte umiddelbart når en interessant arytmisk EKG-bølge genererer (siden de fleste hjertearytmier induseres av elektrisk pacing, blir de optiske signalene samplet 2-3 s før burst pacing i tilfelle du mister viktige hjertehendelser).
- Bilde med EMCCD-kamera (samplingsfrekvens: 500 Hz, pikselstørrelse: 64 x 64).
- Analyse av data
- Bildelasting og signalbehandling
- Trykk på Velg mappe og last inn bilder for å laste bildene inn i bildeinnsamlingsprogramvaren for halvautomatisk massiv videodataanalyse i henhold til oppsettet og protokollen beskrevet tidligere15,16.
- Angi de riktige prøvetakingsparametrene (for eksempel pikselstørrelse og bildefrekvens).
- Angi bildeterskelen med manuell inndata, og velg interesseområdet (ROI).
- Implementer et gaussisk romfilter på 3 x 3 piksler, et Savitzky-Goaly-filter og en baseline-korrigering med hatten.
- Trykk på Prosessbilder for å fjerne grunnlinjen og beregne de elektrofysiologiske parametrene, for eksempel APD80 og CaTD50.
- Elektrofysiologisk parameteranalyse
- Sett starttiden for APD på toppen og terminalpunktet på 80% repolarisering (APD80) for beregning av APD80. Tilsvarende er CaTD starttid definert som toppen, og terminalpunktet er definert som 80% avslapning.
- Måling av konduksjonshastighet (CV) avhenger av pikselstørrelsen og handlingspotensialets ledningstid mellom to piksler eller mer. Beregn gjennomsnittshastigheten fra alle de valgte pikslene - dette er gjennomsnittlig ledningshastighet for den valgte regionen. Generer tilsvarende isokrone kart samtidig for en klar visning av ledningsretningen.
MERK: O'Shea et al.15 rapporterte CV-målingen i detalj. - For alternans og arytmianalyse defineres kalsiumalternans som en kontinuerlig stor og liten toppamplitude som opptrer alternativt. Bruk maksimal amplituderatio for å vurdere alvorlighetsgraden av frekvensavhengige alternans (1-A2/A1). Anvende fasekart for å analysere komplekse arytmier som ventrikulær takykardi (VT). Se etter rotorene som vises tydelig i et bestemt område når rotorene skifter.
- Bildelasting og signalbehandling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk kartlegging har vært en populær tilnærming til å studere komplekse hjertearytmier det siste tiåret. Det optiske kartleggingsoppsettet består av et EMCCD-kamera, som gir en samplingsfrekvens på opptil 1000 Hz og en romlig oppløsning på 74 x 74 μm for hver piksel. Det muliggjør et ganske høyt signal-støyforhold under signalsampling (figur 1). Når det Langendorff-perfuserte hjertet når en stabil tilstand og fargestoffbelastningen er ferdig, plasseres hjertet i det homootermiske kammeret under belysningen av to 530 nm lysdioder, som brukes til eksitering av spenningsindikatoren RH237 og Ca2+ indikator Rhod-2 AM. Emisjonslyset er delt inn i to bølgelengder på 600 nm (for Ca2+) og 670 nm (for Vm), som detekteres samtidig ved hjelp av EMCCD-kameraet. Etter perfusjon av avertin og heparin i 15 minutter, bruk kirurgiske instrumenter (figur 2A) for å åpne brystet og raskt trekke ut hjertet, og overfør det deretter til den kalde Krebs-løsningen (4 ° C, 95% O 2, 5% CO2) (figur 2B). Rengjør det omkringliggende vevet nøye, fest aorta med en 4-0 sutur, og et 0,7 mm plastrør settes inn i venstre ventrikkel (figur 2C) for å frigjøre overbelastning av perfusatet i venstre ventrikkelkammer. Sett EKG-ledningene inn i perfusatet (figur 2D) og sørg for at hjertet slår rytmisk i henhold til EKG-overvåking drevet av EKG-registreringsprogramvaren. Deretter utfører du dual-dye-lasting i mørket (figur 2E).
Etter at sammentrekningsartefakter er minimert av blebbistatin (10 μM) og en tilstrekkelig fargestoffbelastning er fullført, startet filmingen i ca. 10 sinusslag før S1S1-pacingprotokollen for å evaluere frekvensavhengige elektrofysiologiske parameterrestitusjonsegenskaper og kalsiumalternans etter isoproterenol (1 μM ISO) utfordring (figur 3A). Figur 3B viser en representativ EKG-bølgefront av VT og tilsvarende aksjonspotensial (AP) og CaT-spor indusert av en 50 Hz burst pacing-sekvens i en CPVT-mus. Optisk signalbildebehandlingsprogramvare brukes til å fullføre en halvautomatisk analyse av massive videodata.
Figur 4A,B viser typiske spor og varmekart over henholdsvis APD80 og CaTD80. ISO forkorter APD80 hos WT- og CPVT-mus, men det ble ikke funnet noen forskjell mellom WT- og CPVT-mus før og etter ISO-utfordringen (figur 4C, **P < 0,01. n = 5/6). Figur 4D indikerer at CaTD80 i CPVT-mus er lengre enn i WT etter ISO-utfordringen, mens det ikke var noen signifikans før ISO-behandling (**P < 0,01. n = 6.).
For konduksjonsmåling presenterer figur 5A en enkelt vektoralgoritme for kvantifisering av CV. I henhold til spenningssignalene har WT- og CPVT-hjertene samme ledningsevne over epikardiet ved baseline og etter ISO-intervensjon (figur 5B). Figur 5C,D viser de representative aktiveringskartene for spenning og kalsium i WT- og CPVT-hjerter før og etter ISO-utfordringen.
Kalsiumalternans er en kritisk parameter for arytmi. Kalsiumamplitudealternans beregnes i henhold til formuleringen som vist i figur 6A. Kalsiumsignaler i WT-hjerter holder seg stabile ved baseline under påfølgende S1S1-pacing ved 14,29 og 16,67 Hz (figur 6B), mens CPVT-hjerter viser frekvensavhengige alternans (figur 6C). Etter ISO-utfordringen viser CPVT-hjerter frekvensavhengige alternans i kalsiumsignal under S1S1-pacing, mens WT-hjerter ikke påvirkes (figur 6D, E). Etter kontinuerlig S1S1-pacing utføres en burst pacing-protokoll for å indusere dødelige arytmier. WT- og CPVT-hjerter viser normal ledning under 50 Hz burst-pacing ved baseline (figur 7A). Etter perfusjon med ISO viser CPVT-hjerter høyfrekvente rotorer etter 50 Hz burst-pacing, mens WT-hjerter opprettholder normal ledning (figur 7B).
Figur 1: Optisk kartleggingsapparat. Systemet inkluderer et spesialdesignet EMCCD-kamera med høy romlig-tidsmessig oppløsning (samplingsfrekvens opptil 1000 Hz, minimal samplingspiksel 74 x 74 μm). En elektrisk stimuleringskontroller brukes til prøvetaking og utgang elektrisk stimuleringsprotokoll. To grønne lysdioder brukes til eksitasjonslyset til fluorescensprober. Et langpasss dikroisk speil (610 nm) og tilsvarende emittere splitter spennings- og kalsiumfluorescensutslippslysene. RH237, det spenningsfølsomme fargestoffet, har et utslippslys ved en toppbølgelengde på 670 nm, mens Rhod-2 AM, det kalsiumfølsomme fargestoffet, har et utslippslys ved en topp bølgelengde på 600 nm. Mindre endringer i begge fluorescenssignalene kunne fanges opp av kameraet samtidig på grunn av kamerasensorens høye samplingsfrekvens og følsomhet. Forkortelser: EMCCD = elektronmultipliserende ladningskoblet enhet; LED = lysemitterende diode; EKG = elektrokardiogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klargjøring og dual-dye loading . (A) De kirurgiske instrumentene. (B) Høsting av musehjertet. (C) Klipp av unødvendig vev forsiktig for en klar visning av aorta og sett inn en 0,7 mm plastrør fra aorta inn i venstre ventrikkel. (D) Hjertet fjernes raskt til Langendorff perfusjonssystem. (E) Dual-dye lasting og eksitasjon-sammentrekning opphør i mørket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: S1S1-protokoll og arytmiinduksjonsprotokoll. (A) Representativ EKG-bølgefront og tilsvarende AP- og kalsiumsignalspor ved bruk av S1S1-pacingprotokoll etter ISO-utfordring. (B) VT-induksjon ved en 50 Hz burst pacing-sekvens etter perfusjon av ISO i en CPVT-mus. Forkortelser: EKG = elektrokardiogram; AP = handlingspotensial; ISO = isoproterenol; VT = ventrikulær takykardi; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: APD80- og CaTD80-analyse ved 10 Hz før og etter ISO-utfordring. (A) Representative AP-spor og APD80-varmekart over WT- og CPVT-hjerter før og etter ISO-behandling. (B) Typiske CaT-spor og CaTD80-varmekart over WT- og CPVT-hjerter før og etter ISO-utfordringen. (C) ISO forkorter APD80 i WT- og CPVT-mus, men ingen forskjell er funnet mellom WT- og CPVT-mus før og etter ISO-utfordringen. (D) CaTD80 i CPVT-mus er lengre enn i WT etter ISO-utfordring, mens det ikke var noen signifikans før ISO-behandling. (* P < 0,05, **P < 0,01. n = 5/6.) Forkortelser: AP = handlingspotensial; APD80 = topp ved 80% repolarisering; ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Konduksjonshastighetsanalyse ved 10 Hz. (A) Den enkle vektoralgoritmen for ledningshastighet. (B) Ingen forskjell i CV for AP i WT og CPVT mus. (C) Representative varmekart viser at CPVT-mus har samme ledningsevne som WT-mus før og etter ISO-utfordringen i henhold til spenningssignaler. (D) Det er ikke funnet noen signifikant forskjell i de to gruppene for aksjonspotensialinduserte CaT80-isokroner før og etter ISO-utfordringen. Forkortelser: AP = handlingspotensial; ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vill type; AT = aktiveringstid; CV = ledningshastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Analyse av kalsiumamplitudealternans. (A) Algoritmen for beregning av kalsiumamplitude alternans. (B) Kalsiumsignaler i WT-hjerter holder seg stabile ved baseline under påfølgende S1S1-pacing ved 14,29 og 16,67 Hz, mens (C) CPVT-hjerter viser frekvensavhengige alternans. (D) WT-hjerter påvirkes ikke av ISO-utfordringen, mens (E) etter ISO-utfordringen viser CPVT-hjerter frekvensavhengige alternans i kalsiumsignal under S1S1-pacing. Forkortelser: ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Takyarytmianalyse med fasekart . (A) WT- og CPVT-hjerter viser normal ledning under 50 Hz burst pacing ved baseline. (B) Etter perfusjon med ISO viser CPVT-hjerter høyfrekvente rotorer etter 50 Hz burst-pacing, mens WT-hjerter opprettholder normal ledning. Forkortelser: ISO = isoproterenol; CPVT = katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi; WT = vill type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basert på vår erfaring inkluderer nøklene til en vellykket dobbelfarget optisk kartlegging av et musehjerte en godt forberedt løsning og hjerte-, fargestoffbelastning, oppnå det beste signal-støy-forholdet og redusere bevegelsesartefakten.
Fremstilling av oppløsning
Krebs løsning er viktig for et vellykket hjerteeksperiment. MgCl2 ogCaCl2 stamløsninger (1 mol / L) fremstilles på forhånd med tanke på vannabsorpsjon og tilsettes til Krebs-løsningen etter at alle andre komponenter er oppløst i rent vann fordi Mg 2 + og Ca 2 + lett kan utfelle med CO3 2 +. Krebs-løsningen bobles med 95%O2/5% CO2 i minst 30 minutter for å sikre oksygenering. Fordi musehjertet er spesielt følsomt for pH, bør løsningens pH være rundt 7,4 etter oksygenering. Selv om små partikler er i løsningen, kan de eksperimentelle resultatene påvirkes fordi disse partiklene kan blokkere kapillærene og påvirke perfusjonseffekten. Oppløsningen filtreres derfor ved hjelp av et 0,22 μm aseptisk nålfilter før bruk.
Hjerte forberedelse
Før hjerter høstes, blir musene først heparinisert for å unngå koagulasjonsdannelse i koronararteriesystemet, og forhindrer dårlig fargestoffperfusjon forårsaket av hjertebelastning fra å påvirke den påfølgende avbildningen. Jo kortere hjertets iskemiske tid, desto bedre er hjertets tilstand. Derfor styres den iskemiske tiden innen 2-3 minutter fra hjerter høstes til kanylering via aorta på Langendorff-systemet. I tillegg er godt vedlikeholdt perfusjonstrykk også viktig. Derfor settes et tynt silikon (plast) rør inn i venstre ventrikkelhule for å unngå at venstre ventrikkeltrykk blir for høyt under ventrikulær sammentrekning etter at venstre ventrikkelutløp er ligert, noe som kan resultere i dårlig myokardperfusjon og anoksisk vevsforsuring.
Dye lasting
Disse eksperimentene utfører fargebelastning ved å perfusere hjertet i Langendorff-systemet. Det er avgjørende å overvåke hjerterytmen fordi dårlig fargestoffbelastning vil oppstå når den unormale rytmen skyldes kirurgiske operasjoner eller iskemi-reperfusjonsskade. Hjertet må være sunt nok til å utføre de påfølgende trinnene. Rhod-2 AM, et Ca2+-følsomt fargestoff, er et acetylmetylesterderivat av Rhod 2, som lett lastes inn i celler i sin AM-form. En 100 ganger økning i molekylets fluorescensintensitet skyldes Ca2 + chelation17. Pluronic F127 er inkorporert i Rhod-2 AM lasteløsningen for å forhindre Rhod-2 AM fra polymerisering i bufferen og hjelpe den inn i celler. Pluronic F127 kan redusere stabiliteten til Rhod-2 AM, så det anbefales bare å legge det til når du forbereder arbeidsløsningen, men ikke i lagringsløsningen for langtidslagring. Det spenningsfølsomme fargestoffet RH237 brukes i denne studien på grunn av dets gunstige spektrale egenskaper for bruk med Ca2+ indikator Rhod-2 AM.
Oppnå det beste signal-til-støy-forholdet
Å skaffe bilder med høye signal-støy-forhold er målet for bildebehandling, men støy er som et skyggefullt spøkelse som alltid forårsaker problemer. På grunn av svake signaler er lavere støy spesielt viktig i noen høyhastighets mikroskopiske bildebehandlingsapplikasjoner, for eksempel optisk kartlegging. Signal-støy-forholdet (SNR) beregnes som rotens gjennomsnittlige kvadratamplitudeforhold til rotens gjennomsnittlige kvadratstøy, der støyamplituden vurderes ved hvilepotensial18. Noen faktorer, som lyskilde, optiske filtre, fokuseringsoptikk og fotodetektorer, er avgjørende for å oppnå den beste SNR. I studien undersøkes bakgrunnsområdet for støy, som ofte svinger på et lite nivå. Det optiske signalet som oppdages av hver piksel, er gjennomsnittet av utsendt lys fra overflaten. AP og kalsiumaktiviteter svinger under arytmi, og begge signalenes amplitude er relativt lav. Selv mindre forstyrrelser kan føre til forvrengning av optiske signaler og føre til feil i dataanalysen. Derfor bør tolkningen av optiske signaler være forsiktig når den lokale heterogeniteten skyldes elektrisk funksjon under arytmier som VT.
Redusere bevegelsesartefakten
Sammenlignet med elektrodeopptak påvirkes optiske signaler ofte av sammentrekningsaktivitet av Langendorff-perfuserte hjerter på grunn av bevegelsesartefakt. For å fange nøyaktige optiske signaler, brukes farmakologiske hemmere av eksitasjonskontraksjon mest. For å minimere bevegelsesartefakten under avbildning, er blebbistatin vedtatt for å stoppe hjertet fra å slå. Det er en selektiv hemmer av ATPase-aktiviteten til ikke-muskelmyosin II og frigjør effektivt eksitasjonskontraksjonsprosessen i hjertet 19,20,21. Selv om noen studier antyder noen bivirkninger ved bruk av forbindelsen22, bruker vi den laveste arbeidskonsentrasjonen ved 10 μM for å minimere mulig skade på hjertet.
ElectroMap programvare for analyse av hjerteoptiske kartlegging datasett
ElectroMap er en åpen kildekode-programvare med høy gjennomstrømning for analyse av hjerteoptiske kartdatasett. Det gir en analyse av de viktigste hjerteelektrofysiologiske parametrene, inkludert AP- og CaT-morfologi, CV, diastolisk intervall, dominant frekvens, tid til topp og relaksasjonskonstant (τ) 15,23. Programvaren tillater flere filtreringsalternativer, inkludert det gaussiske filteret, Savitzky-Goaly-filteret og Top-hat baseline korreksjon. Gaussisk filter er en todimensjonal utjevning ved å beregne vektet gjennomsnittlig utjevning av hver kanal og tilstøtende kanaler. Det brukes ofte til piggfeilstøy. Savitzky-Goaly-filteret passer til et lavere polynom og kontinuerlig delsett av tilstøtende datasett gjennom den minste kvadratmetoden, som oppfyller behovet for ulike jevne filtrering og er også effektiv for behandling av ikke-periodiske og ikke-lineære datasett avledet av støy. Top-hat baseline korreksjon kan justere de optiske signalene til samme høyde i henhold til toppene av sporene, beregne parametere som aksjonspotensialvarighet (APD) og kalsium forbigående varighet (CaTD) mye mer nøyaktig. Baseline drift oppstår av og til når sampling spenning og kalsiumfluorescens signaler. Det er også nyttig når du beregner kalsium alternans og amplitude. Begge ventriklene ble valgt for elektrofysiologisk undersøkelse.
Fordeler og ulemper med dual-dye kartlegging og metoder for å begrense interferens
I de senere år har det blitt innsett at det er viktig å avklare celledepolarisering eller repolarisering og intercellulær ledningsheterogenitet i hele hjertet, samt kobling av membranklokken og kalsiumklokken, noe som er kritisk for å forstå mekanismen for sykdommer som arytmi24,25. Optisk kartlegging har en høy spatiotemporal oppløsning for å bestemme ventrikkelaktiverings- og repolariseringsegenskapene til hjertet til transgene mus26,27,28,29. Det kan også oppdage multiparameteravbildning, for eksempel måling av membranpotensial og intracellulært kalsium i samme hjerte24,30 eller vev31,32 lastet med spenning og kalsiumfølsomt fargestoff. Dual-dye imaging er gunstig for å studere forholdet mellom handlingspotensial og kalsium, for eksempel forholdet mellom membran (M) klokke og Ca2 + (C) -klokke eller spontan kalsiumfrigivelse og forsinket etter depolarisering (DAD). Normal hjerteeksitasjon krever da at de sykliske hendelsene i de to klokkene er justert. Forstyrrelse i denne justeringen fører til arytmi25. Forholdet mellom spontan kalsiumfrigjøring og DAD er mekanismen for å utløse aktiviteter ved hjertesvikt 33. Imidlertid bør kombinasjonen av fargestoffer velges nøye. Kombinasjonen av RH-237/Rhod-2 eller di-4-ANEPPS/Indo-1 tillater samtidig opptak, mens Fluo-3/4/di-4-ANEPPS vil føre til feil på grunn av overlappende emisjonsspektra av to fargestoffer30,34,35. Dette eksperimentet valgte RH237 og Rhod-2 AM for å belaste hjertet og oppnådde god bildekvalitet.
I tillegg har kameraet som brukes i denne protokollen to målflater, noe som gjør det mulig å fange de delte signalene på ett prøvetakingsgrensesnitt og lar et enkelt kamera oppdage to forskjellige utslippsbølgelengder. Slik samtidig kartlegging av optisk AP og CaT som kombinerer forskjellige fotoelektronspektroskopi (PES) protokoller, vil tillate oss å bestemme sammenhengen mellom unormal [Ca2 +] i og elektrisk ustabilitet under stressforhold og effekten av postaktiveringspotensiering på disse anomaliene. Den romlig heterogene naturen til SR Ca2+-sykling og hvordan dette påvirker fremveksten, alvorlighetsgraden og konkordansen av elektriske alternans og arytmogen oppførsel, som romlig uoverensstemmende alternans og påfølgende VT, vil bli studert i det intakte hjertet i forskjellige grupper. SR Ca 2+ alternans, RyR2 refraktoritet og deres rolle i SR Ca2+ og APD alternans vil bli utforsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Denne studien støttes av National Natural Science Foundation of China (81700308 til XO og 31871181 til ML, og 82270334 til XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 til XO, 23ZYZYTS0433 og 2022YFS0607 til XT, og 2022NSFSC1602 til TC) og State Key Laboratory for kjemi og molekylærteknikk av medisinske ressurser (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 til XO), MRC (G10031871181 til ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE ved Oxford (ML) tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
References
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al.
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
