Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65083
Automatic Translation
1, 1, 1
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Summary

في هذا البروتوكول ، نصف الإجراءات الفنية لتوليد فئران بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة الدهنية البنية (BAT) تستفيد من نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس المرتبط بالغدي (AAV) أحادي التوجيه (sgRNA). تشمل الخطوات الموصوفة تصميم sgRNAs ، وإعداد جزيئات AAV-sgRNA ، والحقن الدقيق ل AAV في فصوص BAT.

Abstract

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي مستودع دهني متخصص في تبديد الطاقة يمكن أن يكون أيضا بمثابة عضو الغدد الصماء عن طريق إفراز الجزيئات النشطة بيولوجيا. يعد إنشاء فئران بالضربة القاضية الخاصة ب BAT أحد أكثر الأساليب شيوعا لفهم مساهمة الجين ذي الأهمية في تنظيم الطاقة بوساطة BAT. كانت استراتيجية استهداف الجينات التقليدية التي تستخدم نظام Cre-LoxP هي النهج الرئيسي لتوليد فئران بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومملة. هنا ، نصف بروتوكولا للضربة القاضية السريعة والفعالة لجين مهم في BAT باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس المرتبط بالغدي (AAV) أحادي التوجيه (sgRNA). يقع BAT بين الكتفين في الطبقة العميقة بين العضلات. وبالتالي ، يجب الكشف عن أفضل التقنيات المتاحة من أجل حقن AAV بدقة ومباشرة في BAT داخل المجال البصري. المعالجة الجراحية المناسبة أمر بالغ الأهمية لمنع تلف الأعصاب والأوعية الودية، مثل وريد سولتزر الذي يتصل بالخفافيش المضادة للضرب. لتقليل تلف الأنسجة ، هناك حاجة ماسة لفهم الموقع التشريحي ثلاثي الأبعاد ل BAT والمهارات الجراحية المطلوبة في الخطوات الفنية. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الإجراءات الفنية الرئيسية ، بما في ذلك تصميم sgRNAs التي تستهدف الجين محل الاهتمام ، وإعداد جزيئات AAV-sgRNA ، وجراحة الحقن المجهري المباشر ل AAV في كل من فصوص BAT لتوليد الفئران بالضربة القاضية الخاصة ب BAT ، والتي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في BAT.

Introduction

تتزايد السمنة بمعدل كبير في جميع أنحاء العالم ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض الأيضية1،2،3. الأنسجة الدهنية هي مفتاح هذه الأمراض. النوعان المتميزان وظيفيا من الأنسجة الدهنية الموجودة هما الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) ، التي تخزن السعرات الحرارية الزائدة ، والأنسجة الدهنية البنية (BAT) والدهون ذات الصلة باللون البيج / البرايت ، والتي تبدد الطاقة من أجل توليد الحرارة. في حين تم الاعتراف BAT لوظيفتها في تبديد الطاقة ، إلا أن لها أيضا وظائف الغدد الصماء عن طريق إنتاج جزيئات نشطة بيولوجيا تنظم عملية التمثيل الغذائي في الأعضاء البعيدة 4,5. أظهرت العديد من الدراسات التي أجريت على القوارض أن زيادة كمية أو نشاط الدهون البنية أو البيج يؤدي إلى زيادة إنفاق الطاقة وتحسين حساسية الأنسولين. في البشر ، الأشخاص الذين يعانون من BAT يمكن اكتشافها لديهم معدل انتشار أقل بكثير من أمراض القلبوالأوعية الدموية 6. وبالتالي ، فإن BAT يحمل إمكانات علاجية ممتازة للعقابيل الأيضية المرتبطة بالسمنة7،8،9.

للتحقيق في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لتطور BAT ووظيفتها ولتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في هذه العمليات ، فإن نموذج الماوس المعدل وراثيا الخاص ب BAT هو طريقة الاختيار10. نظام إعادة التركيب Cre-LoxP هو الوسيلة الأكثر استخداما لإنتاج فئران خروج المغلوب الشرطية عن طريق تحرير جينوم الفأر. وقد مكن هذا النظام من تعديل (الإفراط في التعبير أو الضربة القاضية) للجينات ذات الأهمية بطريقة خاصة بالأنسجة / الخلايا11. يمكن استخدامه أيضا لتسمية نوع معين من الخلايا عن طريق التعبير عن جين مراسل فلوري انتقائي.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج نظام Cre-LoxP بشكل أكبر من خلال الجمع بين تقنية CRISPR-Cas9 ونظام الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) المرتبط بالفيروس الغدي (AAV)12. نظام CRISPR-Cas9 هو أداة محددة وفعالة لتحرير الجينات لتعديل أو تنظيم أو استهداف مناطق دقيقة من الجينوم13. يسمح تحرير الجينوم القائم على CRISPR-Cas9 بالتلاعب الجيني السريع للمواقع الجينومية لأنه لا يتطلب إعادة التركيب المتماثل مع ناقل استهداف الجينات. تمكن تقنيات Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA المشتركة الباحثين من فهم وظائف الجينات بشكل أكثر دقة من خلال السماح بالتحقيق في دور الجينات ذات الأهمية في الأوقات المرغوبة في الأنسجة / الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل هذه التقنيات مجتمعة من الوقت والجهد اللازمين لتوليد الفئران المعدلة وراثيا وتسمح بالتحكم الزمني في نشاط CRISPR-Cas9 لتحرير الجينوم المستحث في الفئران إذا تم استخدام خط Cre المستحث14.

نواقل AAV آمنة وفعالة في أنظمة توصيل الجينات في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن AAVs التي تستهدف الأنسجة الدهنية قد تخلفت عن التطبيقات في الأنسجة الأخرى ، مثل الدماغ والقلب والكبد والعضلات15. نظرا لكفاءة النقل المنخفضة نسبيا والانتحاء مع نواقل النمط المصلي التي تحدث بشكل طبيعي ، لا يزال توصيل الجينات الموجهة ب AAV إلى الأنسجة الدهنية يمثل تحديا15. على مدى السنوات ال 5 الماضية ، نجحنا نحن وآخرون في إنشاء طرق فعالة وطفيفة التوغل لتوصيل الجينات الموجهة ب AAV إلى الأنسجة الدهنية وإنشاء نماذج فأر تسمح لنا بفهم الجينات المشاركة في تنظيم وظيفة BAT16،17،18،19. على سبيل المثال ، باستخدام AAV8 لتوصيل sgRNA الذي يستهدف Alox12 ، والذي يشفر 12-lipoxygenase (12-LOX) ، إلى BAT للفئران Ucp1-Cre / Cas9 ، اكتشفنا أن BAT المنشط ينتج مستقلبات 12-LOX ، وهي حمض 12-hydroxy-eicosapentaenoic (12-HEPE) و 13R ، 14S-dihydroxy docosahexaenoic acid (maresin 2) ، لتنظيم استقلاب الجلوكوز وحل الالتهابات المرتبطة بالسمنة ، على التوالي16 ، 17. هنا ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة بشأن الإجراءات الفنية ، لا سيما جراحة الحقن المجهري المباشر ل AAV-sgRNA في فصوص BAT ، لتوليد فئران خروج المغلوب الخاصة ب BAT باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA المدمج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات وإجراءات الرعاية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مركز جوسلين للسكري.

1. فحص sgRNAs الفعالة في الخلايا المستزرعة

ملاحظة: لجعل الفحص فعالا من حيث التكلفة ، قبل تعبئة sgRNAs في جزيئات AAV ، نوصي باختبار sgRNAs مختلفة في الخلايا المستزرعة عبر نظام قائم على lentivirus لتعبير Cas9 / sgRNA (الشكل 1) واختيار sgRNAs التي تعطي أعلى كفاءة ضربة قاضية للتجارب في الجسم الحي .

  1. تصميم كريسبر-كاس9 sgRNA
    1. صمم sgRNAs باستخدام أدوات عبر الإنترنت ، مثل أداة تصميم sgRNA الواسعة (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) 20,21 ، وأداة CRISPOR عبر الإنترنت (http://crispor.tefor.net/)22 ، وغيرها من الأدوات المتاحة.
    2. أدخل أسماء الجينات أو تسلسلات هدف الحمض النووي في مربع اسم الجين ، وحدد NGG كشكل مجاور للفضاء الأولي (PAM) ل SpCas9 لإنشاء تسلسلات sgRNA المحتملة.
    3. حدد sgRNAs ذات الكفاءة العالية المتوقعة على الهدف والنشاط المنخفض خارج الهدف. على سبيل المثال ، يوصى باستخدام sgRNAs بدرجة خصوصية لا تقل عن 50 على مخرج CRISPOR. من بين sgRNAs المحددة التي تجتاز المرشح ، اختر تلك ذات درجات الكفاءةالعالية 23.
      ملاحظة: بشكل عام ، يتم اختيار ثلاثة أو أربعة sgRNAs لضمان تحديد sgRNAs الفعالة.
  2. بناء بلازميد كريسبر-كاس9 sgRNA
    1. توليف أزواج sgRNA oligo التي تشفر 20 تسلسلا مستهدفا من النوكليوتيدات (nt) مع نتوءات (5 'و 3') من موقع تقييد BsmBI (الجدول 1) من خلال منصة تخليق الحمض النووي.
    2. أزواج oligo الملدنة Ligate مع ناقل lentiCRISPR v2 الخطي BsmBI.
    3. قم بتحويل منتج الربط إلى سلالة Stbl3 E. coli ، وتأكد من إدخال sgRNA بواسطة تسلسل Sanger DNA باستخدام التمهيدي الأمامي U6.
      ملاحظة: انظر إجراء الاستنساخ المفصل في بروتوكول Addgene بعنوان LentiCRISPRv2 و lentiGuide-Puro: CRISPR / Cas9 العدسي ودليل واحد RNA24.
  3. إنتاج جزيئات الفيروسات العدسية
    1. حوالي 24 ساعة قبل النقل ، لوحة 7 × 105 خلايا HEK-293 في 4 مل من وسط النمو الكامل في لوحة زراعة الأنسجة 6 سم.
    2. أضف 15 ميكرولتر من كاشف النقل LT1 إلى 250 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإعداد كوكتيل نقل لكل sgRNA وفقا للجدول 2 في 250 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. امزج كاشف النقل المحضر في الخطوة 1.3.2 مع كوكتيل البلازميد ، واحتضانه لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. استبدل وسط النمو الكامل ب 3.5 مل من وسط النمو الطازج لخلايا HEK-293 ، ثم أضف خليط كاشف نقل الحمض النووي بالتنقيط إلى خلايا HEK-293 المزروعة في 3.5 مل من وسط النمو الجديد.
    5. بعد 12-15 ساعة من النقل ، قم بتغيير الوسط لإزالة كاشف النقل ، واستبدله ب 4 مل من وسط النمو الطازج.
    6. بعد 24 ساعة من الحضانة ، اجمع وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على جزيئات عدسية فيروسية ، وقم بتصفية الوسط من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة أي خلايا HEK-293. قد يتم تخزين الفيروسات في 4 درجات مئوية لبضعة أيام. للتخزين طويل الأجل ، يجب تجميد الفيروسات عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: اتبع إرشادات السلامة الأحيائية عند تحضير جزيئات الفيروسات العدسية ، واعمل في بيئة (على سبيل المثال ، BL2 +) مناسبة للتعامل مع فيروس العدس. انظر الإجراء المفصل لإعداد فيروس العدس في بروتوكول Addgene بعنوان pLKO.1 - ناقل استنساخ TRC (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
  4. عدوى الخلايا preadipocytes البنية وتحديد ضربة قاضية بوساطة sgRNA
    1. لوحة 1 × 106 خلايا برياديبو بنية خالدة للفأر في 1 مل من وسط طازج يحتوي على 8 ميكروغرام / مل بوليبرين لكل بئر في صفيحة 6 آبار.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إنشاء الخلايا البنية الخالدة باستخدام مستضد SV40 T25. يتم استزراع الخلايا البني في DMEM عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS.
    2. أضف 1 مل من محلول الجسيمات الفيروسية العدسية من الخطوة 1.3 لإصابة الخلايا. الحفاظ على بئر واحد غير مصاب من الخلايا بالتوازي لتكون بمثابة التحكم في اختيار المضادات الحيوية.
    3. التغيير إلى وسط جديد بعد 24 ساعة من الإصابة. أضف المضادات الحيوية المقابلة (على سبيل المثال ، بوروميسين بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل) إلى الوسط لقتل الخلايا غير المصابة واختيار الخلايا المصابة. التغيير إلى وسط جديد يحتوي على المضاد الحيوي المحدد كل يوم حتى تموت جميع خلايا التحكم غير المصابة.
    4. جمع البروتين من الخلايا المصابة بالفيروس ، وتحديد كفاءة ضربة قاضية من sgRNAs عن طريق تحليل لطخة الغربية. اتبع إجراء النشاف الغربي المفصل في إسلامي ولوجان26. نظرا لاختلاف معدل الدوران بين البروتينات ، اختبر نقاطا زمنية متعددة (على سبيل المثال ، من اليوم 6 إلى اليوم 12 بعد الإصابة بالفيروس) لمراقبة فقدان إشارة البروتين.
      ملاحظة: إذا لم يتوفر جسم مضاد يتعرف على البروتين المشفر بواسطة الجين محل الاهتمام ، فيمكن بدلا من ذلك استخدام تسلسل سانجر لتحديد كفاءة تحرير الجينوم لكل sgRNA. باختصار ، قم بتضخيم الحمض النووي الجينومي باستخدام الاشعال التي تحيط بالمنطقة المستهدفة ب sgRNA لتوليد مضخمات PCR بطول ~ 700 bp. يفضل أن يكون موقع الاستراحة المتوقع ~ 200 نقطة أساس في اتجاه مجرى النهر من موقع بدء التسلسل. بعد ذلك ، قم بإخضاع منتج PCR لتسلسل سانجر. قم بتحليل نتائج التسلسل باستخدام الأدوات عبر الإنترنت ، مثل تتبع Indels بواسطة DEcomposition (TIDE) ، لتحديد تردد indels الصغيرة الناتجة عن كل sgRNA في مجموعة من الخلايا27.

2. بناء البلازميد AAV-sgRNA

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم استنساخ sgRNAs الفعالة المحددة من الشاشة أعلاه في ناقل pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP28 (الشكل 2). في غضون ذلك ، يتم أيضا استنساخ sgRNA غير المستهدف (على سبيل المثال ، TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) الذي لا يتعرف على أي تسلسل في جينوم الفأر في نفس المتجه ليكون بمثابة عنصر تحكم غير محرر.

  1. خطي pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP العمود الفقري باستخدام BbsI ، والذي يولد نتوءات متطابقة مع oligos.
  2. اربط أزواج oligo الملدنة بناقل pAAV الخطي ، وتأكد من إدخالات sgRNA كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    ملاحظة: يتم تطبيق إجراء استنساخ lentiCRISPRv2-sgRNA أيضا على بناء البلازميد AAV-sgRNA.

3. تغليف AAV

  1. قم بتعبئة متجهات AAV التي تم إنشاؤها في القسم 2 في النمط المصلي AAV 8. قم بإعداد AAV عالي العيار وفقا للبروتوكولالسابق 30 ، أو اطلب خدمة تغليف AAV من النوى الفيروسية أو الخدمات التجارية. تمييع عيار الفيروس إلى 1 × 1013 نسخة جينوم / مل.
    ملاحظة: يتم تعبئة جينوم AAV2 المعدل الذي يعبر عن sgRNA في النمط المصلي AAV 8. تم اختيار هذا النمط المصلي بسبب كفاءته العالية للأنسجة الدهنية18,31. لمنع الاستجابة المناعية التي تسببها الملوثات ، مثل حطام الخلايا وكميات صغيرة من المكونات المتوسطة ، يلزم AAV فائق النقاء للحقن في الجسم الحي. يمكن تحقيق التنقية الفائقة عن طريق تدرجات اليوديكسانول والطرد المركزيالفائق 30.

4. إعداد الفئران Ucp1 Cre / Cas9

  1. قم بشراء سلالة الماوس Ucp1-Cre (انظر جدول المواد) التي تعبر عن Cre recombinase تحت سيطرة مروج Ucp1. قم بشراء الفئران ROSA26-floxed STOP-Cas932 متماثلة الزيجوت (انظر جدول المواد) ، حيث يتم تنظيم التعبير عن Cas9 بطريقة تعتمد على Cre recombinase.
  2. اعبر هذه السلالات لتوليد فئران Ucp1-Cre / Cas9 ، كما هو موضح سابقا16,17. احتفظ بجميع الفئران في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها ورطوبتها (23 درجة مئوية ، رطوبة 30٪) في دورة 12 ساعة من الضوء والظلام (تضيء الأنوار في الساعة 6:30 صباحا ؛ تنطفئ الأنوار في الساعة 6:30 مساء) مع حرية الوصول إلى حمية تشاو والماء.
  3. عالج الفئران الناتجة Ucp1-Cre / Cas9 باستخدام AAVs التي تحمل إما sgRNA للتحكم أو sgRNA التي تستهدف الجين محل الاهتمام من خلال الطريقة الموضحة أدناه. في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران Ucp1-Cre / Cas9 البالغة من العمر 12-15 أسبوعا والتي تزن حوالي 30 جم.

5. جراحة لحقن AAV في BAT في الفئران

  1. تخدير الفئران مع الاستنشاق المستمر من 2.5 ٪ إيزوفلوران للتحريض والصيانة.
  2. تليين كلتا العينين لمنع الجفاف. بعد ذلك ، أعط المسكنات (بانامين ، 2.5 مجم / كجم من وزن الجسم [BW] ، الحقن تحت الجلد ، انظر جدول المواد) للفئران لتقليل ومنع الألم والضيق بعد العملية الجراحية.
  3. حلق فرو الفأر في المنطقة بين الكتفين باستخدام ماكينة حلاقة وعقم المنطقة الجراحية بثلاث جولات متناوبة على الأقل من مقشر قائم على اليود أو الكلورهيكسيدين متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضع ستائر جراحية معقمة حول موقع الشق.
  4. شق الجلد بين لوح الكتف باستخدام مشرط (الشكل 3A-B) ، ثم قشر الجلد المحلوق لكشف الأنسجة الدهنية على الرقبة باستخدام مقص جراحي (الشكل 3C-D). يعتمد حجم الشق على حجم الجسم ، ولكن بشكل عام ، يجب أن يكون الشق حوالي 2 سم لفضح الأنسجة الدهنية في المنطقة بين الكتفين.
  5. قطع الأنسجة الدهنية على الحدود بين المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية والعضلات باستخدام شق واحد (الشكل 3E-F). يجب أن يكون حجم الشق حوالي 1 سم لفتح المدخل فقط لإدخال المقص الجراحي للتقشير الحاد للأنسجة الدهنية.
  6. باستخدام اليد المهيمنة ، قشر الأنسجة الدهنية بصراحة وعموديا بمقص جراحي لفضح BAT أثناء قرص الأنسجة الدهنية ، بما في ذلك BAT ، باليد غير المهيمنة (الشكل 3G). استخدم وريد Sultzer كمعلم للإشارة إلى موقع BAT الدقيق.
    ملاحظة: تم تعريض أفضل التقنيات المتاحة في الشكل 3H بالكامل لغرض عرض توضيحي للصورة. قد يتسبب التشريح الزائد في تلف أعصاب BAT المحيطة. قد يؤدي الاتجاه غير الصحيح للمقص إلى الإضرار بالعضلات المحيطة ووريد سولتزر الذي يستنزف BAT وقد يؤدي إلى نزيف زائد.
  7. لكل فأر ، قم بحقن 40 ميكرولتر من AAV ببطء في كل من فصوص BAT (20 ميكرولتر لكل فص واحد من BAT) باستخدام إبرة حادة (32 جم ، انظر جدول المواد) متصلة بحقنة هاملتون (100 ميكرولتر ، انظر جدول المواد ؛ 100 ميكرولتر ، انظر جدول المواد ؛ الشكل 3I). تحقق من نجاح الحقن كما هو موضح في عدم وجود تسرب من موقع الحقن أثناء إعطاء AAV.
    ملاحظة: تم الكشف عن أفضل التقنيات المتاحة في الشكل 3I بالكامل لغرض عرض الصورة. يتم تحديد حجم محلول AAV الذي سيتم إعطاؤه في فص BAT حسب حجم BAT للماوس المستلم. لقد قررنا أن 20 ميكرولتر من محلول AAV مناسب لفص BAT واحد يزن حوالي 0.05 جم في ماوس C57BL6 / J عادي يزن 30 جم. إذا لزم الأمر ، قد يلزم تركيز المحلول الفيروسي لتحقيق الحجم المطلوب.
  8. تأكد من عدم وجود نزيف من BAT المحقونة أو الأنسجة المحيطة. اضغط على شاش منقوع بمحلول بيروكسيد الهيدروجين (انظر جدول المواد) على موقع نزيف للإرقاء.
  9. ضع الأنسجة الدهنية المكشوفة مرة أخرى إلى وضعها الطبيعي. قم بخياطة حافة الأنسجة الدهنية والعضلات باستخدام خيط حيدة قابل للامتصاص 5-0 (الشكل 3J). خياطة الجلد المفتوح مع 5-0 خيوط مضفر مغلفة vicryl غير مصبوغة (الشكل 3K-L).
    ملاحظة: يصف الشكل 4 خطوات خياطة الأنسجة الدهنية والعضلات المقشرة.
  10. الحفاظ على الحيوانات على وسادة التدفئة بعد الجراحة حتى الشفاء التام. تزويد الحيوانات بإمكانية الوصول إلى الطعام والماء والفراش الوافر للتعشيش. راقبهم بانتظام بحثا عن أي علامات ضيق أو مرض لمدة 7 أيام من الشفاء قبل بداية التجربة.
  11. تأكد من كفاءة حذف الجينات المستهدفة عن طريق تحليل اللطخة الغربية في BAT المقطعة من الفئران ، كما هو الحال في Sugimoto et al.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خلال الإجراءات المذكورة أعلاه ، يعد التسليم الدقيق ل AAV-sgRNA إلى BAT أمرا بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. لتعظيم تأثير AAV-sgRNA وتقليل تلف الأنسجة أثناء الجراحة ، من الضروري فهم الموقع التشريحي ثلاثي الأبعاد (3D) ل BAT. كما هو موضح في الشكل 3E ، من الصعب تحديد الموقع الدقيق ل BAT دون تعريض الأنسجة. ومع ذلك ، قد يؤدي التعرض الزائد لأفضل التقنيات المتاحة إلى تلف الأنسجة (الشكل 3H ، I) ؛ وبالتالي ، يجب تنفيذ الإجراء لحقن محلول AAV داخل مساحة تشريحية محدودة (الشكل 3G). الشكل 5 أ مهم لضمان نجاح حقن AAV والتعافي السريع للفئران بعد الجراحة. يشير الشكل 5B-D إلى العيوب المحتملة التي قد تؤدي إلى حقن غير ناجحة. وتشمل هذه حقن محلول AAV في المنطقة غير الصحيحة (الشكل 5B) ، واختراق الإبرة عبر الأنسجة (الشكل 5C) ، وتضخم الأنسجة بسبب الحجم الزائد لمحلول AAV (الشكل 5D). أخيرا ، يجب التحقق من كفاءة ضربة قاضية للجين محل الاهتمام من خلال مستويات البروتين في BAT التي تم تشريحها من الفئران المحقونة16. على سبيل المثال ، تظهر مستويات البروتين في 12-LOX في BAT التي تم قياسها بواسطة اللطخة الغربية ضربة قاضية فعالة بسبب AAV8 الذي يقدم sgRNA الذي يستهدف Alox12 (الجين الذي يشفر 12-LOX) في BAT لفئران Ucp1-Cre / Cas9 (انظر الشكل 7 ب في الدراسة المنشورة سابقا16).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للبلازميد الفيروسي العدسي الذي يعبر عن Cas9 و sgRNA. ناقل التعبير الفيروسي العدسي ل Cas9 و sgRNA (lentiCRISPRv2). الاختصارات: Puro = علامة اختيار بوروميسين ؛ psi + = إشارة تغليف psi ؛ RRE = عنصر استجابة rev ؛ cPPT = مجرى البولي بيوريين المركزي ؛ EFS = عامل الاستطالة -1α مروج قصير ؛ P2A = 2A الببتيد الذاتي الشق ؛ WPRE = عنصر تنظيمي بعد النسخ ؛ LTR = تكرار المحطة الطويلة. يمكن هضم LentiCRIPSRv2 باستخدام BsmBI ، ويمكن استنساخ زوج من oligos sgRNA الملدن في سقالة RNA أحادية التوجيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لبلازميد AAV الذي يعبر عن sgRNA. ناقل AAV ل sgRNA. الاختصارات: ITR = I تكرار المحطة ؛ CB = محسن CMV الهجين / مروج β-actin. يمكن هضم pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP باستخدام BbsI ، ويمكن استنساخ زوج من oligos sgRNA الملدن في سقالة RNA أحادية التوجيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الجراحة المتسلسلة لحقن AAV في فصوص BAT الثنائية في الفئران. خضع الفأر المخدر للإجراءات التالية: (A-B) قطع الجلد المحلوق ، (C-D) تقشير الجلد المحلوق بصراحة ، (E-F) قطع الأنسجة الدهنية ، (G) تقشير الأنسجة الدهنية بصراحة ، (H-I) حقن محلول AAV في فصوص BAT باستخدام حقنة هاملتون ، (J) خياطة بين الأنسجة الدهنية والعضلات و (K-L) بين كل من اللوحات الجلدية. ملاحظة: في اللوحتين (H) و (I) ، يعد وريد Sultzer معلما لتأكيد الموقع الدقيق ل BAT. تم عرض أفضل التقنيات المتاحة في هاتين اللوحتين بالكامل لعرض الصورة. تشير الخطوط الصفراء المنقطة إلى الحد الفاصل بين الأنسجة الدهنية والعضلات في اللوحة E ، وطرف الإبرة (أي موقع الحقن) في اللوحة I. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: خطوات خياطة الأنسجة الدهنية والعضلات المقشرة. (أ) أدخل خيطا بإبرة في الأنسجة الدهنية المقشرة للحقن، ب: اخترق الأنسجة الدهنية، ج: ربط عضلة، د: اسحب خيطا لأعلى لخياطة الأنسجة الدهنية والعضلات المقشرة، ثم اربط الخيوط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. صور تمثيلية للوسائل المناسبة وغير المناسبة لحقن AAV في فصوص BAT في الفئران. (أ) يمثل هذا الرقم حقن AAV المقترح ، حيث يتلقى فص BAT أحادي الجانب حقنة قدرها 20 ميكرولتر من محلول AAV. (ب-د) الطرق التالية لحقن AAV يمكن أن تؤدي إلى الفشل. (ب) موقع الحقن غير الصحيح (أي فقدان فصوص أفضل النتائج)؛ (ج) تخترق الإبرة الأنسجة؛ و (د) تضخم الأنسجة بسبب كمية كبيرة من محلول AAV ، حيث يتلقى فص BAT أحادي الجانب حقنة 80 ميكرولتر من محلول AAV. تشير الدوائر الصفراء المنقطة إلى طرف الإبرة (أي موقع الحقن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أوليجو إلى الأمام: 5 'CACC-20bp gRNA تسلسل-3'
أوليجو عكسي: 5 'AAAC-20bp gRNA تسلسل مكمل عكسي -3 '
على سبيل المثال ، إذا كان التسلسل الهدف هو TCTGATAGCGTAGGAGTGAT، فإن oligos سيكون:
أوليغو الأمامية: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3'
عكس oligo: 5 'AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3'

الجدول 1: مثال على تصميم sgRNA. مثال على تسلسل sgRNA مع نتوءات مقابلة لموقع تقييد BsmBI.

اسم المادة شركة رقم الكتالوج مبلغ
لينتي كريسبر v2 بلازميد أدجين #52961 5 ميكروغرام
psPAX2 التعبئة والتغليف البلازميد أدجين #12260 3.75 ميكروغرام
pMD2.G مغلف البلازميد أدجين #12259 1.5 ميكروغرام
وسط خال من مصل OPTI-MEM إنفيتروجين #31985 250 ميكرولتر

الجدول 2: لينتي كريسبر. كوكتيل بلازميد لنقل sgRNA يحتوي على بلازميد LentiCRISPRv2 إلى خلايا HEK-293 لإنتاج فيروس CRISPR-sgRNA lentivirus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا تحتوي الطرق المنشورة الحالية لتوصيل الجينات بوساطة AAV إلى BAT بين الكتفين على صور ومقاطع فيديو مفصلة تصف التقنيات الجراحية ونهج الحقن المباشر ل AAV في BAT. في معظم الطرق المنشورة33,34 ، يتم حقن AAV في الأنسجة الدهنية المحيطة ب BAT بين الكتفين بدلا من BAT نفسها. وبالتالي ، هناك العديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تحدد نجاح الدراسة. وتشمل هذه تصميم sgRNA ، والتعبئة والتغليف AAV والتركيز ، وتوليد الفئران Cas9 الخاصة ب BAT ، والإجراءات الجراحية. مطلوب مهارات جراحية دقيقة ومتميزة لإكمال الإجراءات في الجسم الحي. على وجه الخصوص ، يعد تقليل تلف الأنسجة أثناء تعريض BAT وإدارة AAV أمرا بالغ الأهمية. نظرا لعوامل وراثية وبيئية متعددة ، مثل درجة حرارة السكن ، والتدريب على التمارين الرياضية ، والوجبات الغذائية ، يمكن أن يختلف حجم الدهون البيضاء المحيطة ب BAT وتكوين BAT نفسه بين الحيوانات. على سبيل المثال ، تعرض الفئران البدينة أنسجة دهنية بيضاء شاسعة تحيط ب BAT ، وتظهر الفئران الموجودة في الحياد الحراري (30 درجة مئوية) BAT مبيضة. وبالتالي ، من الصعب تحديد موقع 3D بدقة من BAT دون فتح الجلد. يعد الكشف عن الحد الأدنى من أفضل التقنيات المتاحة خطوة صعبة ولكنها حاسمة لحقن AAV. يمكن أن يؤدي التعرض المفرط لأفضل التقنيات المتاحة أثناء هذا الإجراء إلى تلف شديد للأعصاب والأوعية الودية، وخاصة وريد سولتزر المتصل ب BAT.

وتجدر الإشارة إلى أن حجم AAV المحقون في الأنسجة هو أيضا عامل مقيد للنجاح. يمكن أن يكون الحجم الزائد من المحلول ضارا بالخلايا ويتداخل مع عدوى فيروسية فعالة لتوصيل sgRNA إلى الخلايا الشحمية. نظرا لأن حجم BAT يختلف باختلاف العمر والجنس والخلفية الوراثية للفئران المتلقية ، فقد تكون هناك حاجة إلى تجارب التحسين16,17. بالإضافة إلى هدم الجينات ذات الأهمية ، يمكن تطبيق هذه التقنية بشكل إضافي على الإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية.

أحد المزالق المحتملة لهذه التقنية هو انخفاض كفاءة الضربة القاضية الجينية باستخدام sgRNA واحد في الجسم الحي ، حتى مع sgRNAs التي توفر خروج المغلوب الفعال في المختبر. كحل محتمل ، يمكن أن يؤدي الجمع بين اثنين أو أكثر من sgRNAs الفريدة في حقنة واحدة إلى تحسين كفاءة ضربة قاضية للجينات في الجسم الحي.

في الختام ، توفر تقنيات Ucp1-Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 و AAV-sgRNA مجتمعة نظاما قويا وفعالا لتوليد الفئران مع معالجة الجينات الخاصة ب BAT. يمكن تكييف هذه الطريقة للأنسجة الأخرى باستخدام خطوط Cre المختارة وحقن AAV المعدل في أنسجة مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) R01DK122808 و R01DK102898 و R01DK132469 (إلى Y.-H.T.) ، وكذلك P30DK036836 (إلى مركز أبحاث السكري التابع لمركز جوسلين للسكري). تم دعم T. T. من قبل زمالة SUNSTAR البحثية (منحة Hiroo Kaneda ، مؤسسة Sunstar ، اليابان) ومنحة جمعية القلب الأمريكية 903968. تم دعم Y. Z. من قبل زمالة Charles A. King Trust. نشكر شون د. كوداني على تفضله بتدقيق المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium Invitrogen 31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector  Addgene 52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP Addgene 89060
pMD2.G envelope plasmid Addgene 12259
psPAX2 packaging plasmid Addgene 12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
WT-1 cells Developed in Tseng lab PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice Jackson Laboratories 24857
Ucp1-CRE mice Jackson Laboratories 24670
Others
Banamine Patterson 07-859-1323
Hamilton syringe Hamilton Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution Fisher Scientific H325-500
Needle Hamilton 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx Henry Schein 1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx Henry Schein 1294522

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
  2. Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
  3. Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
  4. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
  5. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
  6. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  9. Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
  10. da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
  11. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
  12. Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
  13. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  14. Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
  15. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  16. Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
  17. Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
  18. Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
  19. Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
  20. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  21. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
  22. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  23. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  24. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  25. Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
  26. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
  27. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  28. Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
  29. Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
  30. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
  31. Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
  32. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  33. Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
  34. Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ، CRISPR-Cas9 ، نظام AAV-sgRNA ، ماوس ، أنسجة دهنية بنية ، حقن مجهري
جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsuji, T., Zhang, Y., Tseng, Y. H.… More

Tsuji, T., Zhang, Y., Tseng, Y. H. Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System. J. Vis. Exp. (193), e65083, doi:10.3791/65083 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter