Summary
在该协议中,我们描述了利用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统生成棕色脂肪组织(BAT)特异性敲除小鼠的技术程序。所描述的步骤包括sgRNA的设计,AAV-sgRNA颗粒的制备以及将AAV显微注射到BAT叶中。
Abstract
棕色脂肪组织(BAT)是一种专门用于能量耗散的脂肪库,也可以通过分泌生物活性分子 作为 内分泌器官。创建BAT特异性敲除小鼠是了解目的基因对BAT介导的能量调节的贡献的最流行方法之一。利用Cre-LoxP系统的传统基因靶向策略一直是产生组织特异性敲除小鼠的主要方法。但是,这种方法既耗时又乏味。在这里,我们描述了一种使用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统快速有效地敲除BAT中目的基因的方案。肩胛间蝙蝠位于肌肉之间的深层。因此,必须对BAT进行曝光,以便将AAV精确地直接注入视野内的BAT。适当的手术处理对于防止交感神经和血管受损至关重要,例如连接到BAT的Sultzer静脉。为了尽量减少组织损伤,迫切需要了解BAT的三维解剖位置以及技术步骤中所需的手术技能。该协议重点介绍了关键技术程序,包括靶向目的基因的sgRNA的设计,AAV-sgRNA颗粒的制备,以及将AAV直接显微注射到两个BAT叶中以产生BAT特异性敲除小鼠的手术,可广泛应用于研究BAT中基因的生物学功能。
Introduction
肥胖症在世界范围内以显着的速度增加,导致广泛的代谢疾病1,2,3。脂肪组织是这些病理的关键。存在的两种功能不同的脂肪组织类型是储存多余卡路里的白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)及其相关的米色/盐渍脂肪,它们消耗能量以进行产热。虽然BAT因其耗能功能而得到认可,但它也通过产生调节远端器官代谢的生物活性分子而具有内分泌功能4,5。对啮齿动物的大量研究表明,增加棕色或米色脂肪的数量或活性会导致能量消耗增加和胰岛素敏感性提高。在人类中,可检测到BAT的人心脏代谢疾病的患病率显着降低6。因此,BAT对肥胖相关的代谢后遗症具有极好的治疗潜力7,8,9。
为了研究BAT发育和功能的生理学和病理生理学,并阐明这些过程中涉及的分子机制,BAT特异性转基因小鼠模型是选择的方法10。Cre-LoxP重组系统是通过编辑小鼠基因组来产生条件敲除小鼠的最常用手段。该系统能够以组织/细胞特异性方式修饰(过表达或敲除)感兴趣的基因11。它还可用于通过表达选择性荧光报告基因来标记特定细胞类型。
最近,通过结合CRISPR-Cas9技术和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统12,进一步发展了Cre-LoxP系统方法。CRISPR-Cas9系统是一种特异性且高效的基因编辑工具,用于修饰,调节或靶向基因组的精确区域13。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑允许对基因组位点进行快速遗传操作,因为它不需要与基因靶向载体进行同源重组。结合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA技术使研究人员能够通过研究目标基因在组织/细胞中所需时间的作用来更精确地了解基因功能。此外,如果使用诱导的Cre系,这些组合技术减少了产生转基因小鼠所需的时间和精力,并允许对CRISPR-Cas9活性进行时间控制,以便在小鼠中进行诱导基因组编辑14。
AAV载体是安全有效的体内基因递送系统。然而,靶向脂肪组织的AAV落后于其他组织的应用,例如大脑,心脏,肝脏和肌肉15。由于天然血清型载体的转导效率和嗜性相对较低,AAV引导的基因递送到脂肪组织仍然具有挑战性15。在过去的5年中,我们和其他人已经成功地建立了有效的微创方法,将AAV引导的基因递送到脂肪组织中,并创建了小鼠模型,使我们能够了解参与调节BAT功能的基因16,17,18,19。例如,通过使用AAV8将编码12-脂氧合酶(12-LOX)的靶向Alox12的sgRNA递送到Ucp1-Cre / Cas9小鼠的BAT中,我们发现活化的BAT产生12-LOX代谢物,即12-羟基二十碳五烯酸(12-HEPE)和13R,14S-二羟基二十二碳六烯酸(maresin 2),分别调节葡萄糖代谢和解决肥胖相关炎症16,17.在这里,我们提供了关于技术程序的分步方案,特别是将AAV-sgRNA直接显微注射到BAT叶中的手术,以使用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA系统产生BAT特异性敲除小鼠。
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Protocol
所有动物实验和护理程序都得到了乔斯林糖尿病中心机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 筛选培养细胞中的有效sgRNA
注意:为了使测定具有成本效益,在将sgRNA包装成AAV颗粒之前,我们建议通过基于慢病毒的系统 在 培养细胞中测试不同的sgRNA,用于Cas9 / sgRNA表达(图1),并选择为 体内 实验提供最高敲低效率的sgRNA。
- CRISPR-Cas9 sgRNA设计
- 使用在线工具设计sgRNA,例如Broad sgRNA设计工具(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21,CRISPOR在线工具(http://crispor.tefor.net/)22以及其他可用工具。
- 在基因名称框中输入基因名称或DNA靶序列,然后选择 NGG 作为SpCas9的原间隔邻域基序(PAM),以生成潜在的sgRNA序列。
- 选择具有高预测靶向效率和低脱靶活性的sgRNA。例如,建议使用在CRISPOR输出上特异性评分至少为50的sgRNA。在通过过滤器的特定 sgRNA 中,选择效率得分高的sgRNA 23。
注意:通常,选择三个或四个sgRNA,以确保鉴定有效的sgRNA。
- 构建CRISPR-Cas9 sgRNA质粒
- 通过 DNA 合成平台合成编码 20 个核苷酸 (nt) 靶向序列的 sgRNA 寡核酸对,这些序列具有来自 BsmBI 限制性位点(表 1)的突出部分(5' 和 3')。
- 连接退火寡核苷酸与BsmBI线性化lentiCRISPR v2载体配对。
- 将连接产物转化为 Stbl3 大肠杆菌 菌株,并使用 U6 正向引物通过 Sanger DNA 测序确认 sgRNA 插入。
注意:请参阅Addgene名为LentiCRISPRv2和lentiGuide-Puro的实验方案中的详细克隆程序:慢病毒CRISPR / Cas9和单向导RNA24。
- 生产慢病毒颗粒
- 转染前约24小时,将7 x 105 HEK-293细胞置于6cm组织培养板中的4mL完全生长培养基中。
- 将 15 μL LT1 转染试剂加入 250 μL 无血清培养基中,并在室温下孵育 5 分钟。
- 按照 表2 在250 μL无血清培养基中为每个sgRNA制备转染混合物。将步骤1.3.2制备的转染试剂与质粒混合物混合,在室温下孵育20-30分钟。
- 用 3.5 mL 用于 HEK-293 细胞的新鲜生长培养基替换完整的生长培养基,然后将 DNA 转染试剂混合物滴加到 3.5 mL 新鲜生长培养基中培养的 HEK-293 细胞中。
- 转染12-15小时后,更换培养基以除去转染试剂,并用4mL新鲜生长培养基代替。
- 孵育24小时后,收集含有慢病毒颗粒的细胞培养基,并通过0.45μm过滤器过滤培养基以除去任何HEK-293细胞。病毒可以在4°C下储存几天。对于长期储存,病毒应在-80°C下冷冻。
注意:制备慢病毒颗粒时遵循生物安全指南,并在适合处理慢病毒的环境(例如BL2+)中工作。请参阅Addgene题为pLKO.1 - TRC克隆载体(https://www.addgene.org/protocols/plko/#G)的方案中的详细慢病毒制备程序。
- 棕色前脂肪细胞感染和sgRNA介导的敲低的测定
- 板 1 x 10 6 小鼠永生化棕色前脂肪细胞在 1 mL 新鲜培养基中,每孔含有 8 μg/mL 聚溴乙烯,在6 孔板中。
注意:在本研究中,使用SV40 T抗原25生成永生化的棕色前脂肪细胞。棕色前脂肪细胞在含有10%FBS的高葡萄糖DMEM中培养。 - 加入步骤 1.3 中的 1 mL 慢病毒颗粒溶液以感染细胞。平行维持一个未感染的细胞孔,作为抗生素选择对照。
- 感染后24小时更换为新鲜培养基。向培养基中加入相应的抗生素(例如终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素)以杀死未感染的细胞并选择感染的细胞。每隔一天更换一次含有所选抗生素的新鲜培养基,直到所有未感染的对照细胞死亡。
- 从病毒感染的细胞中收集蛋白质,并通过蛋白质印迹分析确定sgRNA的敲低效率。遵循Eslami和Lujan26中详细的蛋白质印迹程序。由于蛋白质之间的周转率不同,请测试多个时间点(例如,从病毒感染后的第6天到第12天)以观察蛋白质信号的丢失。
注意:如果没有识别目的基因编码的蛋白质的抗体,则可以使用Sanger测序来确定每个sgRNA的基因组编辑效率。简而言之,使用sgRNA靶向区域两侧的引物扩增基因组DNA,以产生长度为~700 bp的PCR扩增子。预计断裂位点最好位于测序起始位点下游~200 bp。然后,对PCR产物进行桑格测序。使用在线工具分析测序结果,例如通过去组合跟踪插入缺失(TIDE),以确定细胞池中每个sgRNA产生的小插入缺失的频率27。
- 板 1 x 10 6 小鼠永生化棕色前脂肪细胞在 1 mL 新鲜培养基中,每孔含有 8 μg/mL 聚溴乙烯,在6 孔板中。
2. AAV-sgRNA质粒的构建
注意:在此步骤中,从上述筛选中鉴定的有效sgRNA被克隆到pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP载体28 中(图2)。同时,不识别小鼠基因组中任何序列的非靶向sgRNA(例如TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29)也被克隆到同一载体中以作为非编辑对照。
- 使用BbsI线性化pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP骨架,其与合成的sgRNA寡核苷酸产生相同的突出。
- 用线性化的pAAV载体连接退火的寡核苷酸对,并确认步骤1.2中所述的sgRNA插入。
注意:lentiCRISPRv2-sgRNA的克隆程序也适用于AAV-sgRNA质粒构建。
3. AAV包装
- 将第 2 节中生成的 AAV 载体打包到 AAV 血清型 8 中。根据先前的方案30制备高滴度AAV,或从病毒核心或商业服务请求AAV包装服务。将病毒滴度稀释至 1 x 1013 基因组拷贝/mL。
注意:表达sgRNA的修饰AAV2基因组被包装成AAV血清型8。选择这种血清型是由于其对脂肪组织的高效率18,31。为了防止细胞碎片和少量培养基成分等污染物引起的免疫反应, 体内 注射需要超纯化的AAV。超纯化可以通过碘二醇梯度和超速离心30来实现。
4. Ucp1 Cre/Cas9小鼠的制备
- 购买在Ucp1启动子控制下表达Cre重组酶的Ucp1-Cre小鼠株(参见 材料表)。购买纯合Rosa26絮凝的STOP-Cas9敲入小鼠32 (参见 材料表),其中Cas9的表达以Cre重组酶依赖性方式调节。
- 杂交这些菌株以产生Ucp1-Cre / Cas9小鼠,如前所述16,17。将所有小鼠保持在温度和湿度控制的房间(23°C,30%湿度)中,进行12小时的明暗循环(上午6:30开灯;下午6:30关灯),自由获得食物饮食和水。
- 通过下述方法,用携带对照sgRNA或靶向目的基因的sgRNA的AAV处理所得的Ucp1-Cre / Cas9小鼠。在这项研究中,使用体重约30g的12-15周龄雄性Ucp1-Cre / Cas9小鼠。
5.小鼠AAV注射到BAT中的手术
- 用连续吸入2.5%异氟醚麻醉小鼠进行诱导和维持。
- 润滑双眼以防止干燥。然后,给小鼠服用镇痛药(Banamine,2.5mg / kg体重[BW],皮下注射,见 材料表),以尽量减少和预防术后疼痛和痛苦。
- 使用剃须刀在肩胛间区域剃除小鼠毛发,并用至少三轮交替使用碘基或氯己定基磨砂膏对手术区域进行消毒,然后用 70% 乙醇。然后,在切口部位周围应用无菌手术单。
- 使用手术刀切开肩胛骨之间的皮肤(图3A-B),然后用手术剪刀剥下剃光的皮肤以露出颈部的脂肪组织(图3C-D)。切口的大小取决于体型,但一般来说,切口应约为2厘米,以暴露肩胛间区域的脂肪组织。
- 使用单个切口切割脂肪组织和肌肉远端区域之间边界上的脂肪组织(图3E-F)。切口的大小应约为1厘米,以打开入口以插入手术剪刀以钝性剥离脂肪组织。
- 使用惯用手,用手术剪刀将脂肪组织钝化和垂直剥离以露出蝙蝠,同时用非惯用手捏住脂肪组织,包括 BAT(图 3G)。使用苏尔策的静脉作为地标来指示准确的BAT位置。
注意: 图3H中的BAT完全曝光,用于图片演示。过度解剖可能会对周围BAT的神经造成损害。剪刀的方向不正确可能会伤害周围的肌肉和 Sultzer 的静脉引流 BAT,并可能导致出血过多。 - 对于每只小鼠,使用连接到汉密尔顿注射器的锋利针头(32 G,参见 材料表)将 40 μL AAV 缓慢注入两个 BAT 叶(每个 BAT 叶 20 μL)(100 μL,参见 材料表; 图3I)。检查注射是否成功,如AAV给药期间注射部位没有泄漏所示。
注意: 图3I中的BAT完全曝光,用于图片演示。要施用到BAT叶瓣中的AAV溶液的体积由受体小鼠的BAT大小决定。我们已经确定,在重量为 30 g 的常规 C57BL6/J 小鼠中,20 μL AAV 溶液适用于一个重约 0.05 g 的 BAT 叶。如有必要,可能需要浓缩病毒溶液以达到所需的体积。 - 确认注射的BAT或周围组织没有出血。将浸有过氧化氢溶液的纱布(见 材料表)压在出血部位止血。
- 将暴露的脂肪组织放回正常位置。使用5-0可吸收单丝线缝合脂肪组织和肌肉的边缘(图3J)。用5-0涂层的vicryl未染色编织线缝合开放的皮肤(图3K-L)。
注意: 图4 描述了缝合去皮的脂肪组织和肌肉的步骤。 - 手术后将动物放在加热垫上,直到完全康复。为动物提供食物、水和充足的筑巢床上用品。在实验开始前 7 天内定期监测他们是否有任何痛苦或疾病的迹象。
- 通过从小鼠解剖的BAT中的蛋白质印迹分析确认靶向基因缺失的效率,如Sugimoto等人16所示。
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Representative Results
在上述程序中,AAV-sgRNA精确递送到BAT对于协议的成功至关重要。为了最大限度地提高AAV-sgRNA的效果并最大限度地减少手术过程中的组织损伤,了解BAT的三维(3D)解剖位置至关重要。如图3E所示,在不暴露组织的情况下很难确定BAT的精确位置。然而,过量的BAT暴露可能会损害组织(图3H,I);因此,应执行该程序以在有限的解剖空间内注射AAV溶液(图3G)。图5A对于确保AAV注射的成功和手术后小鼠的快速恢复至关重要。图5B-D显示了可能导致注射失败的潜在缺陷。这些包括将AAV溶液注射到不正确的区域(图5B),针头穿透组织(图5C)以及由于AAV溶液体积过大而导致的组织膨胀(图5D)。最后,目的基因的敲低效率需要通过从注射小鼠中解剖的BAT中的蛋白质水平来验证16。例如,通过蛋白质印迹法测量的BAT中12-LOX的蛋白质水平表明,由于AAV8将靶向Alox12(编码12-LOX的基因)的sgRNA递送到Ucp1-Cre / Cas9小鼠的BAT中,因此可以有效地敲低(参见先前发表的研究16中的图7b)。
图 1:表达 Cas9 和 sgRNA 的慢病毒质粒示意图。 Cas9和sgRNA的慢病毒表达载体(lentiCRISPRv2)。缩写:Puro = 嘌呤霉素选择标记;psi+ = psi 封装信号;RRE = 转速 响应元件;cPPT = 中央聚嘌呤束;EFS = 伸长系数-1α 短启动子;P2A = 2A 自裂解肽;WPRE = 转录后调节元件;LTR = 长端子重复。LentiCRIPSRv2可以使用 BsmBI消化, 一对退火的sgRNA寡核苷酸可以克隆到单向导RNA支架中。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:表达 sgRNA 的 AAV 质粒示意图。 用于 sgRNA 的 AAV 载体。缩写:ITR = I 终端重复;CB = 杂交 CMV 增强子/β-肌动蛋白启动子。pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP可以使用 BbsI消化,一对退火的sgRNA寡核苷酸可以克隆到单向导RNA支架中。 请点击此处查看此图的大图。
图3:将AAV注射到小鼠双侧BAT叶的序贯手术。麻醉小鼠经历了以下程序:(A-B)切割剃光的皮肤,(C-D)钝地剥掉剃光的皮肤,(E-F)切割脂肪组织,(G)钝地剥离脂肪组织,(H-I)使用汉密尔顿注射器将AAV溶液注射到BAT叶中,(J)在脂肪组织和肌肉之间缝合,(K-L)在两个皮瓣之间缝合。注意:在图(H)和(I)中,Sultzer的矿脉是确认BAT精确位置的里程碑。这两个面板中的BAT完全暴露用于图片演示。黄色虚线表示图E中脂肪组织和肌肉之间的边界,以及图I中的针尖(即注射部位)。
图 4:缝合剥离的脂肪组织和肌肉的步骤。 (A)将针线插入去皮的脂肪组织进行注射,(B)穿透脂肪组织,(C)钩住肌肉,(D)拉线缝合剥离的脂肪组织和肌肉,然后结扎线。请点击此处查看此图的大图。
图5.将AAV注射到小鼠BAT叶中的适当和不适当手段的代表性图片。 (A)该图代表建议的AAV进样,其中单侧BAT叶接受20μLAAV溶液的进样。(乙-四)以下AAV注射方法可能导致失败。(B)注射部位不正确(即缺少BAT叶);(三)针头穿透组织;(D)由于大量AAV溶液引起的组织膨胀,其中单侧BAT叶接受80μLAAV溶液注射。黄色虚线圆圈表示针尖(即注射部位)。 请点击此处查看此图的大图。
正向寡核苷酸:5' CACC-20bp gRNA 序列-3' |
反向寡核苷酸:5' AAAC-20bp gRNA 反向补体序列-3' |
例如,如果目标序列是TCTGATAGCGTAGGAGTGAT,则寡核苷酸将是: |
前锋寡核苷酸: 5' 中航海 TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
反向寡核苷酸: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
表1:sgRNA设计示例。 具有与BsmBI限制性位点对应的突出部分的sgRNA序列示例。
材料名称 | 公司 | 货号 | 量 |
慢质粒 v2质粒 | 阿德基因 | #52961 | 5微克 |
psPAX2包装质粒 | 阿德基因 | #12260 | 3.75微克 |
pMD2.G包膜质粒 | 阿德基因 | #12259 | 1.5微克 |
OPTI-MEM 无血清培养基 | Invitrogen | #31985 | 250微升 |
表2:LentiCRISPR。 质粒混合物,用于将含有LentiCRISPRv2质粒的sgRNA转染到HEK-293细胞中以产生CRISPR-sgRNA慢病毒。
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Discussion
现有已发表的AAV介导的基因递送至肩胛间BAT的方法不包含详细的图片和视频,描述将AAV直接注射到BAT中的手术技术和方法。在大多数已发表的方法33,34中,AAV被注射到肩胛间BAT周围的脂肪组织中,而不是BAT本身。因此,该协议中有几个关键步骤决定了研究的成功。这些包括sgRNA的设计,AAV包装和浓度,BAT特异性Cas9小鼠的产生以及外科手术。完成体内手术需要仔细和出色的手术技巧。特别是,在暴露BAT和管理AAV时最大限度地减少组织损伤至关重要。由于多种遗传和环境因素,例如房屋温度,运动训练和饮食,BAT周围的白色脂肪体积和BAT本身的组成可能因动物而异。例如,肥胖小鼠在BAT周围显示出巨大的白色脂肪组织,并且在热中性(30°C)下饲养的小鼠表现出白色的BAT。因此,在不打开皮肤的情况下精确确定BAT的3D位置具有挑战性。最低限度地揭示BAT对于AAV注射来说是一个具有挑战性但至关重要的步骤。在此过程中过度暴露BAT会对交感神经和血管造成严重损害,特别是与BAT相连的Sultzer静脉。
值得注意的是,注射到组织中的AAV体积也是成功的限制因素。过量的溶液可能对细胞有害,并干扰有效的病毒感染,将sgRNA递送到脂肪细胞中。由于BAT大小随受体小鼠的年龄,性别和遗传背景而变化,因此可能需要优化实验16,17。除了敲低目的基因外,该技术还可以应用于过表达目的基因。
这种技术的一个潜在缺陷是,即使使用在体外提供有效敲除的sgRNA,在体内使用一种sgRNA的基因敲除效率也很低。作为一种潜在的解决方案,将两个或多个独特的sgRNA组合成一次注射可以提高体内基因敲低的效率。
总之,Ucp1-Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA技术的组合提供了一个强大而高效的系统来生成具有BAT特异性基因操作的小鼠。该方法可以使用选定的Cre系和改良的AAV注射到不同的组织中适用于其他组织。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)拨款R01DK122808,R01DK102898和R01DK132469(给Y.-H.T.)以及P30DK036836(给乔斯林糖尿病中心的糖尿病研究中心)的部分支持。T.T.得到了SUNSTAR研究奖学金(日本Sunstar基金会Hiroo Kaneda奖学金)和美国心脏协会赠款903968的支持。Y. Z.得到了Charles A. King Trust Fellowship的支持。我们感谢Sean D. Kodani友好地校对手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
Recombinant DNA | |||
lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
Experimental Models: Cell Lines | |||
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
Experimental Models: Organisms/Strains | |||
Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
Others | |||
Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
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