Summary
Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA'ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV'nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.
Abstract
Kahverengi yağ dokusu (BAT), biyoaktif moleküllerin salgılanması yoluyla endokrin bir organ olarak da işlev görebilen, enerji dağılımında uzmanlaşmış bir yağ deposudur. BAT'a özgü nakavt farelerin yaratılması, ilgili bir genin BAT aracılı enerji düzenlemesine katkısını anlamak için en popüler yaklaşımlardan biridir. Cre-LoxP sistemini kullanan geleneksel gen hedefleme stratejisi, dokuya özgü nakavt fareleri üretmek için temel yaklaşım olmuştur. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve sıkıcıdır. Burada, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi kullanarak BAT'a ilgi duyan bir genin hızlı ve verimli bir şekilde nakavt edilmesi için bir protokol açıklıyoruz. İnterskapuler BAT, kaslar arasındaki derin tabakada bulunur. Bu nedenle, AAV'yi görme alanı içinde BAT'a tam ve doğrudan enjekte etmek için BAT açığa çıkarılmalıdır. BAT'ye bağlanan Sultzer damarı gibi sempatik sinirlerin ve damarların zarar görmesini önlemek için uygun cerrahi kullanım çok önemlidir. Doku hasarını en aza indirmek için, BAT'ın üç boyutlu anatomik yerini ve teknik adımlarda gerekli olan cerrahi becerileri anlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, ilgilenilen geni hedef alan sgRNA'ların tasarımı, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanması ve BAT'deki genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için geniş çapta uygulanabilecek BAT'ye özgü nakavt fareleri üretmek için AAV'nin her iki BAT lobuna doğrudan mikroenjeksiyonu ameliyatı da dahil olmak üzere temel teknik prosedürleri vurgulamaktadır.
Introduction
Obezite dünya çapında önemli bir oranda artmakta ve geniş bir metabolik hastalık spektrumuna yol açmaktadır 1,2,3. Yağ dokusu bu patolojilerin anahtarıdır. İşlevsel olarak farklı iki yağ dokusu tipi, fazla kaloriyi depolayan beyaz yağ dokusu (WAT) ve termojenez için enerjiyi dağıtan kahverengi yağ dokusu (BAT) ve ilgili bej / brite yağıdır. BAT, enerji dağıtıcı işlevi ile tanınırken, distal organlarda metabolizmayı düzenleyen biyoaktif moleküllerin üretimi yoluyla endokrin fonksiyonlara da sahiptir 4,5. Kemirgenlerde yapılan çok sayıda çalışma, kahverengi veya bej yağın miktarının veya aktivitesinin arttırılmasının, enerji harcamasının artmasına ve insülin duyarlılığının artmasına neden olduğunu göstermiştir. İnsanlarda, saptanabilir BAT'lı kişilerde kardiyometabolik hastalık prevalansı anlamlı derecede düşüktür6. Bu nedenle, BAT obezite ile ilişkili metabolik sekeller 7,8,9 için mükemmel terapötik potansiyele sahiptir.
BAT gelişim ve fonksiyonunun fizyolojisini ve patofizyolojisini araştırmak ve bu süreçlerde yer alan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, BAT'ye özgü transgenik fare modeli tercih edilen bir yöntemdir10. Cre-LoxP rekombinasyon sistemi, fare genomunu düzenleyerek koşullu nakavt fareleri üretmek için en yaygın kullanılan araçtır. Bu sistem, ilgili genlerin doku/hücreye özgü bir şekilde modifikasyonunu (aşırı ekspresyon veya nakavt) sağlamıştır11. Ayrıca, seçici bir floresan muhabir genini eksprese ederek belirli bir hücre tipini etiketlemek için de kullanılabilir.
Son zamanlarda, Cre-LoxP sistem yaklaşımı, CRISPR-Cas9 teknolojisi ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi12'nin birleştirilmesiyle daha da geliştirilmiştir. CRISPR-Cas9 sistemi, genom13'ün kesin bölgelerini değiştirmek, düzenlemek veya hedeflemek için spesifik ve etkili bir gen düzenleme aracıdır. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme, genomik lokusların hızlı genetik manipülasyonuna izin verir, çünkü bir gen hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon gerektirmez. Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA teknikleri, araştırmacıların dokularda / hücrelerde istenen zamanlarda ilgilenilen genlerin rolünün araştırılmasına izin vererek gen fonksiyonlarını daha kesin bir şekilde anlamalarını sağlar. Ek olarak, bu kombine teknikler transgenik fareler üretmek için gereken zamanı ve çabayı azaltır ve indüklenebilir bir Cre hattı kullanılıyorsa, farelerde indüklenebilir genom düzenlemesi için CRISPR-Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin verir14.
AAV vektörleri in vivo gen dağıtım sistemlerinde güvenli ve etkilidir. Bununla birlikte, yağ dokusunu hedef alan AAV'ler, beyin, kalp, karaciğer ve kas15 gibi diğer dokulardaki uygulamaların gerisinde kalmıştır. Doğal olarak oluşan serotip vektörleri ile nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve tropizm nedeniyle, yağ dokusuna AAV rehberliğinde gen iletimi hala zordur15. Son 5 yılda, biz ve diğerleri, AAV rehberliğindeki genleri yağ dokusuna iletmek için etkili ve minimal invaziv yollar oluşturduk ve BAT fonksiyonunun düzenlenmesinde yer alan genleri anlamamızı sağlayan fare modelleri oluşturduk16,17,18,19. Örneğin, 12-lipoksijenazı (12-LOX) kodlayan Alox12'yi hedefleyen sgRNA'yı Ucp1-Cre / Cas9 farelerinin BAT'ına iletmek için AAV8'i kullanarak, aktive edilmiş BAT'ın glikoz metabolizmasını düzenlemek ve obezite ile ilişkili inflamasyonu çözmek için sırasıyla 12-hidroksi-eikosapentaenoik asit (12-HEPE) ve 13R, 14S-dihidroksi dokosaheksaenoik asit (maresin 2) olmak üzere 12-LOX metabolitleri ürettiğini keşfettik. 17. Burada, kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA sistemini kullanarak BAT'a özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürler, özellikle AAV-sgRNA'nın BAT loblarına doğrudan mikroenjeksiyonu için cerrahi konusunda adım adım bir protokol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ve bakım prosedürleri, Joslin Diyabet Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Kültürlenmiş hücrelerde etkili sgRNA'ların taranması
NOT: Tahlili uygun maliyetli hale getirmek için, sgRNA'ları AAV parçacıklarına paketlemeden önce, Cas9 / sgRNA ekspresyonu için lentivirüs tabanlı bir sistem aracılığıyla kültürlenmiş hücrelerde farklı sgRNA'ları test etmenizi öneririz (Şekil 1) ve in vivo deneyler için en yüksek nakavt verimliliğini veren sgRNA'ları seçmenizi öneririz.
- CRISPR-Cas9 sgRNA tasarımı
- Geniş sgRNA tasarım aracı (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, CRISPOR çevrimiçi aracı (http://crispor.tefor.net/)22 ve diğer mevcut araçlar gibi çevrimiçi araçları kullanarak sgRNA'ları tasarlayın.
- Gen adı kutusuna gen adlarını veya DNA hedef dizilerini girin ve potansiyel sgRNA dizileri oluşturmak üzere SpCas9 için protospacer bitişik motif (PAM) olarak NGG'yi seçin.
- Yüksek tahmin edilen hedef içi verimliliğe ve düşük hedef dışı aktiviteye sahip sgRNA'ları seçin. Örneğin, CRISPOR çıkışında özgüllük puanı en az 50 olan sgRNA'ların kullanılması önerilir. Filtreyi geçen spesifik sgRNA'lar arasından, yüksek verimlilik puanlarına sahip olanları seçin23.
NOT: Genel olarak, etkili sgRNA'ların tanımlanmasını sağlamak için üç veya dört sgRNA seçilir.
- CRISPR-Cas9 sgRNA plazmidinin yapımı
- Bir DNA sentez platformu aracılığıyla BsmBI kısıtlama bölgesinden (Tablo 1) çıkıntılı (hem 5' hem de 3') 20 nükleotid (nt) hedefli dizileri kodlayan sgRNA oligo çiftlerini sentezleyin.
- BsmBI-doğrusallaştırılmış lentiCRISPR v2 vektörü ile ligate tavlanmış oligo çiftleri.
- Ligasyon ürününü Stbl3 E. coli suşuna dönüştürün ve U6 ileri astar kullanarak Sanger DNA dizilimi ile sgRNA yerleştirmelerini onaylayın.
NOT: Addgene'nin LentiCRISPRv2 ve lentiGuide-Puro başlıklı protokolündeki ayrıntılı klonlama prosedürüne bakınız: lentiviral CRISPR / Cas9 ve tek kılavuz RNA24.
- Lentiviral partiküllerin üretimi
- Transfeksiyondan yaklaşık 24 saat önce, 6 cm'lik bir doku kültürü plakasında 4 mL tam büyüme ortamında 7 x 105 HEK-293 hücreyi plakalar.
- 250 μL serumsuz ortama 15 μL LT1 transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Her sgRNA için Tablo 2'ye göre 250 μL serumsuz ortamda bir transfeksiyon kokteyli hazırlayın. Adım 1.3.2'de hazırlanan transfeksiyon reaktifini plazmid kokteyli ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
- HEK-293 hücreleri için tüm büyüme ortamını 3.5 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin ve ardından DNA transfeksiyon reaktifi karışımını 3.5 mL taze büyüme ortamında kültürlenmiş HEK-293 hücrelerine damla damla ekleyin.
- 12-15 saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı değiştirin ve 4 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin.
- 24 saatlik inkübasyondan sonra, lentiviral parçacıklar içeren hücre kültürü ortamını toplayın ve herhangi bir HEK-293 hücresini çıkarmak için ortamı 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin. Virüsler birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Uzun süreli depolama için, virüsler -80 ° C'de dondurulmalıdır.
NOT: Lentiviral partikülleri hazırlarken biyogüvenlik kurallarına uyun ve lentivirüsün işlenmesi için uygun bir ortamda (örneğin, BL2+) çalışın. Addgene'nin pLKO.1 - TRC Klonlama Vektörü (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G) başlıklı protokolündeki ayrıntılı lentivirüs hazırlama prosedürüne bakınız.
- Kahverengi preadipositlerin enfeksiyonu ve sgRNA aracılı nakavtın belirlenmesi
- Plaka 1 x 10 6 fare,6 delikli bir plakada kuyucuk başına 8 μg / mL polibren içeren 1 mL taze ortamda kahverengi preadipositleri ölümsüzleştirdi.
NOT: Bu çalışmada ölümsüzleştirilmiş kahverengi preadipositler SV40 T antijeni25 kullanılarak üretilmiştir. Kahverengi preadipositler,% 10 FBS ile yüksek glikozlu DMEM'de kültürlenir. - Hücreleri enfekte etmek için adım 1.3'ten 1 mL lentiviral parçacık çözeltisi ekleyin. Antibiyotik seçim kontrolü olarak hizmet etmek için enfekte olmamış bir hücre kuyusunu paralel olarak koruyun.
- Enfeksiyondan 24 saat sonra taze ortama geçin. Enfekte olmayan hücreleri öldürmek ve enfekte olanları seçmek için ilgili antibiyotikleri (örneğin, son konsantrasyonu 1 μg / mL'lik olan puromisin) ortama ekleyin. Tüm enfekte olmamış kontrol hücreleri ölene kadar her gün seçilen antibiyotiği içeren taze ortama geçin.
- Virüs bulaşmış hücrelerden protein toplayın ve batı leke analizi ile sgRNA'ların yıkma verimliliğini belirleyin. Eslami ve Lujan26'daki ayrıntılı batı lekeleme prosedürünü izleyin. Proteinler arasındaki değişen devir hızı nedeniyle, protein sinyalinin kaybını gözlemlemek için birden fazla zaman noktasını (örneğin, virüs enfeksiyonundan sonra 6. günden 12. güne kadar) test edin.
NOT: İlgili gen tarafından kodlanan proteini tanıyan bir antikor mevcut değilse, her bir sgRNA'nın genom düzenleme verimliliğini belirlemek için alternatif olarak Sanger dizilimi kullanılabilir. Kısaca, ~ 700 bp uzunluğunda PCR amplikonları üretmek için sgRNA hedefli bölgeyi çevreleyen primerleri kullanarak genomik DNA'yı güçlendirin. Öngörülen mola yeri tercihen sıralama başlangıç bölgesinden aşağı yönde ~200 bp olmalıdır. Ardından, PCR ürününü Sanger dizilemesine tabi tutun. Bir hücre havuzundaki her bir sgRNA tarafından üretilen küçük indellerin sıklığını belirlemek için DEcomposition (TIDE) ile Indellerin İzlenmesi (TIDE) gibi çevrimiçi araçları kullanarak sıralama sonuçlarını analiz edin27.
- Plaka 1 x 10 6 fare,6 delikli bir plakada kuyucuk başına 8 μg / mL polibren içeren 1 mL taze ortamda kahverengi preadipositleri ölümsüzleştirdi.
2. AAV-sgRNA plazmidinin yapımı
NOT: Bu adımda, yukarıdaki ekrandan tanımlanan etkili sgRNA'lar pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP vektör28'e klonlanır (Şekil 2). Bu arada, fare genomundaki herhangi bir diziyi tanımayan hedeflemesiz bir sgRNA (örneğin, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) da düzenlenmemiş bir kontrol olarak hizmet etmek için aynı vektöre klonlanır.
- Sentezlenmiş sgRNA oligolarıyla aynı çıkıntıları üreten BbsI kullanarak pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP omurgasını doğrusallaştırın.
- Tavlanmış oligo çiftlerini doğrusallaştırılmış pAAV vektörü ile bağlayın ve adım 1.2'de açıklandığı gibi sgRNA eklemelerini onaylayın.
NOT: lentiCRISPRv2-sgRNA için klonlama prosedürü AAV-sgRNA plazmid yapımı için de uygulanır.
3. AAV paketleme
- Bölüm 2'de oluşturulan AAV vektörlerini AAV serotip 8'e paketleyin. Önceki bir protokol30'a göre yüksek titreli AAV hazırlayın veya viral çekirdeklerden veya ticari hizmetlerden bir AAV paketleme hizmeti isteyin. Virüs titresini 1 x 1013 genom kopyası/mL'ye seyreltin.
NOT: Bir sgRNA'yı eksprese eden modifiye AAV2 genomu, AAV serotip 8'e paketlenmiştir. Bu serotip, yağ dokusu18,31 için yüksek etkinliği nedeniyle seçildi. Hücre kalıntıları ve az miktarda orta bileşen gibi kirleticilerin neden olduğu bağışıklık tepkisini önlemek için, in vivo enjeksiyon için ultra saflaştırılmış AAV gereklidir. Ultra saflaştırma, iyotiksanol gradyanları ve ultrasantrifüjleme30 ile sağlanabilir.
4. Ucp1 Cre / Cas9 farelerin hazırlanması
- Ucp1 destekleyicisinin kontrolü altında Cre rekombinazını ifade eden Ucp1-Cre fare suşunu satın alın (bkz. Cas9 ekspresyonunun Cre rekombinazına bağımlı bir şekilde düzenlendiği homozigot Rosa26-floksed STOP-Cas9 knock-in fareleri32'yi satın alın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Daha önce 16,17'de açıklandığı gibi Ucp1-Cre / Cas9 fareleri üretmek için bu suşları geçin. Tüm fareleri sıcaklık ve nem kontrollü bir odada (23 ° C,% 30 nem) 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde (ışıklar sabah 6: 30'da yanar; ışıklar 18: 30'da kapanır) chow diyetine ve suya serbest erişimle saklayın.
- Elde edilen Ucp1-Cre / Cas9 farelerine, aşağıda açıklanan yöntemle ilgili geni hedefleyen kontrol sgRNA veya sgRNA taşıyan AAV'lerle muamele edin. Bu çalışmada, yaklaşık 30 g ağırlığındaki 12-15 haftalık erkek Ucp1-Cre/Cas9 fareleri kullanıldı.
5. Farelerde BAT içine AAV enjeksiyonu için cerrahi
- İndüksiyon ve bakım için fareleri sürekli olarak% 2.5 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun.
- Kurumayı önlemek için her iki gözü de yağlayın. Daha sonra, postoperatif ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek ve önlemek için farelere analjezikler (banamin, 2.5 mg / kg vücut ağırlığı [BW], deri altı enjeksiyonu, Malzeme Tablosuna bakınız) verin.
- Bir tıraş makinesi kullanarak interskapular bölgedeki fare kürkünü tıraş edin ve cerrahi alanı iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın en az üç alternatif turu ve ardından% 70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra, kesi yerinin etrafına steril cerrahi örtüler uygulayın.
- Bir neşter kullanarak kürek kemiği arasındaki cildi kesin (Şekil 3A-B) ve daha sonra cerrahi makas kullanarak boyundaki yağ dokularını açığa çıkarmak için tıraş edilmiş cildi soyun (Şekil 3C-D). İnsizyonun büyüklüğü vücut büyüklüğüne bağlıdır, ancak genellikle interskapuler bölgedeki yağ dokularını açığa çıkarmak için insizyon yaklaşık 2 cm olmalıdır.
- Yağ dokularının distal bölgesi ile kaslar arasındaki sınırdaki yağ dokularını tek bir kesi ile kesin (Şekil 3E-F). Yağ dokularının künt soyulması için cerrahi makasın yerleştirilmesi için girişi açmak için insizyonun boyutu yaklaşık 1 cm olmalıdır.
- Baskın eli kullanarak, BAT dahil yağ dokularını baskın olmayan el ile sıkıştırırken, BAT'ı açığa çıkarmak için cerrahi makasla yağ dokularını keskin ve dikey olarak soyun (Şekil 3G). Sultzer'in damarını, kesin BAT konumunu belirtmek için bir dönüm noktası olarak kullanın.
NOT: Şekil 3H'deki BAT, bir resim gösterimi amacıyla tamamen ortaya çıkarılmıştır. Aşırı diseksiyon, çevredeki BAT'nin sinirlerine zarar verebilir. Makasın yanlış yönlendirilmesi, çevredeki kaslara ve Sultzer'in damarının BAT'ı boşaltmasına zarar verebilir ve aşırı kanamaya neden olabilir. - Her fare için, bir Hamilton şırıngasına (100 μL, bkz. Şekil 3I). AAV uygulaması sırasında enjekte edilen bölgeden sızıntı olmadığı belirtilen başarılı enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Şekil 3I'deki BAT, bir resim gösterimi amacıyla tamamen ortaya çıkarılmıştır. Bir BAT lobuna uygulanacak AAV çözeltisinin hacmi, alıcı farenin BAT'sinin boyutuna göre belirlenir. 20 μL AAV çözeltisinin, 30 g ağırlığındaki normal bir C57BL6/J farede yaklaşık 0,05 g ağırlığındaki bir BAT lobu için uygun olduğunu belirledik. Gerekirse, istenen hacme ulaşmak için viral çözeltinin konsantre edilmesi gerekebilir. - Enjekte edilen BAT veya çevresindeki dokulardan kanama olmadığını onaylayın. Hidrojen peroksit çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezi (bakınız Malzeme Tablosu) hemostaz için kanama bölgesine bastırın.
- Maruz kalan yağ dokularını normal pozisyonlarına geri yerleştirin. 5-0 emilebilir monofilament iplik kullanarak yağ dokularının ve kasın kenarını dikin (Şekil 3J). Açık cildi 5-0 kaplamalı vicryl boyasız örgülü ipliklerle dikin (Şekil 3K-L).
NOT: Şekil 4 , soyulmuş yağ dokularını ve kaslarını dikme adımlarını açıklamaktadır. - Tamamen iyileşene kadar ameliyattan sonra hayvanları bir ısıtma yastığında tutun. Hayvanlara yiyecek, su ve yuvalama için bol miktarda yatak takımına erişim sağlayın. Deneyin başlamasından önceki 7 günlük iyileşme süresi boyunca herhangi bir sıkıntı veya hastalık belirtisi için düzenli olarak izleyin.
- Sugimoto ve ark.16'da olduğu gibi, farelerden disseke edilen BAT'ta batı leke analizi ile hedeflenen gen delesyonunun etkinliğini onaylayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki prosedürler boyunca, AAV-sgRNA'nın BAT'a kesin olarak verilmesi, protokolün başarısı için çok önemlidir. AAV-sgRNA'nın etkisini en üst düzeye çıkarmak ve ameliyat sırasında doku hasarını en aza indirmek için, BAT'nin üç boyutlu (3D) anatomik yerini anlamak önemlidir. Şekil 3E'de gösterildiği gibi, dokuyu açığa çıkarmadan BAT'ın kesin yerini belirlemek zordur. Bununla birlikte, aşırı BAT maruziyeti dokuya zarar verebilir (Şekil 3H, I); Bu nedenle, AAV çözeltisini sınırlı bir anatomik boşluk içinde enjekte etmek için prosedür uygulanmalıdır (Şekil 3G). Şekil 5A, AAV enjeksiyonunun başarısını ve ameliyattan sonra farelerin hızlı bir şekilde iyileşmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Şekil 5B-D, başarısız enjeksiyonlara yol açabilecek potansiyel kusurları göstermektedir. Bunlar arasında AAV çözeltisinin yanlış bölgeye enjekte edilmesi (Şekil 5B), dokudan iğne penetrasyonu (Şekil 5C) ve AAV çözeltisinin aşırı hacmi nedeniyle doku balonlaşması (Şekil 5D) sayılabilir. Son olarak, ilgili genin nakavt etkinliğinin, enjekte edilen farelerden disseke edilen BAT'taki protein seviyeleri ile doğrulanması gerekir16. Örneğin, batı lekesi ile ölçülen BAT'taki 12-LOX'un protein seviyeleri, AAV8'in Alox12'yi (12-LOX'u kodlayan gen) Ucp1-Cre / Cas9 farelerinin BAT'ına hedefleyen sgRNA vermesi nedeniyle etkili bir şekilde nakavt edildiğini göstermektedir (daha önce yayınlanan çalışmada Şekil 7b'ye bakınız16).
Şekil 1: Cas9 ve sgRNA'yı eksprese eden lentiviral plazmidin şeması. Cas9 ve sgRNA (lentiCRISPRv2) için lentiviral ekspresyon vektörü. Kısaltmalar: Puro = puromisin seçim belirteci; psi+ = psi paketleme sinyali; RRE = devir tepki elemanı; cPPT = merkezi polipürin yol; EFS = uzama faktörü-1α kısa promotör; P2A = 2A kendiliğinden yarılan peptid; WPRE = posttranskripsiyonel düzenleyici unsur; LTR = uzun terminal tekrarı. LentiCRIPSRv2, BsmBI kullanılarak sindirilebilir ve bir çift tavlanmış sgRNA oligosu, tek kılavuzlu RNA iskelesine klonlanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SgRNA eksprese eden AAV plazmidi için şematik. sgRNA için AAV vektörü. Kısaltmalar: ITR = I terminal tekrarı; CB = hibrid CMV arttırıcı/β-aktin promotörü. pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP, BbsI kullanılarak sindirilebilir ve bir çift tavlanmış sgRNA oligosu, tek kılavuzlu RNA iskelesine klonlanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde bilateral BAT loblarına AAV enjeksiyonu için ardışık cerrahi. Anestezi uygulanan bir fare aşağıdaki prosedürlerden geçmiştir: (A-B) tıraş edilmiş cildi kesmek, (C-D) tıraş edilen cildi açıkça soymak, (E-F) yağ dokularını kesmek, (G) yağ dokularını açıkça soymak, (H-I) AAV çözeltisini bir Hamilton şırıngası kullanarak BAT loblarına enjekte etmek, (J) yağ dokuları ve kas arasında dikiş atmak ve (K-L) her iki cilt flebi arasında. Not: (H) ve (I) panellerinde, Sultzer'in damarı, BAT'nin kesin yerini doğrulamak için bir dönüm noktasıdır. Bu iki paneldeki BAT tamamen resim gösterimi için ortaya çıkarıldı. Sarı noktalı çizgiler, panel E'deki yağ dokuları ve kas arasındaki sınırı ve panel I'deki iğnenin ucunu (yani enjeksiyon bölgesini) gösterir.
Şekil 4: Soyulmuş yağ dokularını ve kaslarını dikme adımları. (A) Enjeksiyon için soyulmuş yağ dokularına bir iğne ipliği yerleştirin, (B) yağ dokularına nüfuz edin, (C) bir kası bağlayın, (D) soyulmuş yağ dokularını ve kasları dikmek için bir ipliği yukarı çekin ve ardından iplikleri bağlayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Farelerde BAT loblarına uygun ve uygunsuz AAV enjeksiyon araçlarının temsili resimleri. (A) Bu şekil, tek taraflı bir BAT lobunun 20 μL AAV çözeltisi enjeksiyonu aldığı önerilen AAV enjeksiyonunu temsil eder. (B-D) Aşağıdaki AAV enjeksiyon yöntemleri başarısızlığa neden olabilir. (B) Yanlış enjeksiyon bölgesi (yani, BAT loblarının eksik olması); (C) İğnenin dokulara nüfuz etmesi; ve (D) tek taraflı bir BAT lobunun 80 μL'lik bir AAV çözeltisi enjeksiyonu aldığı büyük miktarda AAV çözeltisi nedeniyle doku balonlaşması. Sarı noktalı daireler iğnenin ucunu (yani enjeksiyon bölgesini) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| İleri oligo: 5' CACC-20bp gRNA dizisi-3' |
| Ters oligo: 5' AAAC-20bp gRNA ters kompleman dizisi-3' |
| Örneğin, hedef dizi TCTGATAGCGTAGGAGTGAT ise, oligolar şöyle olacaktır: |
| İleri oligo: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| Ters oligo: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
Tablo 1: sgRNA tasarım örneği. BsmBI kısıtlama bölgesine karşılık gelen çıkıntılara sahip bir sgRNA dizisi örneği.
| Malzeme Adı | Şirket | Katalog Numarası | Miktar |
| lentiCRISPER v2 plazmid | Arjantin | #52961 | 5 μg |
| psPAX2 ambalaj plazmidi | Arjantin | #12260 | 3,75 μg |
| pMD2.G zarf plazmidi | Arjantin | #12259 | 1,5 μg |
| OPTI-MEM serumsuz ortam | Invitrogen | #31985 | 250 μl |
Tablo 2: LentiCRISPR. LentiCRISPRv2 plazmidini içeren sgRNA'nın CRISPR-sgRNA lentivirüs üretmek için HEK-293 hücrelerine transfeksiyonu için plazmid kokteyli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnterskapuler BAT'a AAV aracılı gen iletimi için mevcut yayınlanmış yöntemler, BAT'ye doğrudan AAV enjeksiyonu için cerrahi teknikleri ve yaklaşımı açıklayan ayrıntılı resimler ve videolar içermemektedir. Yayınlanan yöntemlerin çoğunda33,34, AAV, BAT'ın kendisi yerine interskapuler BAT'ı çevreleyen yağ dokularına enjekte edilir. Bu nedenle, bu protokolde çalışmanın başarısını belirleyen birkaç önemli adım vardır. Bunlar arasında sgRNA'nın tasarımı, AAV ambalajı ve konsantrasyonu, BAT'a özgü Cas9 farelerinin üretimi ve cerrahi prosedürler bulunur. İn vivo prosedürleri tamamlamak için dikkatli ve olağanüstü cerrahi beceriler gereklidir. Özellikle, BAT'ı açığa çıkarırken ve AAV'yi uygularken doku hasarını en aza indirmek kritik öneme sahiptir. Konut sıcaklığı, egzersiz eğitimi ve diyetler gibi çoklu genetik ve çevresel faktörler nedeniyle, BAT'ı çevreleyen beyaz yağ hacmi ve BAT'ın kendisinin bileşimi hayvanlar arasında değişebilir. Örneğin, obez fareler BAT'yi çevreleyen geniş beyaz yağ dokularını gösterir ve termonötritede (30 ° C) bulunan fareler beyazlatılmış BAT sergiler. Bu nedenle, cildi açmadan BAT'ın 3D yerini kesin olarak belirlemek zordur. BAT'ın minimal olarak ortaya çıkarılması, AAV enjeksiyonu için zorlu ama çok önemli bir adımdır. Bu prosedür sırasında BAT'ın aşırı maruz kalması, sempatik sinirlere ve damarlara, özellikle de BAT'ye bağlı Sultzer damarına ciddi zarar verebilir.
Not olarak, dokuya enjekte edilen AAV'nin hacmi de başarı için sınırlayıcı bir faktördür. Çözeltinin aşırı hacmi hücrelere zararlı olabilir ve sgRNA'yı adipositlere iletmek için etkili bir viral enfeksiyona müdahale edebilir. BAT boyutu, alıcı farelerin yaşına, cinsiyetine ve genetik geçmişine göre değiştiğinden, optimizasyon deneyleri gerekebilir16,17. İlgilenilen genleri yıkmaya ek olarak, bu teknik ayrıca ilgilenilen genleri aşırı eksprese etmek için de uygulanabilir.
Bu tekniğin potansiyel tuzaklarından biri, in vitro olarak etkili nakavt sağlayan sgRNA'larla bile, in vivo olarak bir sgRNA kullanarak gen nakavtının düşük verimliliğidir. Potansiyel bir çözüm olarak, iki veya daha fazla benzersiz sgRNA'yı tek bir enjeksiyonda birleştirmek, in vivo gen nakavtının verimliliğini artırabilir.
Sonuç olarak, kombine Ucp1-Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA teknolojileri, BAT'ye özgü gen manipülasyonu ile fareler üretmek için sağlam ve verimli bir sistem sunmaktadır. Bu yöntem, seçilen Cre çizgileri ve farklı dokulara modifiye AAV enjeksiyonu kullanılarak diğer dokular için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ve R01DK132469 (Y.-H.T.'ye) ve P30DK036836 (Joslin Diyabet Merkezi Diyabet Araştırma Merkezi'ne) hibeleri ile desteklenmiştir. T.T., SUNSTAR Araştırma Bursu (Hiroo Kaneda Bursu, Sunstar Vakfı, Japonya) ve Amerikan Kalp Derneği hibe 903968 tarafından desteklenmiştir. Y. Z., Charles A. King Trust Fellowship tarafından desteklendi. Sean D. Kodani'ye makaleyi nazikçe düzelttiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
