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Biology

संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9, और एडेनो-एसोसिएटेड वायरस सिंगल-गाइड आरएनए सिस्टम का उपयोग करके ब्राउन फैट-विशिष्ट नॉकआउट चूहों की पीढ़ी

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65083
Automatic Translation
1, 1, 1
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) -विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए तकनीकी प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, जो एक संयुक्त क्रे-लॉक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9, और एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रणाली का लाभ उठाते हैं। वर्णित चरणों में एसजीआरएनए का डिजाइन, एएवी-एसजीआरएनए कणों की तैयारी और बीएटी लोब में एएवी का माइक्रोइंजेक्शन शामिल है।

Abstract

ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) ऊर्जा अपव्यय में विशिष्ट एक वसा डिपो है जो बायोएक्टिव अणुओं के स्राव के माध्यम से अंतःस्रावी अंग के रूप में भी काम कर सकता है। बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों का निर्माण बीएटी-मध्यस्थता ऊर्जा विनियमन के लिए रुचि के जीन के योगदान को समझने के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोणों में से एक है। क्रे-लॉक्सपी प्रणाली का उपयोग करके पारंपरिक जीन लक्ष्यीकरण रणनीति ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए प्रमुख दृष्टिकोण रहा है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला और थकाऊ है। यहां, हम एक संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-कैस 9, और एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रणाली का उपयोग करके बीएटी में रुचि के जीन के तेजी से और कुशल नॉकआउट के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इंटरस्केपुलर बैट मांसपेशियों के बीच गहरी परत में स्थित है। इस प्रकार, दृश्य क्षेत्र के भीतर एएवी को सटीक रूप से और सीधे बैट में इंजेक्ट करने के लिए बीएटी को उजागर किया जाना चाहिए। सहानुभूति तंत्रिकाओं और वाहिकाओं को नुकसान को रोकने के लिए उचित सर्जिकल हैंडलिंग महत्वपूर्ण है, जैसे कि सल्त्ज़र की नस जो बीएटी से जुड़ती है। ऊतक क्षति को कम करने के लिए, बीएटी के त्रि-आयामी शारीरिक स्थान और तकनीकी चरणों में आवश्यक सर्जिकल कौशल को समझने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल प्रमुख तकनीकी प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालता है, जिसमें रुचि के जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के डिजाइन, एएवी-एसजीआरएनए कणों की तैयारी, और बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए दोनों बीएटी लोब में एएवी के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन के लिए सर्जरी शामिल है, जिसे मोटे तौर पर बीएटी में जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

मोटापा दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण दर से बढ़ रहा है, जिससे चयापचय रोगों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम 1,2,3 हो रहा है। वसा ऊतक इन विकृतियों के लिए महत्वपूर्ण है। दो कार्यात्मक रूप से अलग-अलग प्रकार के वसा ऊतक जो मौजूद हैं वे सफेद वसा ऊतक (डब्ल्यूएटी) हैं, जो अतिरिक्त कैलोरी संग्रहीत करते हैं, और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) और इसके संबंधित बेज / ब्राइट वसा, जो थर्मोजेनेसिस के लिए ऊर्जा को नष्ट करते हैं। जबकि बीएटी को इसके ऊर्जा-विघटन कार्य के लिए मान्यता दी गई है, इसमें बायोएक्टिव अणुओं के उत्पादन के माध्यम से अंतःस्रावी कार्य भी हैं जो डिस्टलअंगों में चयापचय को नियंत्रित करते हैं। कृन्तकों में कई अध्ययनों से पता चला है कि भूरे या बेज वसा की मात्रा या गतिविधि बढ़ने से ऊर्जा व्यय में वृद्धि होती है और इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार होता है। मनुष्यों में, पता लगाने योग्य बीएटी वाले लोगों में कार्डियोमेटाबोलिक रोगों का काफी कम प्रसारहोता है। इस प्रकार, बीएटी मोटापे से संबंधित चयापचय अनुक्रम 7,8,9 के लिए उत्कृष्ट चिकित्सीय क्षमता रखता है।

बीएटी विकास और कार्य के शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच करने और इन प्रक्रियाओं में शामिल आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, बीएटी-विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पसंद10 की एक विधि है। क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली माउस जीनोम को संपादित करके सशर्त नॉकआउट चूहों का उत्पादन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला साधन है। इस प्रणाली ने ऊतक/कोशिका-विशिष्ट तरीके से रुचि के जीनों के संशोधन (ओवरएक्प्रेशन या नॉकआउट) को सक्षमकिया है। इसका उपयोग चयनात्मक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को व्यक्त करके एक विशिष्ट सेल प्रकार को लेबल करने के लिए भी किया जा सकता है।

हाल ही में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 तकनीक और एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) सिस्टम12 के संयोजन से सीआरई-लोक्सपी सिस्टम दृष्टिकोण को और विकसित किया गया है। CRISPR-Cas9 प्रणाली जीनोम13 के सटीक क्षेत्रों को संशोधित, विनियमित या लक्षित करने के लिए एक विशिष्ट और कुशल जीन-संपादन उपकरण है। CRISPR-Cas9-आधारित जीनोम संपादन जीनोमिक लोकी के तेजी से आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देता है क्योंकि इसे जीन-लक्ष्यीकरण वेक्टर के साथ समरूप पुनर्संयोजन की आवश्यकता नहीं होती है। संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-कैस 9, और एएवी-एसजीआरएनए तकनीक शोधकर्ताओं को ऊतकों / कोशिकाओं में वांछित समय पर रुचि के जीन की भूमिका की जांच की अनुमति देकर जीन कार्यों को अधिक सटीक रूप से समझने में सक्षम बनाती है। इसके अतिरिक्त, ये संयुक्त तकनीक ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को कम करती हैं और चूहों में इंड्यूसेबल जीनोम संपादन के लिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 गतिविधि के अस्थायीनियंत्रण की अनुमति देती हैं यदि एक इंड्यूसेबल सीआरई लाइन का उपयोग किया जाता है।

एएवी वैक्टर विवो जीन वितरण प्रणालियों में सुरक्षित और प्रभावी हैं। हालांकि, वसा ऊतक को लक्षित करने वाले एएवी मस्तिष्क, हृदय, यकृत और मांसपेशियों15 जैसे अन्य ऊतकों में अनुप्रयोगों से पीछे रह गए हैं। स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले सीरोटाइप वैक्टर के साथ अपेक्षाकृत कम पारगमन दक्षता और ट्रोपिज्म के कारण, वसा ऊतक के लिए एएवी-निर्देशित जीन वितरण अभीभी चुनौतीपूर्ण है। पिछले 5 वर्षों में, हमने और अन्य लोगों ने वसा ऊतक में एएवी-निर्देशित जीन वितरित करने के लिए प्रभावी और न्यूनतम इनवेसिव तरीके सफलतापूर्वक स्थापित किए हैं और माउस मॉडल बनाए हैं जो हमें बीएटी फ़ंक्शन 16,17,18,19 के विनियमन में शामिल जीन की समझ हासिल करने की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, एएवी 8 का उपयोग करके एलोक्स 12 को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए को वितरित करने के लिए, जो यूसीपी 1-सीआरई / सीएएस 9 चूहों के बीएटी में 12-लिपोक्सीजिनेज (12-एलओएक्स) को एन्कोड करता है, हमने पाया है कि सक्रिय बीएटी 12-एलओएक्स मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करता है, अर्थात् 12-हाइड्रॉक्सी-इकोसापेंटेनोइक एसिड (12-एचईपीई) और13 आर, 14 एस-डाइहाइड्रॉक्सी डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड (मार्सिन 2) को विनियमित करने के लिए। 17. यहां, हम तकनीकी प्रक्रियाओं पर एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विशेष रूप से बीएटी लोब में एएवी-एसजीआरएनए के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन के लिए सर्जरी, संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 और एएवी-एसजीआरएनए प्रणाली का उपयोग करके बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों और देखभाल प्रक्रियाओं को जोसलिन मधुमेह केंद्र में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रभावी एसजीआरएनए की स्क्रीनिंग

नोट: परख को लागत प्रभावी बनाने के लिए, एसजीआरएनए को एएवी कणों में पैकेजिंग करने से पहले, हम कैस 9 / एसजीआरएनए अभिव्यक्ति (चित्रा 1) के लिए लेंटिवायरस-आधारित प्रणाली के माध्यम से सुसंस्कृत कोशिकाओं में विभिन्न एसजीआरएनए का परीक्षण करने और एसजीआरएनए का चयन करने की सलाह देते हैं जो विवो प्रयोगों में उच्चतम वध दक्षता देते हैं।

  1. CRISPR-Cas9 sgRNA डिजाइन
    1. ऑनलाइन उपकरणों का उपयोग करके एसजीआरएनए डिज़ाइन करें, जैसे कि ब्रॉड एसजीआरएनए डिज़ाइन टूल (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, CRISPOR ऑनलाइन टूल (http://crispor.tefor.net/)22, और अन्य उपलब्ध टूल।
    2. जीन नाम बॉक्स में जीन नाम या डीएनए लक्ष्य अनुक्रम दर्ज करें, और संभावित एसजीआरएनए अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए एसपीसीए 9 के लिए प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) के रूप में एनजीजी का चयन करें।
    3. उच्च अनुमानित ऑन-टारगेट दक्षता और कम ऑफ-टारगेट गतिविधि वाले एसजीआरएनए का चयन करें। उदाहरण के लिए, CRISPOR आउटपुट पर कम से कम 50 के विशिष्टता स्कोर वाले एसजीआरएनए को उपयोग के लिए अनुशंसित किया जाता है। फ़िल्टर को पास करने वाले विशिष्ट एसजीआरएनए में से, उच्च दक्षता स्कोर23 वाले चुनें।
      नोट: सामान्य तौर पर, प्रभावी एसजीआरएनए की पहचान सुनिश्चित करने के लिए तीन या चार एसजीआरएनए चुने जाते हैं।
  2. CRISPR-Cas9 sgRNA प्लास्मिड का निर्माण
    1. डीएनए संश्लेषण मंच के माध्यम से बीएसएमबीआई प्रतिबंध साइट (तालिका 1) से ओवरहैंग्स (5' और 3') के साथ 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) लक्षित अनुक्रमों को एन्कोडिंग करने वाले एसजीआरएनए ऑलिगो जोड़े को संश्लेषित करें।
    2. लिगेट ने बीएसएमबीआई-रैखिक लेंटीसीआरआईएसपीआर वी 2 वेक्टर के साथ ओलिगो जोड़े को नष्ट कर दिया।
    3. लिगेशन उत्पाद को एसटीबीएल 3 ई कोलाई स्ट्रेन में बदलें, और यू 6 फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके सेंगर डीएनए अनुक्रमण द्वारा एसजीआरएनए सम्मिलन की पुष्टि करें।
      नोट: Addgene के प्रोटोकॉल में विस्तृत क्लोनिंग प्रक्रिया देखें जिसका शीर्षक है LentiCRISPRV2 और lentiGuide-Puro: लेंटिवायरल CRISPR / Cas9 और एकल गाइड आरएनए24।
  3. लेंटिवायरल कणों का उत्पादन
    1. अभिकर्मक से लगभग 24 घंटे पहले, प्लेट 7 x 105 एचईके -293 कोशिकाएं 6 सेमी ऊतक संवर्धन प्लेट में पूर्ण विकास माध्यम के 4 एमएल में होती हैं।
    2. सीरम मुक्त माध्यम के 250 μL में LT1 अभिकर्मक के 15 μL जोड़ें, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. सीरम मुक्त माध्यम के 250 μL में तालिका 2 के अनुसार प्रत्येक एसजीआरएनए के लिए एक अभिकर्मक कॉकटेल तैयार करें। चरण 1.3.2 में तैयार अभिकर्मक अभिकर्मक को प्लास्मिड कॉकटेल के साथ मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. एचईके -293 कोशिकाओं के लिए 3.5 एमएल ताजा विकास माध्यम के साथ पूर्ण विकास माध्यम को बदलें, और फिर 3.5 एमएल ताजा विकास माध्यम में संवर्धित एचईके -293 कोशिकाओं में डीएनए अभिकर्मक मिश्रण को ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    5. अभिकर्मक के 12-15 घंटे के बाद, अभिकर्मक अभिकर्मक को हटाने के लिए माध्यम बदलें, और इसे 4 एमएल ताजा विकास माध्यम के साथ बदलें।
    6. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, सेल कल्चर माध्यम को इकट्ठा करें जिसमें लेंटिवायरल कण होते हैं, और किसी भी एचईके -293 कोशिकाओं को हटाने के लिए 0.45 μm फ़िल्टर के माध्यम से माध्यम को फ़िल्टर करें। वायरस को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, वायरस को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होना चाहिए।
      नोट: लेंटिवायरल कणों को तैयार करते समय जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें, और लेंटीवायरस को संभालने के लिए उपयुक्त वातावरण (जैसे, बीएल 2 +) में काम करें। पीएलकेओ.1 - टीआरसी क्लोनिंग वेक्टर (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G) नामक एडजीन के प्रोटोकॉल में विस्तृत लेंटिवायरस तैयारी प्रक्रिया देखें।
  4. भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स का संक्रमण और एसजीआरएनए-मध्यस्थता वध का निर्धारण
    1. प्लेट 1 x 106 माउस ने 1 एमएल ताजा माध्यम में भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स को अमर कर दिया जिसमें 6-वेल प्लेट में प्रति कुएं 8 μg / mL पॉलीब्रीन होता है।
      नोट: इस अध्ययन में, एसवी 40 टी एंटीजन25 का उपयोग करके अमर भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स उत्पन्न किए गए थे। ब्राउन प्रीडिपोसाइट्स को 10% एफबीएस के साथ उच्च-ग्लूकोज डीएमईएम में सुसंस्कृत किया जाता है।
    2. कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए चरण 1.3 से लेंटिवायरल कण समाधान के 1 एमएल जोड़ें। एंटीबायोटिक चयन नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए समानांतर में कोशिकाओं के एक असंक्रमित कुएं को बनाए रखें।
    3. संक्रमण के 24 घंटे बाद ताजा माध्यम में बदलें। असंक्रमित कोशिकाओं को मारने और संक्रमित लोगों का चयन करने के लिए माध्यम में संबंधित एंटीबायोटिक्स (जैसे, 1 μg / mL की अंतिम एकाग्रता के साथ प्यूरोमाइसिन) जोड़ें। हर दूसरे दिन चयनित एंटीबायोटिक युक्त ताजा माध्यम में बदलें जब तक कि सभी असंक्रमित नियंत्रण कोशिकाएं मृत न हो जाएं।
    4. वायरस से संक्रमित कोशिकाओं से प्रोटीन एकत्र करें, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा एसजीआरएनए की वध दक्षता निर्धारित करें। इस्लामी और लुजान26 में विस्तृत पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया का पालन करें। प्रोटीन के बीच अलग-अलग टर्नओवर दर के कारण, प्रोटीन सिग्नल के नुकसान का निरीक्षण करने के लिए कई समय बिंदुओं (जैसे, वायरस संक्रमण के बाद दिन 6 से दिन 12 तक) का परीक्षण करें।
      नोट: यदि रुचि के जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन को पहचानने वाला एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो सेंगर अनुक्रमण का उपयोग वैकल्पिक रूप से प्रत्येक एसजीआरएनए की जीनोम संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, लंबाई में ~ 700 बीपी के पीसीआर एम्प्लिकॉन उत्पन्न करने के लिए एसजीआरएनए-लक्षित क्षेत्र को फ्लैंक करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए को बढ़ाएं। अनुमानित ब्रेक साइट अधिमानतः अनुक्रमण प्रारंभ स्थल से ~ 200 बीपी डाउनस्ट्रीम होनी चाहिए। फिर, पीसीआर उत्पाद को सेंगर अनुक्रमण के अधीन करें। कोशिकाओं के पूल में प्रत्येक एसजीआरएनए द्वारा उत्पन्न छोटे इंडेल की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए ऑनलाइन टूल का उपयोग करके अनुक्रमण परिणामों का विश्लेषण करें, जैसे कि डीईकंपोजेशन (टाइड) द्वाराइंडेल की ट्रैकिंग।

2. एएवी-एसजीआरएनए प्लास्मिड का निर्माण

नोट: इस चरण में, उपरोक्त स्क्रीन से पहचाने गए प्रभावी एसजीआरएनए को पीएवी-यू 6-बीबीएसआई-जीआरएनए-सीबी-ईएमजीएफपी वेक्टर28 (चित्रा 2) में क्लोन किया जाता है। इस बीच, एक गैर-लक्ष्यीकरण एसजीआरएनए (उदाहरण के लिए, TCTGATAGCGTAGGAGGAT29) जो माउस जीनोम में किसी भी अनुक्रम को नहीं पहचानता है, उसे भी गैर-संपादित नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए उसी वेक्टर में क्लोन किया जाता है।

  1. बीबीएसआई का उपयोग करके पीएएवी-यू 6-बीबीएसआई-जीआरएनए-सीबी-ईएमजीएफपी बैकबोन को रैखिक करें, जो संश्लेषित एसजीआरएनए ऑलिगोस के साथ समान ओवरहैंग उत्पन्न करता है।
  2. रैखिक पीएएवी वेक्टर के साथ एनाल्ड ऑलिगो जोड़े को सूचीबद्ध करें, और चरण 1.2 में वर्णित एसजीआरएनए सम्मिलन की पुष्टि करें।
    नोट: लेंटीसीआरआईएसपीआरवी 2-एसजीआरएनए के लिए क्लोनिंग प्रक्रिया एएवी-एसजीआरएनए प्लास्मिड निर्माण के लिए भी लागू होती है।

3. एएवी पैकेजिंग

  1. अनुभाग 2 में उत्पन्न एएवी वैक्टर को एएवी सीरोटाइप 8 में पैकेज करें। पिछले प्रोटोकॉल30 के अनुसार उच्च-टिटर एएवी तैयार करें, या वायरल कोर या वाणिज्यिक सेवाओं से एएवी पैकेजिंग सेवा का अनुरोध करें। वायरस टिटर को 1 x 1013 जीनोम प्रतियों / एमएल तक पतला करें।
    नोट: एसजीआरएनए को व्यक्त करने वाले संशोधित एएवी 2 जीनोम को एएवी सीरोटाइप 8 में पैक किया जाता है। इस सीरोटाइप को वसा ऊतक18,31 के लिए इसकी उच्च दक्षता के कारण चुना गया था। दूषित पदार्थों द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, जैसे सेल मलबे और मध्यम घटकों की थोड़ी मात्रा, विवो इंजेक्शन में अल्ट्रा-शुद्ध एएवी की आवश्यकता होती है। अल्ट्रा-शुद्धिकरण आयोडिक्सानोल ग्रेडिएंट और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन30 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

4. यूसीपी 1 सीआरई / सीएएस 9 चूहों की तैयारी

  1. Ucp1-Cre माउस स्ट्रेन खरीदें ( सामग्री की तालिका देखें) जो Ucp1 प्रमोटर के नियंत्रण में Cre recombinase को व्यक्त करता है। होमोजीगोस रोसा 26-फ्लोक्स्ड स्टॉप-कैस 9 नॉक-इन चूहों32 ( सामग्री की तालिका देखें) खरीदें, जिसमें कैस 9 की अभिव्यक्ति को क्रे रिकोम्बिनेस-निर्भर तरीके से विनियमित किया जाता है।
  2. कैस 9 चूहों को उत्पन्न करने के लिए इन उपभेदों को पार करें, जैसा कि पहलेवर्णित 16,17 था। सभी चूहों को चाउ आहार और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र (सुबह 6:30 बजे रोशनी चालू; शाम 6:30 बजे रोशनी बंद) पर तापमान और आर्द्रता-नियंत्रित कमरे (23 डिग्री सेल्सियस, 30% आर्द्रता) में रखें।
  3. कैस 9 चूहों को एएवी के साथ इलाज करें, जो नीचे वर्णित विधि के माध्यम से रुचि के जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए या एसजीआरएनए को नियंत्रित करते हैं। इस अध्ययन में, लगभग 30 ग्राम वजन वाले 12-15 सप्ताह के पुरुष यूसीपी 1-क्रे / कैस 9 चूहों का उपयोग किया गया था।

5. चूहों में बैट में एएवी इंजेक्शन के लिए सर्जरी

  1. प्रेरण और रखरखाव के लिए 2.5% आइसोफ्लुरेन के निरंतर साँस के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  2. सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों को चिकनाई दें। फिर, पोस्टऑपरेटिव दर्द और संकट को कम करने और रोकने के लिए चूहों को एनाल्जेसिक (बैनामाइन, 2.5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन [बीडब्ल्यू], चमड़े के नीचे इंजेक्शन, सामग्री की तालिका देखें) दें।
  3. एक शेवर का उपयोग करके इंटरस्केपुलर क्षेत्र पर माउस फर को शेव करें और आयोडीन-आधारित या क्लोरहेक्सिडाइन-आधारित स्क्रब के कम से कम तीन वैकल्पिक राउंड के साथ सर्जिकल क्षेत्र को निष्फल करें, जिसके बाद 70% इथेनॉल होता है। फिर, चीरा साइट के चारों ओर बाँझ सर्जिकल ड्रेप लागू करें।
  4. स्केलपेल (चित्रा 3 ए-बी) का उपयोग करके स्कैपुला के बीच की त्वचा को इंजेक्ट करें, और फिर सर्जिकल कैंची (चित्रा 3 सी-डी) का उपयोग करके गर्दन पर वसा ऊतकों को उजागर करने के लिए कटी हुई त्वचा को छील दें। चीरा का आकार शरीर के आकार पर निर्भर है, लेकिन आम तौर पर, इंटरस्केपुलर क्षेत्र पर वसा ऊतकों को उजागर करने के लिए चीरा लगभग 2 सेमी होना चाहिए।
  5. एक चीरा का उपयोग करके वसा ऊतकों और मांसपेशियों के बाहर के क्षेत्र के बीच सीमा पर वसा ऊतकों को काटें (चित्रा 3ई-एफ)। चीरा का आकार लगभग 1 सेमी होना चाहिए ताकि वसा ऊतकों के कुंद छीलने के लिए सर्जिकल कैंची के सम्मिलन के लिए प्रवेश द्वार खोला जा सके।
  6. प्रमुख हाथ का उपयोग करके, वसा ऊतकों को सर्जिकल कैंची के साथ कुंद और लंबवत रूप से छीलें ताकि बैट को उजागर किया जा सके, जबकि गैर-प्रमुख हाथ से बीएटी सहित वसा ऊतकों को चुटकी ली जा सके (चित्रा 3जी)। सटीक बैट स्थान को इंगित करने के लिए एक लैंडमार्क के रूप में सल्तज़र की नस का उपयोग करें।
    नोट: चित्र 3 एच में बीएटी को चित्र प्रदर्शन के उद्देश्य से पूरी तरह से उजागर किया गया था। अतिरिक्त विच्छेदन से आसपास के बीएटी की नसों को नुकसान हो सकता है। कैंची की गलत दिशा आसपास की मांसपेशियों और बैट को खत्म करने वाली सल्त्ज़र की नस को चोट पहुंचा सकती है और इससे अतिरिक्त रक्तस्राव हो सकता है।
  7. प्रत्येक माउस के लिए, हैमिल्टन सिरिंज (100 μL, सामग्री की तालिका) से जुड़ी एक तेज सुई (32 G, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके धीरे-धीरे दोनों BAT लोब (BAT के 20 μL) में 40 μL AAV इंजेक्ट करें। चित्र 3I)। एएवी प्रशासन के दौरान इंजेक्शन साइट से कोई रिसाव नहीं होने से संकेत के रूप में सफल इंजेक्शन की जांच करें।
    नोट: चित्र 3 I में BAT को चित्र प्रदर्शन के उद्देश्य से पूरी तरह से उजागर किया गया था। बैट लोब में प्रशासित किए जाने वाले एएवी समाधान की मात्रा प्राप्तकर्ता माउस के बीएटी के आकार से निर्धारित होती है। हमने निर्धारित किया है कि 30 ग्राम वजन वाले नियमित C57BL6/J माउस में लगभग 0.05 ग्राम वजन वाले एक BAT लोब के लिए 20 μL AAV समाधान उपयुक्त है। यदि आवश्यक हो, तो वांछित मात्रा प्राप्त करने के लिए वायरल समाधान को केंद्रित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  8. इंजेक्शन बैट या आसपास के ऊतकों से कोई रक्तस्राव नहीं होने की पुष्टि करें। हेमोस्टेसिस के लिए रक्तस्राव स्थल पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ भिगोए गए धुंध दबाएं।
  9. उजागर वसा ऊतकों को उनकी सामान्य स्थिति में वापस रखें। 5-0 अवशोषित मोनोफिलामेंट थ्रेड (चित्रा 3 जे) का उपयोग करके वसा ऊतकों और मांसपेशियों के किनारे को सिलाई करें। खुली त्वचा को 5-0 लेपित विक्रिल अनडेड ब्रेड वाले धागे के साथ सीवन करें (चित्रा 3के-एल)।
    नोट: चित्रा 4 छिले हुए वसा ऊतकों और मांसपेशियों को सिलाई के चरणों का वर्णन करता है।
  10. सर्जरी के बाद जानवरों को पूरी तरह से ठीक होने तक हीटिंग पैड पर बनाए रखें। जानवरों को भोजन, पानी और घोंसले के शिकार के लिए पर्याप्त बिस्तर तक पहुंच प्रदान करें। प्रयोग की शुरुआत से पहले वसूली के 7 दिनों के लिए संकट या बीमारी के किसी भी संकेत के लिए नियमित रूप से उनकी निगरानी करें।
  11. चूहों से विच्छेदित बीएटी में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा लक्षित जीन विलोपन की दक्षता की पुष्टि करें, जैसा कि सुगिमोतो एट अल.16 में है।

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Representative Results

उपरोक्त प्रक्रियाओं के दौरान, बीएटी को एएवी-एसजीआरएनए की सटीक डिलीवरी प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। एएवी-एसजीआरएनए के प्रभाव को अधिकतम करने और सर्जरी के दौरान ऊतक क्षति को कम करने के लिए, बीएटी के त्रि-आयामी (3 डी) शारीरिक स्थान को समझना आवश्यक है। जैसा कि चित्रा 3 ई में दिखाया गया है, ऊतक को उजागर किए बिना बीएटी के सटीक स्थान की पहचान करना मुश्किल है। हालांकि, अतिरिक्त बीएटी एक्सपोजर ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है (चित्रा 3एच, आई); इस प्रकार, प्रक्रिया को एक सीमित शारीरिक स्थान (चित्रा 3 जी) के भीतर एएवी समाधान को इंजेक्ट करने के लिए किया जाना चाहिए। चित्रा 5 ए एएवी इंजेक्शन की सफलता और सर्जरी के बाद चूहों की तेजी से वसूली सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 5 बी-डी संभावित खामियों को इंगित करता है जो असफल इंजेक्शन का कारण बन सकता है। इनमें एएवी समाधान को गलत क्षेत्र (चित्रा 5 बी) में इंजेक्ट करना, ऊतक के माध्यम से सुई प्रवेश (चित्रा 5 सी), और एएवी समाधान (चित्रा 5 डी) की अत्यधिक मात्रा के कारण ऊतक गुब्बारा शामिल है। अंत में, रुचि के जीन की वध दक्षता कोइंजेक्शन वाले चूहों से विच्छेदित बीएटी में प्रोटीन के स्तर द्वारा सत्यापित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा मापा गया बीएटी में 12-एलओएक्स का प्रोटीन स्तर एएवी 8 द्वारा यूसीपी 1-सीआरई / सीएएस 9 चूहों के बीएटी में एलोक्स 12 (जीन जो 12-एलओएक्स को एन्कोड करता है) को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के कारण कुशल वध का प्रदर्शन करता है (पहले प्रकाशित अध्ययन16 में चित्रा 7 बी देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: कैस 9 और एसजीआरएनए को व्यक्त करने वाले लेंटिवायरल प्लास्मिड के लिए योजनाबद्ध। Cas9 और sgRNA (lentiCRISPRV2) के लिए लेंटिवायरल अभिव्यक्ति वेक्टर। संक्षिप्तरूप: प्यूरो = प्यूरोमाइसिन चयन मार्कर; पीएसआई + = पीएसआई पैकेजिंग सिग्नल; आरआरई = रेव प्रतिक्रिया तत्व; सीपीटी = केंद्रीय पॉलीप्यूरीन पथ; ईएफएस = बढ़ाव कारक -1 : लघु प्रमोटर; पी 2 ए = 2 ए स्व-क्लीवर पेप्टाइड; WPRE = पोस्टट्रांसक्रिप्शनल नियामक तत्व; एलटीआर = लंबा टर्मिनल दोहराव। लेंटीसीआरआईपीएसआरवी 2 को बीएसएमबीआई का उपयोग करके पचाया जा सकता है, और एनाल्ड एसजीआरएनए ओलिगोस की एक जोड़ी को एकल-गाइड आरएनए पाड़ में क्लोन किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसजीआरएनए को व्यक्त करने वाले एएवी प्लास्मिड के लिए योजनाबद्ध। एसजीआरएनए के लिए एएवी वेक्टर। संक्षिप्तीकरण: आईटीआर = आई टर्मिनल रिपीट; सीबी = हाइब्रिड सीएमवी एन्हांसर/ β-एक्टिन प्रमोटर। पीएएवी-यू 6-बीबीएसआई-जीआरएनए-सीबी-ईएमजीएफपी को बीबीएसआई का उपयोग करके पचाया जा सकता है, और एनाल्ड एसजीआरएनए ओलिगोस की एक जोड़ी को एकल-गाइड आरएनए पाड़ में क्लोन किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: चूहों में द्विपक्षीय बीएटी लोब में एएवी इंजेक्शन के लिए अनुक्रमिक सर्जरी। एक एनेस्थेटाइज्ड माउस निम्नलिखित प्रक्रियाओं से गुजरा है: (ए-बी) मुंडा त्वचा को काटना, (सी-डी) शेव की गई त्वचा को कुंद रूप से छीलना, (ई-एफ) वसा ऊतकों को काटना, (जी) वसा ऊतकों को स्पष्ट रूप से छीलना, (एच-आई) हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके बीएटी लोब में एएवी समाधान इंजेक्ट करना, (जे) वसा ऊतकों और मांसपेशियों के बीच झुकना और (के-एल) दोनों त्वचा फ्लैप के बीच। नोट: पैनल (एच) और (आई) में, बैट के सटीक स्थान की पुष्टि करने के लिए सल्त्ज़र की नस एक मील का पत्थर है। उन दो पैनलों में बीएटी को पूरी तरह से चित्र प्रदर्शन के लिए उजागर किया गया था। पीली बिंदीदार रेखाएं पैनल ई में वसा ऊतकों और मांसपेशियों के बीच की सीमा को इंगित करती हैं, और पैनल I में सुई (यानी, इंजेक्शन साइट) की नोक। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: छिले हुए वसा ऊतकों और मांसपेशियों को सिलाई करने के लिए कदम। (A) इंजेक्शन के लिए छीले हुए वसा ऊतकों में एक सुई धागा डालें, (B) वसा ऊतकों में प्रवेश करें, (C) एक मांसपेशी को हुक करें, (D) छीले हुए वसा ऊतकों और मांसपेशियों को सिलाई करने के लिए एक धागा खींचें, और फिर धागे को लपेटें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. चूहों में बैट लोब में एएवी इंजेक्शन के उचित और अनुचित साधनों के प्रतिनिधि चित्र। (ए) यह आंकड़ा सुझाए गए एएवी इंजेक्शन का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें एक एकतरफा बीएटी लोब को एएवी समाधान के 20 μL का इंजेक्शन प्राप्त होता है। (बी-डी) एएवी इंजेक्शन के निम्नलिखित तरीके विफलता का कारण बन सकते हैं। (बी) गलत इंजेक्शन साइट (यानी, बीएटी लोब गायब); (सी) सुई ऊतकों के माध्यम से प्रवेश करती है; और (डी) एएवी समाधान की एक बड़ी मात्रा के कारण ऊतक गुब्बारा, जिसमें एक एकतरफा बीएटी लोब को एएवी समाधान का 80 μL इंजेक्शन प्राप्त होता है। पीले बिंदीदार घेरे सुई की नोक (यानी, इंजेक्शन साइट) को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फॉरवर्ड ऑलिगो: 5 'सीएसीसी -20 बीपी जीआरएनए अनुक्रम -3'
रिवर्स ऑलिगो: 5 'एएएसी -20 बीपी जीआरएनए रिवर्स-पूरक अनुक्रम -3'
उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य अनुक्रम TCTGATAGCGTAGGAGGAT है, तो ऑलिगोस होगा:
फॉरवर्ड ऑलिगो: 5 'सीएसीसी टीसीटीजीएजीटीएजीएटी 3'
रिवर्स ऑलिगो: 5 'AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3'

तालिका 1: एसजीआरएनए डिजाइन का उदाहरण। BSMBI प्रतिबंध साइट के अनुरूप ओवरहैंग के साथ एक sgRNA अनुक्रम का उदाहरण।

सामग्री का नाम कंपनी कैटलॉग नंबर राशि
लेंटीक्रीस्पर वी 2 प्लास्मिड Addgene #52961 5 μg
पीएसपीएएक्स 2 पैकेजिंग प्लास्मिड Addgene #12260 3.75 μg
pMD2.G लिफाफा प्लास्मिड Addgene #12259 1.5 μg
ओपीटीआई-एमईएम सीरम-मुक्त माध्यम इनविट्रोजेन #31985 250 μl

तालिका 2: लेंटीसीआरआईएसपीआर। सीआरआईएसपीआर-एसजीआरएनए लेंटीवायरस का उत्पादन करने के लिए एचईके -293 कोशिकाओं में लेंटिकआरआईएसपीआरवी 2 प्लास्मिड युक्त एसजीआरएनए के अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड कॉकटेल।

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Discussion

इंटरस्केपुलर बीएटी में एएवी-मध्यस्थता जीन वितरण के लिए मौजूदा प्रकाशित तरीकों में सर्जिकल तकनीकों और बीएटी में प्रत्यक्ष एएवी इंजेक्शन के दृष्टिकोण का वर्णन करने वाले विस्तृत चित्र और वीडियो शामिल नहीं हैं। अधिकांश प्रकाशित विधियों33,34 में, एएवी को बीएटी के बजाय इंटरस्केपुलर बीएटी के आसपास के वसा ऊतकों में इंजेक्ट किया जाता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो अध्ययन की सफलता को निर्धारित करते हैं। इनमें एसजीआरएनए का डिजाइन, एएवी पैकेजिंग और एकाग्रता, बीएटी-विशिष्ट सीएएस 9 चूहों की पीढ़ी और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं। विवो प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए सावधानीपूर्वक और उत्कृष्ट शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, बीएटी को उजागर करते समय ऊतक क्षति को कम करना और एएवी का प्रशासन करना महत्वपूर्ण है। कई आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के कारण, जैसे आवास तापमान, व्यायाम प्रशिक्षण और आहार, बीएटी के आसपास सफेद वसा की मात्रा और बीएटी की संरचना जानवरों के बीच भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, मोटापे से ग्रस्त चूहे बीएटी के आसपास विशाल सफेद वसा ऊतकों को प्रदर्शित करते हैं, और थर्मोन्यूट्रैलिटी (30 डिग्री सेल्सियस) पर रखे गए चूहे सफेद बीएटी का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, त्वचा को खोले बिना बैट के 3 डी स्थान को ठीक से निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण है। बैट को न्यूनतम रूप से प्रकट करना एएवी इंजेक्शन के लिए एक चुनौतीपूर्ण लेकिन महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रक्रिया के दौरान बीएटी के अत्यधिक संपर्क में सहानुभूति तंत्रिकाओं और वाहिकाओं को गंभीर नुकसान हो सकता है, विशेष रूप से बीएटी से जुड़ी सल्त्ज़र की नस।

ध्यान दें, ऊतक में इंजेक्ट किए गए एएवी की मात्रा भी सफलता के लिए एक सीमित कारक है। समाधान की अत्यधिक मात्रा कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकती है और एडिपोसाइट्स में एसजीआरएनए देने के लिए एक कुशल वायरल संक्रमण में हस्तक्षेप कर सकती है। चूंकि बीएटी का आकार प्राप्तकर्ता चूहों की उम्र, लिंग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ भिन्न होता है, अनुकूलन प्रयोगों को16,17 की आवश्यकता हो सकती है। रुचि के जीन को गिराने के अलावा, इस तकनीक को रुचि के जीन को अतिरंजित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

इस तकनीक का एक संभावित दोष विवो में एक एसजीआरएनए का उपयोग करके जीन नॉकआउट की कम दक्षता है, यहां तक कि एसजीआरएनए के साथ भी जो विट्रो में कुशल नॉकआउट प्रदान करते हैं। एक संभावित समाधान के रूप में, एक एकल इंजेक्शन में दो या दो से अधिक अद्वितीय एसजीआरएनए के संयोजन से विवो में जीन वध की दक्षता में सुधार हो सकता है।

निष्कर्ष में, संयुक्त Ucp1-Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, और AAV-sgRNA प्रौद्योगिकियां BAT-विशिष्ट जीन हेरफेर के साथ चूहों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और कुशल प्रणाली प्रदान करती हैं। इस विधि को चयनित सीआरई लाइनों और विभिन्न ऊतकों में संशोधित एएवी इंजेक्शन का उपयोग करके अन्य ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) अनुदान आर01डीके122808, आर01डीके102898, और आर01डीके132469 (वाई-एचटी को), साथ ही पी 30डीके036836 (जोसलिन डायबिटीज सेंटर के डायबिटीज रिसर्च सेंटर को) द्वारा समर्थित किया गया था। टी टी को सनस्टार रिसर्च फैलोशिप (हीरू कनेडा छात्रवृत्ति, सनस्टार फाउंडेशन, जापान) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 903968 द्वारा समर्थित किया गया था। वाई जेड चार्ल्स ए किंग ट्रस्ट फैलोशिप द्वारा समर्थित था। हम पांडुलिपि को प्रमाणित करने के लिए शॉन डी कोडानी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium Invitrogen 31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent Sigma TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent Mirus MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector  Addgene 52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP Addgene 89060
pMD2.G envelope plasmid Addgene 12259
psPAX2 packaging plasmid Addgene 12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
WT-1 cells Developed in Tseng lab PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice Jackson Laboratories 24857
Ucp1-CRE mice Jackson Laboratories 24670
Others
Banamine Patterson 07-859-1323
Hamilton syringe Hamilton Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution Fisher Scientific H325-500
Needle Hamilton 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx Henry Schein 1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx Henry Schein 1294522

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References

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Tsuji, T., Zhang, Y., Tseng, Y. H.… More

Tsuji, T., Zhang, Y., Tseng, Y. H. Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System. J. Vis. Exp. (193), e65083, doi:10.3791/65083 (2023).

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