Summary
In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA's, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT) is een vetdepot gespecialiseerd in energiedissipatie dat ook kan dienen als endocriene orgaan via de afscheiding van bioactieve moleculen. Het creëren van BAT-specifieke knock-outmuizen is een van de meest populaire benaderingen voor het begrijpen van de bijdrage van een gen van belang aan BAT-gemedieerde energieregulatie. De conventionele gen-targetingstrategie met behulp van het Cre-LoxP-systeem is de belangrijkste aanpak geweest om weefselspecifieke knock-outmuizen te genereren. Deze aanpak is echter tijdrovend en vervelend. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle en efficiënte knock-out van een gen van belang in BAT met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De interscapulaire BBT bevindt zich in de diepe laag tussen de spieren. De BBT moet dus worden blootgesteld om de AAV nauwkeurig en rechtstreeks in de BBT binnen het gezichtsveld te injecteren. Een goede chirurgische behandeling is cruciaal om schade aan de sympathische zenuwen en bloedvaten te voorkomen, zoals de ader van de Sultzer die verbinding maakt met de BAT. Om weefselschade te minimaliseren, is er een kritieke behoefte om de driedimensionale anatomische locatie van de BAT en de chirurgische vaardigheden die vereist zijn in de technische stappen te begrijpen. Dit protocol belicht de belangrijkste technische procedures, waaronder het ontwerp van sgRNA's gericht op het gen van belang, de voorbereiding van AAV-sgRNA-deeltjes en de operatie voor de directe micro-injectie van AAV in beide BAT-lobben voor het genereren van BAT-specifieke knock-outmuizen, die breed kunnen worden toegepast om de biologische functies van genen in BBT te bestuderen.
Introduction
Obesitas neemt wereldwijd in een aanzienlijk tempo toe, wat leidt tot een breed spectrum van metabole ziekten 1,2,3. Het vetweefsel is de sleutel tot deze pathologieën. De twee functioneel verschillende soorten vetweefsel die er zijn, zijn wit vetweefsel (WAT), dat overtollige calorieën opslaat, en bruin vetweefsel (BAT) en het bijbehorende beige / brite-vet, dat energie afvoert voor thermogenese. Hoewel BAT is erkend voor zijn energiedissiperende functie, heeft het ook endocriene functies via de productie van bioactieve moleculen die het metabolisme in distale organen reguleren 4,5. Talrijke studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat het verhogen van de hoeveelheid of activiteit van bruin of beige vet leidt tot een verhoogd energieverbruik en een verbeterde insulinegevoeligheid. Bij mensen hebben mensen met detecteerbare BBT een significant lagere prevalentie van cardiometabole ziekten6. BAT heeft dus een uitstekend therapeutisch potentieel voor obesitas-gerelateerde metabole sequelae 7,8,9.
Om de fysiologie en pathofysiologie van BBT-ontwikkeling en -functie te onderzoeken en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij deze processen op te helderen, is het BBT-specifieke transgene muismodel een methode bij uitstek10. Het Cre-LoxP-recombinatiesysteem is het meest gebruikte middel om voorwaardelijke knock-outmuizen te produceren door het muizengenoom te bewerken. Dit systeem heeft de modificatie (overexpressie of knock-out) van genen van belang op een weefsel/ cel-specifieke manier mogelijkgemaakt 11. Het kan ook worden gebruikt om een specifiek celtype te labelen door een selectief fluorescerend reportergen tot expressie te brengen.
Onlangs is de Cre-LoxP-systeembenadering verder ontwikkeld door de CRISPR-Cas9-technologie te combineren met het adeno-geassocieerde virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) -systeem12. Het CRISPR-Cas9-systeem is een specifiek en efficiënt genbewerkingsinstrument om precieze regio's van het genoom13 te wijzigen, te reguleren of te targeten. CRISPR-Cas9-gebaseerde genoombewerking maakt snelle genetische manipulatie van genomische loci mogelijk omdat het geen homologe recombinatie met een gen-targeting vector vereist. Gecombineerde Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-technieken stellen onderzoekers in staat om genfuncties nauwkeuriger te begrijpen door onderzoek naar de rol van interessante genen op gewenste tijdstippen in weefsels / cellen mogelijk te maken. Bovendien verminderen deze gecombineerde technieken de tijd en moeite die nodig is om transgene muizen te genereren en maken ze de temporele controle van CRISPR-Cas9-activiteit mogelijk voor induceerbare genoombewerking bij muizen als een induceerbare Cre-lijn wordt gebruikt14.
AAV-vectoren zijn veilige en effectieve in vivo genafgiftesystemen. AAV's gericht op vetweefsel zijn echter achtergebleven bij toepassingen in andere weefsels, zoals de hersenen, het hart, de lever en de spieren15. Vanwege de relatief lage transductie-efficiëntie en het tropisme met natuurlijk voorkomende serotypevectoren, is AAV-geleide genafgifte aan vetweefsel nog steeds een uitdaging15. In de afgelopen 5 jaar hebben wij en anderen met succes effectieve en minimaal invasieve manieren ontwikkeld om AAV-geleide genen in vetweefsel af te leveren en muismodellen gemaakt waarmee we inzicht kunnen krijgen in de genen die betrokken zijn bij de regulatie van BAT-functie16,17,18,19. Door bijvoorbeeld AAV8 te gebruiken om sgRNA gericht op Alox12, dat codeert voor 12-lipoxygenase (12-LOX), af te leveren in de BAT van de Ucp1-Cre / Cas9-muizen, hebben we ontdekt dat geactiveerde BAT 12-LOX-metabolieten produceert, namelijk 12-hydroxy-eicosapentaeenzuur (12-HEPE) en 13R, 14S-dihydroxydocosahexaeenzuur (maresine 2), om het glucosemetabolisme te reguleren en obesitas-geassocieerde ontstekingen op te lossen, respectievelijk16, 17. Hier bieden we een stapsgewijs protocol over de technische procedures, met name de operatie voor de directe micro-injectie van AAV-sgRNA in de BAT-lobben, om BAT-specifieke knock-outmuizen te genereren met behulp van het gecombineerde Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven en zorgprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Joslin Diabetes Center.
1. Screening van effectieve sgRNA's in gekweekte cellen
OPMERKING: Om de test kosteneffectief te maken, raden we aan om, voordat de sgRNA's in AAV-deeltjes worden verpakt, verschillende sgRNA's in gekweekte cellen te testen via een lentivirus-gebaseerd systeem voor Cas9 / sgRNA-expressie (figuur 1) en de sgRNA's te selecteren die de hoogste knockdown-efficiëntie geven voor in vivo experimenten.
- CRISPR-Cas9 sgRNA ontwerp
- Ontwerp sgRNA's met behulp van online tools, zoals de Broad sgRNA design tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, de CRISPOR online tool (http://crispor.tefor.net/)22 en andere beschikbare tools.
- Voer gennamen of DNA-doelsequenties in het vak met de gennaam in en selecteer NGG als het protospacer aangrenzende motief (PAM) voor SpCas9 om potentiële sgRNA-sequenties te genereren.
- Selecteer de sgRNA's met een hoge voorspelde on-target efficiëntie en lage off-target activiteit. Zo worden sgRNA's met een specificiteitsscore van ten minste 50 op de CRISPOR-uitgang aanbevolen voor gebruik. Onder de specifieke sgRNA's die het filter passeren, kiest u degenen met hoge efficiëntiescores23.
OPMERKING: Over het algemeen worden drie of vier sgRNA's gekozen om de identificatie van effectieve sgRNA's te garanderen.
- Bouw van het CRISPR-Cas9 sgRNA plasmide
- Synthetiseer sgRNA oligoparen die coderen voor 20 nucleotide (nt) gerichte sequenties met overhangen (zowel 5' als 3') van de BsmBI-restrictieplaats (tabel 1) via een DNA-syntheseplatform.
- Ligate gegloeide oligoparen met BsmBI-gelineariseerde lentiCRISPR v2 vector.
- Transformeer het ligatieproduct in de Stbl3 E. coli-stam en bevestig de sgRNA-inserties door Sanger DNA-sequencing met behulp van U6 forward primer.
OPMERKING: Zie de gedetailleerde kloonprocedure in het protocol van Addgene getiteld LentiCRISPRv2 en lentiGuide-Puro: lentivirale CRISPR/Cas9 en single guide RNA24.
- Lentivirale deeltjes produceren
- Ongeveer 24 uur voor transfectie, plaat 7 x 105 HEK-293 cellen in 4 ml volledig groeimedium in een weefselkweekplaat van 6 cm.
- Voeg 15 μL LT1-transfectiereagens toe aan 250 μL serumvrij medium en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid een transfectiecocktail voor elk sgRNA volgens tabel 2 in 250 μL serumvrij medium. Meng het transfectiereagens bereid in stap 1.3.2 met de plasmidecocktail en incubeer gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang het volledige groeimedium door 3,5 ml vers groeimedium voor HEK-293-cellen en voeg vervolgens het DNA-transfectiereagensmengsel druppelsgewijs toe aan de HEK-293-cellen die zijn gekweekt in het 3,5 ml verse groeimedium.
- Verander na 12-15 uur transfectie het medium om het transfectiereagens te verwijderen en vervang het door 4 ml vers groeimedium.
- Verzamel na 24 uur incubatie het celkweekmedium dat lentivirale deeltjes bevat en filter het medium door een filter van 0,45 μm om hek-293-cellen te verwijderen. De virussen kunnen enkele dagen bij 4 °C worden bewaard. Voor langdurige opslag moeten de virussen worden ingevroren bij −80 °C.
OPMERKING: Volg de bioveiligheidsrichtlijnen bij het bereiden van lentivirale deeltjes en werk in een omgeving (bijv. BL2+) die geschikt is voor het hanteren van lentivirus. Zie de gedetailleerde lentivirusvoorbereidingsprocedure in het protocol van Addgene met de titel pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
- Infectie van bruine preadipocyten en bepaling van sgRNA-gemedieerde knockdown
- Plaat 1 x 10 6 muis vereeuwigde bruine preadipocyten in 1 ml vers medium met 8 μg/ml polybreen per putje in een6-well plaat.
OPMERKING: In deze studie werden de vereeuwigde bruine preadipocyten gegenereerd met behulp van SV40 T-antigeen25. Bruine preadipocyten worden gekweekt in dmem met een hoog glucosegehalte met 10% FBS. - Voeg 1 ml lentivirale deeltjesoplossing uit stap 1.3 toe om de cellen te infecteren. Houd één niet-geïnfecteerde put van cellen parallel in stand om te dienen als de antibioticaselectiecontrole.
- Overschakelen naar vers medium 24 uur na infectie. Voeg de bijbehorende antibiotica (bijv. puromycine met een eindconcentratie van 1 μg / ml) toe aan het medium om de niet-geïnfecteerde cellen te doden en de geïnfecteerde cellen te selecteren. Verander om de dag naar vers medium met het geselecteerde antibioticum totdat alle niet-geïnfecteerde controlecellen dood zijn.
- Verzamel eiwitten uit de met het virus geïnfecteerde cellen en bepaal de knockdown-efficiëntie van de sgRNA's door western blot-analyse. Volg de gedetailleerde western blotting procedure in Eslami en Lujan26. Vanwege de variërende omloopsnelheid tussen eiwitten, test meerdere tijdstippen (bijvoorbeeld van dag 6 tot dag 12 na virusinfectie) om het verlies van eiwitsignaal te observeren.
OPMERKING: Als een antilichaam dat het eiwit herkent dat gecodeerd is door het gen van belang niet beschikbaar is, kan Sanger-sequencing als alternatief worden gebruikt om de genoombewerkingsefficiëntie van elk sgRNA te bepalen. Kortom, amplificeer het genomische DNA met behulp van primers die het sgRNA-gerichte gebied flankeren om PCR-amplicons van ~ 700 bp lang te genereren. De geprojecteerde pauzeplaats moet bij voorkeur ~ 200 bp stroomafwaarts van de startlocatie van de sequencing zijn. Onderwerp het PCR-product vervolgens aan Sanger-sequencing. Analyseer de sequencingresultaten met behulp van de online tools, zoals Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), om de frequentie te bepalen van kleine indels gegenereerd door elk sgRNA in een pool van cellen27.
- Plaat 1 x 10 6 muis vereeuwigde bruine preadipocyten in 1 ml vers medium met 8 μg/ml polybreen per putje in een6-well plaat.
2. Constructie van het AAV-sgRNA plasmide
OPMERKING: In deze stap worden de effectieve sgRNA's die uit het bovenstaande scherm zijn geïdentificeerd, gekloond in de pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-vector28 (figuur 2). In de tussentijd wordt een niet-gericht sgRNA (bijv. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) dat geen enkele sequentie in het muizengenoom herkent, ook gekloond in dezelfde vector om te dienen als een niet-bewerkte controle.
- Lineariseer pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-backbone met behulp van BbsI, die identieke overhangen genereert met gesynthetiseerde sgRNA-oligo's.
- Ligate de gegloeide oligoparen met gelineariseerde pAAV-vector en bevestig de sgRNA-inserties zoals beschreven in stap 1.2.
OPMERKING: De kloonprocedure voor lentiCRISPRv2-sgRNA wordt ook toegepast voor de AAV-sgRNA-plasmideconstructie.
3. AAV-verpakking
- Verpak de in sectie 2 gegenereerde AAV-vectoren in AAV-serotype 8. Bereid high-titer AAV voor volgens een eerder protocol30, of vraag een AAV-verpakkingsservice aan bij virale kernen of commerciële diensten. Verdun de virustiter tot 1 x 1013 genoomkopieën/ml.
OPMERKING: Het gemodificeerde AAV2-genoom dat een sgRNA tot expressie brengt, is verpakt in AAV-serotype 8. Dit serotype werd gekozen vanwege het hoge rendement voor vetweefsel18,31. Om immuunrespons veroorzaakt door verontreinigingen, zoals celresten en kleine hoeveelheden middelgrote componenten, te voorkomen, is ultragezuiverde AAV vereist voor in vivo injectie. Ultrazuivering kan worden bereikt door jodixanol gradiënten en ultracentrifugatie30.
4. Bereiding van Ucp1 Cre/Cas9 muizen
- Koop de Ucp1-Cre muizenstam (zie Materiaaltabel) die Cre recombinase tot expressie brengt onder controle van de Ucp1-promotor. Koop homozygote Rosa26-floxed STOP-Cas9 knock-in muizen32 (zie Tabel van Materialen), waarbij de expressie van Cas9 wordt gereguleerd op een Cre recombinase-afhankelijke manier.
- Kruis deze stammen om Ucp1-Cre/Cas9-muizen te genereren, zoals eerder beschreven16,17. Houd alle muizen in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde ruimte (23 °C, 30% luchtvochtigheid) gedurende een licht-donkercyclus van 12 uur (lichten aan om 6:30 uur; lichten uit om 18:30 uur) met gratis toegang tot chow-dieet en water.
- Behandel de resulterende Ucp1-Cre/Cas9-muizen met AAV's die ofwel controle-sgRNA ofwel sgRNA dragen, gericht op het gen van belang via de hieronder beschreven methode. In deze studie werden 12-15 weken oude mannelijke Ucp1-Cre/Cas9 muizen met een gewicht van ongeveer 30 g gebruikt.
5. Operatie voor AAV-injectie in de BAT bij muizen
- Verdoof de muizen met continue inhalatie van 2,5% isofluraan voor inductie en onderhoud.
- Smeer beide ogen om uitdroging te voorkomen. Geef vervolgens pijnstillers (banamine, 2,5 mg/kg lichaamsgewicht [BW], subcutane injectie, zie tabel met materialen) aan de muizen om postoperatieve pijn en angst te minimaliseren en te voorkomen.
- Scheer de muizenvacht op het interscapulaire gebied met behulp van een scheerapparaat en steriliseer het operatiegebied met ten minste drie afwisselende rondes van een scrub op basis van jodium of chloorhexidine, gevolgd door 70% ethanol. Breng vervolgens steriele chirurgische gordijnen aan rond de incisieplaats.
- Snijd de huid tussen de schouderbladen in met een scalpel (figuur 3A-B) en pel vervolgens de geschoren huid af om de vetweefsels in de nek bloot te leggen met een chirurgische schaar (figuur 3C-D). De grootte van de incisie is afhankelijk van de lichaamsgrootte, maar over het algemeen moet de incisie ongeveer 2 cm zijn om de vetweefsels op het interscapulaire gebied bloot te leggen.
- Snijd de vetweefsels op de grens tussen het distale gebied van de vetweefsels en spieren met behulp van een enkele incisie (figuur 3E-F). De grootte van de incisie moet ongeveer 1 cm zijn om gewoon de ingang te openen voor het inbrengen van de chirurgische schaar voor stompe peeling van de vetweefsels.
- Schil met de dominante hand de vetweefsels bot en verticaal af met een chirurgische schaar om de BAT bloot te leggen terwijl u de vetweefsels, inclusief de BAT, knijpt met de niet-dominante hand (figuur 3G). Gebruik de ader van de Sultzer als oriëntatiepunt om de exacte BAT-locatie aan te geven.
OPMERKING: De BBT in figuur 3H werd volledig blootgelegd ten behoeve van een fotodemonstratie. Overmatige dissectie kan schade aan de zenuwen van de omliggende BAT veroorzaken. Een verkeerde richting van de schaar kan de omliggende spieren en de ader van de Sultzer beschadigen en de BAT draineren en kan leiden tot overmatig bloeden. - Injecteer voor elke muis langzaam 40 μl AAV in beide BBT-lobben (20 μl per lob van de BBT) met behulp van een scherpe naald (32 G, zie materiaaltabel) die is aangesloten op een Hamilton-spuit (100 μl, zie materiaaltabel; Figuur 3I). Controleer op een succesvolle injectie zoals aangegeven door geen lekkages van de geïnjecteerde plaats tijdens AAV-toediening.
OPMERKING: De BBT in figuur 3I werd volledig belicht ten behoeve van een fotodemonstratie. Het volume AAV-oplossing dat in een BBT-kwab moet worden toegediend, wordt bepaald door de grootte van de BBT van de ontvangende muis. We hebben vastgesteld dat 20 μL AAV-oplossing geschikt is voor één BBT-lob met een gewicht van ongeveer 0,05 g in een gewone C57BL6/J-muis met een gewicht van 30 g. Indien nodig moet de virale oplossing mogelijk worden geconcentreerd om het gewenste volume te bereiken. - Bevestig dat er geen bloedingen zijn uit de geïnjecteerde BAT of omliggende weefsels. Druk gaas gedrenkt in waterstofperoxide-oplossing (zie materiaaltabel) op een bloedingsplaats voor hemostase.
- Plaats de blootgestelde vetweefsels terug naar hun normale positie. Hecht de rand van de vetweefsels en spieren met behulp van een 5-0 absorbeerbare monofilamentdraad (figuur 3J). Hecht de open huid met 5-0 gecoate vicryl ongeverfde gevlochten draden (figuur 3K-L).
OPMERKING: Figuur 4 beschrijft de stappen voor het hechten van de geschilde vetweefsels en spieren. - Houd de dieren na de operatie op een verwarmingskussen totdat ze volledig zijn hersteld. Geef de dieren toegang tot voedsel, water en voldoende strooisel om te nestelen. Controleer ze regelmatig op tekenen van nood of ziekte gedurende 7 dagen herstel voorafgaand aan het begin van het experiment.
- Bevestig de efficiëntie van de gerichte gendeletie door western blot-analyse in de BAT ontleed van muizen, zoals in Sugimoto et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In alle bovenstaande procedures is de precieze levering van AAV-sgRNA aan de BBT cruciaal voor het succes van het protocol. Om het effect van AAV-sgRNA te maximaliseren en de weefselschade tijdens de operatie te minimaliseren, is het essentieel om de driedimensionale (3D) anatomische locatie van de BAT te begrijpen. Zoals te zien is in figuur 3E, is het moeilijk om de precieze locatie van de BBT te bepalen zonder het weefsel bloot te stellen. Overmatige blootstelling aan BAT kan het weefsel echter beschadigen (figuur 3H, I); daarom moet de procedure worden uitgevoerd om de AAV-oplossing binnen een beperkte anatomische ruimte te injecteren (figuur 3G). Figuur 5A is van cruciaal belang om het succes van de AAV-injectie en het snelle herstel van de muizen na de operatie te garanderen. Figuur 5B-D geeft mogelijke gebreken aan die kunnen leiden tot mislukte injecties. Deze omvatten het injecteren van de AAV-oplossing in het verkeerde gebied (figuur 5B), naaldpenetratie door het weefsel (figuur 5C) en weefselballonvorming als gevolg van een overmatig volume van de AAV-oplossing (figuur 5D). Ten slotte moet de knockdown-efficiëntie van het gen van belang worden geverifieerd door de eiwitniveaus in de BAT ontleed van de geïnjecteerde muizen16. De eiwitniveaus van 12-LOX in de BBT, gemeten met western blot, tonen bijvoorbeeld een efficiënte knockdown als gevolg van AAV8 die sgRNA levert dat gericht is op Alox12 (het gen dat codeert voor 12-LOX) in de BAT van Ucp1-Cre / Cas9-muizen (zie figuur 7b in de eerder gepubliceerde studie16).
Figuur 1: Schematisch voor het lentivirale plasmide dat Cas9 en sgRNA tot expressie brengt. Lentivirale expressievector voor Cas9 en sgRNA (lentiCRISPRv2). Afkortingen: Puro = puromycine selectiemarker; psi+ = psi verpakkingssignaal; RRE = toerenresponselement ; cPPT = centraal polypurine kanaal; EFS = rekfactor-1α korte promotor; P2A = 2A zelfsplitsend peptide; WPRE = posttranscriptioneel regulerend element; LTR = lange terminale herhaling. LentiCRIPSRv2 kan worden verteerd met behulp van BsmBI en een paar gegloeide sgRNA-oligo's kunnen worden gekloond in de RNA-steiger met één geleider. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch voor het AAV-plasmide dat sgRNA tot expressie brengt. De AAV-vector voor sgRNA. Afkortingen: ITR = I terminal repeat; CB = hybride CMV-versterker/β-actinepromotor. pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP kan worden verteerd met behulp van BbsI en een paar gegloeide sgRNA-oligo's kunnen worden gekloond in de RNA-steiger met één geleider. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Sequentiële chirurgie voor AAV-injectie in de bilaterale BAT-lobben bij muizen. Een verdoofde muis heeft de volgende procedures ondergaan: (A-B) het snijden van de geschoren huid, (C-D) het botweg afpellen van de geschoren huid, (E-F) het snijden van de vetweefsels, (G) het botweg afpellen van de vetweefsels, (H-I) het injecteren van de AAV-oplossing in de BAT-lobben met behulp van een Hamilton-spuit, (J) hechten tussen de vetweefsels en spieren en (K-L) tussen beide huidflappen. Opmerking: In de panelen (H) en (I) is de ader van de Sultzer een oriëntatiepunt om de precieze locatie van de BBT te bevestigen. De BBT in die twee panelen werd volledig blootgelegd voor fotodemonstratie. De gele stippellijnen geven de grens aan tussen vetweefsel en spieren in paneel E, en de punt van de naald (d.w.z. de injectieplaats) in paneel I. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stappen voor het naaien van de geschilde vetweefsels en spieren. (A) Steek een naalddraad in de geschilde vetweefsels voor injectie, (B) penetreer de vetweefsels, (C) haak een spier, (D) trek een draad omhoog om de geschilde vetweefsels en spieren te naaien en liga vervolgens de draden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Representatieve foto's van de juiste en ongepaste middelen van AAV-injectie in de BAT-lobben bij muizen. (A) Deze figuur vertegenwoordigt de voorgestelde AAV-injectie, waarbij een unilaterale BBT-kwab een injectie van 20 μL AAV-oplossing krijgt. (B-D) De volgende methoden van AAV-injectie kunnen tot falen leiden. (B) onjuiste injectieplaats (d.w.z. het ontbreken van de BBT-lobben); C) de naald dringt door de weefsels; en (D) weefselballonvorming als gevolg van een grote hoeveelheid AAV-oplossing, waarbij een unilaterale BAT-kwab een injectie van 80 μL met AAV-oplossing krijgt. De gele gestippelde cirkels geven de punt van de naald aan (d.w.z. de injectieplaats). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Voorwaartse oligo: 5' CACC-20bp gRNA sequentie-3' |
| Reverse oligo: 5' AAAC-20bp gRNA reverse-complement sequence-3' |
| Als de doelsequentie bijvoorbeeld TCTGATAGCGTAGGAGTGAT is, zijn de oligo's: |
| Voorwaartse oligo: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| Omgekeerde oligo: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
Tabel 1: Voorbeeld van sgRNA-ontwerp. Voorbeeld van een sgRNA-sequentie met overhangen die overeenkomen met de BsmBI-restrictiesite.
| Naam van het materiaal | Bedrijf | Catalogusnummer | Aantal |
| lentiCRISPER v2 plasmide | Addgene | #52961 | 5 μg |
| psPAX2 verpakking plasmide | Addgene | #12260 | 3,75 μg |
| pMD2.G envelop plasmide | Addgene | #12259 | 1,5 μg |
| OPTI-MEM serumvrij medium | Invitrogen | #31985 | 250 μl |
Tabel 2: LentiCRISPR. Plasmidecocktail voor de transfectie van het sgRNA dat het LentiCRISPRv2-plasmide bevat in HEK-293-cellen om CRISPR-sgRNA-lentivirus te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bestaande gepubliceerde methoden voor AAV-gemedieerde genafgifte aan de interscapulaire BBT bevatten geen gedetailleerde foto's en video's die de chirurgische technieken en aanpak voor directe AAV-injectie in de BBT beschrijven. In de meeste van de gepubliceerde methoden33,34 wordt de AAV geïnjecteerd in de vetweefsels rond de interscapulaire BBT in plaats van de BBT zelf. Daarom zijn er verschillende belangrijke stappen in dit protocol die het succes van de studie bepalen. Deze omvatten het ontwerp van het sgRNA, de AAV-verpakking en -concentratie, de generatie van de BAT-specifieke Cas9-muizen en de chirurgische procedures. Zorgvuldige en uitstekende chirurgische vaardigheden zijn vereist om de in vivo procedures te voltooien. In het bijzonder is het minimaliseren van de weefselschade tijdens het blootstellen van de BBT en het toedienen van de AAV van cruciaal belang. Vanwege meerdere genetische en omgevingsfactoren, zoals huisvestingstemperatuur, trainingstraining en diëten, kan het volume wit vet rond de BBT en de samenstelling van BAT zelf variëren tussen dieren. Zwaarlijvige muizen vertonen bijvoorbeeld enorme witte vetweefsels rond de BAT en muizen gehuisvest op thermoneutraliteit (30 ° C) vertonen gewitte BAT. Daarom is het een uitdaging om de 3D-locatie van de BBT nauwkeurig te bepalen zonder de huid te openen. Het minimaal onthullen van de BAT is een uitdagende maar cruciale stap voor AAV-injectie. Overmatige blootstelling van de BAT tijdens deze procedure kan ernstige schade toebrengen aan de sympathische zenuwen en bloedvaten, met name de ader van de Sultzer die verbonden is met de BAT.
Van belang is dat het volume AAV dat in het weefsel wordt geïnjecteerd ook een beperkende factor is voor succes. Een overmatig volume van de oplossing kan schadelijk zijn voor de cellen en interfereren met een efficiënte virale infectie om het sgRNA in de adipocyten af te leveren. Omdat de grootte van de BAT varieert met de leeftijd, het geslacht en de genetische achtergrond van de ontvangende muizen, kunnen optimalisatie-experimenten nodig zijn16,17. Naast het neerhalen van interessante genen, kan deze techniek ook worden toegepast op overexpressiegenen van belang.
Een mogelijke valkuil van deze techniek is de lage efficiëntie van gen knock-out met behulp van één sgRNA in vivo, zelfs met sgRNA's die efficiënte knock-out in vitro bieden. Als mogelijke oplossing kan het combineren van twee of meer unieke sgRNA's in een enkele injectie de efficiëntie van gen knockdown in vivo verbeteren.
Kortom, de gecombineerde Ucp1-Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-technologieën bieden een robuust en efficiënt systeem om muizen te genereren met BAT-specifieke genmanipulatie. Deze methode kan worden aangepast voor andere weefsels met behulp van geselecteerde Cre-lijnen en gemodificeerde AAV-injectie in verschillende weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) subsidies R01DK122808, R01DK102898 en R01DK132469 (aan Y.-H.T.), evenals P30DK036836 (aan het Diabetes Research Center van Joslin Diabetes Center). T.T. werd ondersteund door de SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) en de American Heart Association grant 903968. Y.Z. werd ondersteund door de Charles A. King Trust Fellowship. We bedanken Sean D. Kodani voor het proeflezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
