В этом протоколе мы описываем технические процедуры для создания мышей-нокаутов, специфичных для бурой жировой ткани (BAT), с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Описанные этапы включают проектирование сгРНК, подготовку частиц AAV-sgRNA и микроинъекцию AAV в доли BAT.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация мышей-нокаутов, специфичных для бурого жира, с использованием комбинированной системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированной вирусной РНК
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Бурая жировая ткань (BAT) представляет собой жировое депо, специализирующееся на рассеивании энергии, которое также может служить эндокринным органом посредством секреции биологически активных молекул. Создание BAT-специфических нокаут-мышей является одним из самых популярных подходов к пониманию вклада интересующего гена в BAT-опосредованную регуляцию энергии. Традиционная стратегия нацеливания на гены с использованием системы Cre-LoxP была основным подходом к созданию ткано-специфических нокаутных мышей. Однако такой подход отнимает много времени и утомителен. Здесь мы описываем протокол быстрого и эффективного нокаута интересующего гена в BAT с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Межлопаточная БАТ расположена в глубоком слое между мышцами. Таким образом, BAT должен быть выставлен, чтобы точно и непосредственно вводить AAV в BAT в поле зрения. Надлежащая хирургическая обработка имеет решающее значение для предотвращения повреждения симпатических нервов и сосудов, таких как вена Зульцера, которая соединяется с БАТ. Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, существует острая необходимость в понимании трехмерного анатомического расположения НДТ и хирургических навыков, необходимых на технических этапах. В этом протоколе освещаются ключевые технические процедуры, включая разработку сгРНК, нацеленных на интересующий ген, подготовку частиц AAV-sgRNA и операцию по прямой микроинъекции AAV в обе доли BAT для получения BAT-специфических нокаутных мышей, которые могут быть широко применены для изучения биологических функций генов в BAT.
Введение
Ожирение растет значительными темпами во всем мире, что приводит к широкому спектру метаболических заболеваний 1,2,3. Жировая ткань является ключом к этим патологиям. Существуют два функционально различных типа жировой ткани: белая жировая ткань (WAT), которая хранит лишние калории, и коричневая жировая ткань (BAT) и связанный с ней бежевый / бритовый жир, которые рассеивают энергию для термогенеза. В то время как BAT был признан за его рассеивающую энергию функцию, он также выполняет эндокринные функции за счет производства биологически активных молекул, которые рег....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты и процедуры ухода на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Центре диабета Джослина.
1. Скрининг эффективных сгРНК в культивируемых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать анализ экономически эффективным, перед упаковкой сгРНК в частицы AAV мы рекомендуем протестировать различные сгРНК в культивируемых клетках с помощью системы на основе лентивируса для экспрессии Cas9 / sgRNA (рис. 1) и выбрать sgRNA, которые дают наибольшую эффективность нокдауна для экспериментов in vivo .
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На протяжении всех вышеперечисленных процедур точная доставка AAV-sgRNA в BAT имеет решающее значение для успеха протокола. Чтобы максимизировать эффект AAV-sgRNA и свести к минимуму повреждение тканей во время операции, важно понимать трехмерное (3D) анатомическое расположение BAT. Как показано на рисунке 3E, трудно определить точное местоположение НДТ, не обнажая ткань. Однако чрезмерное воздействие НИМ может повредить ткань (рис. 3H, I); таки.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существующие опубликованные методы доставки генов, опосредованных AAV, в межлопаточную БАТ не содержат подробных фотографий и видео, описывающих хирургические методы и подход к прямому введению ААВ в БАТ. В большинстве опубликованных методов33,34 AAV вводят в жировые ткани, окружающие межлопаточную ВАТ, а не в саму БАТ. Следовательно, в этом протоколе есть несколько ключевых шагов, которые определяют успех исследования. К ним относятся дизайн сгРНК, упаковка и ко.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (NIH) R01DK122808, R01DK102898 и R01DK132469 (для Y.-H.T.), а также P30DK036836 (для Центра исследований диабета Джослина). Т. Т. был поддержан исследовательской стипендией SUNSTAR (стипендия Хироо Канеда, Фонд Sunstar, Япония) и грантом Американской кардиологической ассоциации 903968. Ю. З. был поддержан стипендией Фонда Чарльза А. Кинга. Мы благодарим Шона Д. Кодани за любезную корректуру рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Химикаты, пептиды и рекомбинантные белки | |||
| OPTI-MEM бессывороточная среда | Invitrogen | 31985 | |
| Полибреновая инфекция / трансфекционный реагент | Sigma | TR-1003-G | |
| Трансфекционный реагент | Mirus | MIR 2300 | |
| Рекомбинантная ДНК | |||
| lentiCRISPR v2 вектор | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G конвертная плазмида | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 упаковка плазмиды | Addgene | 12260 | |
| Экспериментальные модели: Клеточные линии | |||
| клетки | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 клетки | Разработано в лаборатории Ценг | PMID: 14966273 | |
| Экспериментальные модели: Организмы/штаммы | |||
| Cas9 нокаут мышей | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE мыши | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Другие | |||
| Банамин | Паттерсон | 07-859-1323 | |
| Гамильтон шприц | Hamilton | Model 710 RN Шприц | |
| Раствор перекиси водорода | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Игла | Hamilton | 32 калибра, маленькая ступица RN игла, тип иглы 2 | |
| Шов 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 дюймов Мононить 12/Bx | Генри Шейн | 1273504 | |
| шов 5-0 Unify Silk P-3 Черный 18 дюймов 12/Bx | Henry Schein |
Ссылки
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
