Summary
В этом протоколе мы описываем технические процедуры для создания мышей-нокаутов, специфичных для бурой жировой ткани (BAT), с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Описанные этапы включают проектирование сгРНК, подготовку частиц AAV-sgRNA и микроинъекцию AAV в доли BAT.
Abstract
Бурая жировая ткань (BAT) представляет собой жировое депо, специализирующееся на рассеивании энергии, которое также может служить эндокринным органом посредством секреции биологически активных молекул. Создание BAT-специфических нокаут-мышей является одним из самых популярных подходов к пониманию вклада интересующего гена в BAT-опосредованную регуляцию энергии. Традиционная стратегия нацеливания на гены с использованием системы Cre-LoxP была основным подходом к созданию ткано-специфических нокаутных мышей. Однако такой подход отнимает много времени и утомителен. Здесь мы описываем протокол быстрого и эффективного нокаута интересующего гена в BAT с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Межлопаточная БАТ расположена в глубоком слое между мышцами. Таким образом, BAT должен быть выставлен, чтобы точно и непосредственно вводить AAV в BAT в поле зрения. Надлежащая хирургическая обработка имеет решающее значение для предотвращения повреждения симпатических нервов и сосудов, таких как вена Зульцера, которая соединяется с БАТ. Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, существует острая необходимость в понимании трехмерного анатомического расположения НДТ и хирургических навыков, необходимых на технических этапах. В этом протоколе освещаются ключевые технические процедуры, включая разработку сгРНК, нацеленных на интересующий ген, подготовку частиц AAV-sgRNA и операцию по прямой микроинъекции AAV в обе доли BAT для получения BAT-специфических нокаутных мышей, которые могут быть широко применены для изучения биологических функций генов в BAT.
Introduction
Ожирение растет значительными темпами во всем мире, что приводит к широкому спектру метаболических заболеваний 1,2,3. Жировая ткань является ключом к этим патологиям. Существуют два функционально различных типа жировой ткани: белая жировая ткань (WAT), которая хранит лишние калории, и коричневая жировая ткань (BAT) и связанный с ней бежевый / бритовый жир, которые рассеивают энергию для термогенеза. В то время как BAT был признан за его рассеивающую энергию функцию, он также выполняет эндокринные функции за счет производства биологически активных молекул, которые регулируют метаболизм в дистальных органах 4,5. Многочисленные исследования на грызунах показали, что увеличение количества или активности бурого или бежевого жира приводит к увеличению расхода энергии и улучшению чувствительности к инсулину. У людей с выявляемой НДТ распространенность кардиометаболическихзаболеваний значительно ниже6. Таким образом, BAT обладает отличным терапевтическим потенциалом в отношении метаболических последствий, связанных с ожирением 7,8,9.
Для исследования физиологии и патофизиологии развития и функционирования БАТ и выяснения молекулярных механизмов, участвующих в этих процессах, методом выбора является модель трансгенных мышей, специфичная для BAT,10. Система рекомбинации Cre-LoxP является наиболее часто используемым средством для получения мышей с условным нокаутом путем редактирования генома мыши. Эта система позволила модифицировать (сверхэкспрессию или нокаут) интересующих генов тканеспецифическим образом11. Он также может быть использован для маркировки определенного типа клеток путем экспрессии селективного флуоресцентного репортерного гена.
В последнее время системный подход Cre-LoxP получил дальнейшее развитие путем объединения технологии CRISPR-Cas9 и системы аденоассоциированного вируса (AAV) с одной направляющей РНК (sgRNA)12. Система CRISPR-Cas9 представляет собой специфический и эффективный инструмент редактирования генов для модификации, регулирования или нацеливания на точные области генома13. Редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 позволяет быстро генетически манипулировать геномными локусами, поскольку не требует гомологичной рекомбинации с вектором, нацеленным на гены. Комбинированные методы Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA позволяют исследователям более точно понимать функции генов, позволяя исследовать роль интересующих генов в желаемое время в тканях / клетках. Кроме того, эти комбинированные методы сокращают время и усилия, необходимые для создания трансгенных мышей, и позволяют контролировать временную активность CRISPR-Cas9 для индуцируемого редактирования генома у мышей, если используется индуцируемая линия Cre14.
Векторы AAV безопасны и эффективны в системах доставки генов in vivo. Однако AAV, нацеленные на жировую ткань, отстают от применения в других тканях, таких как мозг, сердце, печень и мышцы15. Из-за относительно низкой эффективности трансдукции и тропизма с естественными векторами серотипа доставка генов под контролем AAV в жировую ткань по-прежнему является сложнойзадачей 15. За последние 5 лет мы и другие успешно установили эффективные и минимально инвазивные способы доставки генов, управляемых AAV, в жировую ткань и создали мышиные модели, которые позволяют нам получить представление о генах, участвующих в регуляции функции BAT16,17,18,19. Например, используя AAV8 для доставки сгРНК, нацеленной на Alox12, которая кодирует 12-липоксигеназу (12-LOX), в BAT мышей Ucp1-Cre / Cas9, мы обнаружили, что активированный BAT продуцирует метаболиты 12-LOX, а именно 12-гидрокси-эйкозапентаеновую кислоту (12-HEPE) и 13R, 14S-дигидроксидокозагексаеновую кислоту (марезин 2), для регулирования метаболизма глюкозы и устранения воспаления, связанного с ожирением, соответственно16, 17. Здесь мы приводим пошаговый протокол технических процедур, в частности операции по прямой микроинъекции AAV-sgRNA в доли BAT, для создания BAT-специфических нокаутных мышей с использованием комбинированной системы Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты и процедуры ухода на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Центре диабета Джослина.
1. Скрининг эффективных сгРНК в культивируемых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать анализ экономически эффективным, перед упаковкой сгРНК в частицы AAV мы рекомендуем протестировать различные сгРНК в культивируемых клетках с помощью системы на основе лентивируса для экспрессии Cas9 / sgRNA (рис. 1) и выбрать sgRNA, которые дают наибольшую эффективность нокдауна для экспериментов in vivo .
- Дизайн сгРНК CRISPR-Cas9
- Проектирование сгРНК с помощью онлайн-инструментов, таких как инструмент проектирования широких сгРНК (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, онлайн-инструмент CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)22 и другие доступные инструменты.
- Введите названия генов или целевые последовательности ДНК в поле имени гена и выберите NGG в качестве соседнего мотива протоспейсера (PAM) для SpCas9 для генерации потенциальных последовательностей сгРНК.
- Выберите сгРНК с высокой прогнозируемой эффективностью на мишени и низкой нецелевой активностью. Например, рекомендуются для использования сгРНК с оценкой специфичности не менее 50 на выходе CRISPOR. Среди конкретных сгРНК, прошедших фильтр, выберите те, которые имеют высокие показатели эффективности23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, выбираются три или четыре сгРНК, чтобы обеспечить идентификацию эффективных сгРНК.
- Построение плазмиды сгРНК CRISPR-Cas9
- Синтезировать олигопары сгРНК, кодирующие 20 нуклеотидных (nt) целевых последовательностей с выступами (как 5', так и 3') из сайта рестрикции BsmBI (таблица 1) через платформу синтеза ДНК.
- Лигат отожженных олигопар с BsmBI-линеаризованным вектором lentiCRISPR v2.
- Трансформировать продукт лигирования в штамм Stbl3 E. coli и подтвердить вставки сгРНК с помощью секвенирования ДНК Сэнгера с использованием прямого праймера U6.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. подробную процедуру клонирования в протоколе Addgene под названием LentiCRISPRv2 и lentiGuide-Puro: лентивирусная CRISPR/Cas9 и однонаправляющая РНК24.
- Продуцирование лентивирусных частиц
- Приблизительно за 24 ч до трансфекции планшет 7 x 105 клеток HEK-293 в 4 мл полной питательной среды в 6-сантиметровой пластине для культивирования тканей.
- Добавьте 15 мкл реагента для трансфекции LT1 в 250 мкл среды, не содержащей сыворотки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Приготовьте коктейль для трансфекции для каждой сгРНК в соответствии с таблицей 2 в 250 мкл среды, не содержащей сыворотки. Реагент для трансфекции, приготовленный на этапе 1.3.2, смешивают с плазмидным коктейлем и инкубируют в течение 20-30 мин при комнатной температуре.
- Замените полную питательную среду 3,5 мл свежей питательной среды для клеток HEK-293, а затем добавьте смесь реагентов для трансфекции ДНК по каплям к клеткам HEK-293, культивируемым в 3,5 мл свежей питательной среды.
- Через 12-15 ч после трансфекции смените среду, чтобы удалить реагент для трансфекции, и замените ее 4 мл свежей питательной среды.
- После 24 ч инкубации соберите питательную среду для клеток, содержащую лентивирусные частицы, и отфильтруйте среду через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить все клетки HEK-293. Вирусы могут храниться при температуре 4 ° C в течение нескольких дней. Для длительного хранения вирусы следует замораживать при температуре −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте правила биобезопасности при подготовке лентивирусных частиц и работайте в среде (например, BL2+), подходящей для работы с лентивирусом. Подробную процедуру получения лентивируса см. в протоколе Addgene под названием pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
- Инфицирование коричневых преадипоцитов и определение sgRNA-опосредованного нокдауна
- Планшет 1 x 10 6 мышей увековечил коричневые преадипоциты в 1 мл пресной среды, содержащей 8 мкг/мл полибрена на лунку в 6-луночном планшете.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании иммортализированные коричневые преадипоциты были получены с использованием антигена SV40 T25. Коричневые преадипоциты культивируют в ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы с 10% FBS. - Добавьте 1 мл раствора лентивирусных частиц с этапа 1.3, чтобы инфицировать клетки. Поддерживайте одну неинфицированную лунку клеток параллельно, чтобы она служила контролем отбора антибиотиков.
- Переход на свежую среду через 24 ч после заражения. Добавьте соответствующие антибиотики (например, пуромицин с конечной концентрацией 1 мкг/мл) в среду, чтобы убить неинфицированные клетки и выбрать инфицированные. Меняйте на свежую среду, содержащую выбранный антибиотик, через день, пока все неинфицированные контрольные клетки не погибнут.
- Соберите белок из инфицированных вирусом клеток и определите эффективность нокдауна сгРНК с помощью вестерн-блоттинга. Следуйте подробной процедуре вестерн-блоттинга в Эслами и Лухане26. Из-за различной скорости оборота белков протестируйте несколько временных точек (например, с 6-го по 12-й день после вирусной инфекции), чтобы наблюдать потерю белкового сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если антитело, которое распознает белок, кодируемый интересующим геном, недоступно, секвенирование Сэнгера может быть использовано для определения эффективности редактирования генома каждой сгРНК. Вкратце, амплифицируйте геномную ДНК с помощью праймеров, фланкирующих область, нацеленную на сгРНК, для получения ампликонов ПЦР длиной ~ 700.н. Предпочтительно, чтобы прогнозируемый участок разрыва находился на расстоянии ~ 200.н. ниже по течению от места начала секвенирования. Затем подвергните продукт ПЦР секвенированию по Сэнгеру. Проанализируйте результаты секвенирования с помощью онлайн-инструментов, таких как Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), чтобы определить частоту небольших инделов, генерируемых каждой сгРНК в пуле клеток27.
- Планшет 1 x 10 6 мышей увековечил коричневые преадипоциты в 1 мл пресной среды, содержащей 8 мкг/мл полибрена на лунку в 6-луночном планшете.
2. Построение плазмиды AAV-sgRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эффективные сгРНК, идентифицированные с помощью приведенного выше экрана, клонируются в вектор pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP28 (рис. 2). В то же время нецелевая сгРНК (например, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29), которая не распознает какую-либо последовательность в геноме мыши, также клонируется в тот же вектор, чтобы служить неотредактированным контролем.
- Линеаризируйте основную цепь pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP с использованием BbsI, которая генерирует идентичные выступы с синтезированными олиго сгРНК.
- Соедините отожженные пары олиго с линеаризованным вектором pAAV и подтвердите вставки sgRNA, как описано на шаге 1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура клонирования лентиCRISPRv2-sgRNA также применяется для построения плазмиды AAV-sgRNA.
3. Упаковка AAV
- Упакуйте векторы AAV, сгенерированные в разделе 2, в серотип AAV 8. Подготовьте AAV с высоким титром в соответствии с предыдущим протоколом30 или запросите услугу упаковки AAV в вирусных ядрах или в коммерческих службах. Разбавьте титр вируса до 1 x 1013 копий генома / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированный геном AAV2, экспрессирующий сгРНК, упакован в серотип AAV 8. Этот серотип был выбран из-за его высокой эффективности для жировой ткани18,31. Чтобы предотвратить иммунный ответ, вызванный загрязняющими веществами, такими как клеточный мусор и небольшое количество средних компонентов, для инъекций in vivo требуется ультраочищенный AAV. Ультраочистка может быть достигнута градиентами йодиксанола и ультрацентрифугированием30.
4. Подготовка мышей Ucp1 Cre/Cas9
- Приобретите штамм мыши Ucp1-Cre (см. Таблицу материалов), который экспрессирует рекомбиназу Cre под контролем промотора Ucp1. Приобретите гомозиготных мышей32 с нокаутом Rosa26-floxed STOP-Cas9 (см. Таблицу материалов), у которых экспрессия Cas9 регулируется Cre-рекомбиназ-зависимым образом.
- Скрещивайте эти штаммы для получения мышей Ucp1-Cre / Cas9, как описано ранее16,17. Держите всех мышей в помещении с регулируемой температурой и влажностью (23 ° C, влажность 30%) в течение 12 часов светлый и темный цикл (свет включается в 6:30 утра; свет выключается в 6:30 вечера) со свободным доступом к диете чау-чау и воде.
- Обработайте полученных мышей Ucp1-Cre / Cas9 AAV, несущими либо контрольную сгРНК, либо сгРНК, нацеленную на интересующий ген, с помощью метода, описанного ниже. В этом исследовании использовались 12-15-недельные самцы мышей Ucp1-Cre / Cas9 весом около 30 г.
5. Операция по введению AAV в BAT у мышей
- Анестезируют мышей непрерывной ингаляцией 2,5% изофлурана для индукции и поддержания.
- Смажьте оба глаза, чтобы предотвратить высыхание. Затем дайте мышам анальгетики (банан, 2,5 мг / кг массы тела [МВТ], подкожная инъекция, см. Таблицу материалов) мышам, чтобы свести к минимуму и предотвратить послеоперационную боль и дистресс.
- Сбрейте шерсть мыши в межлопаточной области с помощью бритвы и стерилизуйте операционную область не менее чем тремя чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексидина, а затем 70% этанола. Затем наложите стерильные хирургические простыни вокруг места разреза.
- Надрежьте кожу между лопатками с помощью скальпеля (рис. 3A-B), а затем снимите сбритую кожу, чтобы обнажить жировые ткани на шее с помощью хирургических ножниц (рис. 3C-D). Размер разреза зависит от размера тела, но, как правило, разрез должен составлять примерно 2 см, чтобы обнажить жировые ткани в межлопаточной области.
- Разрежьте жировые ткани на границе между дистальной областью жировых тканей и мышцами, используя один разрез (рис. 3E-F). Размер разреза должен быть примерно 1 см, чтобы просто открыть вход для введения хирургических ножниц для тупого отслаивания жировых тканей.
- Используя доминирующую руку, отклейте жировые ткани тупо и вертикально хирургическими ножницами, чтобы обнажить БАТ, одновременно зажимая жировые ткани, включая БАТ, недоминантной рукой (рис. 3G). Используйте вену Зульцера в качестве ориентира, чтобы указать точное местоположение BAT.
ПРИМЕЧАНИЕ: НДТ на рисунке 3H была полностью экспонирована с целью демонстрации изображения. Избыточное рассечение может привести к повреждению нервов окружающего ВАТ. Неправильное направление ножниц может повредить окружающие мышцы и вену Зульцера, дренирующую ВАТ, и может привести к чрезмерному кровотечению. - Для каждой мыши медленно вводите 40 мкл AAV в обе доли BAT (20 мкл на одну долю BAT) с помощью острой иглы (32 G, см. Таблицу материалов), соединенной со шприцем Гамильтона (100 мкл, см. Таблицу материалов; Рисунок 3I). Проверьте успешную инъекцию, о чем свидетельствует отсутствие утечек из места инъекции во время введения AAV.
ПРИМЕЧАНИЕ: НДТ на рисунке 3I была полностью экспонирована с целью демонстрации изображения. Объем раствора AAV, вводимого в долю BAT, определяется размером BAT мыши-реципиента. Мы определили, что 20 мкл раствора AAV подходит для одной доли BAT весом около 0,05 г у обычной мыши C57BL6/J весом 30 г. При необходимости может потребоваться концентрирование вирусного раствора для достижения желаемого объема. - Убедитесь в отсутствии кровотечения из введенной БАТ или окружающих тканей. Прижать марлю, смоченную раствором перекиси водорода (см. Таблицу материалов), к месту кровотечения для гемостаза.
- Поместите открытые жировые ткани обратно в нормальное положение. Сшейте край жировых тканей и мышц с помощью рассасывающейся мононити 5-0 (рис. 3J). Зашить открытую кожу неокрашенными плетеными нитями Vicryl с покрытием 5-0 (рис. 3K-L).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 4 описаны этапы сшивания очищенных жировых тканей и мышц. - После операции держите животных на грелке до полного выздоровления. Обеспечьте животным доступ к пище, воде и достаточному количеству подстилки для гнездования. Регулярно наблюдайте за ними на предмет любых признаков стресса или болезни в течение 7 дней восстановления до начала эксперимента.
- Подтвердите эффективность целевой делеции гена анализом вестерн-блоттинга в BAT, препарированном у мышей, как в Sugimoto et al.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На протяжении всех вышеперечисленных процедур точная доставка AAV-sgRNA в BAT имеет решающее значение для успеха протокола. Чтобы максимизировать эффект AAV-sgRNA и свести к минимуму повреждение тканей во время операции, важно понимать трехмерное (3D) анатомическое расположение BAT. Как показано на рисунке 3E, трудно определить точное местоположение НДТ, не обнажая ткань. Однако чрезмерное воздействие НИМ может повредить ткань (рис. 3H, I); таким образом, процедура должна быть выполнена для введения раствора AAV в ограниченное анатомическое пространство (рис. 3G). Рисунок 5A имеет решающее значение для обеспечения успеха инъекции AAV и быстрого восстановления мышей после операции. На рисунке 5B-D показаны потенциальные недостатки, которые могут привести к неудачным инъекциям. К ним относятся введение раствора AAV в неправильную область (рис. 5B), проникновение иглы через ткань (рис. 5C) и раздувание ткани из-за чрезмерного объема раствора AAV (рис. 5D). Наконец, эффективность нокдауна интересующего гена должна быть проверена уровнями белка в BAT, препарированном у инъецированных мышей16. Например, уровни белка 12-LOX в BAT, измеренные с помощью вестерн-блоттинга, демонстрируют эффективный нокдаун из-за того, что AAV8 доставляет sgRNA, нацеленную на Alox12 (ген, кодирующий 12-LOX), в BAT мышей Ucp1-Cre / Cas9 (см. Рисунок 7b в ранее опубликованном исследовании16).
Рисунок 1: Схема лентивирусной плазмиды, экспрессирующей Cas9 и sgRNA. Вектор экспрессии лентивируса для Cas9 и sgRNA (lentiCRISPRv2). Сокращения: Puro = маркер отбора пуромицина; psi+ = сигнал упаковки psi+; RRE = элемент ответа rev ; cPPT = центральный полипуриновый тракт; EFS = коэффициент удлинения-1α короткий промотор; P2A = 2A саморасщепляющийся пептид; WPRE = посттранскрипционный регуляторный элемент; LTR = длинный терминальный повтор. LentiCRIPSRv2 может быть переварен с использованием BsmBI, и пара отожженных олиго сгРНК может быть клонирована в каркас однонаправляющей РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема плазмиды AAV, экспрессирующей sgRNA. Вектор AAV для sgRNA. Сокращения: ITR = I терминальный повтор; CB = гибридный энхансер ЦМВ/промотор β-актина. pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP можно расщеплять с использованием BbsI, а пара отожженных олиго sgRNA может быть клонирована в каркас однонаправляющей РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Последовательная операция по введению AAV в двусторонние доли BAT у мышей. Мышь, находящаяся под наркозом, прошла следующие процедуры: (A-B) разрезание бритой кожи, (C-D) тупое отслаивание бритой кожи, (E-F) разрезание жировых тканей, (G) тупое отслаивание жировых тканей, (H-I) введение раствора AAV в доли BAT с помощью шприца Гамильтона, (J) наложение швов между жировыми тканями и мышцами и (K-L) между обоими кожными лоскутами. Примечание: На панелях (H) и (I) вена Зульцера является ориентиром, подтверждающим точное местоположение ВАТ. BAT на этих двух панелях была полностью выставлена для демонстрации изображения. Желтые пунктирные линии обозначают границу между жировыми тканями и мышцами на панели E и кончик иглы (т.е. место инъекции) на панели I. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Этапы сшивания очищенных жировых тканей и мышц. (A) Вставьте игольчатую нить в очищенные жировые ткани для инъекции, (B) проникните в жировые ткани, (C) зацепите мышцу, (D) потяните нить вверх, чтобы сшить очищенные жировые ткани и мышцы, а затем перевязывайте нити. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Репрезентативные изображения правильных и неподходящих способов инъекции AAV в доли BAT у мышей. (A) Этот рисунок представляет собой предлагаемую инъекцию AAV, при которой односторонняя доля BAT получает инъекцию 20 мкл раствора AAV. (Б-Д) Следующие методы впрыска AAV могут привести к неудаче. (B) неправильное место инъекции (т.е. отсутствие лепестков НИМ); (В) игла проникает через ткани; и (D) раздувание тканей из-за большого количества раствора AAV, при котором односторонняя доля BAT получает инъекцию 80 мкл раствора AAV. Желтые пунктирные круги обозначают кончик иглы (т.е. место инъекции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Прямой олиго: 5' последовательность гРНК CACC-20bp-3' |
| Обратный олиго: 5' последовательность обратного комплемента гРНК AAAC-20bp-3' |
| Например, если целевой последовательностью является TCTGATAGCGTAGGAGTGAT, олиго будут следующими: |
| Нападающий: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| Обратный олиго: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
Таблица 1: Пример дизайна сгРНК. Пример последовательности сгРНК с выступами, соответствующими сайту рестрикции BsmBI.
| Наименование материала | Компания | Каталожный номер | Количество |
| lentiCRISPER v2 плазмида | Аддген | #52961 | 5 мкг |
| Плазмида упаковки psPAX2 | Аддген | #12260 | 3,75 мкг |
| Плазмида оболочки pMD2.G | Аддген | #12259 | 1,5 мкг |
| Безсывороточная среда OPTI-MEM | Инвитроген | #31985 | 250 мкл |
Таблица 2: LentiCRISPR. Плазмидный коктейль для трансфекции сгРНК, содержащей плазмиду LentiCRISPRv2, в клетки HEK-293 с образованием лентивируса CRISPR-sgRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существующие опубликованные методы доставки генов, опосредованных AAV, в межлопаточную БАТ не содержат подробных фотографий и видео, описывающих хирургические методы и подход к прямому введению ААВ в БАТ. В большинстве опубликованных методов33,34 AAV вводят в жировые ткани, окружающие межлопаточную ВАТ, а не в саму БАТ. Следовательно, в этом протоколе есть несколько ключевых шагов, которые определяют успех исследования. К ним относятся дизайн сгРНК, упаковка и концентрация AAV, генерация мышей Cas9, специфичных для BAT, и хирургические процедуры. Для выполнения процедур in vivo требуются тщательные и выдающиеся хирургические навыки. В частности, решающее значение имеет минимизация повреждения тканей при воздействии BAT и введении AAV. Из-за множества генетических факторов и факторов окружающей среды, таких как температура в помещении, физические упражнения и диеты, объем белого жира, окружающего НДТ, и состав самой НДТ могут варьироваться у разных животных. Например, мыши с ожирением демонстрируют обширные белые жировые ткани, окружающие BAT, а мыши, размещенные в термонейтральности (30 ° C), демонстрируют побеленный BAT. Следовательно, сложно точно определить 3D-местоположение НДТ, не открывая кожу. Минимальное выявление BAT является сложным, но важным шагом для инъекции AAV. Чрезмерное воздействие БАТ во время этой процедуры может привести к серьезному повреждению симпатических нервов и сосудов, особенно вены Зульцера, соединенной с БАТ.
Следует отметить, что объем AAV, вводимого в ткань, также является ограничивающим фактором успеха. Чрезмерный объем раствора может быть вредным для клеток и препятствовать эффективной вирусной инфекции для доставки сгРНК в адипоциты. Поскольку размер BAT варьируется в зависимости от возраста, пола и генетического фона мышей-реципиентов, могут потребоваться эксперименты по оптимизации16,17. В дополнение к уничтожению интересующих генов, этот метод может быть дополнительно применен к сверхэкспрессии интересующих генов.
Одним из потенциальных ловушек этого метода является низкая эффективность нокаута гена с использованием одной сгРНК in vivo, даже с сгРНК, которые обеспечивают эффективный нокаут in vitro. В качестве потенциального решения объединение двух или более уникальных сгРНК в одну инъекцию может повысить эффективность нокдауна генов in vivo.
В заключение, комбинированные технологии Ucp1-Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA предлагают надежную и эффективную систему для получения мышей с помощью манипуляций с генами, специфичными для BAT. Этот метод может быть адаптирован для других тканей с использованием выбранных линий Cre и модифицированной инъекции AAV в различные ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (NIH) R01DK122808, R01DK102898 и R01DK132469 (для Y.-H.T.), а также P30DK036836 (для Центра исследований диабета Джослина). Т. Т. был поддержан исследовательской стипендией SUNSTAR (стипендия Хироо Канеда, Фонд Sunstar, Япония) и грантом Американской кардиологической ассоциации 903968. Ю. З. был поддержан стипендией Фонда Чарльза А. Кинга. Мы благодарим Шона Д. Кодани за любезную корректуру рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
