Summary
このプロトコルでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて褐色脂肪組織(BAT)特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順について説明します。記載されたステップには、sgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、およびBATローブへのAAVのマイクロインジェクションが含まれる。
Abstract
褐色脂肪組織(BAT)は、エネルギー散逸に特化した脂肪貯蔵庫であり、生理活性分子の分泌 を介して 内分泌器官としても機能します。BAT特異的ノックアウトマウスの作成は、BATを介したエネルギー調節に対する目的の遺伝子の寄与を理解するための最も一般的なアプローチの1つです。Cre-LoxPシステムを利用した従来の遺伝子ターゲティング戦略は、組織特異的ノックアウトマウスを作製するための主要なアプローチでした。ただし、このアプローチは時間がかかり、面倒です。ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて、BATの目的遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトするためのプロトコルについて説明します。肩甲骨間BATは、筋肉間の深い層にあります。したがって、視野内のBATにAAVを正確かつ直接注入するには、BATを露光する必要があります。BATにつながるスルツァー静脈などの交感神経や血管の損傷を防ぐためには、適切な外科的取り扱いが不可欠です。組織の損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元解剖学的位置と技術的ステップで必要な外科的スキルを理解することが重要です。このプロトコルは、目的の遺伝子を標的とするsgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、BAT特異的ノックアウトマウスを生成するための両方のBATローブへのAAVの直接マイクロインジェクション手術など、主要な技術的手順を強調しており、BATの遺伝子の生物学的機能の研究に広く適用できます。
Introduction
肥満は世界中でかなりの速度で増加しており、広範囲の代謝性疾患につながっています1,2,3。脂肪組織はこれらの病状の鍵です。存在する2つの機能的に異なるタイプの脂肪組織は、過剰なカロリーを蓄える白色脂肪組織(WAT)と、熱発生のためにエネルギーを放散する褐色脂肪組織(BAT)とそれに関連するベージュ/ブライト脂肪です。BATはそのエネルギー放散機能で認識されていますが、遠位器官の代謝を調節する生理活性分子の生成を介して内分泌機能も持っています4,5。げっ歯類での多くの研究は、茶色またはベージュ色の脂肪の量または活性を増加させることがエネルギー消費の増加とインスリン感受性の改善につながることを示しています。ヒトでは、BATの検出可能な人は心代謝疾患の有病率が有意に低くなります6。したがって、BATは、肥満関連代謝後遺症7、8、9に対して優れた治療可能性を秘めています。
BATの発生と機能の生理学と病態生理学を調査し、これらのプロセスに関与する分子メカニズムを解明するために、BAT特異的トランスジェニックマウスモデルが最適な方法です10。Cre-LoxP組換えシステムは、マウスゲノムを編集することによって条件付きノックアウトマウスを作製するための最も一般的に使用される手段です。このシステムは、組織/細胞特異的な方法で目的の遺伝子の修飾(過剰発現またはノックアウト)を可能にしました11。また、選択的蛍光レポーター遺伝子を発現させることにより特定の細胞型を標識するために利用することもできる。
最近、Cre−LoxPシステムアプローチは、CRISPR-Cas9技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせることによってさらに発展している12。CRISPR-Cas9システムは、ゲノム13の正確な領域を改変、調節、または標的化するための特異的で効率的な遺伝子編集ツールです。CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集は、遺伝子ターゲティングベクターとの相同組換えを必要としないため、ゲノム遺伝子座の迅速な遺伝子操作を可能にします。Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNA技術を組み合わせることで、研究者は組織/細胞における所望の時間における目的の遺伝子の役割を調査できるため、遺伝子機能をより正確に理解することができます。さらに、これらの組み合わせた技術は、トランスジェニックマウスの生成に必要な時間と労力を削減し、誘導性Cre系統が使用されている場合、マウスにおける誘導性ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9活性の時間的制御を可能にする14。
AAVベクターは、安全で効果的なin vivo遺伝子デリバリーシステムです。しかし、脂肪組織を標的とするAAVは、脳、心臓、肝臓、筋肉などの他の組織での応用に遅れをとっています15。形質導入効率が比較的低く、天然に存在する血清型ベクターでは向性が強いため、脂肪組織へのAAV誘導遺伝子送達は依然として困難です15。過去5年間で、私たちらは、AAVガイド下遺伝子を脂肪組織に送達するための効果的で低侵襲な方法を確立することに成功し、BAT機能の調節に関与する遺伝子の理解を可能にするマウスモデルを作成しました16,17,18,19。例えば、AAV8を用いて、12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)をコードするAlox12を標的とするsgRNAをUcp1-Cre/Cas9マウスのBATに送達することにより、活性化されたBATが12-LOX代謝物、すなわち12-ヒドロキシ-エイコサペンタエン酸(12-HEPE)と13R,14S-ジヒドロキシドコサヘキサエン酸(マレジン2)を産生し、それぞれグルコース代謝を調節し、肥満関連炎症を解消することを発見しました16。17.ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNAシステムを組み合わせてBAT特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順、特にAAV-sgRNAをBATローブに直接マイクロインジェクションする手術に関する段階的なプロトコルを提供します。
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Protocol
すべての動物実験とケア手順は、ジョスリン糖尿病センターの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 培養細胞における有効sgRNAのスクリーニング
注:アッセイを費用対効果の高いものにするために、sgRNAをAAV粒子にパッケージングする前に、Cas9/sgRNA発現用のレンチウイルスベースのシステム を介して 培養細胞でさまざまなsgRNAをテストし(図1)、 in vivo 実験で最高のノックダウン効率が得られるsgRNAを選択することをお勧めします。
- クリスプル-Cas9 sgRNAデザイン
- Broad sgRNA設計ツール(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21、CRISPORオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)22、およびその他の利用可能なツールなどのオンラインツールを使用してsgRNAを設計します。
- 遺伝子名ボックスに遺伝子名またはDNAターゲット配列を入力し、SpCas9のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)として NGG を選択して、潜在的なsgRNA配列を生成します。
- 予測されるオンターゲット効率が高く、オフターゲット活性が低いsgRNAを選択します。例えば、CRISPOR出力で特異性スコアが50以上のsgRNAの使用が推奨されます。フィルターを通過する特定のsgRNAの中から、効率スコア23の高いものを選びます。
注:一般に、効果的なsgRNAを確実に同定するために、3つまたは4つのsgRNAが選択されます。
- CRISPR-Cas9 sgRNAプラスミドの構築
- BsmBI制限部位(表1)からオーバーハング(5'と3'の両方)を持つ20ヌクレオチド(nt)標的配列をコードするsgRNAオリゴペアをDNA合成プラットフォームを介して合成します。
- リゲートアニールオリゴは、BsmBI線形化レンチクリスプルv2ベクターとペアを合わせます。
- ライゲーション産物をStbl3大腸 菌 株に変換し、U6フォワードプライマーを用いたサンガーDNAシーケンシングによりsgRNAの挿入を確認します。
注:LentiCRISPRv2およびlentiGuide-PuroというタイトルのAddgeneのプロトコルの詳細なクローニング手順を参照してください:レンチウイルスCRISPR/Cas9およびシングルガイドRNA24。
- レンチウイルス粒子の生成
- トランスフェクションの約24時間前に、7 x 105 HEK-293細胞を4 mLの完全増殖培地に6 cm組織培養プレートでプレートします。
- 15 μLのLT1トランスフェクション試薬を250 μLの無血清培地に加え、室温で5分間インキュベートします。
- 表2に従って、250 μLの無血清培地中で各sgRNAのトランスフェクションカクテルを調製します。ステップ1.3.2で調製したトランスフェクション試薬をプラスミドカクテルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートします。
- 完全な増殖培地をHEK-293細胞用の3.5 mLの新鮮な増殖培地と交換し、3.5 mLの新鮮な増殖培地で培養したHEK-293細胞にDNAトランスフェクション試薬混合物を滴下します。
- トランスフェクションから12〜15時間後、培地を交換してトランスフェクション試薬を除去し、4 mLの新鮮な増殖培地と交換します。
- 24時間のインキュベーション後、レンチウイルス粒子を含む細胞培養培地を収集し、0.45 μmフィルターで培地をろ過してHEK-293細胞を除去します。ウイルスは4°Cで数日間保存することができます。長期保存の場合、ウイルスは-80°Cで凍結する必要があります。
注:レンチウイルス粒子を調製するときはバイオセーフティガイドラインに従い、レンチウイルスの取り扱いに適した環境(BL2 +など)で作業してください。pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G)と題されたAddgeneのプロトコルの詳細なレンチウイルス調製手順を参照してください。
- 褐色脂肪前駆細胞の感染とsgRNAを介したノックダウンの決定
- プレート1 x 10 6マウス不死化褐色脂肪前駆細胞を、ウェルあたり8 μg/mLのポリブレンを含む1 mLの新しい培地に6 ウェルプレートに入れます。
注:この研究では、不死化褐色前駆脂肪細胞はSV40 T抗原25を使用して生成されました。褐色脂肪前駆細胞は、10%FBSを含む高グルコースDMEMで培養されます。 - ステップ1.3のレンチウイルス粒子溶液1 mLを加えて、細胞に感染させます。1つの非感染ウェルの細胞を並行して維持し、抗生物質選択コントロールとして機能する。
- 感染後24時間で新鮮な培地に交換します。対応する抗生物質(例:.、最終濃度1 μg/mLのピューロマイシン)を培地に追加して、感染していない細胞を殺し、感染した細胞を選択します。感染していないすべての対照細胞が死滅するまで、選択した抗生物質を含む新しい培地に1日おきに変更します。
- ウイルス感染細胞からタンパク質を採取し、ウェスタンブロット解析によりsgRNAのノックダウン効率を測定します。EslamiおよびLujan26の詳細なウェスタンブロッティング手順に従ってください。タンパク質間の代謝回転率が異なるため、複数の時点(ウイルス感染後6日目から12日目など)をテストして、タンパク質シグナルの喪失を観察します。
注:目的の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体が利用できない場合は、サンガーシーケンシングを利用して、各sgRNAのゲノム編集効率を決定することもできます。簡単に説明すると、sgRNA標的領域に隣接するプライマーを使用してゲノムDNAを増幅し、~700 bpの長さのPCRアンプリコンを生成します。予測されるブレークサイトは、シーケンシング開始サイトから~200 bp下流にあることが望ましいです。次に、PCR産物をサンガーシーケンシングにかけます。DEcompositionによるインデルの追跡(TIDE)などのオンラインツールを使用してシーケンシング結果を解析し、細胞27のプール内の各sgRNAによって生成される小さなインデルの頻度を決定する。
- プレート1 x 10 6マウス不死化褐色脂肪前駆細胞を、ウェルあたり8 μg/mLのポリブレンを含む1 mLの新しい培地に6 ウェルプレートに入れます。
2. AAV-sgRNAプラスミドの構築
注:このステップでは、上記のスクリーニングから同定された有効なsgRNAがpAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPベクター28 にクローニングされます(図2)。その間、マウスゲノム内のいかなる配列も認識しない非標的sgRNA(例えば、TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29)も、非編集コントロールとして機能するために同じベクターにクローニングされる。
- 合成されたsgRNAオリゴと同一のオーバーハングを生成するBbsIを使用して、pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP骨格を線形化します。
- アニーリングしたオリゴ対を直鎖状pAAVベクターでライゲートし、ステップ1.2の説明に従ってsgRNAの挿入を確認します。
注:レンチクリスCRISPRv2-sgRNAのクローニング手順は、AAV-sgRNAプラスミドの構築にも適用されます。
3. AAVの包装
- セクション2で生成されたAAVベクターをAAV血清型8にパッケージ化します。以前のプロトコル30に従って高力価AAVを調製するか、またはウイルスコアまたは商用サービスからAAVパッケージングサービスを要求する。ウイルス力価を1 x 1013 ゲノムコピー/ mLに希釈します。
注:sgRNAを発現する改変AAV2ゲノムは、AAV血清型8にパッケージ化されています。この血清型は、脂肪組織に対する効率が高いために選択されました18,31。細胞破片や少量の培地成分などの汚染物質によって誘発される免疫応答を防ぐために、in vivo注射には超精製AAVが必要です。超精製は、ヨージキサノール勾配および超遠心分離30によって達成することができる。
4. Ucp1 Cre/Cas9マウスの作製
- Ucp1プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現するUcp1-Creマウス系統( 材料の表を参照)を購入します。ホモ接合型Rosa26フロックスSTOP−Cas9ノックインマウス32 ( 材料の表参照)を購入し、その中でCas9の発現がCreリコンビナーゼ依存的に調節されている。
- これらの株を交配して、前述のようにUcp1-Cre/Cas9マウスを生成します16,17。すべてのマウスを温湿度管理された部屋(23°C、湿度30%)に12時間の明暗サイクル(午前6時30分に点灯、午後6時30分に消灯)に保管し、飼料と水を無料で利用できるようにします。
- 得られたUcp1-Cre/Cas9マウスを、コントロールsgRNAまたは目的の遺伝子を標的とするsgRNAのいずれかを保有するAAVで、以下に説明する方法で処理します。この研究では、体重約30 gの12〜15週齢の雄Ucp1-Cre / Cas9マウスを使用しました。
5.マウスのBATへのAAV注射の手術
- 誘導および維持のために2.5%イソフルランの連続吸入でマウスを麻酔する。
- 乾燥を防ぐために両目を滑らかにします。次に、鎮痛薬(バンアミン、2.5 mg / kg体重[BW]、皮下注射、 材料の表を参照)をマウスに与えて、術後の痛みと苦痛を最小限に抑え、予防します。
- シェーバーを使用して肩甲骨間領域でマウスの毛皮を剃り、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとそれに続く70%エタノールの少なくとも3ラウンドの交互ラウンドで手術領域を滅菌します。次に、切開部位の周りに滅菌外科用ドレープを適用します。
- メスで肩甲骨の間の皮膚を切開し(図3A-B)、剃った皮膚を剥がして、外科用ハサミで首の脂肪組織を露出させます(図3C-D)。切開の大きさは体の大きさにもよりますが、一般的に肩甲骨間部の脂肪組織を露出させるには2cm程度を切開にしてください。
- 脂肪組織の遠位領域と筋肉の境界にある脂肪組織を1回の切開を使用して切断します(図3E-F)。切開のサイズは、脂肪組織の鈍い剥離のための外科用ハサミを挿入するための入り口を開くためだけに約1cmであるべきです。
- 利き手を使用して、外科用ハサミで脂肪組織を鈍く垂直に剥がし、利き手ではない手でBATを含む脂肪組織をつまんでBATを露出させます(図3G)。スルツァーの静脈をランドマークとして使用して、正確なBATの位置を示します。
注: 図3HのBATは、画像のデモンストレーションの目的で完全に露出しています。過度の解剖は、周囲のBATの神経に損傷を与える可能性があります。はさみの方向を誤ると、周囲の筋肉やSULTZERの静脈がBATを排出し、過剰な出血を引き起こす可能性があります。 - 各マウスについて、ハミルトンシリンジ(100 μL、材料表を参照)に接続された鋭利な針(32 G、 材料表を参照)を使用して、40 μLのAAVを両方のBATローブ(BATの1つの葉あたり20 μL)にゆっくりと注入します(100 μL、 材料の表を参照; 図3I)。AAV投与中に注入部位からの漏れがないことで示されるように、注入が成功したことを確認します。
注: 図3IのBATは、画像のデモンストレーションを目的として完全に露出されています。BATローブに投与されるAAV溶液の量は、レシピエントマウスのBATのサイズによって決定される。20 μLのAAV溶液が、体重30 gの通常のC57BL6 / Jマウスの重量約0.05 gの1つのBATローブに適していると判断しました。必要ならば、所望の量を達成するためにウイルス溶液を濃縮する必要があるかもしれない。 - 注入したBATや周辺組織からの出血がないことを確認します。過酸化水素水に浸したガーゼ( 材料の表を参照)を止血のために出血部位に押し付けます。
- 露出した脂肪組織を通常の位置に戻します。5-0吸収性モノフィラメント糸を使用して脂肪組織と筋肉の端を縫います(図3J)。5-0コーティングされたビクリル未染色編組糸で開いた皮膚を縫合します(図3K-L)。
注意: 図4 は、皮をむいた脂肪組織と筋肉を縫う手順を説明しています。 - 完全に回復するまで、手術後、動物を加熱パッドに維持します。動物に食物、水、および営巣のための十分な寝具へのアクセスを提供します。実験開始前の7日間の回復のために、苦痛や病気の兆候がないか定期的に監視してください。
- マウスから解剖したBATにおけるウェスタンブロット解析により標的遺伝子欠失の効率をSugimoto et al.16のように確認した。
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Representative Results
上記の手順を通して、AAV-sgRNAのBATへの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠です。AAV-sgRNAの効果を最大化し、手術中の組織損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元(3D)解剖学的位置を理解することが不可欠です。図3Eに示すように、組織を露出させずにBATの正確な位置を特定することは困難です。ただし、過剰なBAT曝露は組織を損傷する可能性があります(図3H、I)。したがって、限られた解剖学的空間内にAAV溶液を注入する手順を実行する必要があります(図3G)。図5Aは、AAV注射の成功および手術後のマウスの迅速な回復を確実にするために重要である。図5B-Dは、注射の失敗につながる可能性のある潜在的な欠陥を示しています。これらには、AAV溶液の誤った領域への注入(図5B)、組織を通る針の貫通(図5C)、およびAAV溶液の過剰な量による組織バルーニング(図5D)が含まれます。最後に、目的の遺伝子のノックダウン効率は、注入されたマウス16から解剖されたBAT中のタンパク質レベルによって検証される必要がある。例えば、ウェスタンブロットで測定されたBAT中の12-LOXのタンパク質レベルは、AAV8がAlox12(12-LOXをコードする遺伝子)を標的とするsgRNAをUcp1-Cre/Cas9マウスのBATに送達することによる効率的なノックダウンを示しています(以前に発表された研究16の図7bを参照)。
図1:Cas9およびsgRNAを発現するレンチウイルスプラスミドの概略図。 Cas9およびsgRNA用のレンチウイルス発現ベクター(レンチクリスプラv2)。略語:ピューロ=ピューロマイシン選択マーカー;psi + = psiパッケージング信号。RRE = rev 応答要素;cPPT =中央ポリプリン管;EFS =伸長因子-1αショートプロモーター;P2A = 2A自己切断ペプチド;WPRE =転写後調節要素;LTR = 長い終端リピート。LentiCRIPSRv2は BsmBI を使用して消化することができ、アニールされたsgRNAオリゴのペアをシングルガイドRNAスキャフォールドにクローニングすることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:sgRNAを発現するAAVプラスミドの概略図。 sgRNAのためのAAVベクター。略語: ITR = I ターミナルリピート;CB =ハイブリッドCMVエンハンサー/βアクチンプロモーター。pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPは BbsIを用いて消化することができ、アニーリングされたsgRNAオリゴのペアをシングルガイドRNAスキャフォールドにクローニングすることができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの両側BAT葉へのAAV注射の逐次手術。麻酔をかけたマウスは、以下の手順を経た:(A−B)剃毛された皮膚を切断する、(C−D)剃毛した皮膚を鈍く剥離する、(E−F)脂肪組織を切断する、(G)脂肪組織を鈍く剥離する、(H−I)ハミルトンシリンジを用いてAAV溶液をBATローブに注入する、(J)脂肪組織と筋肉の間を縫合する、および(K−L)両方の皮膚フラップの間。注:パネル(H)および(I)では、スルツァーの静脈がBATの正確な位置を確認するためのランドマークです。これら2つのパネルのBATは、画像のデモンストレーションのために完全に公開されました。黄色の点線は、パネルEの脂肪組織と筋肉の境界、およびパネルIの針の先端(つまり注射部位)を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:皮をむいた脂肪組織と筋肉を縫合する手順 。 (A)皮をむいた脂肪組織に注射用の針糸を挿入し、(B)脂肪組織を貫通し、(C)筋肉を引っ掛け、(D)糸を引き上げて皮をむいた脂肪組織と筋肉を縫い合わせ、糸を結紮します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.マウスのBAT葉へのAAV注射の適切および不適切な手段の代表的な写真。(A)この図は、片側BATローブが20μLのAAV溶液の注射を受ける、提案されたAAV注射を表しています。(B-D)次のAAVインジェクションの方法は失敗につながる可能性があります。(B)注射部位が正しくない(すなわち、BATローブがない);(C)針が組織を貫通する。(D)片側BATローブがAAV溶液の80μL注射を受ける、大量のAAV溶液による組織バルーニング。黄色の点線の円は、針の先端(すなわち、注射部位)を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| フォワードオリゴ: 5' CACC-20bp gRNA配列-3' |
| 逆オリゴ:5' AAAC-20bp gRNA逆補体配列-3' |
| 例えば、ターゲット配列がTCTGATAGCGTAGGAGTGATの場合、オリゴは次のようになります。 |
| フォワードオリゴ: 5' CACC TCTGATAGCGTAGGAGTGAT 3' |
| 逆オリゴ: 5' AAAC ATCACTCCTACGCTATCAGA 3' |
表1:sgRNA設計の例。 BsmBI制限部位に対応するオーバーハングを有するsgRNA配列の例。
| 材料名 | 会社 | カタログ番号 | 量 |
| レンチクリスパーv2プラスミド | アドジーン | #52961 | 5μg |
| psPAX2パッケージングプラスミド | アドジーン | #12260 | 3.75 μg |
| pMD2.G エンベローププラスミド | アドジーン | #12259 | 1.5μg |
| オプティMEM無血清培地 | インビトロジェン | #31985 | 250 μl |
表2:レンチクリスプル。 レンチクリスCRISPRv2プラスミドを含むsgRNAをHEK-293細胞にトランスフェクションしてCRISPR-sgRNAレンチウイルスを産生するためのプラスミドカクテル。
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Discussion
肩甲骨間BATへのAAV媒介遺伝子送達のための既存の公開された方法には、BATへのAAV直接注入のための外科的技術とアプローチを説明する詳細な写真とビデオは含まれていません。公表された方法33,34のほとんどにおいて、AAVは、BAT自体ではなく、肩甲骨間BAT周囲の脂肪組織に注入される。したがって、このプロトコルには、研究の成功を決定するいくつかの重要なステップがあります。これらには、sgRNAの設計、AAVパッケージングと濃縮、BAT特異的Cas9マウスの生成、および外科的処置が含まれます。in vivo手順を完了するには、慎重で優れた外科的スキルが必要です。特に、BATを露出させ、AAVを投与しながら組織の損傷を最小限に抑えることが重要です。住居の温度、運動トレーニング、食事などの複数の遺伝的および環境的要因により、BATを取り巻く白色脂肪の量とBAT自体の組成は動物によって異なる場合があります。例えば、肥満マウスはBATを取り囲む広大な白色脂肪組織を示し、熱中性(30°C)で飼育されたマウスは白化したBATを示す。したがって、スキンを開かずにBATの3D位置を正確に決定することは困難です。BATを最小限に明らかにすることは、AAVインジェクションにとって挑戦的ですが重要なステップです。この手順中にBATが過剰にさらされると、交感神経や血管、特にBATに接続されたスルツァー静脈に深刻な損傷を与える可能性があります。
注目すべきことに、組織に注入されるAAVの量も成功の制限要因です。過剰な量の溶液は細胞に有害であり、sgRNAを脂肪細胞に送達するための効率的なウイルス感染を妨げる可能性があります。BATサイズはレシピエントマウスの年齢、性別、および遺伝的背景によって異なるため、最適化実験が必要になる場合があります16,17。この手法は、目的の遺伝子をノックダウンするだけでなく、目的の遺伝子を過剰発現させるためにも適用できます。
この技術の潜在的な落とし穴の1つは、in vitroで効率的なノックアウトを提供するsgRNAを使用しても、in vivoで1つのsgRNAを使用した遺伝子ノックアウトの効率が低いことです。潜在的な解決策として、2つ以上のユニークなsgRNAを1回の注入に組み合わせることで、in vivoでの遺伝子ノックダウンの効率を向上させることができます。
結論として、Ucp1-Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNA技術を組み合わせることで、BAT特異的な遺伝子操作を行うマウスを生成するための堅牢で効率的なシステムが提供されます。この方法は、選択されたCreラインおよび異なる組織への修正AAV注射を使用して、他の組織に適合させることができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究の一部は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK122808、R01DK102898、およびR01DK132469(Y.-H.T.へ)、およびP30DK036836(ジョスリン糖尿病センターの糖尿病研究センターへ)によって支援されました。T. T.は、サンスター・リサーチ・フェローシップ(金田博夫奨学金、サンスター財団)および米国心臓協会助成金903968の支援を受けました。Y.Z.はチャールズA.キングトラストフェローシップによってサポートされました。原稿を校正してくださったショーン・D・コダニに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
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