Summary
Xenogene (kjemiske eller dyreavledede) produkter introdusert i celleterapiforberedelses-/manipulasjonstrinnene er forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og patogen overføring hos vertspasienter. Her beskrives en komplett xenogenfri metode for isolering og in vitro-ekspansjon av humane fettderiverte stamceller.
Abstract
Tatt i betraktning den økende effekten av stamcellebehandling, har biosikkerhetsproblemer blitt reist angående potensiell forurensning eller infeksjonsoverføring på grunn av innføring av animalske avledede produkter under in vitro-manipulasjon . De xenogene komponentene, som kollagenase eller føtalt bovint serum, som vanligvis brukes under celleisolasjons- og ekspansjonstrinnene, kan være forbundet med de potensielle risikoene for immunreaktivitet eller virus-, bakterie- og prioninfeksjon hos de mottakende pasientene. Etter retningslinjer for god produksjonspraksis bør kjemisk vevsdissosiasjon unngås, mens fosterets bovint serum (FBS) kan erstattes med xenogenfrie kosttilskudd. Videre, for å sikre sikkerheten til celleprodukter, er definisjonen av mer pålitelige og reproduserbare metoder viktig. Vi har utviklet en innovativ, helt xenogenfri metode for isolering og in vitro-utvidelse av humane fettavledede stamceller uten å endre egenskapene sammenlignet med kollagenase FBS-dyrkede standardprotokoller. Her ble humane fettavledede stamceller (hASC) isolert fra abdominalt fettvev. Prøven ble mekanisk hakket med saks/skalpell, mikrodissekert og mekanisk dispergert i en 10 cm petriskål, og fremstilt med skalpellsnitt for å lette festingen av vevsfragmentene og migrasjonen av hASCs. Etter vasketrinnene ble hASC valgt på grunn av deres plastiske adherens uten enzymatisk fordøyelse. De isolerte hASCene ble dyrket med medium supplert med 5 % heparinfritt humant blodplatelysat og løsnet med en dyrefri trypsinsubstitutt. Etter god produksjonspraksis (GMP) anvisninger på produksjon av celleprodukter beregnet for human terapi, ble ingen antibiotika brukt i noen kulturmedier.
Introduction
I de siste tiårene har den økende etterspørselen etter innovative terapeutiske behandlinger gitt opphav til betydelig innsats og ressursinvestering i translasjonsmedisinfeltet1. Cellebaserte produkter er forbundet med risiko bestemt av cellekilden, produksjonsprosessen (isolasjon, utvidelse eller genetisk modifisering) og de ikke-cellulære kosttilskuddene (enzymer, vekstfaktorer, kulturtilskudd og antibiotika), og disse risikofaktorene avhenger av den spesifikke terapeutiske indikasjonen. Kvaliteten, sikkerheten og effekten av sluttproduktet kan bli dypt påvirket av de ovenfor angitte elementene2. Stamcelleterapi krever overholdelse av biosikkerhetsprinsipper; Den potensielle risikoen for patogen overføring med animalske avledede produkter i cellekultur kan være problematisk, og grundig testing av ethvert produkt introdusert i produksjonen er viktig3.
Den tradisjonelle metoden for å isolere humane fettavledede stamceller (hASCs) innebærer en enzymatisk fordøyelse utført med kollagenase etterfulgt av vasketrinn gjennom sentrifugering4. Mens enzymatisk isolasjon generelt anses som mer effektiv enn andre mekaniske teknikker når det gjelder celleutbytte og levedyktighet, anses de animalske avledede komponentene som brukes, som kollagenase, mer enn minimalt manipulert av US Food and Drug Administration. Dette betyr at det er en betydelig økt risiko for immunreaksjoner eller sykdomsoverføring, og dermed begrense oversettelsen av hASC-terapi til kliniske innstillinger 5,6.
Trypsinbasert fordøyelse er en annen enzymatisk protokoll for å isolere ASC-er. Ulike teknikker har blitt beskrevet med små modifikasjoner når det gjelder trypsinkonsentrasjon, sentrifugeringshastighet og inkubasjonstid. Dessverre er denne metoden ikke godt beskrevet, og det finnes en mangel på sammenligning i litteraturen, spesielt med de mekaniske isolasjonsprotokollene7. Men når det gjelder oversettbarheten av tilnærmingen, har trypsin de samme ulempene med kollagenase.
Alternative isolasjonsmetoder for å oppnå ASC-er, basert på mekaniske krefter og uten enzymaddisjon, involverer høyhastighets sentrifugering (800 x g eller 1,280 x g, 15 min) av fettvevsfragmentene. Deretter inkuberes pelleten med en lysisbuffer for røde blodlegemer (5 min), etterfulgt av et nytt sentrifugeringstrinn ved 600 x g før resuspensjon i dyrkningsmedium. Til tross for at et større antall celler ble isolert de første dagene sammenlignet med eksplanteringsmetodene, viste en tidligere studie lavere eller fraværende spredning utover den andre uken av kultur8.
Dessuten er ytterligere manipulering med xenogent tilsatt medium, som føtalt bovint serum (FBS), som brukes som et vekstfaktortilskudd for cellekultur, forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og eksponering for virus-, bakterie- eller prioninfeksjoner hos vertspasienten 9,10. Immunreaksjoner og utvikling av urtikariform utslett er allerede beskrevet hos personer som får flere doser mesenkymale stamceller produsert med FBS11. Videre er FBS utsatt for batch-til-batch-variabilitet, noe som kan ha innvirkning på sluttproduktkvaliteten12.
I samsvar med retningslinjer for god produksjonspraksis (GMP) bør enzymatisk vevsdissosiasjon unngås, og FBS bør erstattes med xenogenfrie tilskudd. Disse trinnene, sammen med mer pålitelige og reproduserbare protokoller, er avgjørende for å støtte anvendelsen av celleterapi 3,13.
I denne sammenheng har humant blodplatelysat (hPL) blitt foreslått som en erstatning for FBS siden det er et cellefritt, proteinholdig, vekstfaktorberiket supplement, og det ble tidligere introdusert blant klinisk cellebaserte produkter som et tilsetningsstoff av vekstmedium for in vitro cellekultur og ekspansjon14,15. Siden hPL er et humant avledet produkt, brukes det ofte som en erstatning for FBS under in vitro-kulturen av hASC-er beregnet for kliniske applikasjoner, og reduserer dermed problemer med immunologiske reaksjoner og infeksjoner relatert til FBS-oversettbarhet15,16.
Til tross for de høyere produksjonskostnadene har det allerede blitt påvist at sammenlignet med FBS støtter hPL cellelevedyktighet for mange celletyper, øker spredning, forsinker aldring, sikrer genomisk stabilitet og bevarer den cellulære immunfenotypen selv i sene cellepassasjer; Alle disse elementene støtter overgangen til dette kulturtillegget11.
Målet med dette arbeidet var å utvikle en standardisert protokoll for å isolere og dyrke hASC med en komplett dyrefri metode, uten å endre cellefysiologi og stamhetsegenskaper sammenlignet med klassiske FBS-dyrkede hASCs (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASCs ble isolert fra abdominalt fettvev hos en frisk kvinne som gjennomgikk brystrekonstruksjon ved hjelp av abdominale autologe (deep inferior epigastric perforator flaps, [DIEP]) ved universitetssykehuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Sveits. Den kasserte delen av og fettvevet ble innhentet etter at pasienten signerte informert samtykke. Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av sykehusets Biobank Department DAL (nummer 314 GGC) og etiske komiteer i henhold til Helsinkideklarasjonen.
MERK: Alle trinn må utføres under en avtrekk med laminær luftstrøm og under aseptiske forhold. Hansker og laboratoriefrakker for personlig beskyttelse skal alltid brukes, og alle overflater skal vaskes med passende biocider. Overflødig vev skal kastes på riktig måte som biomedisinsk avfall.
1. Materialer som trengs og forberedelse av kulturløsninger
- For celleisolering, ekspansjon og kryopreservering, oppnå følgende instrumenter: steril saks; sterile skalpeller; steril pinsett; en 10 cm petriskål; 15 ml rør; T25 kolber; et Burker-kammer; kryovialer; en celle frysebeholder; et optisk mikroskop med 4x og 10x forstørrelsesmål; og en svingende bøttesentrifuge.
- For immunfenotyping, oppnå følgende instrumenter og reagenser: FACS-rør, steril fosfatbufret saltvann (PBS); Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM); hPL; dimetylsulfid; og dyrefri trypsin.
- Forbered det komplette dyrkningsmediet ved å supplere DMEM med 5% heparinfri hPL. Oppbevares ved 4 °C i opptil 3 uker, og bruk alltid varmt (mellom romtemperatur og 37 °C). Etter GMP-retningslinjer for produksjon av cellemedisiner beregnet på humanterapi, må du ikke legge til antibiotika til kulturmediet.
- Forbered frysemedium inneholdende 20% hPL og 10% dimetylsulfid i DMEM.
2. Isolering av hASC fra fettvevsprøven
- Behandle fettvevsprøven innen 6 timer etter å ha oppnådd den. Før du går videre til den etablerte mekaniske xenogene frie isolasjonsmetoden, vask vevet 2x med PBS i 10 minutter til bindevev og blod frigjøres.
- Oppbevar den oppnådde fettvevsprøven fra bukplastikkirurgi i PBS ved 4 ° C til behandling og i alle fall ikke lenger enn 24 timer, for ikke å skade hASC-levedyktigheten.
- Klipp fettvevet i mindre biter på ca. 1 cm2 med steril saks.
- Med en skalpell, mikrodissekere hver del i små fragmenter med diametre <5 mm, og spre fem av dem i en 10 cm petriskål (figur 2A).
- For å feste hvert fragment, bruk skalpellen til å lage snitt på plastoverflaten, dra hvert fragment til det sitter fast på petriskålen. Bruk pinsett til å håndtere fragmentet (figur 2B).
- Tilsett forsiktig 10 ml komplett kulturmedium for å dekke alle fragmentene uten å løsne dem.
- Inkuber petriskålene ved 37 °C og 5 % CO2. HASCene vil migrere ut av vevet og bli valgt på grunn av deres plastiske adherens uten enzymatisk fordøyelse.
- Inntil cellekonfluens, overvåke hASC-ekspansjonen under et optisk mikroskop ved 4x forstørrelse en gang per dag. Når hASCene begynner å gå ut av vevet, vises de som små klynger rundt vevsbitene med en typisk fibroblastlignende morfologi. HASC-ene er valgt på grunn av deres evne til å feste seg til plastoverflaten. Hver 72 h, fjern så mye medium som mulig, og erstatt det med friskt komplett medium for å fjerne celleavfall.
- La fragmentene av vev være på plass til den første passasjen av celler, som vanligvis er etter 7 dager.
3. hASC-kultur etter isolasjonsfasen
- Når hASC-kulturen når 70%-80% samløp, er hASC-ene klare til å løsnes og utvides ytterligere for å brukes til andre eksperimenter eller langtidslagring.
- Med steril pinsett, fjern og kast alle biter av vev fra petriskålen. Fjern og kast det utmattede mediet, pass på at du ikke berører hASC-ene for ikke å løsne dem.
- Vask forsiktig cellene en gang med 10 ml PBS. Tilsett 1 ml 1x dyrefri trypsin, og la petriskålen ligge i inkubatoren ved 37 °C i 5 minutter.
- Sjekk under et optisk mikroskop ved 4x forstørrelse hvis alle cellene har løsnet; Ellers la petriskålen stå i ytterligere 2 minutter i inkubatoren, og til slutt banke forsiktig på plastoverflaten for å støtte celleløsningen.
- Stopp trypsinvirkningen ved å legge til 2 ml komplett medium, og samle alle cellene i et 15 ml rør.
- For å fjerne gjenværende trypsin, sentrifuge røret ved 300 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, suspender cellene med 5 ml komplett medium, og overfør cellesuspensjonen til en ny T25-kolbe. Hold hASCene i kultur, og utvid dem til det trengs.
4. Immunfenotypeundersøkelse ved flowcytometri
- Når hASC-kulturen når 70%-80% sammenløp, løsner hASC som tidligere beskrevet i avsnitt 3.
- Etter å ha samlet cellene, suspender dem i 1 ml komplett medium, og telle en alikot med celletelleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- Sentrifuger hASCene ved 300 x g i 5 minutter, og suspender dem ved 1 x 106 celler/ml FACS-buffer. Overfør 100 μl av suspensjonen inneholdende 1 x 105 celler til ett FACS-rør. Bruk ett FACS-rør for hvert undersøkt antigen, pluss ett til for hver isotypisk kontroll.
- Flekk cellene med 100 μL av følgende antistoffer fortynnet i FACS-buffer: anti-CD73 (1:1,000, IgG1, FITC-merket), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-merket); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-merket); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-merket); og isotypiske kontroller for hver fluorofor, IgG1 FITC-merket (1:1 000) og IgG1 PE-merket (1:50).
- Inkuber prøvene i 1 time i mørket under omrøring ved 4 °C. Sentrifuger rørene ved 300 x g i 5 minutter, kast supernatanten og suspender cellene i 500 μL FACS-buffer.
- Vurder celleimmunfenotypen med et flowcytometriinstrument, og registrer 50 000 hendelser for hvert rør innenfor porten som er valgt for å utelukke celleavfall. Beregn prosentandelen av uttrykkende celler som forskjellen fra den spesifikke isotypiske kontrollen.
5. Spredningsanalyse av hASC
- Når hASC-kulturen når 70 %-80 % sammenløp, løsner hASC som beskrevet i avsnitt 3.
- Etter å ha samlet cellene, suspender dem i 1 ml komplett medium, og telle en alikot med celletelleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- Frø 5 x 102 hASCs i 200 μL komplett medium i 96-brønns gjennomsiktige plater. Frø cellene i tekniske replikater, med en brønn for hvert tidspunkt.
- På 3 dager etter såing, begynn å oppdage celleproliferasjonen ved hjelp av et spredningsanalysesett i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt, erstatt kulturmediet med 100 μL ferskt medium tilsatt til 20 μL analysereagens per brønn. Inkuber hASCene i 2,5 timer ved 37 °C, 5 % CO2 for reagensutvikling, og detekter deretter absorbans ved 490 nm med et spektrofotometer.
- Uttrykk hASC-proliferasjonen som prosentvis absorbans etter fjerning av den tomme absorbansen.
6. Kryopreservering og lagring av hASC-ene
- Løsne cellene som beskrevet i avsnitt 3, og tell en alikot med celletelleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter, og kast supernatanten. Suspender cellene med fryseblanding med en tetthet på 1 x 106 hASC / ml, og overfør 1 ml av celleoppløsningen til en kryovial.
- Sett kryovialene ved -80 °C i en frysebeholder som senker temperaturen med 1 °C/min, og flytt deretter kryovialene til flytende nitrogen for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved bruk av isolasjonsmetoden beskrevet ovenfor, ble hASCs vellykket oppnådd fra abdominale fettvevsprøver uten bruk av kollagenase. Videre ble hASCene utvidet i komplette xenogene frie forhold i nærvær av hPL og uten andre komponenter av animalsk opprinnelse. Følgende resultater støtter protokollen og er hentet fra hASC-er dyrket parallelt med hPL og med FBS som kontrollbetingelse.
Etter det første klyngeutseendet viste hASC-ene den klassiske spindellignende formen og var mindre og lengre sammenlignet med kontrollcellene i nærvær av FBS (figur 3). Celleimmunfenotypen evaluert ved flowcytometri syntes å være lik mellom hASCene dyrket med de to kosttilskuddene. Spesielt var mer enn 80 %-90 % av hASCene positive for CD73 17 og CD105 17, og mindre enn 5 % uttrykte CD34 17 og CD45 17 (figur 4). Til slutt viste spredningsanalysen en signifikant økning i cellevekst når hPL ble tilsatt mediet sammenlignet med FBS-kontrollen (figur 5).
Figur 1: Grafisk sammendrag av protokollen. Xenogenfri metode for isolering og in vitro ekspansjon av humane fettavledede stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fettvevsskjæring og såingsprosess for å oppnå hASC i in vitro-kultur . (A) Mikrodisseksjon av fettvevet i fragmenter med diameter <5 mm og spredning av fragmentene i en 10 cm petriskål. (B) Festing til petriskålen etter å ha opprettet snitt på plastoverflaten med en skalpell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: HASCs morfologi. HASCene dyrket i xenogen fri tilstand viste spindellignende form og langstrakt morfologi. HASC-ene dyrket i nærvær av FBS som kontroll var større og hadde en bullseye-form. Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunfenotype av hASCs. Immunfenotypen til hASCene var lik i nærvær av hPL og FBS. Spesielt kan hASC i begge tilstander betraktes som positive for CD73 og CD105 og negative for CD34 og CD45. Feilfeltene angir standardfeilen (n = 3). Forkortelser: hPL = humant blodplatelysat; FBS = føtalt bovint serum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: hASC-spredning. HASCene ekspandert i xenogene frie forhold spredte seg betydelig mer enn de i nærvær av FBS. ** p < 0,01 (signifikans evaluert med Student t-test, n = 3). X-aksen representerer tiden i forhold til antall dager etter såing. Forkortelser: hPL = humant blodplatelysat; FBS = føtalt bovint serum; hASCs = humane fettavledede stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipose-avledede stamceller har tiltrukket seg interessen for translasjonsforskning i det siste tiåret på grunn av deres overflod, raske og rimelige isolasjonsmetoder, høy in vitro / in vivo proliferasjonshastighet og stemness / differensieringsegenskaper18,19,20. Som et resultat anses hASC som en utmerket kandidat for cellebaserte strategier innen regenerativ medisin21. Etter isolering fra fettvev krever hASC ekspansjon in vitro, og i noen tilfeller bør de gjennomgås et differensieringstrinn før de brukes til en spesifikk terapeutisk anvendelse. Hele prosessen, inkludert isolasjon, te in vitro ekspansjon og eventuell differensiering, må gjennomføres i samsvar med GMP-retningslinjene for å redusere eventuelle risikoer fra et oversettelsesperspektiv22,23.
Når det gjelder isolasjonsprosessen, mens de enzymatiske fordøyelses- og sentrifugeringstrinnene raskt gir et høyt antall hASCer på relativt kort tid, har tidligere rapporter vist at disse metodene forårsaker mulige cellefenotypiske endringer når det gjelder klyngedifferensieringsmarkører sammenlignet med andre mekaniske isolasjonsmetoder, og dermed reiser spørsmål om biosikkerhet, celleegenskaper og atferdsproblemer ved bruk av disse hASCene med menneskelige pasienter3 . Videre, for å minimere risikoen knyttet til xenogene komponenter, har nyere studier foreslått å bruke syntetiske enzymer eller mekaniske metoder for å isolere hASCs. Selv syntetiske enzymer kan imidlertid muligens endre celleprofilen og påvirke produktkvaliteten24. Tvert imot kan den eksplantbaserte metoden som er undersøkt her, være et gyldig alternativ for translasjonsformål, siden hASC-ene migrerer ut av vevet og fester seg til plastoverflatene naturlig, uten bruk av xenogene reagenser9. Samtidig må det vurderes at denne metoden viste lavere celleutbytte sammenlignet med den klassiske kollagenaseisolasjonen25.
Når det gjelder tilleggsmediet, basert på nyere litteratur, som er enig i at hPL støtter hASC-utvidelse i høyere grad enn FBS uten å endre hASC-fysiologiske egenskaper 26,27,28,29, erstattet vi det tradisjonelle FBS-tilsatte mediet med hPL16. Ved å støtte cellekulturen med hPL, overvant vi de reduserte celleutbyttene og den langsommere utvinningen relatert til mekanisk isolasjon. Disse mindre manipulerte hASC-ene spredte seg in vitro med en hastighet som tillater utvidelsen som kreves for å nå klinisk relevante volumer på en effektiv og sikker måte30,31. Videre endret ikke kulturen med hPL de stammelignende egenskapene og immunfenotypen som er typisk for hASCs, noe som betyr at den terapeutiske interessen til disse cellene ble opprettholdt.
Så vidt vi vet, mens en rekke eksplantisoleringsprotokoller har blitt beskrevet for ASC-er, er metoden vår den første kombinasjonen av xenogenfri mekanisk isolasjon av ASC-er med hPL-supplert mediumkultur for å oppnå en verdifull cellepopulasjon for translasjonsapplikasjoner.
Dessuten har metoden beskrevet i dette arbeidet noen kritiske aspekter som må beskrives nærmere. For det første bør diametrene til de hakkede fettvevsfragmentene ikke overstige 5 mm for å lette deres vedheft til plastoverflaten og tillate migrering av hASCene ut av vevet. For det andre bør tilstedeværelsen av fettvevsfragmenter i kultur sammen med hASCene som allerede er festet til platen, balanseres, med tanke på forurensningsrisikoen og behovet for et tilstrekkelig antall migrerte celler. For det tredje må forskere være oppmerksomme på en mulig redusert veksthastighet i de første 24 timene etter eksplantsåingen; etter denne perioden stimulerer hPL-tilskuddet cellegjenoppretting og spredning sammenlignet med den klassiske FBS30.
For øyeblikket er det ikke innført ytterligere trinn eller modifikasjoner sammenlignet med den opprinnelige protokollen beskrevet ovenfor.
Avslutningsvis gir den komplette xenogene frie metoden beskrevet her en enkel måte å isolere hASC fra fettvev, inkludert både lipoaspirater og abdominalt fettvev, i fravær av animalske avledede produkter, kjemiske enzymer eller sentrifugeringstrinn. Videre motvirker det hPL-supplerte mediet det resulterende opprinnelige celleutbyttet og forbedrer celleproliferasjonen samtidig som de terapeutiske egenskapene til hASC holdes uendret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen erkjennelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
