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मानव चिकित्सा के लिए एक अभिनव ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि के साथ मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65104
Automatic Translation
*1,4, *2, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Department of Plastic, Reconstructive and Hand Surgery, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV, 2Cell and Tissue Engineering Lab, IRCCS Ospedale Galeazzi Sant'Ambrogio, 3Unit of Regenerative Therapy, Plastic, Reconstructive and Hand Surgery, Department of Musculoskeletal Medicine, Lausanne University Hospital, 4Centre for the Cellular Microenvironment, University of Glasgow
* These authors contributed equally

Summary

सेल थेरेपी तैयारी / हेरफेर चरणों में पेश किए गए ज़ेनोजेनिक (रासायनिक या पशु-व्युत्पन्न) उत्पाद मेजबान रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रोगजनक संचरण के बढ़ते जोखिम से जुड़े हैं। यहां, मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो विस्तार के लिए एक पूर्ण ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि का वर्णन किया गया है।

Abstract

स्टेम सेल थेरेपी के बढ़ते प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, इन विट्रो हेरफेर के दौरान पशु-व्युत्पन्न उत्पादों की शुरूआत के कारण संभावित संदूषण या संक्रमण संचरण के बारे में जैव सुरक्षा चिंताओं को उठाया गया है। ज़ेनोजेनिक घटक, जैसे कोलेजनेज या भ्रूण गोजातीय सीरम, आमतौर पर सेल अलगाव और विस्तार चरणों के दौरान उपयोग किए जाते हैं, जो प्राप्त रोगियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या वायरल, बैक्टीरियल और प्रियन संक्रमण के संभावित जोखिमों से जुड़े हो सकते हैं। अच्छे विनिर्माण अभ्यास दिशानिर्देशों के बाद, रासायनिक ऊतक पृथक्करण से बचा जाना चाहिए, जबकि भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को ज़ेनोजेनिक-मुक्त पूरक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, सेल उत्पादों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की परिभाषा महत्वपूर्ण है। हमने कोलेजनेज एफबीएस-सुसंस्कृत मानक प्रोटोकॉल की तुलना में मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो विस्तार के लिए एक अभिनव, पूरी तरह से ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि विकसित की है। यहां, मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एचएएससी) को पेट के वसा ऊतक से अलग किया गया था। नमूने को यांत्रिक रूप से कैंची / स्केलपेल के साथ काटा गया था, सूक्ष्म-विच्छेदित और यांत्रिक रूप से 10 सेमी पेट्री डिश में फैलाया गया था, और ऊतक के टुकड़ों के लगाव और एचएएससी के प्रवास को सुविधाजनक बनाने के लिए स्केलपेल चीरों के साथ तैयार किया गया था। धोने के चरणों के बाद, एंजाइमेटिक पाचन के बिना उनके प्लास्टिक पालन के कारण एचएएससी का चयन किया गया था। पृथक एचएएससी को 5% हेपरिन-मुक्त मानव प्लेटलेट लाइसेट के साथ पूरक माध्यम के साथ सुसंस्कृत किया गया था और पशु-मुक्त ट्रिप्सिन विकल्प के साथ अलग किया गया था। मानव चिकित्सा के लिए लक्षित सेल उत्पादों के उत्पादन पर अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) निर्देशों के बाद, किसी भी संस्कृति मीडिया में किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग नहीं किया गया था।

Introduction

पिछले दशकों में, अभिनव चिकित्सीय उपचारों की बढ़ती मांग ने ट्रांसलेशनल चिकित्सा क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रयासों और संसाधन निवेश को जन्म दियाहै। सेल-आधारित उत्पाद सेल स्रोत, विनिर्माण प्रक्रिया (अलगाव, विस्तार, या आनुवंशिक संशोधन), और गैर-सेलुलर पूरक (एंजाइम, विकास कारक, संस्कृति की खुराक और एंटीबायोटिक्स) द्वारा निर्धारित जोखिमों से जुड़े होते हैं, और ये जोखिम कारक विशिष्ट चिकित्सीय संकेत पर निर्भर करते हैं। अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता, सुरक्षा और प्रभावकारिता उपरोक्त संकेतित तत्वों से गहराई से प्रभावित हो सकतीहै। स्टेम सेल थेरेपी के लिए जैव सुरक्षा सिद्धांतों के पालन की आवश्यकता होती है; सेल संस्कृति में पशु-व्युत्पन्न उत्पादों के साथ रोगजनक संचरण के संभावित जोखिम समस्याग्रस्त हो सकते हैं, और विनिर्माण में पेश किए गए किसी भी उत्पाद का गहनपरीक्षण आवश्यक है।

मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एचएएससी) को अलग करने की पारंपरिक विधि में कोलेजनेज के साथ किया जाने वाला एक एंजाइमेटिक पाचन शामिल है, जिसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन 4 के माध्यम से धोने के चरणशामिल हैं। जबकि एंजाइमेटिक अलगाव को आमतौर पर सेल पैदावार और व्यवहार्यता के मामले में अन्य यांत्रिक तकनीकों की तुलना में अधिक कुशल माना जाता है, उपयोग किए जाने वाले पशु-व्युत्पन्न घटक, जैसे कोलेजनेज, को अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा न्यूनतम हेरफेर से अधिक माना जाता है। इसका मतलब है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं या रोग संचरण का काफी खतरा बढ़ जाता है, इस प्रकार एचएएससी थेरेपी के अनुवाद को नैदानिक सेटिंग्स 5,6 तक सीमित कर दिया जाता है।

ट्रिप्सिन-आधारित पाचन एएससी को अलग करने के लिए एक और एंजाइमेटिक प्रोटोकॉल है। ट्रिप्सिन एकाग्रता, सेंट्रीफ्यूजेशन गति और इनक्यूबेशन समय के संदर्भ में मामूली संशोधनों के साथ विभिन्न तकनीकों का वर्णन किया गया है। दुर्भाग्य से, इस विधि को अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है, और साहित्य में तुलना की कमी मौजूद है, खासकर यांत्रिक अलगाव प्रोटोकॉल7 के साथ। हालांकि, दृष्टिकोण की ट्रांसलैटेबिलिटी के संदर्भ में, ट्रिप्सिन में कोलेजनेज की समान कमियां हैं।

यांत्रिक बलों के आधार पर और एंजाइम जोड़ के बिना एएससी प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक अलगाव विधियों में वसा ऊतक के टुकड़े के उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन (800 x g या 1,280 x g, 15 मिनट) शामिल हैं। फिर, गोली को लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर (5 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, इसके बाद कल्चर माध्यम में पुन: निलंबन से पहले 600 x g पर एक और सेंट्रीफ्यूजेशन चरण होता है। खोज विधियों की तुलना में पहले दिनों में कोशिकाओं की अधिक संख्या को अलग करने के बावजूद, एक पिछले अध्ययन ने संस्कृति8 के दूसरे सप्ताह से परे कम या अनुपस्थित प्रसार दिखाया।

इसके अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) जैसे ज़ेनोजेनिक जोड़े गए माध्यम के साथ आगे हेरफेर, जिसे सेल कल्चर के लिए विकास कारक पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बढ़ते जोखिम और मेजबान रोगी 9,10 के वायरल, बैक्टीरियल या प्रियन संक्रमणके संपर्क में आने से जुड़ा हुआ है। एफबीएस11 के साथ उत्पादित मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की कई खुराक प्राप्त करने वाले व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और अर्टिकारीफॉर्म रैश विकास का वर्णन पहले से ही किया गया है। इसके अलावा, एफबीएस बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता के अधीन है, जिसका अंतिम उत्पाद गुणवत्ता 12 पर प्रभाव पड़सकता है।

अच्छे विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) दिशानिर्देशों के अनुसार, एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण से बचा जाना चाहिए, और एफबीएस को ज़ेनोजेनिक-मुक्त पूरक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। ये कदम, अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल के साथ, सेल थेरेपी3,13 के आवेदन का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं।

इस संदर्भ में, मानव प्लेटलेट लाइसेट (एचपीएल) को एफबीएस के विकल्प के रूप में सुझाया गया है क्योंकि यह एक सेल-मुक्त, प्रोटीन युक्त, विकास कारक-समृद्ध पूरक है, और इसे पहले नैदानिक-ग्रेड सेल-आधारित उत्पादों के बीच इन विट्रो सेल संस्कृति और विस्तार14,15 के लिए विकास माध्यम के योजक के रूप में पेश किया गया था। चूंकि एचपीएल एक मानव-व्युत्पन्न उत्पाद है, इसलिए इसे अक्सर नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एचएएससी की इन विट्रो संस्कृति के दौरान एफबीएस के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है, इस प्रकार प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं और एफबीएस ट्रांसलैटेबिलिटीसे संबंधित संक्रमणों के बारे में मुद्दों को कम किया जाता है।

उच्च उत्पादन लागत के बावजूद, यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि एफबीएस की तुलना में, एचपीएल कई सेल प्रकारों के लिए सेल व्यवहार्यता का समर्थन करता है, प्रसार बढ़ाता है, शिथिलता में देरी करता है, जीनोमिक स्थिरता का आश्वासन देता है, और देर से सेल मार्ग में भी सेलुलर इम्यूनोफेनोटाइप का संरक्षण करता है; ये सभी तत्व इस संस्कृति पूरक11 की ओर स्विच करने का समर्थन करते हैं।

इस काम का उद्देश्य शास्त्रीय एफबीएस-सुसंस्कृत एचएएससी (चित्रा 1) की तुलना में सेल फिजियोलॉजी और स्टेमनेस गुणों को संशोधित किए बिना, एक पूर्ण पशु-मुक्त विधि के साथ एचएएससी को अलग करने और कल्चर करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित करना था।

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Protocol

एचएएससी को एक स्वस्थ महिला के पेट के वसा ऊतक से अलग किया गया था, जिसने स्विट्जरलैंड के लुसाने, सीएचयूवी, लॉज़ेन के यूनिवर्सिटी अस्पताल में पेट ऑटोलॉगस फ्लैप (गहरे हीन एपिगैस्ट्रिक परफोरेटर फ्लैप, [डीआईईपी]) का उपयोग करके स्तन पुनर्निर्माण किया था। रोगी द्वारा सूचित सहमति पर हस्ताक्षर करने के बाद फ्लैप और वसा ऊतक का छोड़ा हुआ हिस्सा प्राप्त किया गया था। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार अस्पताल के बायोबैंक विभाग डीएएल (संख्या 314 जीजीसी) और नैतिकता समितियों द्वारा सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा और अनुमोदन किया गया था।

नोट: सभी चरणों को एक लामिनार प्रवाह हुड के तहत और सड़न रोकनेवाली स्थितियों के साथ किया जाना चाहिए। व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए दस्ताने और प्रयोगशाला कोट हमेशा पहने जाने चाहिए, और सभी सतहों को उचित बायोसाइड्स के साथ धोया जाना चाहिए। अतिरिक्त ऊतक को बायोमेडिकल कचरे के रूप में ठीक से निपटाया जाना चाहिए।

1. आवश्यक सामग्री और संस्कृति समाधान की तैयारी

  1. सेल अलगाव, विस्तार और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, निम्नलिखित उपकरण प्राप्त करें: बाँझ कैंची; बाँझ स्केलपेल; बाँझ चिमटी; एक 10 सेमी पेट्री डिश; 15 एमएल ट्यूब; टी 25 फ्लास्क; एक बर्कर कक्ष; क्रायोवियल्स; एक सेल फ्रीजिंग कंटेनर; 4x और 10x आवर्धन उद्देश्यों के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप; और एक झूलती बाल्टी सेंट्रीफ्यूज।
  2. इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए, निम्नलिखित उपकरण और अभिकर्मक प्राप्त करें: एफएसीएस ट्यूब, बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस); डलबेको का न्यूनतम आवश्यक माध्यम (डीएमईएम); एचपीएल; डाइमिथाइल सल्फाइड; और पशु मुक्त ट्रिप्सिन।
  3. 5% हेपरिन-मुक्त एचपीएल के साथ डीएमईएम को पूरक करके पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें। माध्यम को 3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और हमेशा गर्म (कमरे के तापमान और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच) का उपयोग करें। मानव चिकित्सा के लिए लक्षित सेल दवाओं के उत्पादन के लिए जीएमपी दिशानिर्देशों का पालन करते हुए, संस्कृति माध्यम में कोई एंटीबायोटिक्स न जोड़ें।
  4. डीएमईएम में 20% एचपीएल और 10% डाइमिथाइल सल्फाइड युक्त फ्रीजिंग माध्यम तैयार करें।

2. वसा ऊतक के नमूने से एचएएससी का अलगाव

  1. इसे प्राप्त करने के 6 घंटे के भीतर वसा ऊतक के नमूने को संसाधित करें। स्थापित यांत्रिक ज़ेनोजेनिक-मुक्त अलगाव विधि पर आगे बढ़ने से पहले, ऊतक 2x को पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए धो लें जब तक संयोजी ऊतक और रक्त जारी न हो जाए।
  2. पीबीएस में एब्डोमिनोप्लास्टिक सर्जरी से प्राप्त वसा ऊतक के नमूने को प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और, किसी भी मामले में, 24 घंटे से अधिक नहीं, ताकि एचएएससी व्यवहार्यता को नुकसान न पहुंचे।
  3. बाँझ कैंची के साथ वसा ऊतक को लगभग 1 सेमी2 के छोटे टुकड़ों में काटें।
  4. एक स्केलपेल के साथ, प्रत्येक टुकड़े को <5 मिमी व्यास के साथ छोटे टुकड़ों में सूक्ष्म-विच्छेदन करें, और उनमें से पांच को 10 सेमी पेट्री डिश (चित्रा 2 ए) में फैलाएं।
  5. प्रत्येक टुकड़े को संलग्न करने के लिए, प्लास्टिक की सतह पर चीरे बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें, प्रत्येक टुकड़े को तब तक खींचें जब तक कि यह पेट्री डिश से मजबूती से चिपक न जाए। टुकड़े को संभालने में मदद करने के लिए चिमटी का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)।
  6. धीरे से 10 एमएल पूर्ण संस्कृति माध्यम जोड़ें ताकि उन्हें अलग किए बिना सभी टुकड़ों को कवर किया जा सके।
  7. पेट्री व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। एचएएससी ऊतक से बाहर चले जाएंगे और एंजाइमेटिक पाचन के बिना उनके प्लास्टिक पालन के कारण चुने जाएंगे।
  8. सेल संगम तक, प्रति दिन एक बार 4x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एचएएससी विस्तार की निगरानी करें। जैसे ही एचएएससी ऊतक से बाहर निकलना शुरू करते हैं, वे एक विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान के साथ ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर छोटे समूहों के रूप में दिखाई देते हैं। एचएएससी को प्लास्टिक की सतह का पालन करने की उनकी क्षमता के कारण चुना जाता है। हर 72 घंटे में, जितना संभव हो उतना माध्यम निकालें, और सेल मलबे को हटाने के लिए इसे ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें।
  9. ऊतक के टुकड़ों को कोशिकाओं के पहले पारित होने तक छोड़ दें, जो आमतौर पर 7 दिनों के बाद होता है।

3. अलगाव चरण के बाद एचएएससी संस्कृति

  1. जब एचएएससी संस्कृति 70% -80% स्थिरता तक पहुंच जाती है, तो एचएएससी अलग होने के लिए तैयार होते हैं और आगे अन्य प्रयोगों या दीर्घकालिक भंडारण के लिए उपयोग किए जाने के लिए विस्तारित होते हैं।
  2. बाँझ चिमटी के साथ, पेट्री डिश से ऊतक के सभी टुकड़ों को हटा दें और छोड़ दें। थके हुए माध्यम को हटा दें और त्याग दें, सावधान रहें कि एचएएससी को न छुएं ताकि उन्हें अलग न किया जा सके।
  3. पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक धो लें। 1x पशु-मुक्त ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें, और पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  4. 4x आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत जांचें यदि सभी कोशिकाएं अलग हो गई हैं; अन्यथा, पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में अतिरिक्त 2 मिनट के लिए छोड़ दें, और अंततः सेल डिटेचमेंट का समर्थन करने के लिए प्लास्टिक की सतह को धीरे से टैप करें।
  5. पूर्ण माध्यम के 2 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन कार्रवाई को रोकें, और सभी कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
  6. किसी भी शेष ट्रिप्सिन को हटाने के लिए, ट्यूब को 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, 5 एमएल पूर्ण माध्यम के साथ कोशिकाओं को निलंबित करें, और सेल निलंबन को एक नए टी 25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। एचएएससी को संस्कृति में रखें, और आवश्यकता होने तक उनका विस्तार करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इम्यूनोफेनोटाइप जांच

  1. जब एचएएससी संस्कृति 70% -80% सामंजस्य तक पहुंच जाती है, तो एचएएससी को अलग कर दें जैसा कि पहले धारा 3 में वर्णित है।
  2. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, उन्हें पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में निलंबित करें, और 10x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल काउंटर के साथ एक एलिकोट की गणना करें।
  3. 5 मिनट के लिए 300 x g पर एचएएससी को सेंट्रीफ्यूज करें, और उन्हें एफएसीएस बफर के 1 x 106 सेल / एमएल पर निलंबित करें। 1 x 105 कोशिकाओं वाले निलंबन के 100 μL को एक FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक जांच किए गए एंटीजन के लिए एक एफएसीएस ट्यूब का उपयोग करें, साथ ही प्रत्येक आइसोटाइपिक नियंत्रण के लिए एक और।
  4. एफएसीएस बफर में पतला निम्नलिखित एंटीबॉडी के 100 μL के साथ कोशिकाओं को दाग दें: एंटी-CD73 (1: 1,000, IgG1, FITC-लेबल), एंटी-CD105 (1: 200, IgG1, PE-लेबल); एंटी-सीडी 34 (1: 66, आईजीजी 1, एफआईटीसी-लेबल); एंटी-सीडी 45 (1: 66, आईजीजी 1, एफआईटीसी-लेबल); और प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए आइसोटाइपिक नियंत्रण, आईजीजी 1 एफआईटीसी-लेबल (1: 1,000) और आईजीजी 1 पीई-लेबल (1: 50)।
  5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और कोशिकाओं को एफएसीएस बफर के 500 μL में निलंबित करें।
  6. फ्लो साइटोमेट्री उपकरण के साथ सेल इम्यूनोफेनोटाइप का आकलन करें, सेल मलबे को बाहर करने के लिए चुने गए गेट के अंदर प्रत्येक ट्यूब के लिए 50,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें। विशिष्ट आइसोटाइपिक नियंत्रण से अंतर के रूप में कोशिकाओं को व्यक्त करने के प्रतिशत की गणना करें।

5. एचएएससी का प्रसार परख

  1. जब एचएएससी संस्कृति 70% -80% सामंजस्य तक पहुंच जाती है, तो धारा 3 में वर्णित एचएएससी को अलग कर दें।
  2. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद, उन्हें पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में निलंबित करें, और 10x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल काउंटर के साथ एक एलिकोट की गणना करें।
  3. 96-अच्छीतरह से पारदर्शी प्लेटों में पूर्ण माध्यम के 200 μL में बीज 5 x 10 2 एचएएससी। कोशिकाओं को तकनीकी प्रतिकृति में बीज दें, प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक अच्छी तरह से।
  4. सीडिंग के 3 दिन बाद, निर्माता के निर्देशों के बाद प्रसार परख किट का उपयोग करके सेल प्रसार का पता लगाना शुरू करें। संक्षेप में, संस्कृति माध्यम को 100 μL ताजा माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें, जिसे प्रति अच्छी तरह से परख अभिकर्मक के 20 μL में जोड़ा जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए एचएएससी को इनक्यूबेट करें, अभिकर्मक विकास के लिए 5% सीओ2 , और फिर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 490 एनएम पर अवशोषण का पता लगाएं।
  5. रिक्त अवशोषण को हटाने के बाद एचएएससी प्रसार को प्रतिशत अवशोषण के रूप में व्यक्त करें।

6. एचएएससी का क्रायोप्रिजर्वेशन और भंडारण

  1. खंड 3 में वर्णित कोशिकाओं को अलग करें, और 10x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल काउंटर के साथ एक एलिकोट की गणना करें।
  2. 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। 1 x 106 hASCs / mL के घनत्व पर फ्रीजिंग मिश्रण के साथ कोशिकाओं को निलंबित करें, और सेल समाधान के 1 एमएल को एक क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
  3. क्रायोवियल्स को एक फ्रीजिंग कंटेनर में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें जो तापमान को 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक कम कर देता है, और फिर क्रायोवियल्स को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में ले जाएं।

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Representative Results

ऊपर वर्णित अलगाव विधि को लागू करते हुए, एचएएससी को कोलेजनेज के उपयोग के बिना पेट के वसा ऊतक के नमूनों से सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था। इसके अलावा, एचएएससी को एचपीएल की उपस्थिति में और पशु मूल के किसी भी अन्य घटक के बिना पूर्ण क्सीनोजेनिक-मुक्त परिस्थितियों में विस्तारित किया गया था। निम्नलिखित परिणाम प्रोटोकॉल का समर्थन करते हैं और एचपीएल के समानांतर और नियंत्रण स्थिति के रूप में एफबीएस के साथ सुसंस्कृत एचएएससी से प्राप्त होते हैं।

प्रारंभिक क्लस्टर उपस्थिति के बाद, एचएएससी ने शास्त्रीय स्पिंडल जैसा आकार दिखाया और एफबीएस की उपस्थिति में नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में छोटे और अधिक लम्बी थे (चित्रा 3)। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया सेल इम्यूनोफेनोटाइप दो पूरक के साथ सुसंस्कृत एचएएससी के बीच समान प्रतीत होता है। विशेष रूप से, 80% -90% से अधिक एचएएससी सीडी 7317 और सीडी 105 17 के लिए सकारात्मक थे, और 5% से कम ने सीडी 34 17 और सीडी 4517 व्यक्त किया (चित्रा 4)। अंत में, प्रसार परख ने सेल वृद्धि में महत्वपूर्ण वृद्धि का खुलासा किया जब एचपीएल को एफबीएस नियंत्रण (चित्रा 5) की तुलना में माध्यम में जोड़ा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का ग्राफिकल सार। मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो विस्तार के लिए ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: इन विट्रो कल्चर में एचएएससी प्राप्त करने के लिए वसा ऊतक काटने और सीडिंग प्रक्रिया। (ए) वसा ऊतक का <5 मिमी व्यास वाले टुकड़ों में सूक्ष्म विच्छेदन और 10 सेमी पेट्री डिश में टुकड़ों का फैलाव। (बी) स्केलपेल के साथ प्लास्टिक की सतह पर चीरे बनाने के बाद पेट्री डिश से लगाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एचएएससी की आकृति विज्ञान। ज़ेनोजेनिक-मुक्त स्थिति में सुसंस्कृत एचएएससी ने एक धुरी जैसी आकृति और लम्बी आकृति विज्ञान दिखाया। नियंत्रण के रूप में एफबीएस की उपस्थिति में सुसंस्कृत एचएएससी बड़े थे और उनके पास एक बुलआई आकार था। स्केल पट्टी 100 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचएएससी का इम्यूनोफेनोटाइप। एचपीएल और एफबीएस की उपस्थिति में एचएएससी का इम्यूनोफेनोटाइप समान था। विशेष रूप से, दोनों स्थितियों में एचएएससी को सीडी 73 और सीडी 105 के लिए सकारात्मक और सीडी 34 और सीडी 45 के लिए नकारात्मक माना जा सकता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि (n = 3) इंगित करती हैं. संक्षेप: एचपीएल = मानव प्लेटलेट लाइसेट; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एचएएससी प्रसार। एचएएससी का विस्तार ज़ेनोजेनिक-मुक्त स्थितियों में एफबीएस की उपस्थिति की तुलना में काफी अधिक हुआ। ** पी < 0.01 (छात्र के टी-टेस्ट के साथ मूल्यांकन किया गया महत्व, एन = 3)। एक्स-अक्ष बीज बोने के बाद के दिनों की संख्या के संदर्भ में समय का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप: एचपीएल = मानव प्लेटलेट लाइसेट; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; एचएएससी = मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं ने पिछले दशक में अपनी प्रचुरता, त्वरित और किफायती अलगाव विधियों, उच्च इन विट्रो / इन विवो प्रसार दर, और स्टेमनेस / भेदभावगुणों 18,19,20 के कारण ट्रांसलेशनल अनुसंधान की रुचि को आकर्षित किया है। नतीजतन, एचएएससी को पुनर्योजी चिकित्सा21 में सेल-आधारित रणनीतियों के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार माना जाता है। वसा ऊतक से अलगाव के बाद, एचएएससी को विट्रो में विस्तार की आवश्यकता होती है और, कुछ मामलों में, एक विशिष्ट चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए उपयोग किए जाने से पहले एक भेदभाव चरण के अधीन किया जाना चाहिए। अलगाव, इन विट्रो विस्तार और अंतिम भेदभाव सहित पूरी प्रक्रिया को जीएमपी दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए ताकि अनुवाद परिप्रेक्ष्य22,23 से किसी भी जोखिम को कम किया जा सके।

अलगाव प्रक्रिया के बारे में, जबकि एंजाइमेटिक पाचन और सेंट्रीफ्यूजेशन चरण अपेक्षाकृत कम समय में उच्च संख्या में एचएएससी उत्पन्न करते हैं, पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि ये विधियां अन्य यांत्रिक अलगाव विधियों की तुलना में क्लस्टर भेदभाव मार्करों के संदर्भ में संभावित सेल फेनोटाइपिकपरिवर्तनों का कारण बनती हैं, इस प्रकार मानव रोगियों के साथ इन एचएएससी को लागू करते समय जैव सुरक्षा, सेल गुणों और व्यवहार संबंधी मुद्दों के बारे में सवाल उठते हैं। . इसके अलावा, ज़ेनोजेनिक घटकों से संबंधित जोखिमों को कम करने के लिए, हाल के अध्ययनों ने एचएएससी को अलग करने के लिए सिंथेटिक एंजाइम या यांत्रिक तरीकों का उपयोग करने का सुझाव दिया है। हालांकि, यहां तक कि सिंथेटिक एंजाइम संभवतः सेल प्रोफाइल को संशोधित कर सकते हैं और उत्पाद की गुणवत्ता को प्रभावित करसकते हैं। इसके विपरीत, यहां जांच की गई खोज-आधारित विधि ट्रांसलेशनल उद्देश्यों के लिए एक वैध विकल्प हो सकती है, क्योंकि एचएएससी ऊतक से बाहर चले जाते हैं और किसी भी ज़ेनोजेनिक अभिकर्मकों के उपयोग के बिना स्वाभाविक रूप से प्लास्टिक कीसतहों का पालन करते हैं। उसी समय, यह माना जाना चाहिए कि इस विधि ने क्लासिक कोलेजनेज अलगाव25 की तुलना में कम सेल उपज का प्रमाण दिया।

पूरक माध्यम के बारे में, हाल के साहित्य के आधार पर, जो इस बात से सहमत है कि एचपीएल एचएएससी शारीरिक गुणों26,27,28,29 को बदले बिना एफबीएस की तुलना में उच्च डिग्री तक एचएएससी विस्तार का समर्थन करता है, हमने पारंपरिक एफबीएस-जोड़े गए माध्यम को एचपीएल16 के साथ प्रतिस्थापित किया। एचपीएल के साथ सेल संस्कृति का समर्थन करते हुए, हमने कम सेल पैदावार और यांत्रिक अलगाव से संबंधित धीमी वसूली पर काबू पा लिया। इन कम-हेरफेर वाले एचएएससी ने एक कुशल और सुरक्षिततरीके से नैदानिक रूप से प्रासंगिक मात्रा तक पहुंचने के लिए आवश्यक विस्तार की अनुमति दी। इसके अलावा, एचपीएल के साथ संस्कृति ने स्टेम जैसी विशेषताओं और एचएएससी के विशिष्ट इम्यूनोफेनोटाइप को नहीं बदला, इस प्रकार इन कोशिकाओं के चिकित्सीय हित को बनाए रखा गया था।

हमारे ज्ञान के अनुसार, जबकि एएससी के लिए विभिन्न प्रकार के खोज अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, हमारी विधि ट्रांसलेशनल अनुप्रयोगों के लिए एक मूल्यवान सेल आबादी प्राप्त करने के लिए एचपीएल-पूरक माध्यम संस्कृति के साथ एएससी के जेनोजेनिक-मुक्त यांत्रिक अलगाव का संयोजन है।

इसके अलावा, इस काम में वर्णित विधि में कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं जिन्हें आगे विस्तृत करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, प्लास्टिक की सतह पर उनके आसंजन को सुविधाजनक बनाने और ऊतक से बाहर एचएएससी के प्रवास की अनुमति देने के लिए कीमा वाले वसा ऊतक के टुकड़ों का व्यास 5 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए। दूसरे, संदूषण जोखिम और पर्याप्त संख्या में माइग्रेटेड कोशिकाओं की आवश्यकता को ध्यान में रखते हुए, प्लेट से पहले से जुड़े एचएएससी के साथ संस्कृति में वसा ऊतक के टुकड़ों की उपस्थिति को संतुलित किया जाना चाहिए। तीसरा, शोधकर्ताओं को खोज बीजारोपण के बाद पहले 24 घंटे में संभावित कम वृद्धि दर के बारे में पता होना चाहिए; समय की इस अवधि के बाद, एचपीएल पूरक क्लासिक एफबीएस30 की तुलना में सेल रिकवरी और प्रसार को उत्तेजित करता है।

फिलहाल, ऊपर वर्णित मूल प्रोटोकॉल की तुलना में कोई और कदम या संशोधन पेश नहीं किया गया है।

अंत में, यहां वर्णित पूर्ण ज़ेनोजेनिक मुक्त विधि पशु-व्युत्पन्न उत्पादों, रासायनिक एंजाइमों या सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों की अनुपस्थिति में, लिपोएस्पिरेट और पेट वसा ऊतक दोनों सहित वसा ऊतक से एचएएससी को अलग करने का एक सरल तरीका प्रदान करती है। इसके अलावा, एचपीएल-पूरक माध्यम परिणामी प्रारंभिक सेल कम उपज को संतुलित करता है और एचएएससी के चिकित्सीय गुणों को अपरिवर्तित रखते हुए सेल प्रसार को बढ़ाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों के पास कोई स्वीकृति नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tubes euroclone et5015b
anti-CD105 BD Biosciences BD560839
anti-CD34 BD Biosciences BD555821
anti-CD45 BD Biosciences BD555482
anti-CD73 BD Biosciences BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) Miltenyi 130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) BD accuri -
Burker chamber Blaubrand 717810
Cell freezing container corning CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega G3582
CoolCell Freezing container Corning CLS432002
Cryovials clearline 390701
Dimethyl sulfide Sigma Aldrich D2650-100mL
disposabile blade scalpel paragon bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose GIBCO 11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade) Stemulate PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer Tecan -
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives Olympus CKX41
Petri dish 10 cm Greiner bio-one 664160
Sterile scalpels Reda 07104-00
Sterile scissors Bochem 4071
Sterile tweezers Bochem 1152
Swinging bucket centrifuge Sigma 3-16K
T25 flasks Greiner bio-one 6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute) GIBCO 12604-013

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चिकित्सा अंक 192
मानव चिकित्सा के लिए एक अभिनव ज़ेनोजेनिक-मुक्त विधि के साथ मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति
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