一种用于评估变应性接触性皮炎的小鼠耳部模型

摘要

本文介绍了使用1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）在小鼠耳部诱导过敏性接触性皮炎的方法，以及评估过敏性接触性皮炎严重程度的方法。

摘要

皮肤是人体抵御外界环境的第一道防线，也是最易暴露于环境化学物质的器官之一。变应性接触性皮炎（ACD）是一种常见的皮肤疾病，临床表现为局部皮疹、红斑及皮肤损伤。ACD的发生与发展受到遗传和环境因素的共同影响。尽管近年来许多学者已构建了一系列ACD模型，但这些模型的实验方案各不相同，导致读者难以准确建立。因此，建立一个稳定且高效的动物模型对于进一步研究特应性皮炎的发病机制具有重要意义。本研究详细阐述了一种使用1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）诱导小鼠耳部出现ACD样症状的建模方法，并介绍了在建模过程中评估皮炎严重程度的多种检测手段。该实验方案已在部分实验中成功应用，对ACD研究领域具有一定的推广价值。

引言

变应性接触性皮炎（ACD）是一种常见的皮肤疾病，其特征是在接触部位出现类似湿疹的症状，在中度病例中表现为水肿和红斑，在重度病例中则可出现丘疹、糜烂、渗出，甚至大面积瘢痕¹。该病影响高达20%的人群，可发生于任何年龄段²。ACD常发生于反复接触过敏原的个体，可由个体对其家庭或工作场所中一种或多种过敏原的免疫反应所引发³。IV型迟发型超敏反应被认为是ACD中主要的免疫反应类型⁴。在反复接触过敏原的皮肤区域，循环的记忆T细胞大量积聚，并诱导免疫和炎症反应^3,5,6。本研究的目的是提出一种可靠的实验室技术，以进一步探究ACD发生过程中的免疫和炎症反应。

变应性接触性皮炎（ACD）的发病通常由反复接触化学物质引起的接触性超敏反应所致。在过去几十年中，众多研究人员已在家鼠^7,8、豚鼠^9,10及其他动物中建立了多种ACD动物模型，以模拟该疾病的发病过程。大多数实验方法包括两个阶段：腹部致敏（诱导期）和背部或耳廓激发（激发期）。常用的化学物质主要包括1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）/1-氯-2,4-二硝基苯（DNCB）^8,9,11、唑酮¹²、漆酚¹³等。其中，DNFB和DNCB应用最为广泛，最早于1958年10月被报道¹⁰。镍致敏模型¹⁴和光变应性接触性皮炎模型¹⁵也常被使用。

我们提出了一种构建过敏性接触性皮炎（ACD）模型的实验方法。该方法在以往研究的基础上，结合多次实验比较进行了总结与优化。与其他ACD模型相比，本模型具有一些优势，如个体差异小、实验周期短、化学刺激物用量少等。此外，本研究适用于小鼠，不仅经济实惠，而且在基因敲除或转基因小鼠制备方面具有更多选择¹⁶。我们还描述了实验中用于监测ACD进展的多种方法，例如测量耳部厚度、使用伊文思蓝染料评估炎症渗出等。该模型不仅可通过实验室手段分析小鼠耳组织、血液、脾脏等样本，以探讨ACD的发病机制，还可用于新疗法的临床前评价，具有一定推广意义。

方案

所有小鼠的护理和处理均遵循扬州大学机构动物护理和使用委员会制定的指南，并已获得该项目许可证 SYXK(SU)2022-0044 下机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用6至8周龄的BALB/c雄性和雌性小鼠。每组包含六只小鼠（见材料表）。笼子置于温度受控的环境（22 ± 2 °C，12小时光照/黑暗循环）中，小鼠可自由获取食物和水。实验流程图见图1。

1. 动物准备

1. 在环境适应1周后开始建模。
2. 操作小鼠前，使用紫外线灯和75%酒精消毒剂对环境和操作台面进行清洁和消毒。
   注意：为避免外界因素的干扰，不能在小鼠耳部进行标记以供识别；可选择在背部或尾部进行染色作为替代方法。
3. 使用小棉签将肥皂水涂抹于小鼠腹部（面积约1-2 cm²）。在建模开始时（第0天；图2A），沿毛发生长方向使用刀片或剃毛器（见材料表）剃除该区域毛发。
   注意： 使用直剃刀片脱毛需要熟练的操作者。若操作不当，可能引起皮肤刺激。建议考虑使用脱毛膏、电动剪毛器或安全剃刀进行脱毛。
4. 称量小鼠体重，并比较各组之间的体重变化。

2. 腹部致敏刺激

1. 确保剃除腹部皮肤毛发所引起的轻微损伤完全恢复。在剃毛后第2天（即第2天）进行腹部致敏处理。
2. 配制0.5% DNFB溶液：将DNFB用丙酮与橄榄油按4:1比例混合的溶剂溶解（例如，400 µL丙酮与100 µL橄榄油混合；参见材料表）。使用移液枪吹打混合20次，使DNFB溶液充分混匀。每次向小鼠给药前，需再次吹打混合3至5次。
   注意：DNFB溶液需现用现配，并用铝箔包裹避光保存，避免直接暴露于阳光下。
3. 使用移液器将25 µL的0.5% DNFB溶液滴加至小鼠腹部剃毛区域的皮肤上（图2B）。
4. 将DNFB溶液滴加于腹部剃毛区域中央，并用移液器吸头的光滑面轻轻涂抹，使其均匀分布。
5. DNFB刺激后30秒，将小鼠放入无垫料的空笼中，防止其蹭掉溶液。待DNFB溶液完全干燥（约2分钟）后，将小鼠放回原笼。
6. 操作DNFB溶液时应佩戴手套，因其对人类皮肤具有强烈刺激性。

3. 耳部致敏刺激

1. 按上述方法制备0.2% DNFB溶液、溶剂溶液（丙酮与橄榄油按4:1比例混合）以及纯水。
2. 固定小鼠体位，使耳廓外缘在整个操作过程中朝下，以防止DNFB刺激时溶液进入耳道。
3. 在第4、6、8和10天，使用移液器将20 µL的0.2% DNFB溶液或溶剂溶液缓慢且均匀地涂抹于小鼠左侧耳廓内表面。为避免DNFB溶液进入耳道，给药时应使用移液器吸头的光滑面轻轻涂布。右侧耳朵不做处理（图2C）。
4. 等待DNFB溶液完全干燥后，将小鼠放回笼中（约30秒）。
5. 操作DNFB溶液时应佩戴手套。

4. 记录小鼠体重和过敏性结膜炎症状

1. 每天称量小鼠体重，开始 第1天的体重与其第0天的体重进行比较； 评估ACD对小鼠体重的影响，以体重变化（g）± 平均值的标准误（SEM）表示。
2. 从第1天开始，每2天拍摄一次小鼠耳朵的高分辨率照片，以记录ACD临床症状。

5. 耳廓厚度的测量

1. 从第1天开始，每2天测量一次耳廓厚度。详细测量并记录双耳数据。
2. 使用游标卡尺（见材料表）每天在同一时间测量耳廓厚度，以获得准确结果（图3A）。当感到轻微阻力时即停止游标卡尺继续向内夹紧，以避免对小鼠耳朵组织造成损伤。保持测量位置固定，并记录数据。
3. 在每侧耳廓的三个不同位置采集厚度数据（图3B）。将三个数据的平均值记录为有效值。以微米（µm）±均值标准误（SEM）评估耳肿胀程度。

6. 炎症性肿胀程度的评估

1. 配制0.5%伊文思蓝染料（参见 材料表伊文思蓝溶液：在第11天用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释伊文思蓝染料。操作时需始终穿戴实验服和手套，因为伊文思蓝染料对人类具有轻微毒性。
2. 使用固定器固定小鼠： 打开固定器的盖子（参见 材料表), 抓住小鼠尾巴，使小鼠头部朝向固定器，令小鼠本能地爬入固定器内。盖上盖子，使小鼠尾巴从盖子上的孔中穿出，并调节固定器长度，以完全暴露小鼠尾巴。
3. 用酒精棉球反复擦拭尾部，或将尾部浸入温水中30秒，轻轻捏住尾根部以充盈并扩张两侧静脉。在冷光源照射下进行注射。
4. 使用1 mm胰岛素针头将伊文思蓝染料溶液缓慢注入小鼠尾静脉。等待15分钟后，拍摄小鼠耳朵的图像。
   注意： ​将小鼠放在桌面上并轻轻固定 暴露耳部区域以进行图像采集。注射伊文思蓝染料溶液后不久并观察 相应的指征下，采用颈椎脱位法处死小鼠。

结果

在反复的DNFB刺激下，DNFB组小鼠耳朵表现出明显的临床症状，类似于变应性接触性皮炎（ACD），敏感区域出现红斑、干燥，甚至糜烂和渗出等典型症状。然而，耳部给予纯水（对照组）或溶剂对照（赋形剂组）均未产生类似症状（图4）。

同时，在DNFB组中，与未经处理的右耳相比，左耳在DNFB刺激后厚度显著增加（图5A），而对照组和溶剂组之间无显著差异（图5B）。DNFB组小鼠在建模第11天注射伊文思蓝染料后，左耳明显变为深蓝色，肉眼可见其与右耳的差异；然而，对照组和溶剂组小鼠的左右耳颜色大致相同（图5C）。

此外，还分析了小鼠的体重变化。DNFB或单纯赋形剂刺激使小鼠体重增长略有减缓。图6A），但并未导致显著的体重减轻（

讨论

本文所述在小鼠耳部诱导接触性皮炎样症状的方案可用于研究接触性皮炎的病理生理机制，并可作为新药研发的筛选工具。

建立ACD模型有两个关键步骤：初次致敏和后续刺激。初次致敏通常选择腹部作为部位，而后续刺激部位的选择则略有不同。以往研究表明，大多数学者倾向于使用DNFB/DNCB或唑酮等化学致敏剂在小鼠背部或颈部建立ACD模型，且不可避免地需要使用刀片或剃毛器对建模区域进行脱毛^17,18,19。然而，该步骤容易破坏皮肤屏障，影响后续实验结果。此外，由于颈背部区域面积较大且受周围毛发影响，滴加的药物难以均匀分布，且容易被邻近毛发吸收。

在本实验方案中，我们发现对小鼠耳廓内表面进行操作以实施后续刺激，能够缓解上述部分问题，有助于建立稳定且高度可重复的过敏性接触性皮炎（ACD）模型。根据我们多次重复的实验²⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）	Merck	200-734-3	1-氟-2,4-二硝基苯，≥99%
丙酮	国药集团化学试剂有限公司	10000418	≥99.5%
铝箔	Cleanwrap	CF-2
伊文思蓝染料	Solarbio	314-13-6	染料含量约 80%
小鼠固定器	ZHUYANBANG	GEGD-SM1830
橄榄油	Solarbio	8001-25-0	500 ml
移液器吸头	Biofount	FT-200	10 - 200 μl
移液器	Eppendorf AG	3123000250	20 - 200 μl
剃须刀片	上海吉列有限公司	74-S
游标卡尺	德力西电气	DECHOTVCS1200