Summary
在这里，我们描述了通过1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）诱导小鼠耳朵过敏性接触性皮炎的方法以及如何评估过敏性接触性皮炎的严重程度。
Abstract
皮肤是人体的第一道防线，也是最容易受到环境化学物质影响的器官之一。过敏性接触性皮炎（ACD）是一种常见的皮肤病，表现为局部皮疹、发红和皮肤病变。ACD的发生和发展受遗传和环境因素的影响。虽然近年来许多学者构建了一系列ACD模型，但这些模型的实验方案各不相同，这使得读者很难很好地建立它们。因此，稳定高效的动物模型对进一步研究特应性皮炎的发病机制具有重要意义。在这项研究中，我们详细介绍了一种使用1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）在小鼠耳朵中诱导ACD样症状的建模方法，并描述了几种在建模过程中评估皮炎严重程度的方法。该实验方案已在部分实验中成功应用，在ACD研究领域具有一定的促进作用。
Introduction
过敏性接触性皮炎（ACD）是一种常见的皮肤病，其特征是接触部位出现湿疹样症状，中度病例出现水肿和红斑，严重病例出现丘疹、糜烂、渗出甚至大面积疤痕1。它影响多达 20% 的人口，并且可以影响任何年龄的人2。ACD通常发生在反复接触过敏原的个体中，可能是由个体对家中或工作场所的一种或多种过敏原的免疫反应引起的3。IV型迟发性超敏反应被认为是ACD4的主要免疫反应类型。在反复暴露于过敏原的皮肤区域，循环记忆T细胞大量积累并诱导免疫和炎症反应3，5，6。这项工作的目的是提出一种可靠的实验室技术，用于进一步研究ACD发展中的免疫和炎症反应。
ACD 的发作通常是由于反复接触化学品引起的接触超敏反应。在过去的几十年中，许多研究人员在家鼠7，8，豚鼠9，10和其他动物中开发了各种ACD动物模型，以模拟疾病的发作。大多数实验方法包括两个阶段：腹部致敏（诱导）和在背部或耳垂上提供刺激（刺激）。常用化学物质主要有1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）/1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）8，9，11、噁唑啉酮12、漆酚13等。其中，DNFB和DNCB应用最广泛，首次报道于1958年10月10。镍敏化模型14和光过敏性接触性皮炎模型15也经常使用。
我们提出了一种构建ACD模型的实验方法。该方法在前人研究的基础上，与多个实验进行了对比，对该方法进行了总结和优化。与其他ACD模型相比，该模型具有一些优点，如个体差异小，实验周期短，化学刺激量小等。此外，本研究适用于小鼠，不仅经济，而且在基因敲除或转基因小鼠制备方面有更多的选择16。我们还描述了用于监测实验中ACD进展的各种方法，例如测量耳朵厚度，使用埃文斯蓝染料测量炎症渗出等。该模型不仅可以通过实验室手段分析小鼠耳朵、血液、脾脏等样本，探索ACD的发病机制，而且适用于新治疗方法的临床前评价，具有一定的推广意义。
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Protocol
小鼠的所有护理和治疗均符合扬州大学机构动物护理和使用委员会制定的指导方针，并经机构动物护理和使用委员会批准，项目许可证为SYXK（SU）2022-0044。本研究使用6-8周龄的BALB / c雄性和雌性小鼠。每组由六只小鼠组成（见 材料表）。将笼子放置在温度受控室（22±2°C，12小时光照/黑暗循环）中，自由获取食物和水。实验流程图如图 1所示。
1. 动物制备
- 适应环境 1 周后开始建模。
- 在操纵小鼠之前，使用紫外线灯和75%酒精消毒剂清洁和消毒环境和台面。
注意：为避免外界因素的影响，不能在鼠标耳朵上对小鼠进行标记以进行识别;背部或尾部染色可用作替代方法。 - 使用小棉签将肥皂水涂抹在小鼠的腹部（约1-2cm2大小）。在建模开始时（第0天;图2A）。
注意：使用直剃须刀片脱毛需要熟练的操作人员。如果操作不正确，可能会引起皮肤刺激。考虑使用脱毛膏、剪刀或安全剃须刀脱毛。 - 称量鼠标并比较每组之间的重量变化。
2.腹部致敏刺激
- 确保剃须引起的腹部皮肤任何轻微损伤完全恢复。剃须后 2 天（第 2 天）进行腹部致敏。
- 制备0.5%DNFB溶液：用丙酮：橄榄油混合物以4：1的比例稀释DNFB（例如，400μL丙酮与100μL橄榄油混合;见 材料表）。使用移液枪吹气并混合20次，以彻底混合DNFB溶液。在每次向小鼠施用DNFB溶液之前，吹气并混合三到五次。
注意：使用前准备溶液并将其包裹在铝箔中，以防止阳光直射。 - 用移液器将25μL的0.5%DNFB溶液涂在小鼠腹部剃光区域的皮肤上（图2B）。
- 将DNFB溶液滴在腹部剃须区域的中间，并用移液器吸头的光滑侧轻轻涂抹以均匀分散。
- 在DNFB刺激后30秒，将小鼠放在没有垫料的空笼子中，以防止它们擦掉DNFB溶液。当DNFB溶液完全干燥（约2分钟）时，将小鼠放回原来的笼子。
- 处理DNFB溶液时戴手套，因为它对人体皮肤有强烈刺激性。
3.耳敏化刺激
- 如上所述制备0.2%DNFB溶液，载体溶液（丙酮和橄榄油的4：1混合物）和纯水。
- 在整个手术过程中，定向小鼠身体并使耳廓的外缘朝下，以防止溶液在DNFB刺激期间进入耳道。
- 在第 4、6、8 和 10 天，使用移液器将 20 μL 的 0.2% DNFB 溶液或载体溶液缓慢均匀地涂在小鼠左耳廓的内表面上。为避免DNFB溶液进入耳道，请在给药期间使用移液器吸头的光滑侧轻轻分配DNFB溶液。让右耳未经治疗（图2C）。
- 等到DNFB溶液干燥，将小鼠放回笼中（约30秒）。
- 处理DNFB溶液时戴手套。
4.记录小鼠体重和ACD症状
- 每天称量小鼠，从第1天开始，并在第0天与其相应的重量进行比较;评估ACD对小鼠体重的影响，作为体重变化（g）±平均值的标准误差（SEM）。
- 从第1天开始，每2天拍摄小鼠耳朵的高分辨率照片以记录ACD临床症状。
5. 耳廓厚度的测量
- 从第 1 天开始，每 2 天测量一次耳廓厚度。详细测量和记录双耳。
- 使用游标卡尺（见 材料表）每天在同一时间测量耳廓厚度以获得准确的结果（图3A）。当有轻微堵塞时，停止游标卡尺继续向内夹紧，以防止组织对小鼠耳朵造成损害。保持位置固定并记录数据。
- 从每个耳廓上的三个不同位置收集厚度（图3B）。将三个数据的平均值记录为有效值。以微米 （μm） 为单位评估耳朵肿胀±平均值的标准误差 （SEM）。
6.炎症肿胀程度的评估
- 制备0.5%埃文斯蓝染料（见 材料表）溶液：在第11天用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释埃文斯蓝染料。始终穿上实验室外套和手套，因为埃文斯的蓝色染料对人体有轻微毒性。
- 用固定器固定小鼠：打开固定器的盖子（见 材料表），握住鼠标尾巴，使鼠标的头部面向固定器，使鼠标本能地爬进固定器。盖上盖子，使鼠标尾巴从盖子上的孔中出来，并调整固定器的长度以露出整个鼠标尾巴。
- 用酒精棉球反复擦拭尾巴或用温水浸泡30秒，轻轻捏住尾巴根部，填充和扩张两侧静脉。在冷光源的照射下进行注射。
- 使用1毫米胰岛素针将埃文斯蓝色染料溶液缓慢注射到小鼠尾静脉中。等待15分钟，然后拍摄鼠标耳朵的照片。
注意：将鼠标放在桌子上并轻轻握住它以暴露耳朵区域以进行图像采集。注射埃文斯蓝染料溶液并观察相应适应症后不久，使用颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
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Representative Results
在反复的DNFB刺激下，DNFB组小鼠耳朵表现出与ACD相当的明显临床症状，敏感区域表现出发红、干燥甚至侵蚀渗出的典型症状。然而，耳部给予纯水（对照组）或溶剂对照（载体组）没有产生类似的症状（图4）。
同时，在DNFB组中，与未经治疗的右耳相比，DNFB刺激后左耳的厚度显着增加（图5A），而对照组和载体组没有显着差异（图5B）。DNFB组小鼠的左耳在建模第11天注射Evans蓝色染料后明显变为深蓝色，与右耳在视觉上有所不同。然而，对照组和载体组中小鼠的左耳和右耳颜色大致相同（图5C）。
此外，还分析了小鼠的体重变化。DNFB或简单的载体刺激使小鼠体重增加略有减慢（图6A），但没有导致显着的体重减轻（图6B）。同时，在处死小鼠后立即分离脾脏。根据小鼠体重和脾脏重量计算脾脏指数;计算公式如下：
脾脏指数=脾脏重量（g）/体重（g）×100
结果表明，小鼠耳朵中重复DNFB刺激导致脾脏肿大（图6C）和脾脏指数升高（图6D），而载体组中小鼠的脾脏指数没有显着变化。证明在DNFB刺激下，DNFB组小鼠免疫应答功能亢进。
图1：ACD成型时间轴示意图。 箭头表示在相应时间执行的操作。涉及的相关操作包括剃须、敏化、耳廓测量、称重、拍照和埃文斯蓝染料应用。缩写：DNFB = 1-氟-2，4-二硝基苯。 请点击此处查看此图的大图。
图2：ACD模型建立的操作方法 。 （A）腹部剃须的操作。（B）腹部致敏刺激的操作。（C）操纵耳敏化刺激。 请点击此处查看此图的大图。
图3：耳肿胀的评估方法 。 （A）操纵小鼠的耳朵厚度测量。（B）小鼠耳厚测量部位。 请点击此处查看此图的大图。
图4：DNFB给药随时间对小鼠耳朵影响的代表性图片 。 （A）对照组。（二）车辆组。（C） DNFB集团。 请点击此处查看此图的大图。
图5：DNFB给药对小鼠耳肿胀的影响 。 （A）建模期间小鼠左耳和右耳之间的耳朵厚度差异。（B）建模结束时各组小鼠左耳和右耳厚度比较。（C）DNFB给药对小鼠耳血管通透性的影响。（n = 6. ***p < 0.001，右耳和左耳的比较;N.S. = 无显著性）。所有数据均表示为SEM±平均值。 使用未配对学生的t检验或邓内特检验的单因素方差分析来分析组间不同的治疗分析。 小于 0.05 的 p 值被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。
图6：DNFB给药对小鼠体重和脾脏指数的影响 。 （A）建模过程中各组小鼠的体重变化。（B）比较第11天每组小鼠的体重变化。（C）每组小鼠脾脏大小的比较。（D）小鼠组间脾脏指数比较。（n = 6.*p < 0.05，与对照组相比;N.S. = 无显著性）。所有数据均表示为SEM±平均值。 使用未配对学生的t检验或邓内特检验的单因素方差分析来分析组间不同的治疗分析。 小于 0.05 的 p 值被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述的用于诱导小鼠耳朵中ACD样症状的方案可用于研究ACD的病理生理学，并作为开发新药的筛选工具。
建立ACD模型有两个关键步骤：初始致敏和随后的刺激。腹部通常是初始致敏的部位，但随后的刺激部位的选择略有不同。以往的研究表明，大多数学者选择使用DNFB/DNCB或恶唑酮等化学敏化剂在小鼠背部或颈部建立ACD模型，难免要使用刀片或修剪器来挖掘小鼠17，18，19的建模区域。但是，这一步很容易破坏皮肤屏障，影响后续的实验。此外，由于颈背面积大和周围头发的影响，滴落的药物难以均匀分布，很容易被附近的头发吸收。
在这个实验方案中，我们发现在小鼠耳廓内表面执行后续刺激的操作使我们能够减轻上述一些麻烦，有助于建立一个稳定且高度可重复的ACD模型。根据我们重复的实验20，我们还优化和调整了敏化刺激的间隔和实验周期。按照给定的实验方法，在第10天可以获得非常明显的建模效果。此外，由于建模区位于耳廓相对独立的内侧，外部因素对其干扰较小，因此本实验中同一实验组小鼠ACD的严重程度差异较小。
这个实验方案也有一些缺点。首先，应谨慎在耳朵上涂抹化学敏化剂，避免化学物质进入耳道并伤害小鼠。其次，ACD模型经常被用作研究小鼠慢性瘙痒的手段。在小鼠颈背上建立的ACD模型中，可以直观地观察到小鼠的抓挠发作，并由此测量小鼠瘙痒症状的严重程度。虽然在我们的实验中也观察到了小鼠的抓挠行为，但小鼠也有自发的耳朵清洁习惯，因此很难与病理性的抓挠行为区分开来。这限制了该模型在观察ACD诱导的刮擦行为方面的使用。该方案是否适用于此类研究有待进一步的实验验证。
为了跟踪ACD的病理过程，采用了多种监测方法，如临床耳部症状、耳厚测量和血管通透性反射。这些病理指标在耳朵中比在颈部和背部皮肤中更明显。测量鼠标的耳朵厚度时，由于鼠标挣扎行为和耳朵厚度不均匀，会发生测量误差。为了减少测量误差，应在每只耳朵的三个不同位置进行测量。通过注射Evans染料来评估建模区域的血管通透性，可以看到皮炎的严重程度，然而，这也需要尾静脉注射的高成功率。如果需要进一步的比较分析，可以测定小鼠耳组织匀浆上清液的吸光度。
还值得一提的是，在我们之前的研究20中，耳朵组织结构组织良好，受其他紊乱组织结构（例如毛囊）的影响较小，而不是颈部和背部皮肤组织，这导致选择该区域进行研究。
综上所述，本文描述的ACD模型是一种稳定高效的建模方法，值得在后续的过敏性接触性皮炎研究中推广。
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Disclosures
作者报告这项工作没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（NSFC）对N.-N的支持。Y. （81904212）;江苏省中医药科技项目（YB201995）;以及国家博士后科研人员专项资助项目（2020T130562）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
- Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
- Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
- Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
- Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J.
- Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
- Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
- Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
- Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
- Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
- Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
- Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
- Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
- Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
- Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
- Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397 (2022).
- Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
- Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
- Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237 (2021).
- Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023 (2023).
