Summary
Aqui, descrevemos os métodos de indução de dermatite alérgica de contato em orelhas de camundongos pelo 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB) e como avaliar a gravidade da dermatite alérgica de contato.
Abstract
A pele é a primeira linha de defesa do corpo humano e um dos órgãos mais expostos aos produtos químicos ambientais. A dermatite alérgica de contato (DCA) é uma doença de pele comum que se manifesta como erupção cutânea local, vermelhidão e lesões cutâneas. A ocorrência e o desenvolvimento da DCA são influenciados por fatores genéticos e ambientais. Embora muitos estudiosos tenham construído uma série de modelos de DCA nos últimos anos, os protocolos experimentais desses modelos são todos diferentes, o que torna difícil para os leitores estabelecê-los bem. Portanto, um modelo animal estável e eficiente é de grande importância para aprofundar o estudo da patogênese da dermatite atópica. Neste estudo, detalhamos um método de modelagem usando 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB) para induzir sintomas semelhantes aos da DAC em orelhas de camundongos e descrevemos vários métodos para avaliar a gravidade da dermatite durante a modelagem. Este protocolo experimental tem sido aplicado com sucesso em alguns experimentos e tem um certo papel promocional no campo da pesquisa em DCA.
Introduction
A dermatite alérgica de contato (DCA) é uma doença cutânea comum que se caracteriza por sintomas semelhantes aos eczemas no local de contato, edema e eritema em casos moderados, e pápulas, erosão, exsudação ou mesmo cicatrizes maciças em casos graves1. Acomete até 20% da população e pode acometer pessoas de qualquer idade2. A DCA ocorre frequentemente em indivíduos que foram expostos a alérgenos repetidamente e pode ser causada pela resposta imune do indivíduo a um ou mais alérgenos em sua casa ou local de trabalho3. A hipersensibilidade tardia tipo IV é considerada o principal tipo de resposta imune naDAC4. Em áreas da pele que têm sido repetidamente expostas a alérgenos, as células T de memória circulantes acumulam-se em grande número e induzem respostas imunes e inflamatórias 3,5,6. O objetivo deste trabalho é propor uma técnica laboratorial confiável para investigação adicional das respostas imunológica e inflamatória no desenvolvimento da DCA.
O início da DCA é geralmente devido à hipersensibilidade de contato causada pela exposição repetida a produtos químicos. Numerosos pesquisadores desenvolveram vários modelos animais de DCA em camundongos domésticos7,8, cobaias 9,10 e outros animais ao longo das últimas décadas, a fim de simular o início da doença. A maioria dos métodos experimentais consiste em duas etapas: sensibilização abdominal (indução) e fornecimento de estímulos no dorso ou no lóbulo da orelha (estimulação). Substâncias químicas comumente usadas incluem principalmente 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB)/1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (DNCB)8,9,11, oxazolona 12, urushiol 13, etc. Dentre elas, DNFB e DNCB são as mais utilizadas, relatadas pela primeira vez em outubro de 195810. O modelo de sensibilização ao níquel14 e a dermatite de contato fotoalérgica modelo15 também são frequentemente utilizados.
Apresentamos um método experimental para a construção do modelo de DCA. Este método é resumido e otimizado com base em estudos anteriores e na comparação com múltiplos experimentos. Comparado com outros modelos de DCA, este modelo tem algumas vantagens, tais como pequenas diferenças individuais, curtos períodos experimentais, uma pequena quantidade de estimulação química, etc. Além disso, este estudo é aplicável a camundongos, que não são apenas econômicos, mas também têm mais opções para knockout gênico ou preparação de camundongos transgênicos16. Também descrevemos os vários métodos usados para monitorar o progresso da DCA no experimento, como medir a espessura da orelha, usar o corante azul de Evans para medir a exsudação inflamatória, etc. Esse modelo pode não apenas analisar orelhas de camundongos, sangue, baço e outras amostras por meios laboratoriais para explorar a patogênese da DAC, mas também é aplicável para a avaliação pré-clínica de novos métodos terapêuticos, o que tem certo significado promocional.
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Protocol
Todos os cuidados e tratamento dos camundongos estavam de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais sob a licença de projeto SYXK(SU)2022-0044. Camundongos BALB/c machos e fêmeas com idade entre 6-8 semanas foram usados neste estudo. Cada grupo consistiu de seis camundongos (ver Tabela de Materiais). As gaiolas foram colocadas em câmara com temperatura controlada (22 ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso a água e ração. Um fluxograma experimental é mostrado na Figura 1.
1. Preparo dos animais
- Iniciar a modelagem após 1 semana de aclimatação ao ambiente.
- Use uma lâmpada ultravioleta e desinfetante com álcool 75% para limpar e desinfetar o ambiente e as bancadas antes de manipular os ratos.
NOTA: Para evitar a influência de fatores externos, a marcação dos camundongos para identificação não pode ser realizada na orelha do camundongo; A coloração nas costas ou na cauda pode ser usada como alternativa. - Use um pequeno cotonete para aplicar água e sabão no abdômen dos camundongos (aproximadamente 1-2 cm2 de tamanho). Raspe a área na direção do crescimento do cabelo com uma lâmina ou barbeador (ver Tabela de Materiais) no início da modelagem (dia 0; Figura 2A).
NOTA: O uso de uma lâmina de barbear lisa para depilação requer um operador qualificado. Se não for realizada corretamente, pode causar irritação na pele. Considere o uso de creme depilatório, cortadores ou uma navalha de segurança para depilação. - Pese o rato e compare as variações de peso entre cada grupo.
2. Estimulação da sensibilização abdominal
- Garantir a recuperação completa de qualquer pequena lesão na pele do abdômen induzida pelo barbear. Aplicar sensibilização abdominal 2 dias após o barbear (dia 2).
- Prepare a solução de DNFB a 0,5%: dilua DNFB com uma mistura de acetona:azeite numa proporção de 4:1 (por exemplo, 400 μL de acetona misturada com 100 μL de azeite; ver Tabela de Materiais). Use uma pistola de pipeta para soprar e misture 20 vezes para misturar completamente a solução DNFB. Antes de cada administração da solução de DNFB ao rato, soprar e misturá-lo três a cinco vezes.
NOTA: Prepare a solução antes de usar e envolva-a em papel alumínio para protegê-la da luz solar direta. - Aplicar 25 μL da solução de DNFB a 0,5% na pele da área raspada no abdome dos camundongos com um pipetador (Figura 2B).
- Drible a solução de DNFB sobre o meio da área de barbear abdominal e espalhe levemente com o lado liso da ponta do pipetador para dispersá-la uniformemente.
- Aos 30 s após a estimulação com DNFB, coloque os camundongos em gaiolas vazias sem roupa de cama para evitar que eles esfreguem a solução de DNFB. Quando a solução de DNFB estiver completamente seca (cerca de 2 min), devolva os ratos à sua gaiola original.
- Use luvas ao manusear a solução de DNFB, pois é fortemente irritante para a pele humana.
3. Estimulação da sensibilização auricular
- Prepare uma solução de DNFB a 0,2% como acima, a solução do veículo (uma mistura 4:1 de acetona e azeite) e água pura.
- Orientar o corpo do rato e fazer com que a borda externa da aurícula fique virada para baixo durante toda a operação para evitar que a solução entre no canal auditivo durante a estimulação com DNFB.
- Nos dias 4, 6, 8 e 10, use um pipetador para aplicar 20 μL da solução de DNFB a 0,2% ou da solução do veículo lenta e uniformemente na superfície interna das aurículas esquerdas dos camundongos. Para evitar que a solução de DNFB entre no canal auditivo, use o lado liso da ponta do pipetador para distribuir suavemente a solução de DNFB durante a administração. Deixar as orelhas direitas sem tratamento (Figura 2C).
- Aguarde até que a solução de DNFB esteja seca e coloque os ratos de volta na gaiola (cerca de 30 s).
- Use luvas ao manusear a solução DNFB.
4. Registro do peso do mouse e dos sintomas de DCA
- Pese o rato todos os dias, comece no dia 1 e compare com o seu peso correspondente no dia 0; avaliar o efeito da DCA sobre o peso corporal de camundongos quanto à mudança de peso (g) ± erro padrão da média (EPM).
- Tire fotos de alta resolução das orelhas do rato para registrar os sintomas clínicos da DCA a cada 2 dias, começando no dia 1.
5. Medição da espessura da aurícula
- Meça a espessura da aurícula a cada 2 dias, começando no dia 1. Meça e registre as duas orelhas em detalhes.
- Use paquímetros vernier (ver Tabela de Materiais) para medir a espessura da aurícula no mesmo horário todos os dias para obter resultados precisos (Figura 3A). Pare os paquímetros vernier de continuar a pinçar para dentro quando houver um ligeiro bloqueio, para evitar danos teciduais à orelha do rato. Mantenha a posição fixa e registre os dados.
- Coletar a espessura de três locais diferentes em cada aurícula (Figura 3B). Registre a média dos três dados como um valor válido. Avaliar-se o edema da orelha em micrômetros (μm) ± erro padrão da média (EPM).
6. Avaliação do grau de edema inflamatório
- Preparar solução de corante azul de Evans a 0,5% (ver Tabela de Materiais): diluir o corante azul de Evans com solução salina tamponada com fosfato (PBS) no dia 11. Use sempre jaleco e luvas, pois o corante azul Evans é ligeiramente tóxico para os seres humanos.
- Imobilize os ratos com um fixador: abra a tampa do fixador (ver Tabela de Materiais), segure a cauda do rato, faça com que a cabeça do rato fique virada para o fixador e faça o rato subir instintivamente no fixador. Tampe a tampa, faça a cauda do rato sair do orifício da tampa e ajuste o comprimento do fixador para expor toda a cauda do rato.
- Limpe a cauda repetidamente com uma bola de algodão de álcool ou mergulhe-a em água morna por 30 s e aperte suavemente a raiz da cauda para preencher e expandir as veias de ambos os lados. Realizar a injeção sob a irradiação de uma fonte de luz fria.
- Injete lentamente a solução de corante azul de Evans na veia da cauda do rato utilizando uma agulha de insulina de 1 mm. Aguarde 15 min e depois tire fotos das orelhas do mouse.
NOTA: Coloque o mouse sobre a mesa e segure-o suavemente para expor a região da orelha para aquisição da imagem. Logo após a injeção com a solução corante azul de Evans e observando as indicações correspondentes, use deslocamento cervical para eutanasiar o camundongo.
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Representative Results
Sob estimulação repetida com DNFB, as orelhas de camundongos do grupo DNFB apresentaram sintomas clínicos evidentes comparáveis aos da DAC, com áreas sensíveis apresentando os sintomas típicos de vermelhidão, ressecamento e até erosão e exsudação. Entretanto, a administração auricular de água pura (grupo controle) ou solvente controle (grupo veículo) não produziu sintomas semelhantes (Figura 4).
Já no grupo DNFB, comparado à orelha direita não tratada, a espessura da orelha esquerda aumentou significativamente após a estimulação com DNFB (Figura 5A), enquanto não houve diferença significativa nos grupos controle e veículo (Figura 5B). As orelhas esquerdas dos camundongos do grupo DNFB obviamente ficaram azuis escuras após a injeção do corante azul de Evans no 11º dia de modelagem, que foi visualmente diferente da orelha direita. No entanto, as orelhas esquerda e direita dos camundongos dos grupos controle e veículo eram aproximadamente da mesma cor (Figura 5C).
Além disso, as alterações de peso corporal de camundongos foram analisadas. O ganho de peso dos camundongos foi levemente retardado pela DNFB ou estimulação veicular simples (Figura 6A), mas não resultou em perda de peso significativa (Figura 6B). Simultaneamente, o baço foi isolado imediatamente após o sacrifício dos camundongos. O índice de baço foi calculado de acordo com o peso do rato e peso do baço; A fórmula de cálculo foi a seguinte:
Índice do baço = peso do baço (g) / peso corporal (g) x 100
O resultado mostra que a estimulação repetida da DNFB na orelha de camundongos resultou em aumento do baço (Figura 6C) e aumento do índice de baço (Figura 6D), enquanto o índice de baço dos camundongos do grupo veículo não se alterou significativamente. Foi provado que, sob a estimulação de DNFB, a função de resposta imune de camundongos no grupo DNFB foi hiperativa.
Figura 1: Diagrama esquemático do eixo do tempo de moldagem do ACD. As setas indicam o que foi feito no momento correspondente. As operações relacionadas envolvidas incluem barbear, sensibilização, medição da aurícula, pesagem, tirar fotos e aplicação de corante azul Evans. Abreviações: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Método de operação do estabelecimento do modelo ACD . (A) Manipulação do barbear abdominal. (B) Manipulação da estimulação sensibilizante abdominal. (C) Manipulação da estimulação sensibilizante da orelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Método de avaliação do edema da orelha. (A) Manipulação das medidas de espessura da orelha em camundongos. (B) Os locais de medida da espessura da orelha em camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem representativa do efeito da administração de DNFB nas orelhas de camundongos ao longo do tempo . (A) Grupo controle. (B) Grupo de veículos. (C) Grupo DNFB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito da administração de DNFB no edema da orelha em camundongos. (A) Diferença na espessura da orelha entre as orelhas esquerda e direita dos camundongos durante a modelagem. (B) Comparação da espessura das orelhas direita e esquerda de camundongos em cada grupo ao final da modelagem. (C) Efeito da administração de DNFB na permeabilidade vascular da orelha em camundongos. (n = 6. ***p < 0,001, comparação entre as orelhas direita e esquerda; N.S. = Não significante). Todos os dados foram expressos como média ± EPM. Diferentes análises de tratamento entre os grupos foram analisadas usando um teste t de Student não pareado ou análise de variância one-way com o teste de Dunnett. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeitos da administração de DNFB sobre o peso corporal e índice de baço em camundongos. (A) Alterações do peso corporal de camundongos em cada grupo durante a modelagem. (B) Comparação das alterações do peso corporal em camundongos de cada grupo no dia 11. (C) Comparação do tamanho do baço em cada grupo de camundongos. (D) Comparação do índice de baço entre grupos de camundongos. (n = 6. *p < 0,05, comparado com o grupo controle; N.S. = Nenhum significativo). Todos os dados foram expressos como média ± EPM. Diferentes análises de tratamento entre os grupos foram analisadas usando um teste t de Student não pareado ou análise de variância one-way com o teste de Dunnett. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito para indução de sintomas semelhantes aos da DAC em orelhas de camundongos pode ser utilizado para estudar a fisiopatologia da DAC e como ferramenta de triagem para o desenvolvimento de novas drogas.
Existem dois passos fundamentais para estabelecer um modelo de DCA: sensibilização inicial e estimulação subsequente. O abdome é geralmente o local de sensibilização inicial, mas o local de estimulação subsequente foi escolhido de forma ligeiramente diferente. Estudos prévios mostraram que a maioria dos estudiosos opta por utilizar sensibilizantes químicos como DNFB/DNCB ou oxazolona para estabelecer modelos de DCA no dorso ou pescoço de camundongos, sendo inevitável o uso de lâminas ou aparadores para depilar a área de modelagem de camundongos17,18,19. No entanto, essa etapa pode facilmente destruir a barreira cutânea e afetar os experimentos subsequentes. Além disso, a droga gotejante é difícil de distribuir uniformemente e é facilmente absorvida pelos cabelos próximos, devido à grande área na nuca e à influência do cabelo circundante.
Neste protocolo experimental, descobrimos que a realização da manipulação para posterior estimulação na superfície interna das aurículas de camundongos nos permitiu aliviar alguns dos problemas acima, ajudando a estabelecer um modelo de DCA estável e altamente reprodutível. De acordo com nossos experimentos repetidos20, também otimizamos e ajustamos o intervalo do estímulo sensibilizante e o período experimental. De acordo com o método experimental dado, um efeito de modelagem muito óbvio pode ser obtido no 10º dia. Além disso, como a área de modelagem está na face interna relativamente independente da aurícula, na qual os fatores externos têm menor interferência, há menos diferença na gravidade da DCA em camundongos do mesmo grupo experimental neste experimento.
Este protocolo experimental também apresenta algumas deficiências. Primeiro, a aplicação de sensibilizantes químicos no ouvido deve ser realizada com cautela para evitar que produtos químicos entrem no canal auditivo e prejudiquem os camundongos. Em segundo lugar, os modelos de DCA são frequentemente usados como um meio para estudar o prurido crônico em camundongos. No modelo de DCA estabelecido na nuca de camundongos, as crises de coceira em camundongos puderam ser intuitivamente observadas, e a gravidade do sintoma de prurido em camundongos pôde ser medida por isso. Embora o comportamento de coçar também tenha sido observado em camundongos durante nosso experimento, os camundongos também apresentaram hábitos espontâneos de limpeza da orelha, tornando difícil distinguir do comportamento de coçar patológico. Isso limitou o uso desse modelo na observação do comportamento de coçar induzido pela DCA. Se o protocolo é aplicável a esse tipo de estudo está sujeito a verificação experimental adicional.
Para rastrear o curso patológico da DAC, uma variedade de métodos de monitorização foi utilizada, como sintomas clínicos otológicos, medida da espessura da orelha e reflexão da permeabilidade vascular. Esses indicadores patológicos são mais visíveis na orelha do que na pele do pescoço e dorso. Ao medir a espessura da orelha de um rato, ocorrerão erros de medição devido ao comportamento de luta do rato e à espessura irregular da orelha. Para reduzir os erros de medição, as medidas devem ser realizadas em três locais diferentes em cada orelha. Ao injetar corante Evans para avaliar a permeabilidade vascular da área modelada, a gravidade da dermatite pode ser observada, no entanto, isso também requer uma alta taxa de sucesso da injeção da veia caudal. Se uma análise comparativa adicional for necessária, a absorbância do sobrenadante do homogeneizado de tecido da orelha de camundongo pode ser determinada.
Vale ressaltar também que, em nossa pesquisaanterior20, a estrutura do tecido da orelha estava bem organizada e menos impactada por outras estruturas teciduais desordenadas (por exemplo, folículos pilosos), do que no tecido cutâneo do pescoço e dorso, o que levou à escolha desta área para pesquisa.
Em conclusão, o modelo de DAC descrito neste trabalho é um método de modelagem estável e eficiente, merecendo promoção em estudos subsequentes sobre dermatite alérgica de contato.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NSFC) para N.-N. Y. (81904212); Projeto de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa de Jiangsu (YB201995); e o Projeto de Financiamento Especial para Pesquisadores de Pós-Doutorado na China (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
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