Summary
Aquí, describimos los métodos para inducir dermatitis alérgica de contacto en orejas de ratón por 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) y cómo evaluar la gravedad de la dermatitis alérgica de contacto.
Abstract
La piel es la primera línea de defensa del cuerpo humano y uno de los órganos más expuestos a los productos químicos ambientales. La dermatitis alérgica de contacto (ACD) es una enfermedad común de la piel que se manifiesta como una erupción local, enrojecimiento y lesiones cutáneas. La aparición y el desarrollo de ACD están influenciados por factores genéticos y ambientales. Aunque muchos estudiosos han construido una serie de modelos de ACD en los últimos años, los protocolos experimentales de estos modelos son todos diferentes, lo que dificulta que los lectores los establezcan bien. Por lo tanto, un modelo animal estable y eficiente es de gran importancia para estudiar más a fondo la patogénesis de la dermatitis atópica. En este estudio, detallamos un método de modelado que utiliza 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) para inducir síntomas similares a ACD en los oídos de ratones y describimos varios métodos para evaluar la gravedad de la dermatitis durante el modelado. Este protocolo experimental se ha aplicado con éxito en algunos experimentos y tiene un cierto papel promocional en el campo de la investigación del ACD.
Introduction
La dermatitis alérgica de contacto (ACD) es una enfermedad común de la piel que se caracteriza por síntomas similares al eccema en el sitio de contacto, edema y eritema en casos moderados, y pápulas, erosión, exudación o incluso cicatrices masivas en casos graves1. Afecta hasta al 20% de la población y puede afectar a personas de cualquier edad2. La ACD a menudo ocurre en individuos que han estado expuestos a alérgenos repetidamente y puede ser causada por la respuesta inmune del individuo a uno o más alérgenos en su hogar o lugar de trabajo3. La hipersensibilidad retardada tipo IV se considera el principal tipo de respuesta inmune en ACD4. En áreas de la piel que han sido expuestas repetidamente a alérgenos, las células T de memoria circulantes se acumulan en grandes cantidades e inducen respuestas inmunes e inflamatorias 3,5,6. El propósito de este trabajo es proponer una técnica de laboratorio confiable para una mayor investigación de las respuestas inmunológicas e inflamatorias en el desarrollo de ACD.
La aparición de ACD generalmente se debe a la hipersensibilidad de contacto causada por la exposición repetida a productos químicos. Numerosos investigadores han desarrollado varios modelos animales de ACD en ratones domésticos7,8, conejillos de indias9,10 y otros animales en el transcurso de las últimas décadas, con el fin de simular el inicio de la enfermedad. La mayoría de los métodos experimentales constan de dos etapas: sensibilización abdominal (inducción) y proporcionar estímulos en la espalda o el lóbulo de la oreja (estimulación). Las sustancias químicas de uso común incluyen principalmente 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB)/1-cloro-2,4-dinitrobenceno (DNCB)8,9,11, oxazolona 12, urushiol 13, etc. Entre ellos, DNFB y DNCB son los más utilizados, reportados por primera vez en octubre de 195810. El modelo de sensibilización al níquel14 y la dermatitis de contacto fotoalérgica modelo15 también se utilizan con frecuencia.
Presentamos un método experimental para construir el modelo ACD. Este método se resume y optimiza sobre la base de estudios previos y tras la comparación con múltiples experimentos. En comparación con otros modelos de ACD, este modelo tiene algunas ventajas, como pequeñas diferencias individuales, períodos experimentales cortos, una pequeña cantidad de estimulación química, etc. Además, este estudio es aplicable a ratones, que no solo son económicos, sino que también tienen más opciones para la eliminación de genes o la preparación de ratones transgénicos16. También describimos los diversos métodos utilizados para monitorear el progreso de ACD en el experimento, como medir el grosor de la oreja, usar colorante azul de Evans para medir la exudación inflamatoria, etc. Este modelo no solo puede analizar orejas de ratón, sangre, bazo y otras muestras por medios de laboratorio para explorar la patogénesis de la ACD, sino que también es aplicable para la evaluación preclínica de nuevos métodos terapéuticos, que tiene un cierto significado promocional.
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Protocol
Todo el cuidado y tratamiento de los ratones estuvo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yangzhou y fueron aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales bajo la licencia del proyecto SYXK (SU) 2022-0044. En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras BALB/c de 6 a 8 semanas de edad. Cada grupo consistía en seis ratones (ver Tabla de Materiales). Las jaulas se colocaron en una cámara de temperatura controlada (22 ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h) con libre acceso a alimentos y agua. En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo experimental.
1. Preparación de animales
- Comience el modelado después de 1 semana de aclimatación al medio ambiente.
- Use una lámpara ultravioleta y desinfectante con alcohol al 75% para limpiar y desinfectar el ambiente y las encimeras antes de manipular a los ratones.
NOTA: Para evitar la influencia de factores externos, no se puede marcar los ratones para su identificación en la oreja del ratón; La tinción en la espalda o en la cola se puede utilizar como alternativa. - Use un pequeño hisopo de algodón para aplicar agua jabonosa en el abdomen de los ratones (aproximadamente 1-2 cm2 de tamaño). Afeite el área en la dirección del crecimiento del cabello con una cuchilla o afeitadora (consulte la Tabla de materiales) al comienzo del modelado (día 0; Figura 2A).
NOTA: El uso de una cuchilla de afeitar recta para la depilación requiere un operador experto. Si no se realiza correctamente, puede causar irritación de la piel. Considere usar crema depilatoria, cortapelos o una maquinilla de afeitar de seguridad para la depilación. - Pesa el ratón y compara los cambios de peso entre cada grupo.
2. Estimulación de la sensibilización abdominal
- Asegurar la recuperación completa de cualquier lesión menor en la piel del abdomen inducida por el afeitado. Aplicar sensibilización abdominal 2 días después del afeitado (día 2).
- Prepare la solución de DNFB al 0,5%: diluya DNFB con una mezcla de acetona: aceite de oliva en una proporción de 4: 1 (por ejemplo, 400 μL de acetona mezclada con 100 μL de aceite de oliva; consulte la Tabla de materiales). Use una pistola de pipeta para soplar y mezclar 20 veces para mezclar bien la solución DNFB. Antes de cada administración de la solución DNFB al ratón, sople y mezcle de tres a cinco veces.
NOTA: Prepare la solución antes de usarla y envuélvala en papel de aluminio para protegerla de la luz solar directa. - Aplique 25 μL de la solución de DNFB al 0,5% en la piel del área afeitada en el abdomen de los ratones con una pipeta (Figura 2B).
- Gotee la solución de DNFB sobre el centro del área de afeitado abdominal y extiéndala ligeramente con el lado liso de la punta de la pipeta para dispersarla uniformemente.
- A los 30 s después de la estimulación con DNFB, coloque a los ratones en jaulas vacías sin ropa de cama para evitar que se froten la solución de DNFB. Cuando la solución de DNFB esté completamente seca (aproximadamente 2 minutos), devuelva los ratones a su jaula original.
- Use guantes cuando manipule la solución DNFB, ya que es muy irritante para la piel humana.
3. Estimulación de la sensibilización del oído
- Prepare una solución de DNFB al 0,2% como la anterior, la solución del vehículo (una mezcla 4: 1 de acetona y aceite de oliva) y agua pura.
- Oriente el cuerpo del ratón y haga que el borde exterior de la aurícula mire hacia abajo durante toda la operación para evitar que la solución entre en el canal auditivo durante la estimulación DNFB.
- En los días 4, 6, 8 y 10, use una pipeta para aplicar 20 μL de la solución de DNFB al 0,2% o solución vehicular lenta y uniformemente a la superficie interna de las aurículas izquierdas de los ratones. Para evitar que la solución de DNFB entre en el canal auditivo, use el lado liso de la punta de la pipeta para distribuir suavemente la solución de DNFB durante la administración. Deje las orejas derechas sin tratar (Figura 2C).
- Espere hasta que la solución de DNFB esté seca y vuelva a colocar los ratones en la jaula (aproximadamente 30 s).
- Use guantes cuando manipule la solución DNFB.
4. Registro del peso del ratón y los síntomas de ACD
- Pese el ratón todos los días, comience el día 1 y compare con su peso correspondiente el día 0; evaluar el efecto de ACD en el peso corporal de ratones como cambio de peso (g) ± error estándar de la media (SEM).
- Tome fotos de alta resolución de las orejas de ratón para registrar los síntomas clínicos de ACD cada 2 días, a partir del día 1.
5. Medición del espesor de la aurícula
- Mida el grosor de la aurícula cada 2 días, a partir del día 1. Mide y registra ambos oídos en detalle.
- Use calibradores vernier (consulte la Tabla de materiales) para medir el grosor de la aurícula a la misma hora cada día para obtener resultados precisos (Figura 3A). Evite que las pinzas vernier continúen sujetando hacia adentro cuando haya un ligero bloqueo, para evitar daños tisulares en la oreja del ratón. Mantenga la posición fija y registre los datos.
- Recoja el grosor de tres ubicaciones diferentes en cada aurícula (Figura 3B). Registre el promedio de los tres datos como un valor válido. Evaluar la hinchazón del oído en micrómetros (μm) ± error estándar de la media (SEM).
6. Evaluación del grado de inflamación inflamatoria
- Prepare una solución de colorante azul Evans al 0,5% (consulte la Tabla de materiales): diluya el colorante azul Evans con solución salina tamponada con fosfato (PBS) el día 11. Use una bata de laboratorio y guantes en todo momento, ya que el tinte azul Evans es ligeramente tóxico para los humanos.
- Inmovilice a los ratones con un fijador: abra la tapa del fijador (consulte la Tabla de materiales), sostenga la cola del mouse, haga que la cabeza del mouse mire hacia el fijador y haga que el mouse se suba instintivamente al fijador. Cubra la tapa, haga que la cola del ratón salga del orificio de la tapa y ajuste la longitud del fijador para exponer toda la cola del ratón.
- Limpie la cola repetidamente con una bola de algodón con alcohol o sumérjala en agua tibia durante 30 s, y pellizque suavemente la raíz de la cola para rellenar y expandir las venas en ambos lados. Realizar la inyección bajo la irradiación de una fuente de luz fría.
- Inyecte lentamente la solución de colorante azul Evans en la vena de la cola del ratón con una aguja de insulina de 1 mm. Espere 15 minutos y luego tome fotografías de las orejas del ratón.
NOTA: Coloque el ratón sobre la mesa y sosténgalo suavemente para exponer la región del oído para la adquisición de imágenes. Poco después de la inyección con la solución de colorante azul Evans y observando las indicaciones correspondientes, use la luxación cervical para sacrificar al ratón.
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Representative Results
Bajo estimulación repetida de DNFB, las orejas de ratón del grupo DNFB mostraron síntomas clínicos evidentes comparables a ACD, con áreas sensibles que muestran los síntomas típicos de enrojecimiento, sequedad e incluso erosión y exudación. Sin embargo, la administración en el oído de agua pura (grupo control) o control con disolvente (grupo de vehículos) no produjo síntomas similares (Figura 4).
Mientras tanto, en el grupo DNFB, en comparación con el oído derecho no tratado, el grosor del oído izquierdo aumentó significativamente después de la estimulación con DNFB (Figura 5A), mientras que no hubo diferencias significativas en los grupos control y vehículo (Figura 5B). Las orejas izquierdas de los ratones del grupo DNFB obviamente se volvieron azul oscuro después de la inyección de tinte azul Evans en el día 11 de modelado, que era visualmente diferente de la oreja derecha. Sin embargo, las orejas izquierda y derecha de los ratones en los grupos de control y vehículo eran aproximadamente del mismo color (Figura 5C).
Además, se analizaron los cambios de peso corporal de los ratones. El aumento de peso del ratón se redujo ligeramente por DNFB o estimulación simple del vehículo (Figura 6A), pero no resultó en una pérdida de peso significativa (Figura 6B). Simultáneamente, el bazo fue aislado inmediatamente después de que los ratones fueron sacrificados. El índice del bazo se calculó de acuerdo con el peso del ratón y el peso del bazo; La fórmula de cálculo fue la siguiente:
Índice del bazo = peso del bazo (g) / peso corporal (g) x 100
El resultado muestra que la estimulación repetida de DNFB en el oído del ratón resultó en un agrandamiento del bazo (Figura 6C) y un aumento en el índice del bazo (Figura 6D), mientras que el índice de bazo de los ratones en el grupo de vehículos no cambió significativamente. Se demostró que bajo la estimulación de DNFB, la función de respuesta inmune de los ratones en el grupo DNFB era hiperactiva.
Figura 1: Diagrama esquemático del eje de tiempo de moldeo ACD. Las flechas indican lo que se hizo en el momento correspondiente. Las operaciones relacionadas incluyen el afeitado, la sensibilización, la medición de aurículas, el pesaje, la toma de fotos y la aplicación de tinte azul Evans. Abreviaturas: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El método de operación del establecimiento del modelo ACD . (A) Manipulación del afeitado abdominal. (B) Manipulación de la estimulación sensibilizante abdominal. (C) Manipulación de la estimulación sensibilizadora del oído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Método de evaluación de la inflamación del oído . (A) Manipulación de las mediciones del grosor del oído en ratones. (B) Los sitios de medición del grosor de la oreja en ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen representativa del efecto de la administración de DNFB en los oídos de ratones a lo largo del tiempo . (A) Grupo de control. B) Grupo de vehículos. (C) Grupo DNFB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto de la administración de DNFB sobre la inflamación del oído en ratones . (A) Diferencia en el grosor del oído entre las orejas izquierda y derecha de los ratones durante el modelado. (B) Comparación del grosor de la oreja izquierda y derecha de ratones en cada grupo al final del modelado. (C) Efecto de la administración de DNFB sobre la permeabilidad vascular del oído en ratones. (n = 6. ***p < 0,001, comparación entre las orejas derecha e izquierda; N.S. = No significativo). Todos los datos se expresaron como la media ± SEM. Se analizaron diferentes análisis de tratamiento entre los grupos mediante una prueba t de estudiante no pareada o un análisis unidireccional de varianza con la prueba de Dunnett. Los valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efectos de la administración de DNFB sobre el peso corporal y el índice del bazo en ratones . (A) Cambios en el peso corporal de los ratones en cada grupo durante el modelado. (B) Comparación de los cambios de peso corporal en ratones en cada grupo en el día 11. (C) Comparación del tamaño del bazo en cada grupo de ratones. (D) Comparación del índice de bazo entre grupos de ratones. (n = 6. *p < 0,05, en comparación con el grupo control; N.S. = No significativo). Todos los datos se expresaron como la media ± SEM. Se analizaron diferentes análisis de tratamiento entre los grupos mediante una prueba t de estudiante no pareada o un análisis unidireccional de varianza con la prueba de Dunnett. Los valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí para inducir síntomas similares al ACD en los oídos de ratones se puede utilizar para estudiar la fisiopatología de ACD y como una herramienta de detección para el desarrollo de nuevos fármacos.
Hay dos pasos clave para establecer un modelo de ACD: sensibilización inicial y estimulación posterior. El abdomen suele ser el sitio de sensibilización inicial, pero el sitio de estimulación posterior se eligió de manera ligeramente diferente. Estudios previos han demostrado que la mayoría de los estudiosos optan por utilizar sensibilizadores químicos como DNFB/DNCB u oxazolona para establecer modelos de ACD en la espalda o el cuello de ratones, y es inevitable utilizar cuchillas o recortadoras para depilarse el área de modelado de ratones17,18,19. Sin embargo, este paso puede destruir fácilmente la barrera cutánea y afectar los experimentos posteriores. Además, el medicamento que gotea es difícil de distribuir uniformemente y es fácilmente absorbido por el cabello cercano, debido a la gran área en la nuca y la influencia del cabello circundante.
En este protocolo experimental, encontramos que realizar la manipulación para la estimulación posterior en la superficie interna de las aurículas de ratón nos permitió aliviar algunos de los problemas anteriores, ayudando a establecer un modelo de ACD estable y altamente reproducible. De acuerdo con nuestros experimentos repetidos20, también optimizamos y ajustamos el intervalo del estímulo sensibilizante y el período experimental. De acuerdo con el método experimental dado, se puede obtener un efecto de modelado muy obvio en el día 10. Además, como el área de modelado está en el lado interno relativamente independiente de la aurícula, en la que los factores externos tienen menos interferencia, hay menos diferencia en la gravedad de ACD en ratones en el mismo grupo experimental en este experimento.
Este protocolo experimental también tiene algunas deficiencias. Primero, la aplicación de sensibilizadores químicos en el oído debe realizarse con precaución para evitar que los productos químicos entren en el canal auditivo y dañen a los ratones. En segundo lugar, los modelos de ACD se utilizan a menudo como un medio para estudiar la picazón crónica en ratones. En el modelo ACD establecido en la nuca de ratones, los episodios de rascado en ratones podrían observarse intuitivamente, y la gravedad del síntoma de picazón en ratones podría medirse por esto. Aunque el comportamiento de rascado también se observó en ratones durante nuestro experimento, los ratones también tenían hábitos espontáneos de limpieza de oídos, lo que dificulta distinguirlo del comportamiento patológico de rascarse. Esto limitó el uso de este modelo para observar el comportamiento de rascado inducido por ACD. Si el protocolo es aplicable a este tipo de estudio está sujeto a una verificación experimental adicional.
Para rastrear el curso patológico de la ACD, se utilizaron una variedad de métodos de monitoreo, como los síntomas clínicos del oído, la medición del grosor del oído y la reflexión de la permeabilidad vascular. Estos indicadores patológicos son más visibles en el oído que en la piel del cuello y la espalda. Al medir el grosor de la oreja de un ratón, se producirán errores de medición debido al comportamiento de lucha del ratón y al grosor desigual de la oreja. Para reducir los errores de medición, las mediciones deben realizarse en tres lugares diferentes en cada oído. Al inyectar tinte Evans para evaluar la permeabilidad vascular del área modelada, se puede ver la gravedad de la dermatitis, sin embargo, esto también requiere una alta tasa de éxito de la inyección de la vena de la cola. Si se requiere un análisis comparativo adicional, se puede determinar la absorbancia del sobrenadante del homogeneizado del tejido del oído del ratón.
También vale la pena mencionar que, en nuestra investigación anterior20, la estructura del tejido del oído estaba bien organizada y menos afectada por otras estructuras tisulares desordenadas (por ejemplo, folículos pilosos), que en el tejido de la piel del cuello y la espalda, lo que llevó a elegir esta área para la investigación.
En conclusión, el modelo de ACD descrito en este trabajo es un método de modelado estable y eficiente y es digno de promoción en estudios posteriores de dermatitis alérgica de contacto.
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Disclosures
Los autores no reportan conflictos de intereses en este trabajo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) a N.-N. Y. (81904212); Proyecto de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de Jiangsu (YB201995); y el Proyecto de Financiación Especial para Investigadores Postdoctorales en China (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
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