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Behavior

एक एंजेलमैन सिंड्रोम माउस मॉडल का व्यवहार लक्षण वर्णन

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65182
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

यह पांडुलिपि एक एंजेलमैन सिंड्रोम माउस मॉडल को मान्य करने के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यवहार परीक्षणों का एक सेट प्रस्तुत करती है।

Abstract

यह पांडुलिपि एएस के एक स्थापित मुराइन मॉडल में एंजेलमैन सिंड्रोम (एएस) जैसे फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए उपलब्ध व्यवहार परीक्षणों की एक बैटरी का वर्णन करती है। हम पशु मोटर हानि का पता लगाने और चिह्नित करने के लिए रोटारोड सीखने के प्रतिमान, विस्तृत चाल विश्लेषण और घोंसले के निर्माण परीक्षण का उपयोग करते हैं। हम खुले मैदान में पशु भावनात्मकता और ऊंचा प्लस भूलभुलैया परीक्षणों का परीक्षण करते हैं, साथ ही पूंछ निलंबन परीक्षण में प्रभाव भी। जब एएस चूहों को खुले क्षेत्र परीक्षण में परीक्षण किया जाता है, तो परिणामों को देखभाल के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, क्योंकि मोटर डिसफंक्शन भूलभुलैया में माउस व्यवहार को प्रभावित करते हैं और गतिविधि स्कोर को बदलते हैं।

प्रस्तुत व्यवहार परीक्षणों की प्रजनन क्षमता और प्रभावशीलता को पहले से ही विभिन्न नॉकआउट वेरिएंट के साथ कई स्वतंत्र यूबीए 3 ए माउस लाइनों में मान्य किया गया है, जो एएस अनुसंधान में एक उत्कृष्ट सत्यापन उपकरण के रूप में परीक्षणों के इस सेट को स्थापित करता है। प्रासंगिक निर्माण और चेहरे की वैधता वाले मॉडल रोग के पैथोफिज़ियोलॉजी को स्पष्ट करने और कारण उपचार के विकास को मंजूरी देने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता होगी।

Introduction

एंजेलमैन सिंड्रोम (एएस) एक दुर्लभ न्यूरोडेवलपमेंटल बीमारी है। एएस की सबसे आम आनुवंशिक उत्पत्ति मातृ-व्युत्पन्न गुणसूत्र के 15q11-q13 क्षेत्र का एक बड़ा विलोपन है, जो लगभग 74% रोगियों में पाया जाता है। इस क्षेत्र को हटाने से UBE3A का नुकसान होता है, जो एएस का मुख्य प्रेरक जीन है जो E3 यूबिकिटिन लिगेज को एन्कोड करता है। न्यूरॉन्स में यूबीई 3 ए जीन के पैतृक एलील को एक प्रक्रिया में चुप कर दिया जाता है जिसे इंप्रिंटिंग कहा जाता है। नतीजतन, जीन की पैतृक छाप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 2 में केवल मातृ अभिव्यक्ति की अनुमति देती है। इसलिए, मातृ-व्युत्पन्न गुणसूत्र से यूबीई 3 ए जीन विलोपन एएस लक्षणों के विकास की ओर जाता है। मनुष्यों में, एएस लगभग 6 महीने की उम्र में प्रकट होता है, विकासात्मक मंदता के साथ जो सभी विकास चरणों में बनी रहती है और इसके परिणामस्वरूपप्रभावित व्यक्तियों में गंभीर दुर्बल लक्षण होते हैं। विकार के मुख्य लक्षणों में ठीक और सकल मोटर कौशल की कमी शामिल है, जिसमें झटकेदार गतिभंग चाल, गंभीर भाषण हानि और बौद्धिक विकलांगता शामिल है। लगभग 80% एएस रोगी नींद की गड़बड़ी और मिर्गी से भी पीड़ित हैं। आज तक, एकमात्र उपलब्ध उपचार रोगसूचक दवाएं हैं, जो मिर्गी के दौरे को कम करती हैं और नींदकी गुणवत्ता में सुधार करती हैं। इसलिए, परिष्कृत फेनोटाइपिंग विश्लेषण के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यवहार फेनोटाइप के साथ मजबूत पशु मॉडल का विकास विकार के पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र को स्पष्ट करने और प्रभावी दवाओं और उपचारों की खोज करने के लिए आवश्यक होगा।

सीएनएस को प्रभावित करने वाले मानव विकार की जटिलता मॉडल जीवों को एक तुलनीय जीनोम, शरीर विज्ञान और व्यवहार रखने की मांग करती है। चूहे अपने छोटे प्रजनन चक्र, छोटे आकार और डीएनए संशोधन की सापेक्ष आसानी के कारण एक मॉडल जीव के रूप में लोकप्रिय हैं। 1984 में, पॉल विलनर ने तीन बुनियादी रोग मॉडल सत्यापन मानदंड प्रस्तावित किए: निर्माण, चेहरा और भविष्य कहनेवाला वैधता, जिसका उपयोग मॉडल के मूल्य5 को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। बस, निर्माण वैधता विकार के विकास के लिए जिम्मेदार जैविक तंत्र को दर्शाती है, चेहरे की वैधता इसके लक्षणों को पुन: उत्पन्न करती है, और भविष्य कहनेवाली वैधता चिकित्सीय दवाओं के लिए मॉडल प्रतिक्रिया का वर्णन करती है।

उपरोक्त सिद्धांतों का पालन करने के लिए, हमने एएस मॉडल चूहों को बनाने के लिए सबसे आम आनुवंशिक एटियलजि, यूबीई 3 ए जीन सहित मातृ 15 क्यू 11.2-13 क्यू लोकस का एक बड़ा विलोपन चुना है। हमने सीआरआईएसपीआर/कैस 9 तकनीक का उपयोग पूरे यूबीई 3 ए जीन में फैले 76,225 बीपी लंबे क्षेत्र को हटाने के लिए किया, जिसमें सी 57बीएल / 6 एन पृष्ठभूमि6 से चूहों में जीन के कोडिंग और गैर-कोडिंग दोनों तत्व शामिल थे। फिर हमने जानवरों को UBE3A + / − विषम चूहों को प्राप्त करने के लिए पैदा किया। मॉडल के चेहरे के सत्यापन के लिए, हमने UBE3A+/- मादाओं और जंगली प्रकार के पुरुषों के क्रॉस से जानवरों का उपयोग UBE3A+/- संतान (C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph और बाद में UBE3A mGenedel/+ के रूप में सौंपा गया) प्राप्त करने के लिए किया और कूड़े को नियंत्रित किया। हमने कोर एएस लक्षणों को पुन: उत्पन्न करने के लिए उनके ठीक और सकल मोटर कौशल, भावनात्मकता और प्रभाव का परीक्षण किया। पिछले लेख में, हमने जानवरों के संज्ञानात्मक कार्यों का भी मूल्यांकन किया, क्योंकि एएस रोगी बौद्धिक विकलांगतासे भी पीड़ित हैं। हालांकि, हमें UBE3AmGenedel / + चूहों में कोई संज्ञानात्मक हानि नहीं मिली, शायद परीक्षण7 के समय जानवरों की कम उम्र के कारण। बाद में लगभग 18 सप्ताह के पुराने जानवरों की जांच में स्थान वरीयता प्रतिमान में रिवर्सल लर्निंग के दौरान व्यवहार लचीलेपन में कमी का पता चला। हालांकि, इस विश्लेषण के लिए नियोजित उपकरणों की जटिलता के लिए एक अलग पद्धति मॉड्यूल की आवश्यकता होती है और इसे यहां शामिल नहीं किया गया है।

यहां प्रस्तुत व्यवहार परीक्षण आनुवंशिक अनुसंधान में सामान्य फेनोटाइपिंग टूल से संबंधित हैं, उनके उच्च पूर्वानुमान मूल्य और पर्याप्त निर्माण वैधता 8,9,10 के लिए धन्यवाद। हमने इन परीक्षणों का उपयोग मानव रोग के मुख्य लक्षणों को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, आयु-स्वतंत्र तरीके से पुन: प्रस्तुत करने के द्वारा एएस के माउस मॉडल को मान्य करने के लिए किया। जानवर की भावनात्मकता का मूल्यांकन ऊंचा प्लस भूलभुलैया और खुले क्षेत्र परीक्षणों में किया गया था। ये दोनों परीक्षण दृष्टिकोण-परिहार संघर्ष पर आधारित हैं, जहां जानवर भोजन, आश्रय या संभोग के अवसरों की तलाश में एक नए वातावरण का पता लगाते हैं, जबकि साथ ही साथ एंक्सीोजेनिक डिब्बोंसे बचते हैं। इसके अतिरिक्त, ओपन फील्ड परीक्षण का उपयोग माउस की लोकोमोटर गतिविधि8 का परीक्षण करने के लिए किया जाता है। टेल सस्पेंशन टेस्ट का व्यापक रूप से अवसाद अनुसंधान में माउस नॉकआउट मॉडल12 में नई एंटीडिप्रेसेंट दवाओं या अवसादग्रस्तता जैसे फेनोटाइप ्स की जांच के लिए उपयोग किया जाता है। यह परीक्षण निराशा का मूल्यांकन करता है कि जानवर एक अपरिहार्य स्थिति में समय के साथ विकसित होते हैं। मोटर सीखने और विस्तृत चाल विशेषताओं को क्रमशः रोटारोड और डिजीगैट में निर्धारित किया गया था। तेज रॉड पर पशु धीरज इसके संतुलन और आंदोलन समन्वय कौशल की विशेषता है, जबकि माउस के चरण पैटर्न का विस्तृत विश्लेषण कई न्यूरोजेनरेटिव आंदोलन विकारों 13,14,15 से जुड़े न्यूरोमस्कुलर हानि का एक संवेदनशील मूल्यांकन है। नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण कृन्तकों में आवेगपूर्ण व्यवहार का पता लगाने के लिए मानक पद्धति का हिस्सा है, और चूंकि यह प्राकृतिक कृंतक निर्माण व्यवहार का उपयोग करता है, इसलिए यह जानवर की भलाई को इंगित करता है16,17.

प्रयोगात्मक समूहों का आकार 3 आर नियम मांगों और कॉलोनी प्रजनन प्रदर्शन के कुशल उपयोग को पूरा करने के लिए एक समझौते का परिणाम था। हालांकि, सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने के लिए, पर्याप्त मात्रा में प्रजनन जोड़े की स्थापना के कारण समूहों में 10 से कम व्यक्ति नहीं थे। दुर्भाग्य से, प्रजनन प्रदर्शन के परिणामस्वरूप हमेशा पर्याप्त संख्या में जानवर नहीं होते थे।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी जानवरों और प्रयोगों की नैतिक समीक्षा की गई और यूरोपीय निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार आयोजित किया गया। अध्ययन को पशु कल्याण के लिए चेक केंद्रीय आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों में रखा गया था और 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 22 ± 2 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर बनाए रखा गया था। चूहों को माउस चाउ और पानी एड लिबिटम प्रदान किया गया था। चूहों को प्रति पिंजरे में तीन से छह जानवरों के समूह में रखा गया था। परीक्षण से पहले वजन के अलावा कोई हैंडलिंग नहीं की गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. परीक्षण से पहले और दौरान सामान्य विचार

नोट: स्पष्टता और समझ के लिए, व्यक्तिगत परीक्षणों के विवरण से पहले सामान्य टिप्पणियां प्रस्तुत की जाती हैं। यह प्रत्येक परीक्षण पर लागू होता है, नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण के स्पष्ट अपवाद के साथ, जो एक आवास कक्ष में किया जाता है और किसी भी प्रयोगात्मक उपकरण के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है।

  1. परिवहन और पर्यावरण में परिवर्तन के परिणामस्वरूप किसी भी तनाव को कम करने के लिए परीक्षण से पहले कम से कम 14 दिनों के लिए अनुसंधान सुविधा में जानवरों को समायोजित करें।
  2. परीक्षण से पहले पशु वजन रिकॉर्ड करें, क्योंकि वजन व्यवहार अनुसंधान में एक सामान्य भ्रामक कारक है।
  3. परिवहन तनाव को कम करने के लिए अपने आवास कक्ष से परिवहन के बाद जानवरों को कम से कम 1 घंटे के लिए प्रयोगात्मक कमरे में रहने के लिए छोड़ दें, जब भी ऐसा परिवहन होता है (यानी, नेस्लेट श्रेडिंग को छोड़कर नीचे वर्णित हर परीक्षण, जो आवास कक्ष में किया जाता है)।
  4. प्रयोग के दौरान तेजी से पहचान की अनुमति देने के लिए पूंछ पर प्रत्येक जानवर को एक गैर विषैले, पानी आधारित मार्कर के साथ लेबल करें।
  5. प्रत्येक परीक्षण के बाद परीक्षण के दौरान प्रयोगात्मक तंत्र में जानवरों द्वारा जमा किए गए सभी मूत्र और मल को हटा दें।
  6. प्रत्येक परीक्षण किए गए जानवर से पहले और बाद में 75% अल्कोहल के साथ सभी प्रयोगात्मक उपकरणों को पोंछ दें। सफाई परीक्षण के दौरान जमा घ्राण निशान को हटा देती है और स्थिर प्रयोगात्मक स्थितियों को बनाए रखने में मदद करती है।
  7. जानवरों को उनके घर के पिंजरे से प्रयोगात्मक तंत्र में यथासंभव देखभाल के साथ ले जाएं, अधिमानतः एक छोटे से अपारदर्शी कंटेनर में, और फिर उन्हें स्वतंत्र रूप से छोड़ दें जब तक कि अन्य जोड़तोड़ की आवश्यकता न हो।
  8. परीक्षण के बाद प्रत्येक जानवर को एक अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में रखें ताकि उन्हें घर के पिंजरे में परीक्षण न किए गए जानवरों को प्रभावित करने से रोका जा सके।
  9. लगातार दिनों में पुरुषों और महिलाओं का परीक्षण करें। प्रयोगात्मक समूहों के बीच अप्रत्याशित पर्यावरणीय कारकों को संतुलित करने के लिए परीक्षण के दौरान विभिन्न जीनोटाइप के क्रम को वैकल्पिक करें।
  10. सभी जानवरों का परीक्षण करने के बाद जानवरों को उनके घर के पिंजरे में वापस रखें और उन्हें आवास कक्ष में वापस कर दें।
  11. जानवरों के बार-बार परीक्षण के मामले में, प्रत्येक परीक्षण के बीच कम से कम 1 दिन का अंतराल बनाए रखें।

2. व्यवहार परीक्षण

  1. उन्नत प्लस भूलभुलैया (ईपीएम)
    नोट: C57BL/6NCrl और UBE3AmGenedel/+ चूहों के दोनों लिंगों को 9-12 सप्ताह की उम्र में इस अध्ययन के लिए परीक्षण किया गया था। परीक्षण के समय जानवरों का वजन पुरुषों के लिए 22 से 36 ग्राम और महिलाओं के लिए 18 से 28 ग्राम तक था।
    1. कैमरे के ठीक नीचे परीक्षण मंच पर प्लस-आकार की भूलभुलैया रखें। दीवार पर पोटेंशियोमीटर का उपयोग करके, लक्सोमीटर की मदद से इसके केंद्र में प्रकाश की तीव्रता को 70 लक्स पर सेट करें, इसके सेंसर को समायोजन के दौरान भूलभुलैया के केंद्र में रखा जाए।
    2. व्यूअर सॉफ़्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर खोलें और कॉन्फ़िगरेशन टैब के ऊपरी बाईं ओर आइकन पर क्लिक करके ईपीएम परीक्षण के लिए कॉन्फ़िगरेशन लोड करें। फ़ाइल मेनू से EPM प्लगइन लोड करें। प्रयोग टैब के संबंधित फ़ील्ड में कंप्यूटर कीबोर्ड-पशु आईडी, जीनोटाइप, लिंग और प्रयोग जानकारी (तिथि, प्रकाश तीव्रता) का उपयोग करके पशु जानकारी भरें। जांचें कि क्या ज़ोन की स्थिति, खुली बाहें और बंद हाथ ठीक से कॉन्फ़िगर किए गए हैं। एक दृश्य नियंत्रण और कंप्यूटर माउस की मदद से, सुनिश्चित करें कि वर्चुअल रेखांकित क्षेत्र वीडियो पूर्वावलोकन पर संबंधित ईपीएम ज़ोन से मेल खाते हैं।
    3. ईपीएम एक परीक्षण है जिसका उपयोग किसी जानवर की सामान्य चिंता का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है, जो दृष्टिकोण-संघर्ष से बचने पर आधारित है। कृंतक स्वाभाविक रूप से सुरक्षित लोगों (बंद हाथों) के पक्ष में अच्छी तरह से रोशनी वाले असुरक्षित क्षेत्रों (खुली बाहों) से बचते हैं। चूंकि यह पूरी तरह से स्वचालित परीक्षण एक वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम पर आधारित है, इसलिए सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से प्रत्येक क्षेत्र में बिताए गए समय के साथ-साथ प्रवेश द्वारों की संख्या की गणना करने दें।
    4. परीक्षण के दौरान, एक औद्योगिक, अवरक्त प्रकाश-संवेदनशील कैमरे के माध्यम से वीडियो पर जानवरों को रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग के दौरान वास्तविक समय में सॉफ्टवेयर को जानवर की स्थिति का पता लगाने की अनुमति दें। इसके बाद, सॉफ्टवेयर को भूलभुलैया में जानवर के व्यवहार का वर्णन करने वाले सभी मापदंडों की गणना करने के लिए स्वचालित रूप से जानवर के ट्रैक का मूल्यांकन करने दें। जानवरों में चिंता जैसे व्यवहार के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए एंक्सिोजेनिक खुली बाहों में बिताए गए समय और खुली बाहों के दौरे के प्रतिशत का उपयोग करें।
      नोट: कस्टम-निर्मित भूलभुलैया अवरक्त प्रकाश-पारगम्य सामग्री से बना है और इसे प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) अवरक्त प्रकाश स्रोत मंच पर रखा गया है।
    5. माउस कर्सर को अधिग्रहण टैब के ऊपरी बाईं ओर तीर आइकन पर रखें। हाथ से घर के पिंजरे से एक जानवर निकालें और इसे ईपीएम के केंद्र में धीरे से रखें। कंप्यूटर माउस पर बाएं क्लिक करके प्रोटोकॉल शुरू करें और प्रयोगात्मक कक्ष को तुरंत छोड़ दें।
    6. एक बार जब रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल 5 मिनट के मुफ्त भूलभुलैया अन्वेषण के बाद समाप्त हो जाता है, तो प्रोटोकॉल समाप्ति के बाद दिखाई देने वाली विंडो पर ओके पर क्लिक करके रिकॉर्ड किए गए डेटा को सहेजें, फ़ाइल को उचित रूप से नाम दें, और सहेजें पर क्लिक करें। डेटा विश्लेषण टैब के बाएं ऊर्ध्वाधर पैनल पर आइकन पर क्लिक करके ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए प्रत्येक परीक्षण किए गए जानवर के लिए परिणामों को एक .csv फ़ाइल में निर्यात करें।
    7. जानवर को हाथ से भूलभुलैया से निकालें और इसे अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में डाल दें। एक ही तरीके से सभी जानवरों के परीक्षण के साथ आगे बढ़ें। एलिवेटेड प्लस भूलभुलैया प्लगइन के परिणाम टैब में कॉपी परिणाम आइकन पर क्लिक करके सभी परीक्षण किए गए जानवरों के परिणामों को ऑफ़-लाइन विश्लेषण के लिए नोटपैड फ़ाइल में कॉपी करें।
      नोट: सॉफ़्टवेयर और हार्डवेयर भिन्न हो सकते हैं, और प्रासंगिक मैनुअल का पालन किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक सेटअप, जैसे प्रकाश व्यवस्था या कंप्यूटर प्लेसमेंट, पशु सुविधा के निर्माण के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  2. ओपन फील्ड (ओएफ) परीक्षण
    नोट: ओपन फील्ड टेस्ट एक जानवर के समग्र आंदोलन का आकलन करता है, जो एक नए वातावरण में खोजपूर्ण व्यवहार से शुरू होता है। इसके अतिरिक्त, यह आमतौर पर एक असुरक्षित, अच्छी तरह से रोशनी वाली जगह में सामान्य चिंता का पता लगाने के लिए एक स्क्रीनिंग टूल के रूप में उपयोग किया जाता है। यह एक पूरी तरह से स्वचालित परीक्षण है जो एक वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम का उपयोग करता है, जिसका उपयोग पिछले परीक्षण में भी किया गया था।
    1. कैमरे के ठीक नीचे परीक्षण मंच पर चार परीक्षण बक्से रखें। दीवार पर पोटेंशियोमीटर का उपयोग करके, एक लक्सोमीटर की मदद से प्रत्येक ओएफ परीक्षण के केंद्र में प्रकाश की तीव्रता को 200 लक्स पर सेट करें, समायोजन के दौरान प्रत्येक बॉक्स के केंद्र में इसके सेंसर को रखा जाए।
    2. व्यूअर सॉफ़्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर खोलें और कॉन्फ़िगरेशन टैब के ऊपरी बाईं ओर आइकन पर क्लिक करके ओएफ परीक्षण के लिए कॉन्फ़िगरेशन लोड करें। प्रयोग टैब के संबंधित फ़ील्ड में कंप्यूटर कीबोर्ड-पशु आईडी, जीनोटाइप, लिंग और प्रयोग जानकारी (तिथि, प्रकाश तीव्रता) का उपयोग करके पशु जानकारी भरें। जांचें कि क्या ज़ोन की स्थिति (केंद्र और परिधि) ओएफ टेस्ट बॉक्स से मेल खाती है और यदि आवश्यक हो तो उन्हें समायोजित करें। एक दृश्य नियंत्रण और कंप्यूटर माउस की मदद से, सुनिश्चित करें कि वर्चुअल उल्लिखित केंद्र और परिधि क्षेत्र वीडियो पूर्वावलोकन पर संबंधित ओएफ परीक्षण क्षेत्रों से मेल खाते हैं।
    3. परीक्षण के दौरान, एक औद्योगिक, अवरक्त प्रकाश-संवेदनशील कैमरे के माध्यम से वीडियो पर जानवरों को रिकॉर्ड करें। सॉफ्टवेयर को रिकॉर्डिंग के दौरान वास्तविक समय में जानवर की स्थिति का पता लगाने की अनुमति दें और ओएफ परीक्षण बॉक्स में जानवर के व्यवहार का वर्णन करने वाले सभी मापदंडों की गणना करने के लिए पशु के ट्रैक का स्वचालित रूप से मूल्यांकन करें। चलने की दूरी, औसत गति और आराम करने का समय एक नए वातावरण में पशु गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर हैं, जबकि केंद्र प्रविष्टियों की संख्या और केंद्र में अवधि जानवरों में चिंता जैसे व्यवहार का वर्णन करती है।
      नोट: कस्टम-निर्मित भूलभुलैया अवरक्त प्रकाश-पारगम्य सामग्री से बना है और इसे एलईडी इन्फ्रारेड प्रकाश स्रोत मंच पर रखा गया है।
    4. माउस कर्सर को अधिग्रहण टैब के ऊपरी बाईं ओर तीर आइकन पर रखें। हाथ से घर के पिंजरे से चार जानवरों को निकालें और उन्हें प्रत्येक परीक्षण बॉक्स के कोने में धीरे से रखें। कंप्यूटर माउस पर बाएं क्लिक करके प्रोटोकॉल शुरू करें और तुरंत प्रयोगात्मक कक्ष छोड़ दें।
    5. जब प्रोटोकॉल 10 मिनट के मुफ्त भूलभुलैया अन्वेषण के बाद समाप्त हो जाता है, तो प्रोटोकॉल समाप्ति के बाद दिखाई देने वाली विंडो पर ठीक पर क्लिक करके डेटा सहेजें, फ़ाइल को उचित रूप से नाम दें, और सहेजें पर क्लिक करें। डेटा विश्लेषण टैब के बाएं ऊर्ध्वाधर पैनल पर आइकन पर क्लिक करके ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए प्रत्येक परीक्षण किए गए जानवर के लिए परिणामों को एक .csv फ़ाइल में निर्यात करें।
    6. जानवरों को हाथ से भूलभुलैया से निकालें और उन्हें अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में डाल दें। एक ही तरीके से सभी जानवरों के परीक्षण के साथ आगे बढ़ें। निर्यात किए गए डेटा का विश्लेषण करें.
      नोट: सॉफ़्टवेयर और हार्डवेयर भिन्न हो सकते हैं, और प्रासंगिक मैनुअल का पालन किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक सेटअप, जैसे प्रकाश व्यवस्था, भूलभुलैया की संख्या, या कंप्यूटर प्लेसमेंट, पशु सुविधा के निर्माण के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  3. टेल सस्पेंशन टेस्ट (टीएसटी)
    नोट: स्वचालित पूंछ निलंबन उपकरण के साथ एक साथ तीन चूहों का परीक्षण किया जाता है।
    1. कमरे की प्रकाश तीव्रता को 100-120 लक्स पर बनाए रखें।
    2. TST सिस्टम को USB केबल के माध्यम से कंप्यूटर से कनेक्ट करें। कंप्यूटर में USB डोंगल डालें और BIO-TST सॉफ़्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें। Global के अंतर्गत सेटिंग टैब में, अधिग्रहण अवधि को 360 s तक समायोजित करें. प्रयोग टैब में, विषयों की नई सूची का चयन करें, और खोले गए टैब में दिए गए निर्देशों का पालन करके एक नई प्रयोग फ़ाइल और परीक्षण किए गए विषयों की एक नई सूची बनाएं।
    3. प्रारंभ रन क्लिक करके रन प्रारंभ करें | अधिग्रहण टैब में जारी रखें. जानवरों को एकल-पक्षीय चिपकने वाला टेप लपेटकर परीक्षण के लिए तैयार करें, जैसे कि ट्रांसपोर मेडिकल टेप, जानवर की पूंछ का लगभग 3/4, आधार से शुरू होता है।
    4. टेप के माध्यम से निलंबन हुक पास करें और उस पर जानवर को निलंबित करें। प्रत्येक जानवर के लिए विज़ुअलाइज़ की गई स्थिति के तहत स्टार्ट आइकन पर क्लिक करके हुक पर लटकाने के तुरंत बाद प्रत्येक जानवर के लिए व्यक्तिगत रूप से डेटा प्राप्त करना शुरू करें और परीक्षण के दौरान लगातार जानवरों का निरीक्षण करें।
    5. जानवरों के पहले सेट के लिए अधिग्रहण पूरा होने के बाद, अगला रन शुरू करें, जानवरों को हुक से हटा दें, चिपकने वाले टेप को उनकी पूंछ से अलग करें, पूंछ के साथ कैंची के साथ टेप को सावधानी से काट दें, और जानवरों को अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में डाल दें।
    6. 75% अल्कोहल और पेपर ऊतकों के साथ उपकरण को साफ करें और ऊपर वर्णित बाकी जानवरों के साथ आगे बढ़ें। विश्लेषण टैब में, विश्लेषण के लिए अधिग्रहण के अंतिम 4 मिनट का चयन करें, फिर विश्लेषण अवधि में सभी मान्य रन का चयन करें, चयनित विषयों का विश्लेषण करें पर क्लिक करें, वांछित डेटा प्रारूप चुनें, और आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए डेटा को निर्यात करने के लिए चयनित डेटा निर्यात करें पर क्लिक करें।
      नोट: परीक्षण 6 मिनट तक रहता है। पहले 2 मिनट के दौरान, जानवर सख्ती से संघर्ष करेंगे, लेकिन जैसे ही शेष 4 मिनट के दौरान निराशा प्रतिक्रिया प्रचलित हो जाती है, इस अवधि के दौरान गतिहीनता का समय विश्लेषण के लिए लिया जाता है। सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर भिन्न हो सकते हैं, और प्रासंगिक मैनुअल का पालन किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, उपकरण स्वयं भिन्न हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, परीक्षण पदों की संख्या)।
  4. चाल विश्लेषण
    1. ट्रेडमिल चालू करें और गति संकेतक के बगल में स्थित + या - प्रतीक पर क्लिक करके उपकरण पैनल पर बेल्ट की गति को मैन्युअल रूप से 20 सेमी / सेकंड पर सेट करें। नॉब को क्लॉकवाइज घुमाकर उपकरण की रोशनी चालू करें। सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके डिजीगैट इमेजर सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और शटर स्पीड के लिए क्षेत्र में अल्बिनो चूहों के लिए शटर गति को 100 या काले / अंधेरे चूहों के लिए 130 पर सेट करें।
    2. हाथ से घर के पिंजरे से पहले जानवर को निकालें और धीरे से इसे ट्रेडमिल बेल्ट पर रखें। जानवरों के डिब्बे का दरवाजा बंद करें। यह सुनिश्चित करने के लिए नेत्रहीन निरीक्षण करें कि जानवर की पूंछ दरवाजे और फ्रेम के बीच फंसी नहीं है।
    3. रिकॉर्डिंग से पहले माउस को ट्रेडमिल बेल्ट का पता लगाने की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि जानवर ट्रेडमिल को ~ 3 सेकंड के लिए धीमी गति से चलने की गति पर सेट करके परीक्षण करने में सक्षम है और फिर इसे रोककर, जानवर को लगातार देखता है।
    4. उपकरण पैनल पर स्टार्ट बटन दबाकर बेल्ट शुरू करें और लगभग 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि कम से कम 10-15 चरणों की एक स्पष्ट और धाराप्रवाह हरकत देखने योग्य है। उपकरण पैनल पर स्टॉप बटन दबाकर बेल्ट को रोकें और माउस को हाथ से अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में वापस कर दें।
    5. प्ले पर क्लिक करके और संपादन मोड में दृश्य नियंत्रण के साथ रिकॉर्डिंग की समीक्षा करके धाराप्रवाह चरणों के साथ छवियों के अनुक्रम के लिए रिकॉर्डिंग को स्क्रीन करें। संबंधित फ़ील्ड में मैन्युअल रूप से अपने शुरुआती और अंतिम फ्रेम नंबर लिखकर 10-15 धाराप्रवाह आंदोलनों का चयन करें (पहले फ्रेम के लिए फ्रेम # और अंतिम फ्रेम के लिए फ्रेम से)। पशु की जानकारी-पशु आईडी, जन्म तिथि, लिंग, वजन, बेल्ट की गति और बेल्ट कोण भरें - और संबंधित क्षेत्रों में आवश्यकता होने पर टिप्पणी करें। सहेजें क्लिक करके फ़ाइल को आगे के विश्लेषण के लिए सहेजें.
    6. पानी के साथ बेल्ट को साफ करें और बाकी जानवरों के साथ उसी तरह आगे बढ़ें। अगले जानवर के चलने की रिकॉर्डिंग के साथ आगे बढ़ने के लिए कैमरा चुनें। जब सभी जानवरों के लिए रिकॉर्डिंग प्राप्त की जाती है, तो विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: जो जानवर बेल्ट की एक निर्धारित गति से चलने में सक्षम नहीं हैं, उन्हें परीक्षण से बाहर रखा गया है। हमारे अनुभव के आधार पर, हम देखते हैं कि पुराने जानवरों (50 सप्ताह से अधिक) को ट्रेडमिल पर चलने के साथ अधिक कठिनाइयों का अनुभव होता है, जिसमें जीनोटाइप के आधार पर 2% से 50% के बीच परिवर्तनीय आवृत्ति होती है। ट्रेडमिल के सामने या पीछे ट्रे में पशु अपशिष्ट एकत्र किया जाता है। ट्रे को प्रत्येक अध्ययन के बाद खाली कर दिया जाता है और गर्म साबुन के पानी से धोया जाता है। बेल्ट को एक नम कपड़े से पोंछा जाता है।
    7. पशु पदचिह्नों की वीडियो रिकॉर्डिंग के पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण के आधार पर चाल विश्लेषण करें। DigiGait विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा समायोजित करें।
      नोट: चाल विश्लेषण न केवल मोटर समन्वय का एक उपाय प्रदान करता है, बल्कि गतिशील चाल संकेत के विश्लेषण के आधार पर एक विस्तृत किनेमेटिक विवरण भी प्रदान करता है, जो अनुक्रमिक प्रगति के माध्यम से पंजे के स्थान के अस्थायी इतिहास का प्रतिनिधित्व करता है। निम्नलिखित मापदंडों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा मापा जाता है: स्विंग अवधि, स्विंगिंग में स्ट्राइड अवधि का प्रतिशत, ब्रेकिंग अवधि, ब्रेकिंग में स्ट्राइड अवधि का प्रतिशत, प्रणोदन अवधि, प्रणोदन में प्रगति का प्रतिशत, रुख अवधि, रुख में प्रगति का प्रतिशत, स्ट्राइड अवधि, रुख का ब्रेकिंग प्रतिशत, रुख चरण का प्रणोदन प्रतिशत, स्विंग टू स्टांस अनुपात, स्ट्राइड लंबाई, स्ट्राइड आवृत्ति, पंजा कोण, पंजा कोण परिवर्तनशीलता, रुख चौड़ाई, चरण कोण, स्ट्राइड लंबाई परिवर्तनशीलता, स्ट्राइड चौड़ाई परिवर्तनशीलता, चरण कोण परिवर्तनशीलता, स्ट्राइड लंबाई की भिन्नता का गुणांक, रुख चौड़ाई की भिन्नता का गुणांक, चरण कोण की भिन्नता का गुणांक, स्विंग अवधि की भिन्नता का गुणांक, चरम रुख पर पंजा क्षेत्र, चरम रुख पर पंजा क्षेत्र परिवर्तनशीलता, हिंद अंग साझा रुख अवधि, साझा रुख का प्रतिशत, बाएं और दाएं पीछे के रुख की अवधि का अनुपात, चाल समरूपता, ब्रेकिंग चरण के दौरान ट्रेडमिल बेल्ट के संपर्क में पंजे के क्षेत्र के परिवर्तन की अधिकतम दर, प्रणोदन चरण के दौरान ट्रेडमिल बेल्ट के संपर्क में पंजे के क्षेत्र के परिवर्तन की अधिकतम दर, ताऊ-प्रणोदन, पंजा ओवरलैप दूरी, पंजा प्लेसमेंट पोजिशनिंग, गतिभंग गुणांक, मध्य रेखा दूरी, अक्ष दूरी और पंजा खींचना। सॉफ्टवेयर चरण ट्रेस शोर के एक छोटे से सुधार की अनुमति देता है, जिसे सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले पूरा किया जाना चाहिए। सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर भिन्न हो सकते हैं, और प्रासंगिक मैनुअल का पालन किया जाना चाहिए।
  5. Rotarod
    नोट: रोटारोड परीक्षण का उपयोग कृंतक मोटर कार्यों-संतुलन और मोटर समन्वय का आकलन करने के लिए किया जाता है। परीक्षण के लिए एक माउस को एक निश्चित व्यास (5 सेमी) की घूर्णन रॉड पर चलने की आवश्यकता होती है, जिसमें एक निश्चित अवधि (5 मिनट) में रोटेशन तेज हो जाता है जब तक कि जानवर अब नहीं रह सकता है।
    1. उपकरण पर ऑन/ऑफ स्विच दबाकर रोटारोड उपकरण पर स्विच करें और रॉड सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें। फ़ाइल टैब में एक नई फ़ाइल प्रारंभ करें और इसे उपयुक्त नाम के तहत सहेजें। सेटअप विंडो में, प्रयोग विवरण भरें, जैसे दिनांक, उपयोगकर्ता का नाम, और कोई भी अंतिम टिप्पणियाँ. स्पीड प्रोफाइल को 300 एस, प्रारंभिक गति को 4 आरपीएम और टर्मिनल गति को 40 आरपीएम पर सेट करें।
    2. पशु क्षेत्र में परीक्षण किए गए जानवरों के लिए एक अनुसूची तैयार करें, और प्रत्येक जानवर को रॉड पर अपनी स्थिति में असाइन करें। सॉफ्टवेयर में पदों को स्पष्ट रूप से इंगित नहीं किया गया है, लेकिन वे सूची लाइन के अनुरूप हैं; उदाहरण के लिए, पहली पंक्ति रॉड की पहली स्थिति को इंगित करेगी, पांचवीं रेखा रॉड की पांचवीं स्थिति को इंगित करेगी, और इसी तरह। प्रयोगात्मक समूहों के बीच प्रत्येक रॉड की स्थिति को संतुलित करना याद रखें।
      नोट: एक साथ पांच जानवरों का परीक्षण किया जा सकता है।
    3. बंद करें क्लिक करके सेटअप पैनल बंद करें बंद करें और मापन क्लिक करके मापने वाले पैनल को खोलें. स्टार्ट/स्टॉप पर क्लिक करके 4 आरपीएम पर रॉड का प्रारंभिक रोटेशन शुरू करें और पहले पांच जानवरों को उनके निर्दिष्ट पदों पर रखें। जब सभी जानवर रॉड पर हों, तो स्टार्ट प्रोफाइल पर क्लिक करके परीक्षण प्रोटोकॉल शुरू करें, और रॉड धीरे-धीरे 5 मिनट में 40 आरपीएम तक बढ़ जाएगी। यदि कोई जानवर रॉड से गिर जाता है, तो प्रोटोकॉल शुरू होने से पहले इसे रॉड पर वापस कर दें।
      नोट: जानवर आमतौर पर रॉड पर लंबे समय तक नहीं रहते हैं ताकि पहले प्रयास के दौरान सभी चूहों को एक बार में उस पर रखा जा सके। शुरुआत में रोटेशन की निरंतर गति के साथ रॉड पर जानवरों को रखते समय धैर्य रखना महत्वपूर्ण है। परीक्षण का उद्देश्य एक निश्चित रोटेशन गति पर रॉड पर जानवर के धीरज को निर्धारित करना नहीं है, बल्कि उस गति का पता लगाना है जिस पर जानवर रॉड पर रहने में असमर्थ है। रॉड की गति उस पर रहने की विलंबता के समानुपाती है; इस प्रकार, इसका उपयोग जानवर के संतुलन को व्यक्त करने के लिए किया जाता है।
    4. जानवरों को अस्थायी होल्डिंग पिंजरे में ले जाएं जब वे सभी रॉड से गिर गए हों या 5 मिनट बीत जाने के बाद। किसी भी पशु अपशिष्ट को हटा दें और रॉड और ट्रे को शराब से साफ करें।
    5. जानवरों के अगले समूह के साथ उसी तरह से आगे बढ़ने के लिए पशु -> पर क्लिक करें। सभी जानवरों का परीक्षण करने के बाद, बंद करें पर क्लिक करके माप विंडो बंद करें और एकत्र किए गए डेटा को प्रदर्शित करने के लिए दिखाएँ पर क्लिक करें। निर्यात CSV क्लिक करके आगे के विश्लेषण के लिए अधिग्रहित डेटा .csv फ़ाइल स्वरूप में निर्यात करें.
    6. 15 मिनट के इंटरट्रायल अंतराल के साथ रॉड पर प्रत्येक जानवर का तीन बार परीक्षण करें। आगे के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए तीन परीक्षणों में गिरने के लिए विलंबता के औसत मूल्य का उपयोग करें। लगातार 5 दिनों के लिए परीक्षण को दोहराकर जानवर की मोटर सीखने का मूल्यांकन करें।
      नोट: सॉफ़्टवेयर और हार्डवेयर भिन्न हो सकते हैं, और प्रासंगिक मैनुअल का पालन किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, उपकरण स्वयं भिन्न हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, परीक्षण पदों की संख्या, समग्र निर्माण और रॉड आयाम में।
  6. नेस्लेट कतर-घोंसले की इमारत
    1. जानवरों को 1 सप्ताह के लिए मानक उपकरण (बिस्तर, भोजन जाल और पानी की आपूर्ति) के साथ एकल पॉली कार्बोनेट माउस पिंजरों में अलग करें। फोर्सप्स का उपयोग करके लगभग 12 ग्राम कपास का घोंसला लें, तराजू का उपयोग करके मैन्युअल रूप से अपना वजन रिकॉर्ड करें, और इसे एक पिंजरे में बेतरतीब ढंग से रखें, लेकिन पानी की आपूर्ति के विपरीत तरफ। जानवरों के साथ पिंजरों को आवास कक्ष में वापस करें।
    2. तराजू का उपयोग करके अगले 4 दिनों के लिए हर दिन एक ही समय पर प्रत्येक नेस्लेट का वजन करें। कागज पर या प्रीमेड स्प्रेडशीट में वजन रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि वजन किए जाने पर प्रत्येक घोंसला सूखा है; यदि नहीं, तो हीटिंग पैड पर सुखाएं और सभी नेस्टलेट्स को उसी समय उनके असाइन किए गए पिंजरों में वापस कर दें जहां माउस ने अपना घोंसला बनाया था। यदि नेस्लेट कई भागों में फट गया है, तो सबसे बड़ा वजन करें।
    3. डेटा विश्लेषण के लिए, प्रारंभिक वजन के सापेक्ष प्रत्येक दिन नेस्लेट वजन में कमी व्यक्त करें और इसे उपयोग की गई सामग्री के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत करें।
      नोट: नर को एक सामान्य पिंजरे में वापस लाने से जानवरों के बीच आक्रामकता और अवांछित चोटें बढ़ सकती हैं। इसलिए, पशु कल्याण से समझौता करने से बचने के लिए परीक्षण आहार के अंत में नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण निर्धारित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

उन्नत प्लस भूलभुलैया और खुले क्षेत्र परीक्षण।
ईपीएम और ओएफ परीक्षण नए वातावरण का पता लगाने के लिए कृन्तकों की प्राकृतिकप्रवृत्ति का उपयोग करते हैं। अन्वेषण एक दृष्टिकोण-परिहार संघर्ष द्वारा नियंत्रित होता है, जहां कृंतक एक नए वातावरण की खोज और संभावित खतरे से बचने के बीच चयन करते हैं। जानवर आश्रय, सामाजिक संपर्क, या चारा खोजने की तलाश में अज्ञात स्थानों का पता लगाते हैं। हालांकि, नए स्थानों में शिकारियों या प्रतियोगियों जैसे जोखिम कारक शामिल हो सकते हैं। ओएफ परीक्षण और ईपीएम दोनों में सुरक्षित और जोखिम भरे डिब्बे शामिल हैं- ओएफ परीक्षण में परिधि और केंद्र और ईपीएम में बंद और खुली बाहें। कृंतक स्वाभाविक रूप से खुले, ऊंचे और चमकदार रोशनी वाले क्षेत्रों की तुलना में अंधेरे, संलग्न डिब्बों को पसंद करते हैं। इस प्रकार, जोखिम भरे / एंक्सीोजेनिक भागों की कम खोज, जिसे यात्राओं और यात्रा की अवधि की संख्या में कमी के रूप में व्यक्त किया जाता है, या पहली यात्रा के लिए बढ़ी हुई विलंबता के रूप में, पशु चिंता जैसे व्यवहार को चिह्नित करता है 8,11. आराम करने का समय, औसत गति, और कुल तय की गई दूरी जानवरों की सहज गतिविधि के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती है। ओएफ परीक्षण या ईपीएम (चित्रा 1 डी-जी) में यूबीई 3 एएमजीनेडेल / + उत्परिवर्ती में चिंता जैसे व्यवहार से संबंधित मापदंडों में से कोई भी नहीं बदला गया था। +जानवर काफी हाइपोएक्टिव थे, जैसा कि ओएफ परीक्षण (चित्रा 1 ए-सी) में कम दूरी तय करने, कम औसत गति और लंबे समय तक आराम करने के समय से परिलक्षित होता है।

Figure 1
चित्रा 1: ईपीएम और ओएफ परीक्षण में एक नए वातावरण के लिए सहज गतिविधि और चिंता प्रतिक्रिया। +जानवर कम औसत गति (बी) और लंबे समय तक आराम करने के समय (सी) के साथ कम दूरी (ए) पर चलते थे। केंद्र में यात्राओं की संख्या और अवधि जानवरों (डी, ई) के बीच भिन्न नहीं थी। एक दो-तरफा एनोवा ने जीनोटाइप और सेक्स के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं होने के साथ एक महत्वपूर्ण मुख्य जीनोटाइप प्रभाव का खुलासा किया (जीनोटाइप प्रभाव: पी < 0.01; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन: पी > 0.7)। खुली और बंद बाहों के दौरे का प्रतिशत जीनोटाइप (एफ) पर निर्भर नहीं था, न ही प्रयोगात्मक समूहों (जी) के बीच एंक्सीोजेनिक खुली बाहों में बिताया गया समय भिन्न था। एक दो-तरफा एनोवा ने महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव या जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन (जीनोटाइप प्रभाव: पी > 0.9; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन: पी > 0.9) को प्रकट नहीं किया। बॉक्सप्लॉट में दर्शाया गया डेटा औसत मान, अंतर चतुर्थक सीमा और मूल्यों की सीमा दिखाता है। महत्वपूर्ण पोस्ट-हॉक परीक्षण परिणामों को * के रूप में इंगित किया गया है। नियंत्रित जानवरों (मादा एन = 10, नर एन = 11) के लिए डेटा लाल रंग में प्रस्तुत किया जाता है, और उत्परिवर्ती (मादा एन = 9, पुरुष एन = 10) नीले रंग में। यह आंकड़ा Syding et al.6 से अनुकूलित किया गया था। संक्षेप: ईपीएम = ऊंचा प्लस भूलभुलैया; ओएफ = खुला मैदान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

टेल सस्पेंशन टेस्ट
टीएसटी एक अपरिहार्य स्थिति में विकसित पशु निराशा को मापता है। पूंछ द्वारा निलंबित होने पर, कृंतक जोरदार गतिविधि की प्रारंभिक अवधि के बाद तेजी से गतिहीन हो जाते हैं। गतिहीनता की अवधि "निराशा" के परिमाण को इंगित करती है। कई प्रयोगशालाओं ने दिखाया है कि नैदानिक रूप से सक्रिय एंटीडिप्रेसेंट दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला गतिहीनता अवधि 9,20,21 को कम करती है। यह सरल परीक्षण आमतौर पर संभावित एंटीडिप्रेसेंट पदार्थों के लिए स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है, और इसका उपयोग विभिन्न जानवरों के उपभेदों के फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है, साथ ही साथ ट्रांसजेनिक म्यूरिन,अवसादग्रस्तता राज्यों के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार की खोज करने वाले अध्ययनों में 9,21। +जानवर अपने नियंत्रण कूड़े की तुलना में काफी लंबे समय तक स्थिर थे, जो उनके अवसाद जैसे व्यवहार को दर्शाता है (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: पूंछ निलंबन परीक्षण में गतिहीनता समय। +जानवरों ने पूंछ निलंबन के दौरान एक लंबी गतिहीनता दिखाई। एक दो-तरफा एनोवा ने महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव दिखाए लेकिन जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन में कोई महत्व नहीं है (जीनोटाइप प्रभाव: पी < 0.001; सेक्स प्रभाव: पी < 0.001; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन : पी > 0.5)। बॉक्सप्लॉट में दर्शाया गया डेटा औसत मान, इंटरक्वार्टाइल रेंज और मूल्यों की सीमा दिखाता है। महत्वपूर्ण पोस्ट-हॉक परीक्षण परिणामों को * के रूप में इंगित किया गया है। नियंत्रित जानवरों (मादा एन = 10, नर एन = 14) के लिए डेटा लाल रंग में प्रस्तुत किया जाता है, और उत्परिवर्ती (महिला एन = 10, पुरुष एन = 11) नीले रंग में। यह आंकड़ा Syding et al.6 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रोटारोड और चाल विश्लेषण
न्यूरोमोटर घाटे के मॉडल में रोटारोड परीक्षण का इतिहास 20वीं शताब्दी22 के मध्य से शुरू होता है। रोटारोड का उपयोग पशु संतुलन और आंदोलन समन्वय का आकलन करने के लिए किया जाता है, क्योंकि उनकी हानि घूर्णन रॉड14 से गिरने के लिए काफी कम विलंबता में प्रकट होती है। रोटारोड पर बार-बार परीक्षण का उपयोग पशु मोटर सीखने की क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। आधुनिक उपकरणों और डिजिटल प्रौद्योगिकियों के तेजी से विकास ने कृंतक लोकोमोटर फेनोटाइप्स के स्वचालित, सटीक और निष्पक्ष मूल्यांकन को सक्षम किया है, जो उनकी चाल23 के विस्तृत विवरण पर आधारित है। स्वचालित चाल विश्लेषण ने पदचिह्न विश्लेषण को बदल दिया, और न्यूरोमस्कुलर घाटे 14,24,25 के प्रति भी अधिक संवेदनशील है। पशु चाल की स्थानिक-अस्थायी विशेषताओं के परिवर्तन मॉडलिंग नोसोलॉजिकल यूनिट26,27,28 के लिए विशिष्ट हैं। +उत्परिवर्ती में चाल सूचकांक (चित्रा 3 ए-जी) का एक मजबूत परिवर्तन था, जो आगे रोटारोड (चित्रा 3 एच) से गिरने के लिए कम विलंबता द्वारा पुष्टि की गई थी।

Figure 3
चित्रा 3: रोटारोड पर विस्तृत चाल विश्लेषण और मोटर सीखना। (ए-जी) यूबीई 3 ए एमजीनेडेल / + जानवरों के चाल सूचकांक बदल दिए गए थे। +जानवरों में एक लंबा स्विंग (ए) और रुख (बी) था जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक स्ट्राइड अवधि और लंबाई (सी, डी) थी। उनके पिछले अंग प्रणोदन अवधि (ई) और मंदी (एफ) में भी वृद्धि हुई थी। विश्लेषण से चरम रुख (जी) पर एक बड़े पंजे के क्षेत्र का भी पता चला। न तो जानवरों के मीट्रिक पैरामीटर और न ही वजन भिन्न थे (डेटा नहीं दिखाया गया), यह दर्शाता है कि देखे गए अंतर जानवरों के आकार में अंतर के कारण नहीं थे। बार-बार माप के साथ एक दो-तरफा एनोवा ने जीनोटाइप का एक महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव दिखाया जिसमें कोई महत्वपूर्ण जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन नहीं था (जीनोटाइप प्रभाव: पी < 0.001; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन: पी > 0.2)। (एच) रोटारोड प्रदर्शन के परिणाम UBE3AmGenedel / + जानवरों में गिरने के लिए एक छोटी विलंबता दिखाते हैं। बार-बार माप के साथ एक दो-तरफा एनोवा ने एक महत्वपूर्ण बातचीत के बिना महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव दिखाए (जीनोटाइप प्रभाव: पी < 0.001; सेक्स प्रभाव: पी < 0.01; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन: पी > 0.1)। बॉक्सप्लॉट में दर्शाए गए चाल पैरामीटर औसत मूल्य, इंटरक्वार्टाइल रेंज और मूल्यों की सीमा दिखाते हैं। महत्वपूर्ण पोस्ट-हॉक परीक्षण परिणामों को * के रूप में इंगित किया गया है। गिरने की विलंबता के डेटा को एसईएम के औसत ± रूप में एक लाइन प्लॉट में प्रस्तुत किया जाता है। नियंत्रित जानवरों (मादा एन = 10, नर एन = 14) के लिए डेटा लाल रंग में प्रस्तुत किया जाता है, और उत्परिवर्ती (महिला एन = 10, पुरुष एन = 11) नीले रंग में। यह आंकड़ा Syding et al.6 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नेस्लेट-श्रेडिंग - घोंसले का निर्माण
नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण मुख्य रूप से चूहों29,30 में रूढ़िवादी बाध्यकारी व्यवहार का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, चूहे अपने घोंसले के निर्माण के लिए प्रदान की गई सामग्री को फाड़ने की प्राकृतिक प्रवृत्ति दिखाते हैं। इस प्रकार एक सूती घोंसले को काटने में असमर्थता का उपयोग न्यूरोडेवलपमेंटल हानि16,31 से प्रभावित उनकी भलाई के संकेतक के रूप में किया जाता है। +जानवरों ने अपने घोंसले बनाने के लिए काफी कम सामग्री का उपयोग किया, और यह अंतर ट्रांसजेनिक महिलाओं और उनके नियंत्रण समकक्षों के बीच विशेष रूप से प्रमुख था (चित्रा 4 ए)।

Figure 4
चित्र 4: घोंसले के निर्माण के लिए नेस्लेट सामग्री का उपयोग। +जानवरों ने अपने नियंत्रण कूड़े की तुलना में कम कपास सामग्री काटा। डेटा को सामान्य शर्त को पूरा करने के लिए संरेखित रैंकों में बदल दिया गया था। बार-बार उपायों के साथ भिन्नता के विश्लेषण से जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन (जीनोटाइप प्रभाव: पी < 0.05; जीनोटाइप / सेक्स इंटरैक्शन: पी > 0.4) के महत्व के बिना एक महत्वपूर्ण जीनोटाइप प्रभाव का पता चला। लाइन प्लॉट में दर्शाया गया डेटा एसईएम ± माध्य दिखाता है। महत्वपूर्ण पोस्ट-हॉक परीक्षण परिणामों को * के रूप में इंगित किया गया है। नियंत्रित जानवरों (मादा एन = 10, नर एन = 14) के लिए डेटा लाल रंग में प्रस्तुत किया जाता है, और उत्परिवर्ती (महिला एन = 10, पुरुष एन = 11) नीले रंग में। यह आंकड़ा Syding et al.6 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

परीक्षण का समय
प्रत्येक समूह (नियंत्रण और प्रयोगात्मक) को एक ही दिन में एक ही परीक्षण के अधीन किया जाता है। संभावित कैरीओवर प्रभावों को कम करने के लिए परीक्षणों के बीच 1 दिन का ब्रेक नियोजित किया जाता है। यदि संभव हो, तो महिलाओं और पुरुषों को लगातार दिनों में परीक्षण किया जाता है; अन्यथा, पुरुषों का परीक्षण किए जाने के बाद महिलाओं का परीक्षण किया जाता है (चित्रा 5)6।

Figure 5
चित्रा 5: परीक्षण टाइमस्केल। +जानवरों और उनके नियंत्रण का परीक्षण दो समूहों में किया गया था। पहले समूह के लिए परीक्षण टाइमस्केल ऊपरी पैनल में प्रस्तुत किया जाता है, और निचले पैनल में दूसरे समूह के लिए। जिन दिनों पर पुरुषों का परीक्षण किया गया था, उन्हें नीले रंग में इंगित किया गया है, जबकि जिन दिनों पर महिलाओं का परीक्षण किया गया था, उन्हें हरे रंग में इंगित किया गया है। जिन दिनों पर दोनों लिंगों का परीक्षण किया गया था, उन्हें पीले रंग में इंगित किया गया है। सप्ताहांत पर कोई परीक्षण नहीं किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आंकड़ों को एमडीपीआई लाइसेंस नीति के अनुसार सिडिंग एट अल.6 से अनुकूलित किया गया था।

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Discussion

विभिन्न मुराइन उपभेदों में बनाए गए एएस मॉडल आमतौर परमानव लक्षणों की तुलना की सुविधा के लिए पशु भावनात्मक स्थिति, मोटर कार्यों और संज्ञानात्मक क्षमताओं के परीक्षणों के साथ मान्य होते हैं। एएस मॉडल में मोटर की कमी प्रयोगशालाओं में सबसे सुसंगत खोज है, इसके बाद उत्परिवर्ती की अपरिवर्तित भावनात्मकस्थिति और घोंसले के निर्माण में कठिनाइयों का सामना करनापड़ता है। इसके विपरीत, संज्ञानात्मक हानि या तो हल्की या अनुपस्थित 7,31,33 है। संज्ञानात्मक फेनोटाइप में विसंगति परीक्षण किए गए जानवरों की उम्र पर निर्भर करती है, जैसा कि हुआंग एट अल .7 द्वारा दिखाया गया है। इसलिए, इस पेपर के लिए, परीक्षणों की एक बैटरी को उनकी प्रजनन क्षमता, साथ ही आयु- और प्रजातियों-स्वतंत्रता के आधार पर चुना गया था, क्योंकि माउस और चूहे एएस मॉडल 6,31,32 दोनों में तुलनीय परिणाम देखे जाते हैं।

गंभीर रूप से, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअपों में बार-बार जानवरों का परीक्षण करने के लिए उनके सावधानीपूर्वक आदेश की आवश्यकता होती है, जो पूर्व हेरफेर के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील परीक्षणों से शुरू होता है, और साथ ही निम्नलिखित परीक्षणों पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, जैसे कि ईपीएम और ओएफ परीक्षण34। अतिरिक्त चिंताएं नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण से संबंधित हैं, जहां जानवरों को एकल-रखा जाता है, जिसे तनावपूर्ण स्थितिके रूप में जाना जाता है। इसके बाद, एक आम पिंजरे में पुरुषों को इकट्ठा करने से अक्सर पदानुक्रम स्थापना के कारण आक्रामकता बढ़ जाती है। इस प्रकार, नेस्लेट श्रेडिंग परीक्षण को परीक्षण अनुसूची का समापन करना चाहिए। महिलाओं से पहले पुरुषों का परीक्षण करना भी अच्छा अभ्यास है ताकि पुरुष व्यवहार को पीछे चल रही महिला घ्राण निशान से प्रभावित होने से बचाया जा सके। परीक्षण के दौरान विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों से संबंधित वैकल्पिक जानवर पशु व्यवहार पर अप्रत्याशित कारकों के प्रभावों को संतुलित करने के लिए व्यवहार अनुसंधान में महत्वपूर्ण हैं। यह सर्वविदित है कि ईपीएम में परीक्षण से पहले जानवरों को संभालना उनकी देखी गई तनाव प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। इसलिए, हैंडलिंग की मात्रासभी जानवरों के लिए सुसंगत होनी चाहिए। आवास की स्थिति (एकल बनाम समूह), परीक्षण के दौरान प्रकाश व्यवस्था, परीक्षण का समय और प्रत्येक जानवर के लिए परीक्षण अनुभव से पहले बनाए रखना भी बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये सभी कारक ईपीएम और ओएफ परीक्षण में माउस की प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैंऔर परिणामों को पूर्वाग्रह कर सकते हैं।

दवा विकास और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों फेनोटाइपिंग में अच्छी तरह से स्थापित स्क्रीनिंग टूल से संबंधित प्रस्तुत परीक्षणों के बावजूद जो प्रयोगशालाओं में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देते हैं, कुछ परीक्षण अभी भी मामूली संशोधनों के अधीन हो सकते हैं। चूंकि मोटर हानि एक एएस पशु मॉडल के फेनोटाइप की मुख्य विशेषता है, रोटारोड परीक्षण लगातार 5 दिनों के बजाय 1 दिन के परीक्षण तक सीमित हो सकता है। इसके अतिरिक्त, एक निर्मित घोंसले की गुणवत्ता का वर्णन करने वाले मापदंडों को नेस्लेट श्रेडिंग टेस्ट38 में शामिल किया जा सकता है।

प्रस्तुत परिणामों की एक स्पष्ट सीमा उनकी व्याख्या की अस्पष्टता है। विशेष रूप से, एएस जानवरों का मोटर कि घाटा हरकत-आधारित कार्यों में परिवर्तन की व्याख्या कर सकता है, जैसे कि ओएफ परीक्षण और ईपीएम। एनालॉजिकल रूप से, टीएसटी में लंबे समय तक गतिहीनता का समय अधिक शारीरिक थकान का परिणाम हो सकता है जो एएस जानवर इस मांग वाले परीक्षण के दौरान विकसित होते हैं, अवसादग्रस्तता जैसे व्यवहार के विपरीत। इसके अलावा, नेस्लेट श्रेडिंग टेस्ट में, कम कपास का उपयोग घोंसले के निर्माण वृत्ति के नुकसान के बजाय न्यूरोमस्कुलर फेनोटाइप के कारण हो सकता है। स्ट्राइड लंबाई में परिवर्तन की व्याख्या अस्पष्ट है, क्योंकि पार्किंसंस रोग के कुछ माउस मॉडल में छोटा पन देखा जाता है, जबकि उम्र बढ़ने वाले चूहों मेंलंबाई 39,40 देखी जाती है। हालांकि, हम मानते हैं कि कुल स्ट्राइड लंबाई में वृद्धि एक लंबी स्विंग अवधि का परिणाम है। स्विंग की अवधि दर्द के साथ बढ़ जाती है और गठिया मॉडल में लंबे समय तक होती है, जिसका अर्थ है कि चूहों में एक लंबी स्विंग अवधि संभावित रूप से वजन41,42 सहन करने से पहले अंगों की उचित स्थिति की अनुमति दे सकती है। प्रणोदन अवधि एक जानवर को आगे की गति शुरू करने और बनाए रखने के लिए आवश्यक समय की अवधि को संदर्भित करती है। इस प्रकार, स्वस्थ जानवरों में एक छोटी अवधि अधिक ताकत और बेहतर नियंत्रण का संकेत दे सकती है। ये निष्कर्ष न केवल इस एएस चूहों के मॉडल को चिह्नित करते हैं, बल्कि चाल हानि का भी संकेत देते हैं। हालांकि, इस तरह की हानि के शारीरिक आधार को स्पष्ट करने के लिए बारीकी से जांच की आवश्यकता है, जैसे कि मांसपेशियों की ताकत का निर्धारण करना और न्यूरोमस्कुलर कनेक्शन / संचरण की जांच करना।

व्याख्यात्मक दुविधा के बावजूद, व्यवहार परीक्षणों की प्रस्तुत बैटरी प्रयोगशालाओं में सुसंगत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करती है और एंजेलमैन सिंड्रोम के नए मुराइन मॉडल और नए चिकित्सीय दृष्टिकोण 6,31,32,43,44,45 के लिए एक सुरुचिपूर्ण सत्यापन उपकरण के रूप में काम कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज आरवीओ 68378050, LM2018126 चेक सेंटर फॉर फेनोजेनोमिक्स द्वारा एमईवाईएस सीआर, ओपी आरडीई सीजेड.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (चेक सेंटर फॉर फेनोजेनोमिक्स का उन्नयन: एमईवाईएस और ईएसआईएफ द्वारा अनुवाद अनुसंधान की दिशा में विकास), ओपी आरडीई सीजेड.02.1.01/0.0.01/0.0/18_046/0015861 द्वारा प्रदान किया गया था। इसके अलावा, इस अध्ययन को एनजीओ "एसोसिएशन ऑफ जीन थेरेपी (एएसजेंट)", चेकिया (https://asgent.org/) और चेक गणराज्य के शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय द्वारा प्रदान किए गए चेक सेंटर फॉर फेनोजेनोमिक्स से धन प्राप्त LM2023036।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE		 Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany		 Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

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References

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व्यवहार अंक 200 एंजेलमैन सिंड्रोम व्यवहार परीक्षण मॉडल सत्यापन UBE3A C57BL /
एक एंजेलमैन सिंड्रोम माउस मॉडल का व्यवहार लक्षण वर्णन
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Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J.,… More

Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

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