Summary
כתב יד זה מציג סדרה של מבחנים התנהגותיים הניתנים לשחזור כדי לאמת מודל עכבר של תסמונת אנג'למן.
Abstract
כתב יד זה מתאר סוללה של מבחנים התנהגותיים הזמינים כדי לאפיין פנוטיפים דמויי תסמונת אנג'למן (AS) במודל מוריני מבוסס של AS. אנו משתמשים בפרדיגמת הלמידה של רוטרוד, ניתוח הליכה מפורט ומבחן בניית קן כדי לזהות ולאפיין ליקויים מוטוריים של בעלי חיים. אנו בודקים רגשנות של בעלי חיים בשדה הפתוח ובמבחני מבוך מוגבהים פלוס, כמו גם את ההשפעה במבחן מתלה הזנב. כאשר עכברי AS נבדקים במבחן השדה הפתוח, יש לפרש את התוצאות בזהירות, שכן תפקוד מוטורי לקוי משפיע על התנהגות העכבר במבוך ומשנה את ציוני הפעילות.
יכולת השחזור והיעילות של המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כבר אומתו במספר קווי עכבר עצמאיים של Uba3a עם גרסאות נוקאאוט שונות, וביססו קבוצה זו של בדיקות ככלי אימות מצוין במחקר AS. מודלים עם המבנה הרלוונטי ותוקף הפנים יצדיקו חקירות נוספות כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהעניק פיתוח של טיפולים סיבתיים.
Introduction
תסמונת אנג'למן (AS) היא מחלה נוירו-התפתחותית נדירה. המקור הגנטי הנפוץ ביותר של AS הוא מחיקה גדולה של אזור 15q11-q13 של הכרומוזום שמקורו באם, שנמצא בכמעט 74% מהחולים1. מחיקה של אזור זה גורמת לאובדן של UBE3A, הגן הסיבתי העיקרי של AS המקודד E3 ubiquitin ligase. האלל האבהי של הגן UBE3A בתאי עצב מושתק בתהליך המכונה הטבעה. כתוצאה מכך, הטבעה אבהית של הגן מאפשרת ביטוי אימהי בלבד במערכת העצבים המרכזית (CNS)2. לכן, מחיקת גן UBE3A מכרומוזום שמקורו באם מובילה להתפתחות תסמיני AS. בבני אדם, AS מתבטא בסביבות גיל 6 חודשים, עם פיגור התפתחותי שנמשך לאורך כל שלבי ההתפתחות וגורם לתסמינים מתישים חמורים אצל אנשים מושפעים 3,4. תסמיני הליבה של ההפרעה כוללים את הגירעון של מיומנויות מוטוריות עדינות וגסות, כולל הליכה אטקסית קופצנית, ליקוי דיבור חמור ונכות אינטלקטואלית. כ-80% מחולי AS סובלים גם מהפרעות שינה ואפילפסיה. נכון להיום, הטיפול הזמין היחיד הוא תרופות סימפטומטיות, המפחיתות התקפים אפילפטיים ומשפרות את איכות השינה1. לכן, פיתוח מודלים חזקים של בעלי חיים עם פנוטיפים התנהגותיים הניתנים לשחזור לצד ניתוח פנוטיפ מעודן יהיה חיוני כדי להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ההפרעה ולגלות תרופות וטיפולים יעילים.
המורכבות של ההפרעה האנושית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית דורשת מאורגניזמי המודל להיות בעלי גנום, פיזיולוגיה והתנהגות דומים. עכברים פופולריים כאורגניזם מודל בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, גודלם הקטן והקלות היחסית של שינוי DNA. בשנת 1984 הציע פול וילנר שלושה קריטריונים בסיסיים לאימות מודל המחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי, המשמשים לקביעת ערךהמודל 5. בפשטות, תוקף המבנה משקף את המנגנונים הביולוגיים האחראים להתפתחות ההפרעה, תוקף הפנים משחזר את הסימפטומים שלה, ותוקף הניבוי מתאר את תגובת המודל לתרופות טיפוליות.
כדי לדבוק בעקרונות לעיל, בחרנו באטיולוגיה הגנטית הנפוצה ביותר, מחיקה גדולה של מוקד 15q11.2-13q האימהי כולל הגן UBE3A, כדי ליצור עכברי מודל AS. השתמשנו בטכניקת CRISPR/Cas9 כדי למחוק אזור באורך 76,225 bp המשתרע על פני כל הגן UBE3A, ומקיף הן את רכיבי הקידוד והן את האלמנטים שאינם מקודדים של הגן, בעכברים מרקע C57BL/6N6. לאחר מכן גידלנו את החיות כדי להשיג עכברים הטרוזיגוטיים מסוג UBE3A+/−. לצורך אימות פנים של המודל, השתמשנו בבעלי חיים מצלבים של נקבות UBE3A+/− וזכרים מסוג בר כדי להשיג צאצאי UBE3A+/- (זן בשם C57BL/6NCrl-UBE3A
המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כאן שייכים לכלי הפנוטיפ הנפוצים במחקר גנטי, הודות לערך הניבוי הגבוה שלהם ותוקף המבנה המספיק 8,9,10. השתמשנו בבדיקות אלה כדי לאמת מודל עכברי של AS על ידי סיכום תסמיני הליבה של המחלה האנושית באופן שניתן לשחזר ואינו תלוי בגיל. הרגשנות של החיה הוערכה במבוך פלוס מוגבה ובמבחני שדה פתוחים. שני הניסויים הללו מבוססים על קונפליקט גישה-הימנעות, שבו בעלי חיים חוקרים סביבה חדשה בחיפוש אחר מזון, מחסה או הזדמנויות הזדווגות, ובו בזמן נמנעים ממדורים חרדתיים11. בנוסף, מבחן השדה הפתוח משמש לבדיקת פעילות לוקומוטוריתשל עכבר 8. מבחן מתלה הזנב נמצא בשימוש נרחב במחקר דיכאון כדי לסנן תרופות נוגדות דיכאון חדשות או פנוטיפים דמויי דיכאון במודלים נוקאאוט עכבר12. מבחן זה מעריך את הייאוש שבעלי חיים מפתחים לאורך זמן במצב שאין מנוס ממנו. למידה מוטורית ומאפייני הליכה מפורטים נקבעו על הרוטרוד וב- DigiGait, בהתאמה. סיבולת בעלי חיים על המוט המאיץ מאפיינת את כישורי שיווי המשקל ותיאום התנועה שלו, בעוד ניתוח מפורט של דפוסי הצעדים של העכבר הוא הערכה רגישה של ליקויים עצביים-שריריים הקשורים להפרעות תנועה נוירוגנרטיביות רבות13,14,15. בדיקת גריסת הקן היא חלק מהמתודולוגיה הסטנדרטית לאיתור התנהגות אימפולסיבית במכרסמים, ומכיוון שהיא משתמשת בהתנהגות טבעית של בניית מכרסמים, היא מעידה על רווחת בעל החיים16,17.
גודלן של קבוצות הניסוי היה תוצאה של פשרה כדי לעמוד בדרישות חוק 3R ושימוש יעיל בביצועי הרבייה של המושבות. עם זאת, כדי להשיג כוח סטטיסטי, היו לקבוצות לא פחות מ -10 פרטים, בשל הקמת כמות מספקת של זוגות רבייה. למרבה הצער, ביצועי הרבייה לא תמיד הביאו למספר מספיק של בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים והניסויים ששימשו במחקר זה עברו בדיקה אתית ונערכו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU. המחקר אושר על ידי הוועדה המרכזית הצ'כית לרווחת בעלי חיים. עכברים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד והוחזקו בטמפרטורה קבועה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 12 שעות. העכברים קיבלו צ'או עכבר ומים אד ליביטום. העכברים שוכנו בקבוצות של שלושה עד שישה בעלי חיים בכל כלוב. לא בוצע טיפול מלבד שקילה לפני הבדיקה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. שיקולים כלליים לפני הבדיקה ובמהלכה
הערה: למען הבהירות וההבנה, הערות כלליות מובאות לפני תיאור המבחנים האישיים. זה חל על כל בדיקה, למעט כמובן מבחן גריסת הקן, המתבצע בחדר דיור ואינו דורש שימוש בציוד ניסיוני כלשהו.
- לארח בעלי חיים במתקן המחקר לפחות 14 יום לפני הבדיקה כדי למזער כל לחץ הנובע מהובלה ושינויים בסביבה.
- רשמו משקלים של בעלי חיים לפני הבדיקה, שכן משקל הוא גורם מבלבל נפוץ במחקר התנהגותי.
- הניחו לבעלי החיים להתאקלם בחדר הניסויים לפחות שעה אחת לאחר ההובלה מחדר הדיור שלהם כדי למזער את לחץ ההובלה, בכל פעם שהובלה כזו מתבצעת (כלומר, כל בדיקה המתוארת להלן למעט גריסת קן, המבוצעת בחדר הדיור).
- תייגו כל חיה על הזנב בטוש לא רעיל על בסיס מים כדי לאפשר זיהוי מהיר במהלך הניסוי.
- הסר את כל השתן והצואה שהופקדו על ידי בעלי החיים במנגנון הניסוי במהלך הבדיקה לאחר כל ניסוי.
- נגבו את כל המכשירים הניסיוניים עם 75% אלכוהול לפני ואחרי כל חיה שנבדקה. הניקוי מסיר עקבות ריח שהצטברו במהלך הבדיקה ומסייע לשמור על תנאי ניסוי יציבים.
- העבירו את בעלי החיים מהכלוב הביתי שלהם למכשיר הניסוי בזהירות רבה ככל האפשר, רצוי במיכל קטן ואטום, ואז שחררו אותם בחופשיות אלא אם כן יש צורך במניפולציות אחרות.
- הכניסו כל בעל חיים לכלוב החזקה זמני לאחר הבדיקה, כדי למנוע ממנו להשפיע על בעלי החיים שלא נבדקו בכלוב הביתי.
- בדוק זכרים ונקבות בימים עוקבים. החליפו את סדר הגנוטיפים השונים במהלך הבדיקה כדי לאזן גורמים סביבתיים בלתי צפויים בין קבוצות הניסוי.
- החזירו את בעלי החיים לכלוב הביתי שלהם לאחר שכל בעלי החיים נבדקו והחזירו אותם לחדר הדיור.
- במקרה של ניסויים חוזרים ונשנים בבעלי חיים, יש לשמור על מרווח של יום אחד לפחות בין כל בדיקה.
2. מבחנים התנהגותיים
- מבוך פלוס מוגבה (EPM)
הערה: שני המינים של זני עכברי C57BL/6NCrl ו-UBE3AmGenedel/+ נבדקו למחקר זה בגיל 9-12 שבועות. משקלם של בעלי החיים נע בין 22 ל -36 גרם לזכרים ו -18 עד 28 גרם לנקבות בזמן הבדיקה.- מקם את המבוך בצורת פלוס על פלטפורמת הבדיקה ממש מתחת למצלמה. בעזרת הפוטנציומטר שעל הקיר, כוונו את עוצמת האור ל-70 לוקס במרכזו בעזרת לוקסומטר, כאשר החיישן שלו ממוקם במרכז המבוך במהלך הכוונון.
- פתח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Viewer וטען את התצורה לבדיקת EPM על ידי לחיצה על הסמל בצד שמאל למעלה של הכרטיסייה תצורה . טען את תוסף EPM מתפריט קובץ . מלא את פרטי בעלי החיים באמצעות מקלדת המחשב - מזהה בעל חיים, גנוטיפ, מין ומידע הניסוי (תאריך, עוצמת אור) - בשדות המתאימים בכרטיסיה ניסוי . בדוק אם מיקום האזור, זרועות פתוחות וזרועות סגורות מוגדרים כראוי. בעזרת פקד חזותי ועכבר מחשב, ודא שאזורי המתאר הווירטואליים תואמים לאזורי EPM המתאימים בתצוגה המקדימה של הווידאו.
- EPM הוא מבחן המשמש להערכת חרדה כללית של בעל חיים, המבוסס על גישה להימנע מקונפליקט. מכרסמים נוטים באופן טבעי להימנע מאזורים מוארים היטב שאינם מוגנים (זרועות פתוחות), לטובת אזורים בטוחים יותר (זרועות סגורות). מכיוון שבדיקה אוטומטית לחלוטין זו מבוססת על מערכת מעקב וידאו, תן לתוכנה לחשב באופן אוטומטי את הזמן המושקע בכל אזור, כמו גם את מספר הכניסות.
- במהלך הניסויים, תיעדו את בעלי החיים בווידיאו באמצעות מצלמה תעשייתית רגישה לאור אינפרא אדום. אפשר לתוכנה לזהות את מיקום החיה בזמן אמת במהלך ההקלטה. לאחר מכן, תן לתוכנה להעריך באופן אוטומטי את עקבות החיה כדי לחשב את כל הפרמטרים המתארים את התנהגות החיה במבוך. השתמש בזמן המושקע בזרועות הפתוחות החרדתיות ובאחוז הביקורים בזרועות פתוחות כדי להעריך את רמת ההתנהגות דמוית החרדה אצל בעלי חיים.
הערה: המבוך המותאם אישית עשוי מחומר חדיר לאור אינפרא אדום ומונח על פלטפורמת מקור אור אינפרא אדום של דיודה פולטת אור (LED). - מקם את סמן העכבר על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של הכרטיסיה רכישה . הוציאו בעל חיים מהכלוב הביתי ביד והניחו אותו בעדינות במרכז ה-EPM. הפעל את הפרוטוקול על ידי לחיצה שמאלית על עכבר המחשב ועזוב את חדר הניסוי מיד.
- לאחר סיום פרוטוקול ההקלטה לאחר 5 דקות של חקר מבוך חופשי, שמור את הנתונים שהוקלטו על ידי לחיצה על אישור בחלון שמופיע לאחר סיום הפרוטוקול, תן שם לקובץ כראוי ולחץ על שמור. יצא את התוצאות לקובץ .csv עבור כל חיה שנבדקה לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על הסמל בחלונית האנכית השמאלית של הכרטיסייה ניתוח נתונים .
- הוציאו את בעל החיים מהמבוך ביד והכניסו אותו לכלוב ההחזקה הזמני. המשך עם ניסויים של כל בעלי החיים באותו אופן. העתק את התוצאות עבור כל בעלי החיים שנבדקו לקובץ פנקס רשימות לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על סמל העתק תוצאות בכרטיסיית התוצאות של תוסף מבוך פלוס מוגבה .
הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, מערך הניסוי, כגון תאורה או מיקום מחשב, עשוי להשתנות בהתאם לבניית מתקן בעלי החיים.
- בדיקת שדה פתוח (OF)
הערה: מבחן השדה הפתוח מעריך את התנועה הכוללת של בעל החיים, אשר מופעלת על ידי התנהגות גישוש בסביבה חדשה. בנוסף, הוא משמש בדרך כלל ככלי סינון לאיתור חרדה כללית בחלל לא מוגן ומואר היטב. זוהי בדיקה אוטומטית לחלוטין המשתמשת במערכת מעקב וידאו, אשר שימשה גם במבחן הקודם.- מקם את ארבע תיבות הבדיקה בפלטפורמת הבדיקה ממש מתחת למצלמה. באמצעות הפוטנציומטר שעל הקיר, כוונו את עוצמת האור ל-200 לוקס במרכז כל בדיקה בעזרת לוקסומטר, כאשר החיישן שלו ממוקם במרכז כל קופסה במהלך הכוונון.
- פתח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Viewer וטען את התצורה עבור בדיקות על ידי לחיצה על הסמל בצד שמאל למעלה של כרטיסיית התצורה . מלא את פרטי בעלי החיים באמצעות מקלדת המחשב - מזהה בעל חיים, גנוטיפ, מין ומידע על ניסוי (תאריך, עוצמת אור) - בשדות המתאימים בכרטיסיה ניסוי . בדוק אם מיקום האזור (מרכז ופריפריה) תואם לתיבות הבדיקה של OF והתאם אותן במידת הצורך. בעזרת פקד חזותי ועכבר מחשב, ודא שאזורי המרכז והפריפריה המתוארים הווירטואליים תואמים לאזורי הבדיקה המתאימים בתצוגה המקדימה של הווידאו.
- במהלך הניסויים, תיעדו את בעלי החיים בווידיאו באמצעות מצלמה תעשייתית, רגישה לאור אינפרא אדום. אפשר לתוכנה לזהות את מיקום החיה בזמן אמת במהלך ההקלטה ולהעריך באופן אוטומטי את עקבות החיה כדי לחשב את כל הפרמטרים המתארים את התנהגות החיה בתיבת הבדיקה. מרחק ההליכה, המהירות הממוצעת וזמן המנוחה הם פרמטרים המשמשים להערכת פעילות בעלי חיים בסביבה חדשה, בעוד שמספר הכניסות למרכז ומשך הזמן במרכז מתארים התנהגות דמוית חרדה אצל בעלי חיים.
הערה: המבוך המותאם אישית עשוי מחומר חדיר לאור אינפרא אדום וממוקם על פלטפורמת מקור אור אינפרא אדום LED. - מקם את סמן העכבר על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של הכרטיסיה רכישה . הוציאו ארבעה בעלי חיים מהכלוב הביתי ביד והניחו אותם בעדינות בפינה של כל קופסת בדיקה. הפעל את הפרוטוקול על ידי לחיצה שמאלית על עכבר מחשב ומיד לעזוב את חדר הניסוי.
- כאשר הפרוטוקול מסתיים לאחר 10 דקות של חקר מבוך חופשי, שמור את הנתונים על-ידי לחיצה על אישור בחלון שמופיע לאחר סיום הפרוטוקול, תן שם מתאים לקובץ ולחץ על שמור. יצא את התוצאות לקובץ .csv עבור כל חיה שנבדקה לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על הסמל בחלונית האנכית השמאלית של הכרטיסייה ניתוח נתונים .
- הוציאו את בעלי החיים מהמבוך ביד והכניסו אותם לכלוב ההחזקה הזמני. המשך עם ניסויים של כל בעלי החיים באותו אופן. נתח את הנתונים המיוצאים.
הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, מערך הניסוי, כגון תאורה, מספר מבוכים או מיקום מחשב, עשוי להשתנות בהתאם לבניית מתקן בעלי החיים.
- מבחן מתלה זנב (TST)
הערה: שלושה עכברים נבדקים בו זמנית באמצעות מנגנון מתלה הזנב האוטומטי.- שמרו על עוצמת האור בחדר ב-100-120 לוקס.
- חבר את מערכת TST למחשב באמצעות כבל USB. הכנס את פלאג ה- USB למחשב והפעל את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת BIO-TST . בכרטיסיה הגדרות תחת כללי, התאם את משך הרכישה ל- 360 שניות. בכרטיסיה ניסוי, בחר רשימת נבדקים חדשה וצור קובץ ניסוי חדש ורשימה חדשה של נבדקים על-ידי ביצוע ההוראות בכרטיסיה הפתוחה.
- התחל את הריצה על-ידי לחיצה על התחל הפעלה | המשך בכרטיסיה רכישה . הכינו את בעלי החיים לניסוי על ידי עטיפת סרט הדבקה חד צדדי, כגון הסרט הרפואי transpore, סביב 3/4 זנב החיה, החל מהבסיס.
- מעבירים את וו ההשעיה דרך הקלטת ותולים עליו את החיה. התחל לאסוף נתונים עבור כל בעל חיים בנפרד מיד לאחר תלייתו על הוו על ידי לחיצה על סמל התחל מתחת לתנוחה החזותית עבור כל בעל חיים והתבונן בבעלי חיים ברציפות במהלך הניסוי.
- לאחר השלמת הרכישה עבור קבוצת בעלי החיים הראשונה, לחץ על התחל את הריצה הבאה, הסר את החיות מהקרס, נתק את סרט ההדבקה מהזנב שלהן, גזר בזהירות את הסרט עם מספריים לאורך הזנב, והכנס את החיות לכלוב ההחזקה הזמני.
- נקו את המכשיר עם 75% אלכוהול ורקמות נייר והמשיכו עם שאר בעלי החיים כמתואר לעיל. בכרטיסיה ניתוח, בחר את 4 הדקות האחרונות של הרכישה לניתוח, ולאחר מכן בחר את כל הריצות החוקיות בתקופת הניתוח, לחץ על נתח נושאים נבחרים, בחר את תבנית הנתונים הרצויה ולחץ על יצא את הנתונים שנבחרו כדי לייצא את הנתונים שנאספו לניתוח נוסף.
הערה: הבדיקה נמשכת 6 דקות. במהלך 2 הדקות הראשונות, בעלי החיים ייאבקו במרץ, אך ככל שתגובת הייאוש הופכת לנפוצה במהלך 4 הדקות הנותרות, זמן חוסר התנועה בתקופה זו נלקח לניתוח. התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, הציוד עצמו עשוי להשתנות (למשל, מספר עמדות הבדיקה).
- ניתוח הליכה
- הפעל את ההליכון והגדר ידנית את מהירות החגורה ל- 20 ס"מ לשנייה בלוח הציוד על ידי לחיצה על הסמל + או - הממוקם ליד מחוון המהירות. הפעל את נורית המכשיר על ידי סיבוב הידית בכיוון השעון. הפעל את תוכנת DigiGait Imager על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה והגדר את מהירות התריס ל- 100 עבור עכברים לבקנים או 130 לעכברים שחורים/כהים בשדה למהירות תריס.
- הוציאו את בעל החיים הראשון מהכלוב הביתי ביד והניחו אותו בעדינות על חגורת ההליכון. סגור את דלת תא החיות. בדוק חזותית כדי לוודא שזנבו של בעל החיים אינו תקוע בין הדלת למסגרת.
- אפשרו לעכבר לחקור את חגורת ההליכון לפני ההקלטה. ודא כי בעל החיים מסוגל לבצע את הבדיקה על ידי הגדרת ההליכון למהירות הליכה איטית במשך ~ 3 שניות ולאחר מכן לעצור אותו, התבוננות בחיה ברציפות.
- הפעל את החגורה על ידי לחיצה על לחצן התחל בלוח הציוד והקלט במשך כ- 10 שניות. ודא כי תנועה ברורה ושוטפת של לפחות 10-15 צעדים ניתן לצפות. עצור את החגורה על ידי לחיצה על כפתור עצור בלוח הציוד והחזיר את העכבר לכלוב האחיזה הזמני ביד.
- מסך את ההקלטה עבור רצף של תמונות עם שלבים שוטפים על ידי לחיצה על PLAY וסקירת ההקלטה עם הפקד החזותי במצב EDIT . בחר 10-15 תנועות שוטפות על ידי כתיבה ידנית של מספרי המסגרת המתחילה והמסתיימת שלהם בשדות הרלוונטיים (ממסגרת# לפריים הראשון ואל לפריים האחרון). מלא את פרטי בעל החיים - תעודת זהות, תאריך לידה, מין, משקל, מהירות חגורה וזווית חגורה - והערה בעת הצורך בתחומים הרלוונטיים. שמור את הקובץ לניתוח נוסף על-ידי לחיצה על שמור.
- נקו את החגורה במים והמשיכו עם שאר בעלי החיים באותו אופן. בחר מצלמה כדי להמשיך בתיעוד ההליכה הבאה של בעל החיים. כאשר הקלטות נרכשות עבור כל בעלי החיים, להמשיך לניתוח.
הערה: בעלי חיים שאינם מסוגלים ללכת במהירות מוגדרת של החגורה אינם נכללים בניסויים. בהתבסס על הניסיון שלנו, אנו רואים כי בעלי חיים מבוגרים (מעל 50 שבועות) חווים יותר קשיים בהליכה על ההליכון, עם תדירות משתנה בין 2% ל -50% בהתאם לגנוטיפ. פסולת בעלי חיים נאספת במגשים בחלק הקדמי או האחורי של ההליכון. המגשים מרוקנים לאחר כל מחקר ונשטפים במי סבון חמימים. את החגורה מנגבים במטלית לחה. - בצע ניתוח הליכה המבוסס על ניתוח אוטומטי לחלוטין של הקלטות וידאו של עקבות בעלי חיים. התאימו את הנתונים בתוכנת DigiGait Analysis .
הערה: ניתוח הליכה מספק לא רק מדד של תיאום מוטורי, אלא גם תיאור קינמטי מפורט המבוסס על ניתוח של אות הליכה דינמי, המייצג את ההיסטוריה הטמפורלית של מיקום כפות באמצעות צעדים עוקבים. הפרמטרים הבאים נמדדים אוטומטית על ידי התוכנה: משך הנדנדה, אחוז משך הצעד בנדנדה, משך הבלימה, אחוז משך הצעד בבלימה , משך ההנעה, אחוז הצעד בהנעה, אחוז הצעד בעמידה, אחוז הצעד בעמדה, אחוז הבלימה מהעמידה, אחוז ההנעה בשלב העמידה, יחס נדנדה לעמידה, אורך צעד, תדירות צעד, זווית כפה, השתנות זווית כפה, רוחב עמידה, זווית צעד, השתנות אורך צעד, השתנות רוחב צעד, משתנה זווית צעד, מקדם וריאציה של אורך צעד, מקדם וריאציה של רוחב עמידה, מקדם וריאציה של זווית צעד, מקדם וריאציה של משך הנדנדה, שטח כף בעמדת שיא, השתנות שטח כף בעמדת שיא, משך העמידה המשותפת לגפה האחורית, אחוז העמידה המשותפת, יחס משכי העמידה האחורית השמאלית והימנית, סימטריית הליכה, קצב שינוי מקסימלי של שטח הכף במגע עם חגורת ההליכון בשלב הבלימה, קצב שינוי מקסימלי של שטח הכף במגע עם חגורת ההליכון בשלב ההנעה, הנעה, מרחק חפיפה של כפות הרגליים, מיקום מיקום כפות, מקדם אטקיה, מרחק קו אמצע, מרחק ציר וגרירת כפות. התוכנה מאפשרת תיקון קטן של רעש עקבות צעדים, אשר צריך להסתיים לפני ניתוח סטטיסטי. התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים.
- רוטרוד
הערה: מבחן הרוטרוד משמש להערכת תפקודים מוטוריים של מכרסמים - איזון ותיאום מוטורי. הבדיקה דורשת מהעכבר ללכת על מוט מסתובב בקוטר קבוע (5 ס"מ), כאשר הסיבוב מואץ על פני פרק זמן נתון (5 דקות) עד שבעל החיים כבר לא יכול להישאר דולק.- הפעל את ציוד הרוטרוד על ידי לחיצה על מתג ההפעלה/כיבוי של הציוד והפעל את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Rod . אתחל קובץ חדש בכרטיסיה קובץ ושמור אותו תחת השם המתאים. בחלון הגדרה , מלא את פרטי הניסוי, כגון תאריך, שם משתמש וכל הערה עתידית. הגדר את פרופיל המהירות ל- 300 שניות, את המהירות ההתחלתית ל- 4 סל"ד ואת מהירות המסוף ל- 40 סל"ד.
- הכינו לוח זמנים לבעלי החיים שנבדקו בשדה בעלי החיים , והקצו כל חיה למיקומה על המוט. המיקומים אינם מצוינים בתוכנה במפורש, אך הם תואמים את שורת הרשימה; לדוגמה, הקו הראשון יציין את המיקום הראשון של המוט, הקו החמישי יציין את המיקום החמישי של המוט, וכן הלאה. זכרו לאזן כל מיקום מוט בין קבוצות הניסוי.
הערה: ניתן לבדוק חמישה בעלי חיים בו זמנית. - סגור את החלונית Setup בלחיצה על Close ופתח את חלונית המדידה בלחיצה על Measure. התחל את הסיבוב הראשוני של המוט ב- 4 סל" ד על ידי לחיצה על התחל/עצור והנח את חמשת בעלי החיים הראשונים במיקומים שהוקצו להם. כאשר כל החיות נמצאות על המוט, התחל את פרוטוקול הבדיקה על ידי לחיצה על התחל פרופיל, והמוט יאיץ בהדרגה ל -40 סל"ד במשך 5 דקות. אם בעל חיים נופל מהמוט, החזירו אותו למוט לפני תחילת הפרוטוקול.
הערה: בעלי חיים בדרך כלל לא נשארים על המוט מספיק זמן כדי להניח עליו את כל העכברים בבת אחת במהלך הניסיון הראשון. חשוב להיות סבלני בעת הצבת בעלי חיים על המוט עם מהירות קבועה של סיבוב בהתחלה. מטרת הבדיקה אינה לקבוע את הסיבולת של בעל החיים על המוט במהירות סיבוב קבועה, אלא למצוא את המהירות שבה בעל החיים אינו מסוגל להישאר על המוט. מהירות המוט פרופורציונלית לחביון השהייה עליו; לכן, הוא משמש כדי לבטא את האיזון של החיה. - העבירו את בעלי החיים לכלוב ההחזקה הזמני לאחר שכולם נפלו מהמוט או לאחר שחלפו 5 דקות. הסר כל פסולת בעלי חיים ולנקות את המוט והמגש עם אלכוהול.
- לחץ על חיות -> כדי להמשיך עם קבוצת החיות הבאה באותו אופן. לאחר בדיקת כל בעלי החיים, סגור את החלון מדידה על-ידי לחיצה על סגור ולחץ על הצג כדי להציג את הנתונים שנאספו. יצא את הנתונים שנרכשו בתבנית קובץ .csv לניתוח נוסף על-ידי לחיצה על ייצוא CSV.
- בדוק כל חיה על המוט שלוש פעמים עם מרווחים של 15 דקות בין משפטים. השתמש בערך הממוצע של ההשהיה כדי ליפול על שלושת הניסויים לניתוח סטטיסטי נוסף. הערך את הלמידה המוטורית של בעל החיים על ידי חזרה על הבדיקה במשך 5 ימים רצופים.
הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, הציוד עצמו עשוי להשתנות, למשל, במספר עמדות הבדיקה, הבנייה הכוללת וממד המוט.
- בניית קן גריסה של נסטלט
- הפרידו את בעלי החיים לכלובי עכבר פוליקרבונט בודדים עם ציוד סטנדרטי (מצעים, רשת מזון ואספקת מים) למשך שבוע אחד. קחו כ-12 גרם של קן כותנה באמצעות מלקחיים, רשמו את משקלו באופן ידני באמצעות מאזניים, והניחו אותו באופן אקראי בכלוב, אך בצד הנגדי לאספקת המים. החזירו את הכלובים עם בעלי החיים לחדר הדיור.
- שקלו כל קן באותה שעה בכל יום במשך 4 הימים הבאים באופן ידני באמצעות מאזניים. רשום את המשקולות על נייר או בגיליון אלקטרוני מוכן מראש. יש לוודא שכל קן יבש בעת שקילה; אם לא, יבשו על כרית חימום והחזירו את כל הקינים לכלובים שהוקצו להם באותו זמן במקום שבו העכבר יצר את הקן שלו. אם הקן נקרע למספר חלקים, שקלו את הגדול ביותר.
- לצורך ניתוח הנתונים, מבטאים את הירידה במשקל הנסט בכל יום ביחס למשקל ההתחלתי ומציגים אותה כאחוז מהחומר המשומש.
הערה: החזרת זכרים לכלוב משותף עלולה להוביל לתוקפנות מוגברת ולפציעות לא רצויות בקרב בעלי החיים. לכן, יש לתזמן את בדיקת גריסת הקינון לקראת סוף משטר הבדיקות כדי למנוע פגיעה ברווחת בעלי החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבוך מוגבה פלוס ומבחני שדה פתוח
בדיקות EPM ו- OF משתמשות בנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור סביבות חדשות18,19. החקירה נשלטת על ידי קונפליקט גישה-הימנעות, שבו מכרסמים בוחרים בין חקר סביבה חדשה לבין הימנעות מסכנה אפשרית. בעלי חיים חוקרים מקומות לא ידועים בחיפוש אחר מחסה, קשר חברתי או ליקוט מזון. עם זאת, מקומות חדשים עשויים לכלול גורמי סיכון כגון טורפים או מתחרים. הן ה-OF Test והן ה-EPM מורכבים מתאים בטוחים ומסוכנים - הפריפריה והמרכז ב-OF Test וזרועות סגורות ופתוחות ב-EPM, בהתאמה. מכרסמים מעדיפים באופן טבעי תאים חשוכים וסגורים על פני אזורים פתוחים, מוגבהים ומוארים. לפיכך, חקירה מופחתת של החלקים המסוכנים/חרדתיים, המתבטאת בירידה במספר הביקורים ומשך הביקור, או כחביון מוגבר לביקור הראשון, מאפיינים התנהגות דמוית חרדה של בעלי חיים 8,11. זמן מנוחה, מהירות ממוצעת ומרחק חציה כולל מספקים מידע נוסף על הפעילות הספונטנית של בעלי החיים. אף אחד מהפרמטרים הקשורים להתנהגות דמוית חרדה לא השתנה במוטציות UBE3AmGenedel/+ במבחן OF או ב-EPM (איור 1D-G). אולם חיות UBE3AmGenedel/+ היו היפואקטיביות באופן משמעותי, כפי שמשתקף על ידי מרחק חצייה קצר יותר, מהירות ממוצעת נמוכה יותר וזמן מנוחה ארוך יותר במבחן (איור 1A-C).
איור 1: פעילות ספונטנית ותגובת חרדה לסביבה חדשה ב-EPM ובמבחן. (A-E) חקר השדה הפתוח. בעלי החיים UBE3AmGenedel/+ הלכו מרחק קצר יותר (A) עם מהירות ממוצעת נמוכה יותר (B) וזמן מנוחה ממושך (C). מספר הביקורים ומשך הזמן במרכז לא היה שונה בין בעלי חיים (D,E). ANOVA דו-כיווני חשף אפקט גנוטיפ עיקרי משמעותי ללא אינטראקציה משמעותית בין גנוטיפ למין (אפקט גנוטיפ: p < 0.01; אינטראקציה גנוטיפ/מין: p > 0.7 ). אחוז הביקורים בזרועות פתוחות וסגורות לא היה תלוי בגנוטיפ (F), וגם הזמן שבילה בזרועות הפתוחות החרדתיות לא היה שונה בין קבוצות הניסוי (G). ANOVA דו-כיוונית לא חשפה השפעות עיקריות משמעותיות או אינטראקציה גנוטיפית/מינית (אפקט גנוטיפ: p > 0.9; אינטראקציה גנוטיפית/מינית: p > 0.9). הנתונים המתוארים בתרשים התיבה מציגים את הערך החציוני, הטווח הבין-רבעוני וטווח הערכים. תוצאות משמעותיות של בדיקה פוסט-הוק מסומנות כ-*. נתונים עבור חיות ביקורת (נקבה n = 10, זכר n = 11) מוצגים באדום, ומוטנטים (נקבה n = 9, זכר n = 10) בכחול. נתון זה נלקח מ- Syding et al.6. קיצורים: EPM = מוגבה בתוספת מבוך; OF = שדה פתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מבחן מתלה זנב
ה-TST מודד ייאוש של בעלי חיים שנוצר במצב שאין מנוס ממנו. כאשר הם תלויים על ידי הזנב, מכרסמים הופכים לחסרי תנועה במהירות לאחר תקופה ראשונית של פעילות נמרצת. משך חוסר התנועה מעיד על גודל ה"ייאוש". מעבדות רבות הראו כי מגוון רחב של תרופות נוגדות דיכאון פעילות קלינית מפחיתות את משך חוסר התנועה 9,20,21. בדיקה לא מסובכת זו הפכה נפוצה לסינון חומרים נוגדי דיכאון פוטנציאליים, וניתן להשתמש בה גם כדי לאפיין את הפנוטיפ של זנים שונים של בעלי חיים, כמו גם מורינים טרנסגניים, במחקרים הבוחנים את הבסיס הנוירוביולוגי של מצבי דיכאון 9,21. חיות UBE3AmGenedel/+ היו חסרות תנועה זמן רב יותר באופן משמעותי מחברותיהן לקבוצת הביקורת, מה שמצביע על התנהגותן דמוית הדיכאון (איור 2).
איור 2: זמן חוסר תנועה במבחן מתלה הזנב. חיות UBE3AmGenedel/+ הראו חוסר תנועה ארוך יותר במהלך מתלה הזנב. ANOVA דו-כיווני הראה השפעות עיקריות משמעותיות אך ללא מובהקות בגנוטיפ/אינטראקציה בין המינים (אפקט גנוטיפ: p < 0.001; אפקט מין : p < 0.001; גנוטיפ/אינטראקציה מינית: p > 0.5). הנתונים המתוארים בתרשים התיבה מציגים את הערך החציוני, הטווח הבין-רבעוני וטווח הערכים. תוצאות משמעותיות של בדיקה פוסט-הוק מסומנות כ-*. נתונים עבור חיות ביקורת (נקבה n = 10, זכר n = 14) מוצגים באדום, ומוטנטים (נקבה n = 10, זכר n = 11) בכחול. נתון זה נלקח מ- Syding et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
רוטרוד וניתוח הליכה
ההיסטוריה של בדיקות רוטרוד במודלים של ליקויים נוירומוטוריים מתחילה באמצע המאה ה-2022. הרוטרוד משמש להערכת שיווי משקל ותיאום תנועה של בעלי חיים, שכן הליקויים שלהם מתבטאים בהשהיה קצרה משמעותית לנפילה מהמוט המסתובב14. ניסויים חוזרים ונשנים על הרוטרוד משמשים לחקר יכולות למידה מוטורית של בעלי חיים. ההתפתחות המהירה של ציוד מודרני וטכנולוגיות דיגיטליות אפשרה הערכה אוטומטית, מדויקת ובלתי משוחדת של פנוטיפים של מנועי מכרסמים בהתבסס על התיאורים המפורטים של הילוכם23. ניתוח הליכה אוטומטי החליף ניתוח טביעת רגל, והוא גם רגיש יותר לליקויים עצביים-שריריים14,24,25. שינויים במאפיינים מרחביים-זמניים של הילוך בעלי החיים הם ספציפיים ליחידה הנוזולוגית המעוצבת26,27,28. למוטנטים של UBE3AmGenedel/+ הייתה החלפה חזקה של מדדי הליכה (איור 3A-G), שאושרה עוד יותר על-ידי השהיה מופחתת ליפול מהרוטרוד (איור 3H).
איור 3: ניתוח הליכה מפורט ולמידה מוטורית על הרוטארוד. (א-ג) מדדי ההליכה של בעלי חיים מסוג UBE3AmGenedel/+ שונו. בעלי חיים מסוג UBE3AmGenedel/+ היו בעלי נדנדה ארוכה יותר (A) ועמידה (B) שהביאו למשך ואורך צעדים ארוכים יותר (C,D). גם משך ההנעה של הגפיים האחוריות שלהם (E) וההאטה (F) הוגדלו. הניתוח גילה גם שטח כפות גדול יותר בעמדת השיא (G). לא הפרמטרים המטריים ולא המשקל של בעלי החיים היו שונים (הנתונים לא הוצגו), מה שמצביע על כך שההבדלים שנצפו לא נבעו מהבדלים בגודל בעלי החיים. ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות הראה השפעה עיקרית משמעותית של גנוטיפ ללא אינטראקציה משמעותית בין גנוטיפ למין (אפקט גנוטיפ: p < 0.001; אינטראקציה גנוטיפית/מינית: p > 0.2). (H) תוצאות ביצועי הרוטרוד מראות השהיה קצרה יותר ליפול בבעלי חיים מסוג UBE3AmGenedel/+. ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות ונשנות גילה השפעות עיקריות משמעותיות ללא אינטראקציה משמעותית (אפקט גנוטיפ: p < 0.001; אפקט מין : p < 0.01; אינטראקציה גנוטיפ/מין: p > 0.1). פרמטרי הליכה המתוארים ב- boxplot מציגים את הערך החציוני, הטווח הבין-רבעוני וטווח הערכים. תוצאות משמעותיות של בדיקה פוסט-הוק מסומנות כ-*. נתונים על ההשהיה ליפול מוצגים בתרשים קו כממוצע ± SEM. נתונים עבור חיות ביקורת (נקבה n = 10, זכר n = 14) מוצגים באדום, ומוטנטים (נקבה n = 10, זכר n = 11) בכחול. נתון זה נלקח מ- Syding et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
גריסת נסטלט - בניית קן
מבחן גריסת הקן משמש בעיקר לזיהוי התנהגות סטריאוטיפית כפייתית בעכברים29,30. עם זאת, עכברים מראים נטייה טבעית לקרוע חומר שסופק לבניית הקן שלהם. חוסר היכולת לגרוס קן כותנה משמש אפוא אינדיקטור לרווחתם המושפעת מליקוי נוירו-התפתחותי16,31. חיות UBE3AmGenedel/+ השתמשו בהרבה פחות חומר כדי לבנות את הקנים שלהן, וההבדל הזה היה בולט במיוחד בין נקבות טרנסגניות לבין מקבילות הבקרה שלהן (איור 4A).
איור 4: שימוש בחומר קינון לבניית קן. בעלי חיים מסוג UBE3AmGenedel/+ גרסו פחות חומר כותנה מאשר חבריהם לקבוצת הביקורת. הנתונים שונו לדרגות מיושרות כדי לעמוד בתנאי הנורמליות המוקדמים. ניתוח השונות במדידות חוזרות ונשנות גילה אפקט גנוטיפ מובהק ללא מובהקות של אינטראקציה גנוטיפית/מינית (אפקט גנוטיפ: p < 0.05; אינטראקציה גנוטיפ/מין: p > 0.4). הנתונים המתוארים בתרשים הקו מראים ממוצע ± SEM. תוצאות משמעותיות של בדיקות פוסט-הוק מסומנות כ-*. נתונים עבור חיות ביקורת (נקבה n = 10, זכר n = 14) מוצגים באדום, ומוטנטים (נקבה n = 10, זכר n = 11) בכחול. נתון זה נלקח מ- Syding et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
לוח זמנים לבדיקה
כל קבוצה (בקרה וניסוי) נתונה לאותם מבחנים באותם ימים. הפסקה של יום אחד בין בדיקות מנוצל כדי למזער השפעות נשיאה פוטנציאליות. במידת האפשר, נקבות וזכרים נבדקים בימים רצופים; אחרת, נקבות נבדקות לאחר שהזכרים נבדקו (איור 5)6.
איור 5: ציר הזמן של הבדיקה. בעלי חיים מסוג UBE3AmGenedel/+ והבקרות שלהם נבדקו בשתי קבוצות. לוח הזמנים של הבדיקה עבור המחזור הראשון מוצג בלוח העליון, ועבור המחזור השני בלוח התחתון. הימים שבהם נבדקו הזכרים מסומנים בכחול, ואילו הימים שבהם נבדקו הנקבות מסומנים בירוק. הימים שבהם נבדקו שני המינים מסומנים בצהוב. בסופי שבוע לא בוצעו בדיקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הנתונים הותאמו מ-Syding et al.6 בהתאם למדיניות הרישוי של MDPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים שנוצרו בזני מורין שונים מאומתים בדרך כלל עם בדיקות של מצב רגשי של בעלי חיים, תפקודים מוטוריים ויכולות קוגניטיביות כדי להקל על השוואה לסימפטומים אנושיים31,32. ליקוי מוטורי במודלים של AS הוא הממצא העקבי ביותר במעבדות, ואחריו מצב רגשי ללא שינוי של מוטנטים וקשיים בבניית קנים31,32,33. לעומת זאת, ליקוי קוגניטיבי הוא קל או נעדר 7,31,33. נראה כי אי התאמה בפנוטיפ הקוגניטיבי תלויה בגיל בעלי החיים הנבדקים, כפי שמוצג על ידי Huang et al.7. לכן, עבור מאמר זה, נבחרה סוללה של בדיקות על בסיס יכולת השחזור שלהם, כמו גם גיל ועצמאות המינים, כמו תוצאות דומות נצפות הן עכבר וחולדה כמו מודלים 6,31,32.
באופן קריטי, יש לזכור כי ניסויים חוזרים ונשנים בבעלי חיים במערכי ניסוי שונים דורשים את הזמנתם הקפדנית, החל מהבדיקות הרגישות ביותר למניפולציות קודמות, ובמקביל עם השפעה מינימלית על הניסויים הבאים, כגון EPM ו- OF ניסויים34. חששות נוספים נוגעים לניסוי גריסת הקן, שבו בעלי החיים הם חד-ביתיים, מה שידוע כמצב מלחיץ35 . לאחר מכן, איגום זכרים בכלוב משותף מוביל לעתים קרובות לתוקפנות מוגברת עקב התבססות היררכית. לפיכך, מבחן גריסת הקן צריך לסיים את לוח הזמנים של הבדיקה. כמו כן, מומלץ לבדוק זכרים לפני נקבות כדי למנוע מהתנהגות זכרית להיות מושפעת מעקבות ריח נקביים נגררים. בעלי חיים מתחלפים השייכים לקבוצות ניסוי שונות במהלך הניסויים חיוניים במחקר התנהגותי כדי לאזן את ההשפעות של גורמים בלתי צפויים על התנהגות בעלי חיים. ידוע היטב כי טיפול בבעלי חיים לפני ניסוי ב-EPM משפיע על תגובת העקה שנצפתה בהם. לכן, כמות הטיפול חייבת להיות עקבית עבור כל בעלי החיים36 . כמו כן, חשוב מאוד לשמור על תנאי הדיור (יחיד לעומת קבוצה), תאורה במהלך הבדיקה, זמן הבדיקה, ולפני ניסיון הבדיקה עבור כל חיה, שכן כל הגורמים הללו משפיעים על תגובת העכבר ב- EPM וב- OF הבדיקה ועלולים להטות את התוצאות37.
למרות הבדיקות המוצגות השייכות לכלי סינון מבוססים היטב בפיתוח תרופות ופנוטיפ עכברים מהונדסים גנטית המניבים תוצאות הניתנות לשחזור במעבדות, חלק מהבדיקות עדיין יכולות להיות כפופות לשינויים קלים. מכיוון שליקוי מוטורי הוא המאפיין העיקרי של הפנוטיפ של מודל בעלי חיים AS, בדיקת הרוטרוד יכולה להיות מוגבלת ליום אחד של בדיקה במקום 5 ימים רצופים. בנוסף, ניתן לשלב פרמטרים המתארים את איכות הקן הבנוי בבדיקת גריסת קינון38.
מגבלה ברורה אחת של התוצאות המוצגות היא העמימות של פרשנותן. בפרט, הגירעון המוטורי של בעלי חיים יכול להסביר שינויים במשימות מבוססות תנועה, כגון ניסוי ו- EPM. מבחינה אנליטית, חוסר תנועה ממושך ב-TST יכול להיות תוצאה של עייפות פיזית גדולה יותר שבעלי חיים מפתחים במהלך מבחן תובעני זה, בניגוד להתנהגות דמוית דיכאון. כמו כן, במבחן גריסת הקן, שימוש מופחת בכותנה עשוי לנבוע מהפנוטיפ העצבי-שרירי ולא מאובדן אינסטינקט בניית הקן. הפרשנות של שינויים באורך הצעד היא מעורפלת, שכן קיצור נצפה בכמה מודלים עכבריים של מחלת פרקינסון, בעוד הארכה נצפתה בעכברים מזדקנים39,40. עם זאת, אנו מאמינים כי עלייה באורך הצעד הכולל היא תוצאה של משך נדנדה ארוך יותר. משך הנדנדה עולה עם הכאב והוא ממושך במודלים של דלקת פרקים, מה שמרמז על כך שמשך נדנדה ארוך יותר בעכברים עשוי לאפשר מיקום נכון של הגפיים לפני נשיאת משקל41,42. משך הנעה מתייחס למשך הזמן הדרוש לבעל חיים ליזום ולשמור על תנועה קדימה. לכן, משך זמן קצר בבעלי חיים בריאים עשוי להצביע על כוח רב יותר ושליטה טובה יותר. ממצאים אלה לא רק מאפיינים מודל עכברי AS זה, אלא גם מצביעים על ליקוי בהליכה. עם זאת, יש צורך בחקירה מעמיקה יותר כדי להבהיר את הבסיס הפיזיולוגי של ליקוי כזה, כגון קביעת כוח השרירים ובחינת קשרים/העברה עצבית-שרירית.
למרות הדילמה הפרשנית, הסוללה המוצגת של מבחנים התנהגותיים מספקת תוצאות ניתנות לשחזור עקביות במעבדות שונות ויכולה לשמש ככלי תיקוף אלגנטי למודלים חדשים של תסמונת אנג'למן וגישות טיפוליות חדשות 6,31,32,43,44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הצ'כית למדעים RVO 68378050, LM2018126 המרכז הצ'כי לפנוגנומיקה שסופק על ידי MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (שדרוג המרכז הצ'כי לפנוגנומיה: פיתוח לקראת מחקר תרגום על ידי MEYS ו- ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS ו- ESIF), ו- OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (איכות וקיבולת גבוהות יותר למודלים טרנסגניים על ידי MEYS ו- ERDF). בנוסף, מחקר זה קיבל מימון מהארגון הלא ממשלתי "האגודה לריפוי גנטי (ASGENT)", צ'כיה (https://asgent.org/) והמרכז הצ'כי LM2023036 לפנוגנומיקה המסופקים על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ'כית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
References
- Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
- Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
- Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
- Jolleff, N., Ryan, M. M.
- Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
- Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
- Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
- Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
- Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M.
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
- Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
- La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
- Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
- Hampton, T. G., et al.
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
- Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
- Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
- Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
- Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
- Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
- File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
- Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
- Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
- Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
- Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
- Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).
