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Behavior

Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65182
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

Questo manoscritto presenta una serie di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino con sindrome di Angelman.

Abstract

Questo manoscritto descrive una batteria di test comportamentali disponibili per caratterizzare i fenotipi simili alla sindrome di Angelman (AS) in un modello murino consolidato di AS. Utilizziamo il paradigma di apprendimento rotarod, l'analisi dettagliata dell'andatura e il test di costruzione del nido per rilevare e caratterizzare le disabilità motorie degli animali. Testiamo l'emotività animale in campo aperto e nei test a labirinto sopraelevati, nonché l'affetto nel test di sospensione della coda. Quando i topi AS vengono testati nel test in campo aperto, i risultati devono essere interpretati con cautela, poiché le disfunzioni motorie influenzano il comportamento del topo nel labirinto e alterano i punteggi di attività.

La riproducibilità e l'efficacia dei test comportamentali presentati è già stata convalidata in diverse linee murine Uba3a indipendenti con diverse varianti di knockout, stabilendo questa serie di test come un eccellente strumento di validazione nella ricerca sulla SA. I modelli con il costrutto e la validità del volto pertinenti giustificheranno ulteriori indagini per chiarire la fisiopatologia della malattia e garantire lo sviluppo di trattamenti causali.

Introduction

La sindrome di Angelman (AS) è una rara malattia del neurosviluppo. L'origine genetica più comune della SA è una grande delezione della regione 15q11-q13 del cromosoma di origine materna, che si trova in quasi il 74% dei pazienti1. La delezione di questa regione provoca la perdita di UBE3A, il principale gene causativo della SA che codifica per l'ubiquitina ligasi E3. L'allele paterno del gene UBE3A nei neuroni viene silenziato in un processo noto come imprinting. Di conseguenza, l'imprinting paterno del gene consente solo l'espressione materna nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Pertanto, la delezione del gene UBE3A dal cromosoma di origine materna porta allo sviluppo dei sintomi della SA. Nell'uomo, la SA si manifesta intorno ai 6 mesi di età, con ritardo dello sviluppo che persiste in tutte le fasi dello sviluppo e provoca gravi sintomi debilitanti nei soggetti affetti 3,4. I sintomi principali del disturbo includono il deficit delle capacità motorie fini e grossolane, tra cui andatura atassica a scatti, grave compromissione del linguaggio e disabilità intellettiva. Circa l'80% dei pazienti con SA soffre anche di disturbi del sonno ed epilessia. Ad oggi, l'unico trattamento disponibile sono i farmaci sintomatici, che riducono le crisi epilettiche e migliorano la qualità del sonno1. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali robusti con fenotipi comportamentali riproducibili insieme a una raffinata analisi della fenotipizzazione sarà essenziale per chiarire i meccanismi fisiopatologici del disturbo e scoprire farmaci e trattamenti efficaci.

La complessità del disturbo umano che colpisce il sistema nervoso centrale richiede che gli organismi modello possiedano un genoma, una fisiologia e un comportamento comparabili. I topi sono popolari come organismi modello a causa del loro breve ciclo riproduttivo, delle piccole dimensioni e della relativa facilità di modifica del DNA. Nel 1984, Paul Willner ha proposto tre criteri di base per la validazione del modello di malattia: il costrutto, il volto e la validità predittiva, che vengono utilizzati per determinare il valore del modello5. Semplicemente, la validità del costrutto riflette i meccanismi biologici responsabili dello sviluppo del disturbo, la validità del volto ne ricapitola i sintomi e la validità predittiva descrive la risposta del modello ai farmaci terapeutici.

Per aderire ai principi di cui sopra, abbiamo scelto l'eziologia genetica più comune, una grande delezione del locus materno 15q11.2-13q che include il gene UBE3A, per creare topi modello AS. Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per eliminare una regione lunga 76.225 bp che copre l'intero gene UBE3A, comprendendo sia gli elementi codificanti che quelli non codificanti del gene, nei topi provenienti da un background C57BL/6N6. Abbiamo quindi allevato gli animali per ottenere topi eterozigoti UBE3A+/−. Per la validazione facciale del modello, abbiamo utilizzato animali provenienti da incroci di femmine UBE3A+/− e maschi wild-type per ottenere la progenie UBE3A+/- (ceppo denominato C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e successivamente assegnato come UBE3A mGenedel/+) e compagni di cucciolata di controllo. Abbiamo testato le loro capacità motorie fini e grossolane, l'emotività e l'affetto per ricapitolare i sintomi principali dell'AS. In un precedente articolo, abbiamo anche valutato le funzioni cognitive degli animali, poiché i pazienti con AS soffrono anche di disabilità intellettiva6. Tuttavia, non abbiamo riscontrato disturbi cognitivi nei topiUBE3A mGenedel/+, forse a causa della giovane età degli animali al momento del test7. L'esame successivo degli animali più anziani, di circa 18 settimane, ha rivelato un deficit nella flessibilità comportamentale durante l'apprendimento inverso nel paradigma della preferenza di luogo. Tuttavia, la complessità delle apparecchiature impiegate per questa analisi richiede un modulo metodologico separato e non è incluso in questa sede.

I test comportamentali qui presentati appartengono agli strumenti di fenotipizzazione più comuni nella ricerca genetica, grazie al loro elevato valore predittivo e alla sufficiente validità del costrutto 8,9,10. Abbiamo utilizzato questi test per convalidare un modello murino di SA ricapitolando i sintomi principali della malattia umana in modo riproducibile e indipendente dall'età. L'emotività dell'animale è stata valutata nei test di labirinto elevato e campo aperto. Entrambi questi test si basano sul conflitto approccio-evitamento, in cui gli animali esplorano un nuovo ambiente in cerca di cibo, riparo o opportunità di accoppiamento, evitando contemporaneamente i compartimenti ansiogeni11. Inoltre, il test in campo aperto viene utilizzato per testare l'attività locomotoria di un topo8. Il test della sospensione della coda è ampiamente utilizzato nella ricerca sulla depressione per lo screening di nuovi farmaci antidepressivi o fenotipi simili alla depressione in modelli murini knockout12. Questo test valuta la disperazione che gli animali sviluppano nel tempo in una situazione ineluttabile. L'apprendimento motorio e le caratteristiche dettagliate dell'andatura sono state determinate rispettivamente sul rotarod e nel DigiGait. La resistenza dell'animale sull'asta accelerante caratterizza le sue capacità di equilibrio e coordinazione del movimento, mentre l'analisi dettagliata dei modelli di passo di un topo è una valutazione sensibile delle menomazioni neuromuscolari connesse a molti disturbi neurogenerativi del movimento13,14,15. Il test di triturazione del nido fa parte della metodologia standard per rilevare il comportamento impulsivo nei roditori e, poiché utilizza il comportamento naturale della costruzione dei roditori, indica il benessere dell'animale16,17.

La dimensione dei gruppi sperimentali è stata il risultato di un compromesso per soddisfare le esigenze della regola 3R e l'uso efficiente delle prestazioni di allevamento delle colonie. Tuttavia, per ottenere potere statistico, i gruppi avevano non meno di 10 individui, a causa della creazione di un numero sufficiente di coppie nidificanti. Purtroppo, le prestazioni riproduttive non sempre hanno portato a un numero sufficiente di animali.

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Protocol

Tutti gli animali e gli esperimenti utilizzati in questo studio sono stati sottoposti a revisione etica e sono stati condotti in conformità con la Direttiva Europea 2010/63/UE. Lo studio è stato approvato dalla Commissione centrale ceca per il benessere degli animali. I topi sono stati alloggiati in gabbie ventilate singolarmente e mantenuti a una temperatura costante di 22 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore. Ai topi è stato fornito cibo per topi e acqua ad libitum. I topi sono stati alloggiati in gruppi da tre a sei animali per gabbia. Prima del test non è stata eseguita alcuna manipolazione diversa dalla pesatura. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

1. Considerazioni generali prima e durante la prova

NOTA: Per motivi di chiarezza e comprensibilità, prima della descrizione delle singole prove vengono presentate osservazioni di carattere generale. Questo vale per ogni prova, con l'ovvia eccezione della prova di triturazione del nido, che viene effettuata in un locale di stabulazione e non richiede l'uso di alcuna attrezzatura sperimentale.

  1. Ospitare gli animali nella struttura di ricerca per almeno 14 giorni prima dei test per ridurre al minimo lo stress derivante dal trasporto e dai cambiamenti ambientali.
  2. Registrare il peso degli animali prima del test, poiché il peso è un fattore di confusione comune nella ricerca comportamentale.
  3. Lasciare gli animali acclimatati nella stanza sperimentale per almeno 1 ora dopo il trasporto dalla sala di stabulazione per ridurre al minimo lo stress da trasporto, ogniqualvolta tale trasporto abbia luogo (vale a dire, tutte le prove descritte di seguito, ad eccezione della triturazione dei nidi, che viene eseguita nella stanza di stabulazione).
  4. Etichettare ogni animale sulla coda con un pennarello non tossico a base d'acqua per consentire una rapida identificazione durante l'esperimento.
  5. Rimuovere tutte le urine e le feci depositate dagli animali nell'apparecchio sperimentale durante le prove dopo ogni prova.
  6. Pulire tutti gli apparecchi sperimentali con alcol al 75% prima e dopo ogni animale testato. La pulitura rimuove le tracce olfattive depositate durante i test e aiuta a mantenere stabili le condizioni sperimentali.
  7. Trasportare gli animali dalla gabbia di casa all'apparato sperimentale con la massima cura possibile, preferibilmente in un piccolo contenitore opaco, e poi rilasciarli liberamente a meno che non siano necessarie altre manipolazioni.
  8. Metti ogni animale in una gabbia temporanea dopo il test per evitare che influenzino gli animali non testati nella gabbia domestica.
  9. Testare maschi e femmine in giorni consecutivi. Alternare l'ordine dei diversi genotipi durante i test per controbilanciare i fattori ambientali imprevedibili tra i gruppi sperimentali.
  10. Rimetti gli animali nella loro gabbia di casa dopo che tutti gli animali sono stati testati e rimettili nella stanza di stabulazione.
  11. In caso di test ripetuti su animali, mantenere un intervallo di almeno 1 giorno tra un test e l'altro.

2. Test comportamentali

  1. Labirinto sopraelevato e (EPM)
    NOTA: Entrambi i sessi dei ceppi di topi C57BL/6NCrl e UBE3AmGenedel/+ sono stati testati per questo studio a 9-12 settimane di età. Il peso degli animali variava da 22 a 36 g per i maschi e da 18 a 28 g per le femmine al momento del test.
    1. Posiziona il labirinto a forma di più sulla piattaforma di test appena sotto la telecamera. Utilizzando il potenziometro a parete, imposta l'intensità della luce a 70 lux al suo centro con l'aiuto di un luxometro, con il suo sensore posizionato al centro del labirinto durante la regolazione.
    2. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del software Viewer e caricare la configurazione per il test EPM facendo clic sull'icona nella parte superiore sinistra della scheda Configurazione . Caricare il plug-in EPM dal menu File . Compila le informazioni sull'animale utilizzando la tastiera del computer - ID animale, genotipo, sesso e informazioni sull'esperimento (data, intensità della luce) - nei campi corrispondenti della scheda Esperimento . Controllare se la posizione della zona, le braccia aperte e le braccia chiuse sono configurate correttamente. Con l'aiuto di un controllo visivo e del mouse del computer, assicurarsi che le zone con contorno virtuale corrispondano alle zone EPM corrispondenti nell'anteprima video.
    3. L'EPM è un test utilizzato per valutare l'ansia generale di un animale, che si basa sul conflitto tra approccio ed evitamento. I roditori tendono naturalmente ad evitare le zone non protette ben illuminate (braccia aperte), a favore di quelle più sicure (braccia chiuse). Poiché questo test completamente automatizzato si basa su un sistema di tracciamento video, lascia che il software calcoli automaticamente il tempo trascorso in ogni zona e il numero di ingressi.
    4. Durante i test, registrare gli animali in video tramite una telecamera industriale sensibile alla luce infrarossa. Consenti al software di rilevare la posizione dell'animale in tempo reale durante la registrazione. Successivamente, lascia che il software valuti automaticamente le tracce dell'animale per calcolare tutti i parametri che descrivono il comportamento dell'animale nel labirinto. Usa il tempo trascorso nelle braccia aperte ansiogene e la percentuale di visite a braccia aperte per valutare il livello di comportamento ansioso negli animali.
      NOTA: Il labirinto su misura è realizzato in materiale permeabile alla luce infrarossa ed è posizionato su una piattaforma di sorgenti luminose a infrarossi a diodo emettitore di luce (LED).
    5. Posizionare il cursore del mouse sull'icona a forma di freccia in alto a sinistra della scheda Acquisizione . Rimuovere manualmente un animale dalla gabbia domestica e posizionarlo delicatamente al centro dell'EPM. Avvia il protocollo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse del computer e lascia immediatamente la stanza sperimentale.
    6. Una volta terminato il protocollo di registrazione dopo 5 minuti di esplorazione libera del labirinto, salvare i dati registrati facendo clic su OK nella finestra che appare dopo la terminazione del protocollo, assegnare un nome appropriato al file e fare clic su Salva. Esportare i risultati in un file .csv per ogni animale testato per l'analisi off-line facendo clic sull'icona nel pannello verticale sinistro della scheda Analisi dati .
    7. Rimuovi l'animale dal labirinto a mano e mettilo nella gabbia di contenimento temporanea. Procedere con i test su tutti gli animali allo stesso modo. Copia i risultati di tutti gli animali testati in un file Blocco note per l'analisi offline facendo clic sull'icona Copia risultati nella scheda dei risultati del plug-in del labirinto Elevated Plus .
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, la configurazione sperimentale, come l'illuminazione o il posizionamento del computer, può variare a seconda della struttura della struttura per animali.
  2. Test in campo aperto (OF)
    NOTA: Il test in campo aperto valuta il movimento complessivo di un animale, che è innescato dal comportamento esplorativo in un nuovo ambiente. Inoltre, è comunemente usato come strumento di screening per rilevare l'ansia generale in uno spazio non protetto e ben illuminato. Si tratta di un test completamente automatizzato che utilizza un sistema di tracciamento video, utilizzato anche nel test precedente.
    1. Posiziona le quattro caselle di test OF sulla piattaforma di test appena sotto la telecamera. Utilizzando il potenziometro a parete, impostare l'intensità luminosa a 200 lux al centro di ogni test OF con l'aiuto di un luxometro, con il suo sensore posto al centro di ogni scatola durante la regolazione.
    2. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del software Viewer e caricare la configurazione per il test OF facendo clic sull'icona nella parte in alto a sinistra della scheda Configurazione . Compila le informazioni sull'animale utilizzando la tastiera del computer - ID animale, genotipo, sesso e informazioni sull'esperimento (data, intensità della luce) - nei campi corrispondenti della scheda Esperimento . Controllare se la posizione della zona (centro e periferia) corrisponde alle caselle di test OF e regolarle se necessario. Con l'aiuto di un controllo visivo e del mouse del computer, assicurarsi che le zone centrali e periferiche con contorno virtuale corrispondano alle corrispondenti zone di test OF nell'anteprima video.
    3. Durante il test, registrare gli animali in video tramite una telecamera industriale sensibile alla luce infrarossa. Consenti al software di rilevare la posizione dell'animale in tempo reale durante la registrazione e valutare automaticamente le tracce dell'animale per calcolare tutti i parametri che descrivono il comportamento dell'animale nella scatola di prova OF. La distanza percorsa, la velocità media e il tempo di riposo sono parametri utilizzati per valutare l'attività degli animali in un nuovo ambiente, mentre il numero di ingressi al centro e la durata nel centro descrivono un comportamento simile all'ansia negli animali.
      NOTA: Il labirinto su misura è realizzato in materiale permeabile alla luce infrarossa ed è posizionato su una piattaforma di sorgente luminosa a infrarossi a LED.
    4. Posizionare il cursore del mouse sull'icona a forma di freccia in alto a sinistra della scheda Acquisizione . Rimuovere a mano quattro animali dalla gabbia domestica e posizionarli delicatamente nell'angolo di ciascuna scatola di prova OF. Avvia il protocollo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse di un computer e lascia immediatamente la stanza sperimentale.
    5. Al termine del protocollo dopo 10 minuti di esplorazione libera del labirinto, salvare i dati facendo clic su OK nella finestra visualizzata dopo la terminazione del protocollo, assegnare un nome appropriato al file e fare clic su Salva. Esportare i risultati in un file .csv per ogni animale testato per l'analisi off-line facendo clic sull'icona nel pannello verticale sinistro della scheda Analisi dati .
    6. Rimuovi gli animali dal labirinto a mano e mettili nella gabbia di contenimento temporanea. Procedere con i test su tutti gli animali allo stesso modo. Analizzare i dati esportati.
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, la configurazione sperimentale, come l'illuminazione, il numero di labirinti o il posizionamento del computer, può variare a seconda della costruzione della struttura per animali.
  3. Test di sospensione della coda (TST)
    NOTA: Tre topi vengono testati contemporaneamente con l'apparato di sospensione automatica della coda.
    1. Mantenere l'intensità luminosa della stanza a 100-120 lux.
    2. Collegare il sistema TST al computer tramite un cavo USB. Inserire il dongle USB nel computer e avviare il software facendo doppio clic sull'icona del software BIO-TST . Nella scheda Impostazioni in Globale, regolare la durata dell'acquisizione a 360 s. Nella scheda Esperimento , seleziona Nuovo elenco di soggetti e crea un nuovo file dell'esperimento e un nuovo elenco di soggetti testati seguendo le istruzioni nella scheda aperta.
    3. Avviare l'esecuzione facendo clic su Avvia esecuzione | continua nella scheda Acquisizione . Preparare gli animali al test avvolgendo del nastro monoadesivo, come il nastro medico transporato, intorno ai 3/4 della coda dell'animale, partendo dalla base.
    4. Passare il gancio di sospensione attraverso il nastro e appendere l'animale su di esso. Iniziare ad acquisire i dati per ogni animale individualmente subito dopo averlo appeso al gancio facendo clic sull'icona Avvia sotto la posizione visualizzata per ogni animale e osservare gli animali continuamente durante il test.
    5. Dopo aver completato l'acquisizione per il primo gruppo di animali, fare clic su Avvia la corsa successiva, rimuovere gli animali dal gancio, staccare il nastro adesivo dalla coda, tagliando con cura il nastro con le forbici lungo la coda e mettere gli animali nella gabbia di detenzione temporanea.
    6. Pulire l'apparecchio con alcool al 75% e fazzoletti di carta e procedere con il resto degli animali come descritto sopra. Nella scheda Analisi, selezionare gli ultimi 4 minuti dell'acquisizione per l'analisi, quindi selezionare tutte le esecuzioni valide nel periodo di analisi, fare clic su Analizza soggetti selezionati, scegliere il formato di dati desiderato e fare clic su Esporta dati selezionati per esportare i dati raccolti per ulteriori analisi.
      NOTA: Il test dura 6 min. Durante i primi 2 minuti, gli animali lotteranno vigorosamente, ma poiché la reazione di disperazione diventa prevalente durante i restanti 4 minuti, il tempo di immobilità durante questo periodo viene preso per l'analisi. Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, l'apparecchiatura stessa può variare (ad esempio, il numero di posizioni di test).
  4. Analisi dell'andatura
    1. Accendere il tapis roulant e impostare manualmente la velocità del nastro su 20 cm/s sul pannello dell'attrezzatura facendo clic sul simbolo + o - situato accanto all'indicatore di velocità. Accendere la luce dell'apparecchio ruotando la manopola in senso orario. Avviare il software DigiGait Imager facendo doppio clic sull'icona del software e impostare la velocità dell'otturatore su 100 per i mouse albini o su 130 per i mouse neri/scuri sul campo per la velocità dell'otturatore.
    2. Rimuovere manualmente il primo animale dalla gabbia domestica e posizionarlo delicatamente sul nastro del tapis roulant. Chiudere la porta dello scomparto animali. Ispezionare visivamente per assicurarsi che la coda dell'animale non sia incastrata tra la porta e il telaio.
    3. Consentire al mouse di esplorare il nastro del tapis roulant prima della registrazione. Accertarsi che l'animale sia in grado di eseguire il test impostando il tapis roulant su una velocità di camminata lenta per ~3 s e poi fermandolo, osservando continuamente l'animale.
    4. Avviare la cinghia premendo il pulsante Start sul pannello dell'apparecchiatura e registrare per circa 10 s. Assicurarsi che sia osservabile una locomozione chiara e fluida di almeno 10-15 passi. Arrestare la cinghia premendo il pulsante Stop sul pannello dell'apparecchiatura e riportare manualmente il mouse nella gabbia di attesa temporanea.
    5. Eseguire lo screening della registrazione per una sequenza di immagini con passi fluidi facendo clic su PLAY e rivedendo la registrazione con il controllo visivo in modalità EDIT. Scegli 10-15 movimenti fluenti scrivendo manualmente i loro numeri di fotogramma iniziale e finale nei campi pertinenti (Dal fotogramma# per il primo fotogramma e A per l'ultimo fotogramma). Compila le informazioni dell'animale - ID dell'animale, data di nascita, sesso, peso, velocità e angolo della cintura - e commenta quando necessario nei campi pertinenti. Salvare il file per un'ulteriore analisi facendo clic su Salva.
    6. Pulisci la cintura con acqua e procedi con il resto degli animali allo stesso modo. Scegli FOTOCAMERA per procedere con la registrazione del prossimo animale che cammina. Una volta acquisite le registrazioni di tutti gli animali, procedere all'analisi.
      NOTA: Gli animali che non sono in grado di camminare a una velocità impostata del nastro sono esclusi dal test. Sulla base della nostra esperienza, osserviamo che gli animali più anziani (oltre le 50 settimane) hanno più difficoltà a camminare sul tapis roulant, con una frequenza variabile tra il 2% e il 50% a seconda del genotipo. I rifiuti animali vengono raccolti in vassoi sulla parte anteriore o posteriore del tapis roulant. I vassoi vengono svuotati dopo ogni studio e lavati con acqua tiepida e sapone. La cintura viene pulita con adamp stoffa.
    7. Esegui l'analisi dell'andatura sulla base di un'analisi completamente automatizzata delle registrazioni video delle impronte degli animali. Regola i dati nel software di analisi DigiGait .
      NOTA: L'analisi dell'andatura fornisce non solo una misura della coordinazione motoria, ma anche una descrizione cinematica dettagliata basata sull'analisi del segnale dinamico dell'andatura, che rappresenta la storia temporale del posizionamento della zampa attraverso passi sequenziali. I seguenti parametri vengono misurati automaticamente dal software: durata dell'oscillazione, percentuale della durata della falcata in oscillazione, durata della frenata, percentuale della durata della falcata in frenata, durata della propulsione, percentuale della falcata nella propulsione, durata della posizione, percentuale della falcata in posizione, durata della falcata, percentuale di frenata della posizione, percentuale di propulsione della fase di appoggio, rapporto oscillazione/appoggio, lunghezza del passo, frequenza del passo, angolo della zampa, variabilità dell'angolo della zampa, larghezza della posizione, angolo del passo, variabilità della lunghezza della falcata, variabilità della larghezza della falcata, variabilità dell'angolo del passo, coefficiente di variazione della lunghezza della falcata, coefficiente di variazione della larghezza della posizione, coefficiente di variazione dell'angolo del passo, coefficiente di variazione della durata dell'oscillazione, area della zampa alla posizione di picco, variabilità dell'area della zampa alla posizione di picco, durata della posizione condivisa dell'arto posteriore, percentuale della posizione condivisa, rapporto tra la durata della posizione posteriore sinistra e destra, simmetria dell'andatura, velocità massima di cambiamento dell'area della zampa a contatto con il nastro del tapis roulant durante la fase di frenata, velocità massima di cambiamento dell'area della zampa a contatto con il nastro del tapis roulant durante la fase di propulsione, propulsione tau, distanza di sovrapposizione della zampa, posizionamento della zampa, coefficiente di atassia, distanza della linea mediana, distanza dell'asse e trascinamento della zampa. Il software consente una piccola correzione del rumore di traccia del passo, che dovrebbe essere completata prima dell'analisi statistica. Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali.
  5. Rotarod
    NOTA: Il test rotarod viene utilizzato per valutare le funzioni motorie dei roditori: equilibrio e coordinazione motoria. Il test richiede che un topo cammini su un'asta rotante di diametro fisso (5 cm), con la rotazione che accelera in un determinato periodo di tempo (5 minuti) fino a quando l'animale non riesce più a stare in piedi.
    1. Accendere l'apparecchiatura rotarod premendo l'interruttore di accensione/spegnimento sull'apparecchiatura e avviare il software facendo doppio clic sull'icona del software Rod. Inizializzare un nuovo file nella scheda File e salvarlo con il nome appropriato. Nella finestra Configurazione, compila i dettagli dell'esperimento, ad esempio la data, il nome dell'utente ed eventuali commenti. Impostare il profilo di velocità su 300 s, la velocità iniziale su 4 giri/min e la velocità terminale su 40 giri/min.
    2. Prepara un programma per gli animali testati nel campo Animali e assegna a ciascun animale la sua posizione sull'asta. Le posizioni non sono indicate nel software in modo esplicito, ma corrispondono alla riga dell'elenco; Ad esempio, la prima riga indicherebbe la prima posizione dell'asta, la quinta riga indicherebbe la quinta posizione dell'asta e così via. Ricordarsi di controbilanciare ogni posizione dell'asta tra i gruppi sperimentali.
      NOTA: Cinque animali possono essere testati contemporaneamente.
    3. Chiudere il pannello Impostazione facendo clic su Chiudi e aprire il pannello di misurazione facendo clic su Misura. Avviare la rotazione iniziale dell'asta a 4 giri/min facendo clic su Start/Stop e posizionare i primi cinque animali nelle posizioni assegnate. Quando tutti gli animali sono sull'asta, avviare il protocollo di test facendo clic su Avvia profilo e l'asta accelererà gradualmente a 40 giri/min in 5 minuti. Se un animale cade dall'asta, rimettila sull'asta prima dell'inizio del protocollo.
      NOTA: Gli animali di solito non rimangono sull'asta abbastanza a lungo da posizionare tutti i topi su di essa contemporaneamente durante il primo tentativo. È importante essere pazienti quando si posizionano gli animali sull'asta con la velocità di rotazione costante all'inizio. Lo scopo del test non è quello di determinare la resistenza dell'animale sull'asta a una velocità di rotazione fissa, ma di trovare la velocità alla quale l'animale non è in grado di rimanere sull'asta. La velocità dell'asta è proporzionale alla latenza di permanenza su di essa; Pertanto, è usato per esprimere l'equilibrio dell'animale.
    4. Spostare gli animali nella gabbia di detenzione temporanea dopo che tutti sono caduti dall'asta o dopo che sono trascorsi 5 minuti. Rimuovere eventuali escrementi animali e pulire l'asta e il vassoio con alcool.
    5. Fare clic su Animali -> per procedere con il gruppo di animali successivo nello stesso modo. Dopo aver testato tutti gli animali, chiudere la finestra Misura facendo clic su Chiudi e fare clic su Mostra per visualizzare i dati raccolti. Esportare i dati acquisiti in formato file .csv per ulteriori analisi facendo clic su Esporta CSV.
    6. Testare ogni animale sull'asta tre volte con intervalli di 15 minuti tra le prove. Utilizzare il valore medio della latenza per diminuire nelle tre prove per un'ulteriore analisi statistica. Valutare l'apprendimento motorio dell'animale ripetendo il test per 5 giorni consecutivi.
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, l'apparecchiatura stessa può variare, ad esempio, nel numero di posizioni di prova, nella costruzione complessiva e nelle dimensioni dell'asta.
  6. Costruzione di nidi di triturazione di nidi
    1. Separare gli animali in gabbie singole per topi in policarbonato con attrezzature standard (lettiera, rete alimentare e approvvigionamento idrico) per 1 settimana. Prendi circa 12 g di nido di cotone usando una pinza, registra il suo peso manualmente usando una bilancia e mettilo a caso in una gabbia, ma sul lato opposto alla rete idrica. Rimetti le gabbie con gli animali nella stanza di stabulazione.
    2. Pesare ogni nido alla stessa ora ogni giorno per i successivi 4 giorni manualmente utilizzando la bilancia. Registra i pesi su carta o in un foglio di calcolo predefinito. Assicurati che ogni nido sia asciutto quando viene pesato; In caso contrario, asciugare su un termoforo e riportare tutti i nidi nelle gabbie assegnate contemporaneamente nel luogo in cui il topo ha fatto il nido. Se il nido è strappato in più parti, pesare quella più grande.
    3. Per l'analisi dei dati, esprimere il decremento del peso del nido ogni giorno rispetto al peso iniziale e presentarlo come percentuale del materiale utilizzato.
      NOTA: Riportare i maschi in una gabbia comune può portare a un aumento dell'aggressività e a lesioni indesiderate tra gli animali. Pertanto, il test di triturazione del nido dovrebbe essere programmato verso la fine del regime di test per evitare di compromettere il benessere degli animali.

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Representative Results

Sopraelevato più labirinto e test in campo aperto
I test EPM e OF utilizzano la naturale tendenza dei roditori ad esplorare nuovi ambienti18,19. L'esplorazione è governata da un conflitto di avvicinamento-evitamento, in cui i roditori scelgono tra l'esplorazione di un nuovo ambiente e l'evitare possibili pericoli. Gli animali esplorano luoghi sconosciuti alla ricerca di riparo, contatto sociale o foraggiamento. Tuttavia, i nuovi luoghi possono comportare fattori di rischio come predatori o concorrenti. Sia il test OF che l'EPM sono costituiti da compartimenti sicuri e rischiosi: la periferia e il centro nel test OF e le braccia chiuse e aperte nell'EPM, rispettivamente. I roditori preferiscono naturalmente compartimenti bui e chiusi rispetto alle aree aperte, sopraelevate e molto illuminate. Pertanto, la ridotta esplorazione delle parti rischiose/ansiogene, espressa come decremento del numero di visite e della durata della visita, o come aumento della latenza alla prima visita, caratterizzano il comportamento ansiogeno degli animali 8,11. Il tempo di riposo, la velocità media e la distanza totale percorsa forniscono ulteriori informazioni sull'attività spontanea degli animali. Nessuno dei parametri relativi al comportamento ansioso è stato alterato nei mutantiUBE3A mGenedel/+ sia nel test OF che nell'EPM (Figura 1D-G). Tuttavia, gli animali UBE3AmGenedel/+ erano significativamente ipoattivi, come si evince da una distanza percorsa più breve, una velocità media inferiore e un tempo di riposo più lungo nel test OF (Figura 1A-C).

Figure 1
Figura 1: Attività spontanea e risposta ansiosa a un nuovo ambiente nel test EPM e OF. (A-E) Esplorazione del campo aperto. Gli animaliUBE3A mGenedel/+ hanno percorso una distanza più breve (A) con una velocità media inferiore (B) e un tempo di riposo prolungato (C). Il numero di visite e la durata nel centro non differivano tra gli animali (D,E). Un'ANOVA bidirezionale ha rivelato un significativo effetto del genotipo principale senza alcuna interazione significativa tra genotipo e sesso (effetto genotipo: p < 0,01; interazione genotipo/sesso: p > 0,7). La percentuale di visite a braccia aperte e chiuse non dipendeva dal genotipo (F), né il tempo trascorso a braccia aperte ansiogene differiva tra i gruppi sperimentali (G). Un'ANOVA bidirezionale non ha rivelato effetti principali significativi o interazione genotipo/sesso (effetto genotipo: p > 0,9; interazione genotipo/sesso: p > 0,9). I dati illustrati nel boxplot mostrano il valore mediano, l'intervallo tra quartili e l'intervallo di valori. I risultati significativi dei test post-hoc sono indicati con *. I dati per gli animali di controllo (femmine n = 10, maschi n = 11) sono presentati in rosso, mentre i mutanti (femmine n = 9, maschi n = 10) sono presentati in blu. Questa figura è stata adattata da Syding et al.6. Abbreviazioni: EPM = elevato più labirinto; OF = campo aperto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Test di sospensione della coda
Il TST misura la disperazione animale sviluppatasi in una situazione ineluttabile. Quando sono sospesi per la coda, i roditori diventano rapidamente immobili dopo un periodo iniziale di attività vigorosa. La durata dell'immobilità indica l'entità della "disperazione". Numerosi laboratori hanno dimostrato che un'ampia gamma di farmaci antidepressivi clinicamente attivi riduce la durata dell'immobilità 9,20,21. Questo test semplice è diventato comunemente usato per lo screening di potenziali sostanze antidepressive e può anche essere utilizzato per caratterizzare il fenotipo di vari ceppi animali, così come murini transgenici, in studi che esplorano le basi neurobiologiche degli stati depressivi 9,21. Gli animali UBE3AmGenedel/+ sono rimasti immobili significativamente più a lungo rispetto ai loro compagni di cucciolata di controllo, indicando il loro comportamento simile alla depressione (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Tempo di immobilità nel test di sospensione della coda. Gli animali UBE3AmGenedel/+ hanno mostrato un'immobilità più lunga durante la sospensione della coda. Un'ANOVA a due vie ha mostrato effetti principali significativi, ma nessun significato nell'interazione genotipo/sesso (effetto genotipo: p < 0,001; effetto sesso : p < 0,001; interazione genotipo/sesso: p > 0,5). I dati illustrati nel boxplot mostrano il valore mediano, l'intervallo interquartile e l'intervallo di valori. I risultati significativi dei test post-hoc sono indicati con *. I dati per gli animali di controllo (femmina n = 10, maschio n = 14) sono presentati in rosso, mentre i mutanti (femmina n = 10, maschio n = 11) sono presentati in blu. Questa figura è stata adattata da Syding et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rotarod e analisi del cammino
La storia del test del rotarod in modelli di deficit neuromotori risale alla metà del 20° secolo. Il rotarod viene utilizzato per valutare l'equilibrio degli animali e la coordinazione dei movimenti, poiché le loro menomazioni si manifestano in una latenza significativamente più breve per cadere dall'asta rotante14. Test ripetuti sul rotarod vengono utilizzati per studiare le capacità di apprendimento motorio degli animali. Il rapido sviluppo delle moderne attrezzature e delle tecnologie digitali ha consentito una valutazione automatizzata, precisa e imparziale dei fenotipi locomotori dei roditori sulla base delle descrizioni dettagliate della loro andatura23. L'analisi automatizzata dell'andatura ha sostituito l'analisi dell'impronta ed è anche più sensibile ai deficit neuromuscolari14,24,25. Le alterazioni delle caratteristiche spazio-temporali dell'andatura animale sono specifiche dell'unità nosologica modellata26,27,28. I mutantiUBE3A mGenedel/+ avevano una robusta alternanza di indici di deambulazione (Figura 3A-G), ulteriormente confermata da una ridotta latenza di caduta dal rotarod (Figura 3H).

Figure 3
Figura 3: Analisi dettagliata dell'andatura e apprendimento motorio sul rotarod. (A-G) Gli indici dell'andatura degli animali UBE3AmGenedel/+ sono stati alterati. Gli animali UBE3AmGenedel/+ avevano un'oscillazione (A) e una posizione (B) più lunghe che hanno comportato una durata e una lunghezza del passo prolungate (C,D). Anche la durata della propulsione (E) e la decelerazione (F) degli arti posteriori sono state aumentate. L'analisi ha anche rivelato un'area della zampa più ampia nella posizione di picco (G). Né i parametri metrici né il peso degli animali differivano (dati non mostrati), indicando che le differenze osservate non erano dovute a differenze nelle dimensioni degli animali. Un'ANOVA bidirezionale con misurazioni ripetute ha mostrato un effetto principale significativo del genotipo senza alcuna interazione genotipo/sesso significativa (effetto genotipo : p < 0,001; interazione genotipo/sesso: p > 0,2). (H) I risultati delle prestazioni del rotarod mostrano una latenza più breve per diminuire negli animali UBE3AmGenedel/+. Un'ANOVA bidirezionale con misurazioni ripetute ha rivelato effetti principali significativi senza un'interazione significativa (effetto genotipo: p < 0,001; effetto sesso : p < 0,01; interazione genotipo/sesso: p > 0,1). I parametri dell'andatura illustrati nel boxplot mostrano il valore mediano, l'intervallo interquartile e l'intervallo di valori. I risultati significativi dei test post-hoc sono indicati con *. I dati relativi alla latenza di caduta sono presentati in un grafico a linee come media ± SEM. I dati per gli animali di controllo (femmine n = 10, maschi n = 14) sono presentati in rosso e i mutanti (femmina n = 10, maschio n = 11) in blu. Questa figura è stata adattata da Syding et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Triturazione di nidi - costruzione di nidi
Il test di triturazione del nido viene utilizzato principalmente per rilevare il comportamento compulsivo stereotipato nei topi29,30. Tuttavia, i topi mostrano una tendenza naturale a strappare il materiale fornito per costruire il loro nido. L'incapacità di sminuzzare un nido di cotone viene quindi utilizzata come indicatore del loro benessere influenzato da una compromissione dello sviluppo neurologico16,31. Gli animaliUBE3A mGenedel/+ hanno utilizzato molto meno materiale per costruire i loro nidi, e questa differenza è stata particolarmente evidente tra le femmine transgeniche e le loro controparti di controllo (Figura 4A).

Figure 4
Figura 4: Uso del materiale per nidi per la costruzione del nido. Gli animali UBE3AmGenedel/+ hanno triturato meno materiale di cotone rispetto ai loro compagni di cucciolata di controllo. I dati sono stati trasformati in ranghi allineati per soddisfare il prerequisito di normalità. Un'analisi della varianza con misure ripetute ha rivelato un effetto genotipico significativo senza una significatività dell'interazione genotipo/sesso (effetto genotipo: p < 0,05; interazione genotipo/sesso: p > 0,4). I dati illustrati nel grafico a linee mostrano la media ± SEM. I risultati significativi dei test post-hoc sono indicati con *. I dati per gli animali di controllo (femmina n = 10, maschio n = 14) sono presentati in rosso, mentre i mutanti (femmina n = 10, maschio n = 11) sono presentati in blu. Questa figura è stata adattata da Syding et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempistica del test
Ogni gruppo (di controllo e sperimentale) viene sottoposto agli stessi test negli stessi giorni. Viene impiegata una pausa di 1 giorno tra un test e l'altro per ridurre al minimo i potenziali effetti di trascinamento. Se possibile, femmine e maschi vengono testati in giorni consecutivi; in caso contrario, le femmine vengono testate dopo che i maschi sono stati testati (Figura 5)6.

Figure 5
Figura 5: Tempistica del test. Gli animali UBE3AmGenedel/+ e i loro controlli sono stati testati in due coorti. La scala temporale dei test per la prima coorte è presentata nel pannello superiore e per la seconda coorte nel pannello inferiore. I giorni in cui sono stati testati i maschi sono indicati in blu, mentre i giorni in cui sono state testate le femmine sono indicati in verde. I giorni in cui entrambi i sessi sono stati testati sono indicati in giallo. Nessun test è stato eseguito nei fine settimana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le cifre sono state adattate da Syding et al.6 in conformità con la politica di licenza MDPI.

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Discussion

I modelli di AS creati in diversi ceppi murini sono comunemente convalidati con test dello stato emotivo, delle funzioni motorie e delle capacità cognitive degli animali per facilitare il confronto con i sintomi umani31,32. Un deficit motorio nei modelli di AS è il risultato più consistente in tutti i laboratori, seguito da uno stato emotivo invariato dei mutanti e dalle difficoltà a costruire i nidi31,32,33. Al contrario, il deterioramento cognitivo è lieve o assente 7,31,33. La discrepanza nel fenotipo cognitivo sembra dipendere dall'età degli animali testati, come mostrato da Huang et al.7. Pertanto, per questo articolo, è stata scelta una batteria di test sulla base della loro riproducibilità, nonché dell'indipendenza dall'età e dalla specie, poiché risultati comparabili sono stati osservati sia nei modelli di AS di topo chedi ratto 6,31,32.

Criticamente, si dovrebbe tenere a mente che testare ripetutamente gli animali in diverse configurazioni sperimentali richiede un loro ordine accurato, a partire dai test più sensibili alla manipolazione preventiva, e allo stesso tempo con un effetto minimo sui test successivi, come i test EPM e OF34. Ulteriori preoccupazioni riguardano il test di triturazione dei nidi, in cui gli animali sono alloggiati in una sola stabulazione, che è noto per essere una condizione stressante35. Successivamente, raggruppare i maschi in una gabbia comune spesso porta a un aumento dell'aggressività a causa dell'instaurazione della gerarchia. Pertanto, la prova di triturazione del nido dovrebbe concludere il programma di prova. È anche buona norma testare i maschi prima delle femmine per evitare che il comportamento maschile venga influenzato dalle tracce olfattive femminili. L'alternanza di animali appartenenti a diversi gruppi sperimentali durante i test è fondamentale nella ricerca comportamentale per bilanciare gli effetti di fattori imprevedibili sul comportamento animale. È ben noto che la manipolazione degli animali prima dei test nell'EPM influenza la loro risposta allo stress osservata. Pertanto, la quantità di manipolazione deve essere coerente per tutti gli animali36. È anche molto importante mantenere le condizioni di stabulazione (singolo o gruppo), l'illuminazione durante il test, il tempo del test e prima dell'esperienza di test per ogni animale, poiché tutti questi fattori influenzano la risposta di un topo nel test EPM e OF e possono influenzare i risultati37.

Nonostante i test presentati appartengano a strumenti di screening consolidati nello sviluppo di farmaci e nella fenotipizzazione di topi geneticamente modificati che producano risultati riproducibili in tutti i laboratori, alcuni test possono ancora essere soggetti a modifiche minori. Poiché la compromissione motoria è la caratteristica principale del fenotipo di un modello animale di SA, il test del rotarod potrebbe essere limitato a 1 giorno invece di 5 giorni consecutivi. Inoltre, i parametri che descrivono la qualità di un nido costruito potrebbero essere incorporati nel test di triturazione del nido38.

Un chiaro limite dei risultati presentati è l'ambiguità della loro interpretazione. In particolare, il deficit motorio degli animali con AS può spiegare i cambiamenti nei compiti basati sulla locomozione, come il test OF e l'EPM. Analogamente, un tempo di immobilità prolungato nel TST può essere il risultato della maggiore stanchezza fisica che gli animali AS sviluppano durante questo test impegnativo, al contrario del comportamento depressivo. Inoltre, nel test di triturazione del nido, la riduzione dell'uso di cotone può essere dovuta al fenotipo neuromuscolare piuttosto che alla perdita dell'istinto di costruzione del nido. L'interpretazione delle variazioni della lunghezza del passo è ambigua, poiché l'accorciamento è stato osservato in alcuni modelli murini di malattia di Parkinson, mentre il prolungamento è stato osservato nei topi anziani39,40. Tuttavia, riteniamo che un aumento della lunghezza totale del passo sia una conseguenza di una maggiore durata dello swing. La durata dell'oscillazione aumenta con il dolore ed è prolungata nei modelli di artrite, il che implica che una durata dell'oscillazione più lunga nei topi potrebbe potenzialmente consentire il corretto posizionamento degli arti prima di sopportare il peso41,42. La durata della propulsione si riferisce alla durata del tempo necessario a un animale per avviare e mantenere il movimento in avanti. Pertanto, una breve durata negli animali sani può indicare una maggiore forza e un migliore controllo. Questi risultati non solo caratterizzano questo modello murino AS, ma indicano anche una compromissione dell'andatura. Tuttavia, è necessaria un'indagine più approfondita per chiarire le basi fisiologiche di tale compromissione, come la determinazione della forza muscolare e l'esame delle connessioni/trasmissione neuromuscolari.

Nonostante il dilemma interpretativo, la batteria di test comportamentali presentata fornisce risultati riproducibili coerenti tra i laboratori e può servire come elegante strumento di validazione per nuovi modelli murini della sindrome di Angelman e nuovi approcci terapeutici 6,31,32,43,44,45.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia ceca delle scienze RVO 68378050, LM2018126 Centro ceco per la fenogenomica fornito da MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II di MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (qualità e capacità superiori per i modelli transgenici di MEYS e FESR). Inoltre, questo studio ha ricevuto finanziamenti dall'ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", dalla Repubblica Ceca (https://asgent.org/) e dal Centro cec LM2023036 o di fenogenomica fornito dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE		 Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany		 Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

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References

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Comportamento Sindrome di Angelman test comportamentali validazione del modello UBE3A C57BL/6N
Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman
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Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J.,… More

Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

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