Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

Summary

Este manuscrito apresenta um conjunto de testes comportamentais altamente reprodutíveis para validar um modelo de camundongo com síndrome de Angelman.

Abstract

Este manuscrito descreve uma bateria de testes comportamentais disponíveis para caracterizar fenótipos semelhantes à síndrome de Angelman (SA) em um modelo murino estabelecido de EA. Usamos o paradigma de aprendizado de rotarod, análise detalhada da marcha e teste de construção de ninhos para detectar e caracterizar deficiências motoras em animais. Testamos a emocionalidade dos animais em campo aberto e testes de labirinto em cruz elevados, bem como o efeito no teste de suspensão de cauda. Quando camundongos SA são testados no teste de campo aberto, os resultados devem ser interpretados com cuidado, uma vez que disfunções motoras influenciam o comportamento de camundongos no labirinto e alteram os escores de atividade.

A reprodutibilidade e eficácia dos testes comportamentais apresentados já foi validada em várias linhagens independentes de camundongos Uba3a com diferentes variantes knockout, estabelecendo este conjunto de testes como uma excelente ferramenta de validação em pesquisas de EA. Modelos com validade de construto e de face relevantes justificarão novas investigações para elucidar a fisiopatologia da doença e propiciar o desenvolvimento de tratamentos causais.

Introduction

A síndrome de Angelman (SA) é uma doença rara do neurodesenvolvimento. A origem genética mais comum da EA é uma grande deleção da região 15q11-q13 do cromossomo materno, que é encontrada em quase 74% dos pacientes¹. A deleção dessa região causa a perda de UBE3A, o principal gene causador da EA que codifica uma ubiquitina ligase E3. O alelo paterno do gene UBE3A em neurônios é silenciado em um processo conhecido como imprinting. Como consequência, o imprinting paterno do gene permite apenas a expressão materna no sistema nervoso central (SNC)². Portanto, a deleção do gene UBE3A do cromossomo materno leva ao desenvolvimento de sintomas de EA. Em humanos, a EA manifesta-se por volta dos 6 meses de idade, com retardo do desenvolvimento que persiste em todos os estágios de desenvolvimento e resulta em sintomas debilitantes graves nos indivíduos afetados ^3,4. Os principais sintomas do transtorno incluem o déficit de habilidades motoras finas e grossas, incluindo marcha atáxica brusca, comprometimento grave da fala e deficiência intelectual. Aproximadamente 80% dos pacientes com EA também sofrem de distúrbios do sono e epilepsia. Até o momento, o único tratamento disponível são as drogas sintomáticas, que reduzem as crises epilépticas e melhoram a qualidade do sono¹. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais robustos com fenótipos comportamentais reprodutíveis, juntamente com análises fenotípicas refinadas, será essencial para elucidar os mecanismos fisiopatológicos do transtorno e descobrir medicamentos e tratamentos eficazes.

A complexidade da desordem humana que afeta o SNC exige que os organismos-modelo possuam genoma, fisiologia e comportamento comparáveis. Os camundongos são populares como um organismo modelo devido ao seu curto ciclo reprodutivo, tamanho pequeno e relativa facilidade de modificação do DNA. Em 1984, Paul Willner propôs três critérios de validação do modelo básico de doença: validade de construto, validade de face e preditiva, que são usados para determinar o valor do modelo⁵. Simplesmente, a validade de construto reflete os mecanismos biológicos responsáveis pelo desenvolvimento do transtorno, a validade de face recapitula seus sintomas e a validade preditiva descreve a resposta do modelo a drogas terapêuticas.

Para aderir aos princípios acima, escolhemos a etiologia genética mais comum, uma grande deleção do locus 15q11.2-13q materno, incluindo o gene UBE3A, para criar camundongos modelo AS. Usamos a técnica CRISPR/Cas9 para excluir uma região longa de 76.225 pb abrangendo todo o gene UBE3A, englobando tanto os elementos codificantes quanto os não codificantes do gene, em camundongos de^{um fundo} C57BL/6N6. Em seguida, criamos os animais para obter camundongos heterozigotos UBE3A^+/−. Para validação de face do modelo, foram utilizados animais de cruzamentos de fêmeas UBE3A+/− e machos selvagens para ganhar progênie UBE3A^+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e posteriormente designada como UBE3A ^mGenedel/+) e companheiros controle. Testamos suas habilidades motoras finas e grossas, emocionalidade e afeto para recapitular os sintomas centrais da EA. Em artigo anterior, também avaliamos as funções cognitivas dos animais, uma vez que pacientes com EA também sofrem de deficiência intelectual⁶. No entanto, não encontramos prejuízos cognitivos em camundongos UBE3A^mGenedel/+, talvez devido à pouca idade dos animais no momento do teste⁷. Exames posteriores dos animais mais velhos, por volta das 18 semanas de idade, revelaram um déficit na flexibilidade comportamental durante o aprendizado de reversão no paradigma de preferência de lugar. No entanto, a complexidade dos equipamentos empregados para esta análise requer um módulo metodológico separado e não está aqui incluído.

Os testes comportamentais aqui apresentados pertencem às ferramentas de fenotipagem comuns na pesquisa genética, graças ao seu alto valor preditivo e suficiente validade de construto8,9,10. Usamos esses testes para validar um modelo de EA em camundongos, recapitulando os principais sintomas da doença humana de maneira reprodutível e independente da idade. A emocionalidade do animal foi avaliada nos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto. Ambos os testes são baseados no conflito abordagem-evitação, em que os animais exploram um novo ambiente em busca de alimento, abrigo ou oportunidades de acasalamento, evitando simultaneamente compartimentos ansiogênicos¹¹. Além disso, o teste de campo aberto é utilizado para testar a atividade locomotora de camundongos⁸. O teste de suspensão de cauda é amplamente utilizado em pesquisas de depressão para rastrear novas drogas antidepressivas ou fenótipos semelhantes aos depressivos em modelos knockout de camundongos¹². Este teste avalia o desespero que os animais desenvolvem ao longo do tempo em uma situação inescapável. Aprendizado motor e características detalhadas da marcha foram determinadas no rotarod e no DigiGait, respectivamente. A resistência do animal na haste aceleradora caracteriza suas habilidades de equilíbrio e coordenação do movimento, enquanto a análise detalhada dos padrões de passos de um camundongo é uma avaliação sensível de comprometimentos neuromusculares ligados a muitos distúrbios neurogenerativos do movimento^13,14,15. O teste de trituração de filhotes faz parte da metodologia padrão para detecção de comportamento impulsivo em roedores e, por utilizar o comportamento natural de construção de roedores, indica o bem-estar do animal^16,17.

O tamanho dos grupos experimentais foi resultado de um compromisso em atender às exigências da regra 3R e ao uso eficiente do desempenho reprodutivo das colônias. No entanto, para a obtenção do poder estatístico, os grupos possuíam nada menos que 10 indivíduos, devido ao estabelecimento de uma quantidade suficiente de pares reprodutores. Infelizmente, o desempenho reprodutivo nem sempre resultou em um número suficiente de animais.

Protocol

Todos os animais e experimentos utilizados neste estudo foram submetidos à revisão ética e conduzidos de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE. O estudo foi aprovado pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente e mantidos a uma temperatura constante de 22 ± 2 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos receberam ração e água ad libitum. Os camundongos foram alojados em grupos de três a seis animais por gaiola. …

Representative Results

Testes de labirinto em cruz elevado e em campo abertoOs testes de EPM e FO utilizam a tendência natural dos roedores em explorar novos ambientes18,19. A exploração é regida por um conflito de abordagem-evitação, onde os roedores escolhem entre a exploração de um novo ambiente e evitar possíveis perigos. Os animais exploram lugares desconhecidos em busca de abrigo, contato social ou forrageamento. No entanto, novos locais podem envolv…

Discussion

Modelos de EA criados em diferentes linhagens murinas são comumente validados com testes de estado emocional, funções motoras e habilidades cognitivas de animais para facilitar a comparação com sintomas humanos^31,32. Um déficit motor em modelos de EA é o achado mais consistente entre os laboratórios, seguido por um estado de emocionalidade inalterado dos mutantes e dificuldades na construção de ninhos^31,32,33<sup class…

Materials

Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.