Summary
이 원고는 Angelman 증후군 마우스 모델을 검증하기 위해 재현 가능한 행동 테스트 세트를 제공합니다.
Abstract
이 원고는 확립된 쥐 모델의 AS에서 Angelman 증후군(AS) 유사 표현형을 특성화하는 데 사용할 수 있는 일련의 행동 테스트를 설명합니다. 우리는 로타로드 학습 패러다임, 상세한 보행 분석 및 둥지 짓기 테스트를 사용하여 동물의 운동 장애를 감지하고 특성화합니다. 우리는 오픈 필드와 상승 플러스 미로 테스트에서 동물의 감정을 테스트하고 꼬리 서스펜션 테스트의 영향을 테스트합니다. AS 마우스를 오픈 필드 테스트에서 테스트할 때 운동 기능 장애가 미로에서 마우스 행동에 영향을 미치고 활동 점수를 변경하기 때문에 결과를 신중하게 해석해야 합니다.
제시된 행동 테스트의 재현성과 효과는 다양한 녹아웃 변형이 있는 여러 독립적인 Uba3a 마우스 라인에서 이미 검증되었으며, 이 테스트 세트는 AS 연구에서 우수한 검증 도구로 자리 잡았습니다. 관련 구조와 얼굴 타당성을 가진 모델은 질병의 병태생리학을 밝히고 인과적 치료법의 개발을 승인하기 위한 추가 조사가 필요합니다.
Introduction
Angelman 증후군 (AS)은 드문 신경 발달 질환입니다. AS의 가장 흔한 유전적 기원은 모계 유래 염색체의 15q11-q13 영역의 큰 결실이며, 이는 환자의 거의 74%에서 발견된다1. 이 영역의 결실은 E3 유비퀴틴 리가제를 암호화하는 AS의 주요 원인 유전자인 UBE3A의 손실을 유발합니다. 뉴런에서 UBE3A 유전자의 부계 대립 유전자는 각인으로 알려진 과정에서 침묵합니다. 결과적으로, 유전자의 부계 각인은 중추 신경계 (CNS)에서 모계 발현 만 허용합니다 2. 따라서 모계 유래 염색체에서 UBE3A 유전자가 결실되면 AS 증상이 발생합니다. 인간의 경우, AS는 생후 6개월경에 나타나며, 발달 지연은 모든 발달 단계에 걸쳐 지속되며, 영향을 받은 개인에게 심각한 쇠약 증상을 초래한다 3,4. 이 장애의 핵심 증상에는 갑작스러운 운동 실조 보행, 심각한 언어 장애 및 지적 장애를 포함한 미세 및 대근육 운동 능력의 결핍이 포함됩니다. AS 환자의 약 80%는 또한 수면 장애 및 간질을 앓고 있습니다. 현재까지 유일하게 이용 가능한 치료법은 간질 발작을 줄이고 수면의 질을 향상시키는 증상 약물입니다1. 따라서 정제된 표현형 분석과 함께 재현 가능한 행동 표현형을 가진 강력한 동물 모델의 개발은 장애의 병태생리학적 메커니즘을 밝히고 효과적인 약물 및 치료법을 발견하는 데 필수적입니다.
CNS에 영향을 미치는 인간 장애의 복잡성은 모델 유기체가 유사한 게놈, 생리학 및 행동을 소유할 것을 요구합니다. 마우스는 짧은 생식 주기, 작은 크기 및 DNA 변형의 상대적 용이성으로 인해 모델 유기체로 인기가 있습니다. 1984년, 폴 윌너(Paul Willner)는 모델의 값을 결정하는 데 사용되는 세 가지 기본 질병 모델 검증 기준, 구성, 얼굴 및 예측 타당도를 제안했다5. 간단히 말해서, 작제물 타당도는 장애 발생을 담당하는 생물학적 메카니즘을 반영하고, 얼굴 타당성은 그 증상을 요약하고, 예측 타당도는 치료 약물에 대한 모델 반응을 설명한다.
위의 원칙을 고수하기 위해 우리는 AS 모델 마우스를 만들기 위해 가장 일반적인 유전적 병인인 UBE3A 유전자를 포함한 모계 15q11.2-13q 유전자좌의 대규모 결실을 선택했습니다. 우리는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 C57BL/6N 배경의 마우스에서 유전자의 코딩 요소와 비코딩 요소를 모두 포함하는 전체 UBE3A 유전자에 걸쳐 있는 76,225bp 길이의 영역을 삭제했습니다6. 그런 다음 동물을 사육하여 UBE3A+/- 이형접합체 마우스를 얻었습니다. 모델의 얼굴 검증을 위해 UBE3A+/- 암컷과 야생형 수컷의 교배된 동물을 사용하여 UBE3A+/- 자손(C57BL/6NCrl-UBE3A
여기에 제시된 행동 테스트는 높은 예측 가치와 충분한 구성 타당도 8,9,10 덕분에 유전 연구에서 일반적인 표현형 도구에 속합니다. 우리는 이러한 테스트를 사용하여 재현 가능하고 연령에 구애받지 않는 방식으로 인간 질병의 핵심 증상을 요약하여 AS의 마우스 모델을 검증했습니다. 동물의 감정은 상승 플러스 미로 및 오픈 필드 테스트에서 평가되었습니다. 이 두 가지 테스트는 동물이 음식, 피난처 또는 짝짓기 기회를 찾기 위해 새로운 환경을 탐색하는 동시에 불안을 유발하는 구획을 피하는 접근 회피 갈등을 기반으로 합니다11. 또한, 개방 필드 테스트는 마우스의 운동 활동을 테스트하기 위해 사용된다8. 꼬리 서스펜션 테스트는 마우스 녹아웃 모델12에서 새로운 항우울제 또는 우울 유사 표현형을 선별하기 위해 우울증 연구에서 널리 사용됩니다. 이 테스트는 피할 수 없는 상황에서 시간이 지남에 따라 동물이 발전하는 절망을 평가합니다. 운동 학습과 상세한 보행 특성은 각각 rotarod와 DigiGait에서 결정되었습니다. 가속 막대에 대한 동물의 지구력은 균형 및 운동 조정 기술을 특징 짓는 반면, 마우스의 단계 패턴에 대한 상세한 분석은 많은 신경 생성 운동 장애13,14,15와 관련된 신경근 장애에 대한 민감한 평가입니다. 네슬렛 파쇄 테스트는 설치류의 충동적인 행동을 감지하기 위한 표준 방법론의 일부이며, 자연적인 설치류 형성 행동을 이용하기 때문에 동물의 웰빙을 나타냅니다16,17.
실험군의 규모는 3R 규칙 요구 사항을 충족하기 위한 타협과 군체 육종 성능의 효율적인 사용의 결과였습니다. 그러나 통계적 검정력을 얻기 위해 그룹은 충분한 양의 번식 쌍을 확립했기 때문에 10 명 이상의 개체를 가졌습니다. 불행하게도, 번식 성과가 항상 충분한 수의 동물을 낳는 것은 아닙니다.
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Protocol
이 연구에 사용된 모든 동물과 실험은 윤리적 검토를 거쳤으며 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 체코 동물 복지 중앙위원회의 승인을 받았습니다. 마우스를 개별적으로 환기된 케이지에 수용하고 12시간의 명암 주기로 22± 2°C의 일정한 온도로 유지했습니다. 마우스에는 마우스 차우와 물이 임의로 제공되었습니다. 마우스는 케이지 당 3-6 마리의 동물 그룹으로 수용되었습니다. 테스트 전에 계량 이외의 취급은 수행되지 않았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 테스트 전과 테스트 중 일반적인 고려 사항
참고: 명확성과 이해를 위해 개별 테스트에 대한 설명 앞에 일반적인 설명이 제공됩니다. 이것은 하우징 룸에서 수행되고 실험 장비를 사용할 필요가없는 네슬렛 파쇄 테스트를 제외하고 각 테스트에 적용됩니다.
- 운송 및 환경 변화로 인한 스트레스를 최소화하기 위해 테스트 전 최소 14일 동안 연구 시설에 동물을 수용하십시오.
- 체중은 행동 연구에서 일반적인 교란 요소이므로 테스트하기 전에 동물의 체중을 기록하십시오.
- 그러한 운송이 발생할 때마다 운송 스트레스를 최소화하기 위해 수용실에서 이송 후 최소 1시간 동안 동물을 실험실에 적응시키십시오(즉, 사육실에서 수행되는 네슬렛 파쇄를 제외하고 아래에 설명된 모든 테스트).
- 실험 중에 신속하게 식별할 수 있도록 꼬리에 있는 각 동물에 무독성 수성 마커를 표시합니다.
- 각 시험 후 시험 중에 실험 장치에 동물이 축적 한 모든 소변과 대변을 제거하십시오.
- 각 실험 동물 전후에 모든 실험 장치를 75% 알코올로 닦습니다. 세척은 테스트 중에 퇴적된 후각 흔적을 제거하고 안정적인 실험 조건을 유지하는 데 도움이 됩니다.
- 가능한 한 많은 주의를 기울여 동물을 집 케이지에서 실험 장치로 운반한 다음, 가급적이면 작은 불투명한 용기에 담아 운반한 다음 다른 조작이 필요하지 않는 한 자유롭게 풀어줍니다.
- 홈 케이지에서 테스트되지 않은 동물에 영향을 미치지 않도록 테스트 후 각 동물을 임시 보관 케이지에 넣습니다.
- 연속적으로 남성과 여성을 테스트합니다. 실험 그룹 간의 예측할 수 없는 환경 요인을 상쇄하기 위해 테스트 중에 서로 다른 유전자형의 순서를 번갈아 가며 조정합니다.
- 모든 동물을 테스트한 후 동물을 집 케이지에 다시 넣고 사육실로 돌려보냅니다.
- 동물을 반복적으로 실험하는 경우 각 시험 사이에 최소 1 일 간격을 유지하십시오.
2. 행동 테스트
- 상승 플러스 미로(EPM)
참고: C57BL/6NCrl 및 UBE3AmGenedel/+ 마우스 균주의 암수 모두 9-12주령에 이 연구를 위해 테스트되었습니다. 실험 당시 동물의 무게는 수컷의 경우 22 내지 36 g, 암컷의 경우 18 내지 28 g이었다.- 카메라 바로 아래 테스트 플랫폼에 플러스 모양의 미로를 놓습니다. 벽에 있는 전위차계를 사용하여 조정 중에 센서를 미로 중앙에 배치하고 룩소미터를 사용하여 중앙에서 광도를 70lux로 설정합니다.
- Viewer 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 열고 구성 탭의 왼쪽 상단에 있는 아이콘을 클릭하여 EPM 테스트용 구성을 로드합니다. 파일 메뉴에서 EPM 플러그인을 로드합니다. 컴퓨터 키보드를 사용하여 동물 ID, 유전자형, 성별 및 실험 정보(날짜, 광도)를 실험 탭의 해당 필드에 입력합니다. 구역의 위치, 열린 팔, 닫힌 팔이 제대로 구성되었는지 확인하십시오. 시각적 제어 및 컴퓨터 마우스를 사용하여 가상 윤곽선 영역이 비디오 미리 보기의 해당 EPM 영역과 일치하는지 확인합니다.
- EPM은 접근-회피 갈등을 기반으로 하는 동물의 일반적인 불안을 평가하는 데 사용되는 테스트입니다. 설치류는 자연적으로 조명이 잘 된 보호되지 않은 영역 (열린 팔)을 피하고 더 안전한 영역 (닫힌 팔)을 선호하는 경향이 있습니다. 이 완전 자동화된 테스트는 비디오 추적 시스템을 기반으로 하므로 소프트웨어가 각 구역에서 보낸 시간과 입구 수를 자동으로 계산하도록 합니다.
- 테스트하는 동안 산업용 적외선 감지 카메라를 통해 비디오에 동물을 녹화하십시오. 소프트웨어가 기록하는 동안 실시간으로 동물의 위치를 감지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어가 동물의 발자국을 자동으로 평가하여 미로에서 동물의 행동을 설명하는 모든 매개변수를 계산하도록 합니다. 불안을 유발하는 두 팔을 벌린 시간과 두 팔을 벌린 비율에 시간을 사용하여 동물의 불안과 같은 행동 수준을 평가하십시오.
알림: 맞춤형 미로는 적외선 투과성 재료로 만들어졌으며 발광 다이오드(LED) 적외선 광원 플랫폼에 배치됩니다. - 획득 탭의 왼쪽 상단에 있는 화살표 아이콘에 마우스 커서를 놓습니다. 홈 케이지에서 손으로 동물을 꺼내 EPM 중앙에 부드럽게 놓습니다. 컴퓨터 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 프로토콜을 시작하고 즉시 실험실을 떠납니다.
- 5분 동안 무료 미로 탐험 후 기록 프로토콜이 완료되면 프로토콜 종료 후 나타나는 창에서 확인을 클릭하여 기록된 데이터를 저장하고 파일 이름을 적절하게 지정한 다음 저장을 클릭합니다. 데이터 분석 탭의 왼쪽 세로 패널에 있는 아이콘을 클릭하여 오프라인 분석을 위해 테스트된 각 동물에 대한 .csv 파일로 결과를 내보냅니다.
- 미로에서 동물을 손으로 꺼내 임시 보관 케이지에 넣습니다. 모든 동물에 대한 동일한 방식으로 실험을 진행하십시오. Elevated Plus 미로 플러그인의 결과 탭에서 결과 복사 아이콘을 클릭하여 오프라인 분석을 위해 모든 테스트 동물에 대한 결과를 메모장 파일에 복사합니다.
알림: 소프트웨어와 하드웨어는 다를 수 있으며 관련 설명서를 따라야 합니다. 또한 조명이나 컴퓨터 배치와 같은 실험 설정은 동물 시설의 구성에 따라 다를 수 있습니다.
- 오픈 필드(OF) 테스트
참고: 오픈 필드 테스트는 새로운 환경에서의 탐색 행동에 의해 유발되는 동물의 전반적인 움직임을 평가합니다. 또한 보호되지 않고 조명이 밝은 공간에서 일반적인 불안을 감지하는 선별 도구로 일반적으로 사용됩니다. 이것은 이전 테스트에서도 사용된 비디오 추적 시스템을 활용하는 완전 자동화된 테스트입니다.- 카메라 바로 아래 테스트 플랫폼에 4개의 OF 테스트 박스를 놓습니다. 벽에 있는 전위차계를 사용하여 조도계를 사용하여 각 OF 테스트의 중앙에서 광도를 200lux로 설정하고 조정하는 동안 센서를 각 상자의 중앙에 배치합니다.
- Viewer 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 열고 Configuration 탭의 왼쪽 상단에 있는 아이콘을 클릭하여 OF 테스트를 위한 구성을 로드합니다. 컴퓨터 키보드를 사용하여 동물 ID, 유전자형, 성별 및 실험 정보(날짜, 광도)를 실험 탭의 해당 필드에 입력합니다. 구역의 위치(중앙 및 주변)가 OF 테스트 상자와 일치하는지 확인하고 필요한 경우 조정합니다. 시각적 제어 및 컴퓨터 마우스를 사용하여 가상의 윤곽선이 있는 중앙 및 주변 영역이 비디오 사전의 해당 OF 테스트 영역과 일치하는지 확인합니다.view.
- 테스트하는 동안 산업용 적외선에 민감한 카메라를 통해 비디오에 동물을 녹화하십시오. 소프트웨어가 기록하는 동안 실시간으로 동물의 위치를 감지하고 동물의 발자국을 자동으로 평가하여 OF 테스트 상자에서 동물의 행동을 설명하는 모든 매개변수를 계산할 수 있습니다. 걸은 거리, 평균 속도 및 휴식 시간은 새로운 환경에서 동물의 활동을 평가하는 데 사용되는 매개 변수이며, 센터의 센터 진입 횟수와 지속 시간은 동물의 불안과 같은 행동을 나타냅니다.
알림: 맞춤형 미로는 적외선 투과성 재료로 만들어졌으며 LED 적외선 광원 플랫폼에 배치됩니다. - 획득 탭의 왼쪽 상단에 있는 화살표 아이콘에 마우스 커서를 놓습니다. 홈 케이지에서 4마리의 동물을 손으로 꺼내 각 OF 테스트 상자의 모서리에 부드럽게 놓습니다. 컴퓨터 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 프로토콜을 시작하고 즉시 실험실을 나갑니다.
- 10분 동안 무료 미로 탐험을 한 후 프로토콜이 완료되면 프로토콜 종료 후 나타나는 창에서 확인을 클릭하여 데이터를 저장하고 파일 이름을 적절하게 지정한 다음 저장을 클릭합니다. 데이터 분석 탭의 왼쪽 세로 패널에 있는 아이콘을 클릭하여 오프라인 분석을 위해 각 테스트 동물에 대한 .csv 파일로 결과를 내보냅니다.
- 미로에서 동물을 손으로 꺼내 임시 보관 케이지에 넣습니다. 모든 동물에 대한 동일한 방식으로 실험을 진행하십시오. 내보낸 데이터를 분석합니다.
알림: 소프트웨어와 하드웨어는 다를 수 있으며 관련 설명서를 따라야 합니다. 또한 조명, 미로 수 또는 컴퓨터 배치와 같은 실험 설정은 동물 시설의 구성에 따라 달라질 수 있습니다.
- 테일 서스펜션 테스트 (TST)
참고: 3마리의 마우스가 자동 테일 서스펜션 장치로 동시에 테스트됩니다.- 실내 조명 강도를 100-120lux로 유지하십시오.
- USB 케이블을 통해 TST 시스템을 컴퓨터와 연결합니다. USB 동글을 컴퓨터에 삽입하고 BIO-TST 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 시작합니다. Global(전역) 아래의 Settings(설정) 탭에서 획득 기간을 360초로 조정합니다. 실험 탭에서 새 피험자 목록을 선택하고 열린 탭의 지침에 따라 새 실험 파일과 새 피험자 목록을 만듭니다.
- 획득 탭에서 실행 시작 | 계속을 클릭하여 실행을 시작합니다. 트랜스포어 의료용 테이프와 같은 단면 접착 테이프를 동물 꼬리의 3/4 정도를 바닥에서 시작하여 감아 테스트를 위해 동물을 준비합니다.
- 서스펜션 후크를 테이프에 통과시키고 동물을 매달아 놓습니다. 각 동물에 대해 시각화된 위치 아래에 있는 시작 아이콘을 클릭하여 후크에 매달린 직후 각 동물에 대한 데이터 수집을 시작하고 테스트 중에 동물을 지속적으로 관찰합니다.
- 첫 번째 동물 세트에 대한 획득이 완료되면 다음 실행 시작을 클릭하고 후크에서 동물을 제거하고 꼬리에서 접착 테이프를 분리하고 꼬리를 따라 가위로 테이프를 조심스럽게 자르고 동물을 임시 보관 케이지에 넣습니다.
- 75 % 알코올 및 종이 티슈로 장치를 세척하고 나머지 동물을 위에서 설명한대로 진행하십시오. 분석 탭에서 분석을 위해 수집의 마지막 4분을 선택한 다음 분석 기간의 모든 유효한 실행을 선택하고 선택한 주제 분석을 클릭하고 원하는 데이터 형식을 선택한 다음 선택한 데이터 내보내기를 클릭하여 추가 분석을 위해 수집된 데이터를 내보냅니다.
알림: 테스트는 6분 동안 진행됩니다. 처음 2분 동안 동물들은 격렬하게 몸부림치지만 나머지 4분 동안 절망 반응이 만연해지면 이 기간 동안 움직이지 않는 시간을 분석에 사용합니다. 소프트웨어와 하드웨어가 다를 수 있으며 관련 매뉴얼을 따라야 합니다. 또한 장비 자체가 다를 수 있습니다(예: 테스트 위치 수).
- 보행 분석
- 트레드밀을 켜고 속도 표시기 옆에 있는 + 또는 - 기호를 클릭하여 장비 패널에서 벨트 속도를 수동으로 20cm/s로 설정합니다. 손잡이를 시계 방향으로 돌려 장치 조명을 켭니다. 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 DigiGait Imager 소프트웨어를 실행하고 셔터 속도를 알비노 마우스의 경우 100으로, 필드의 블랙/다크 마우스의 경우 셔터 속도를 130으로 설정합니다.
- 홈 케이지에서 첫 번째 동물을 손으로 꺼내 러닝 머신 벨트에 부드럽게 놓습니다. 동물 구획의 문을 닫습니다. 동물의 꼬리가 문과 프레임 사이에 끼어 있지 않은지 육안으로 검사하십시오.
- 녹음하기 전에 마우스가 트레드밀 벨트를 탐색하도록 합니다. 트레드밀을 ~3초 동안 느린 보행 속도로 설정한 다음 멈추고 동물을 지속적으로 관찰하여 동물이 테스트를 수행할 수 있는지 확인합니다.
- 장비 패널의 시작 버튼을 눌러 벨트를 시작하고 약 10초 동안 기록합니다. 최소 10-15 단계의 명확하고 유창한 운동이 관찰 가능한지 확인하십시오. 장비 패널의 중지 버튼을 눌러 벨트를 멈추고 마우스를 손으로 임시 고정 케이지에 되돌립니다.
- PLAY를 클릭하고 EDIT 모드에서 시각적 컨트롤로 녹화를 검토하여 유창한 단계로 일련의 이미지에 대한 녹화를 스크리닝합니다. 시작 및 끝 프레임 번호를 관련 필드에 수동으로 작성하여 10-15개의 유창한 움직임을 선택합니다(첫 번째 프레임의 경우 From frame#, 마지막 프레임의 경우 To). 동물 ID, 생년월일, 성별, 체중, 벨트 속도, 벨트 각도 등 동물의 정보를 입력하고 필요한 경우 관련 필드에 의견을 말하십시오. 저장을 클릭하여 추가 분석을 위해 파일을 저장합니다.
- 벨트를 물로 청소하고 나머지 동물들도 같은 방법으로 진행하십시오. 카메라를 선택하여 다음 동물 산책 녹화를 진행합니다. 모든 동물에 대한 기록이 수집되면 분석을 진행합니다.
참고: 벨트의 설정 속도로 걸을 수 없는 동물은 테스트에서 제외됩니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 우리는 나이가 많은 동물 (50 주 이상)이 유전자형에 따라 2 %에서 50 % 사이의 다양한 빈도로 러닝 머신에서 걷는 데 더 많은 어려움을 겪는다는 것을 관찰합니다. 동물 배설물은 러닝머신의 앞이나 뒤에 있는 쟁반에 수거됩니다. 매 연구 후에 쟁반을 비우고 따뜻한 비눗물로 씻습니다. 벨트는 젖은 천으로 닦습니다. - 동물 발자국의 비디오 녹화에 대한 완전 자동화된 분석을 기반으로 보행 분석을 수행합니다. DigiGait Analysis 소프트웨어에서 데이터를 조정합니다.
참고: 보행 분석은 운동 협응의 측정뿐만 아니라 동적 보행 신호 분석을 기반으로 하는 상세한 운동학적 설명을 제공하여 순차적 보폭을 통한 발 배치의 시간적 이력을 나타냅니다. 다음 매개변수는 소프트웨어에 의해 자동으로 측정됩니다: 스윙 지속 시간, 스윙 시 보폭 백분율, 제동 지속 시간, 제동 시 보폭 백분율, 추진 지속 시간, 추진 보폭의 백분율, 스탠스 지속 시간, 스탠스 지속 시간, 스탠스 백분율, 스탠스 단계의 추진 백분율, 스윙 대 스탠스 비율, 보폭, 보폭 빈도, 발 각도, 발 각도 변동성, 자세 폭, 보폭 변동성, 보폭 변동 계수, 보폭 변동 계수, 스윙 지속 시간 변동 계수, 피크 스탠스에서의 발 면적, 피크 스탠스에서의 발 면적 변동성, 뒷다리 공유 자세 지속 시간, 공유 자세 비율, 좌우 후방 자세 지속 시간의 비율, 보행 대칭, 제동 단계 동안 트레드밀 벨트와 접촉하는 발 면적의 최대 변화율, 추진 단계 동안 트레드밀 벨트와 접촉하는 발 면적의 최대 변화율, 타우 추진력, 발 오버랩 거리, 발 배치 위치, 운동 실조 계수, 정중선 거리, 축 거리 및 발 항력. 이 소프트웨어를 사용하면 통계 분석 전에 완료해야 하는 스텝 트레이스 노이즈를 약간 수정할 수 있습니다. 소프트웨어와 하드웨어가 다를 수 있으며 관련 매뉴얼을 따라야 합니다.
- 로타로드
참고: rotarod 테스트는 설치류 운동 기능(균형 및 운동 협응)을 평가하는 데 사용됩니다. 이 테스트에서는 마우스가 고정된 직경(5cm)의 회전 막대 위를 걸어야 하며, 동물이 더 이상 머물 수 없을 때까지 주어진 시간(5분) 동안 회전이 가속화됩니다.- 장비의 켜기/끄기 스위치를 눌러 rotarod 장비를 켜고 Rod 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 실행합니다. 파일 탭에서 새 파일을 초기화하고 적절한 이름으로 저장합니다. 설정 창에서 날짜, 사용자 이름, 최종 댓글과 같은 실험 세부정보를 입력합니다. 속도 프로파일을 300초로, 초기 속도를 4rpm으로, 최종 속도를 40rpm으로 설정합니다.
- 동물 필드에서 실험한 동물 에 대한 일정을 준비하고 각 동물을 낚싯대 위의 위치에 할당합니다. 위치는 소프트웨어에 명시적으로 표시되지 않지만 목록 줄에 해당합니다. 예를 들어, 첫 번째 줄은 낚싯대의 첫 번째 위치를 나타내고, 다섯 번째 줄은 낚싯대의 다섯 번째 위치를 나타내는 식입니다. 실험 그룹 간의 각 막대 위치를 균형있게 조정하는 것을 잊지 마십시오.
참고: 5마리의 동물을 동시에 실험할 수 있습니다. - 닫기(Close)를 클릭하여 설정 패널을 닫고 측정(Measure)을 클릭하여 측정 패널을 엽니다. 시작/중지를 클릭하여 낚싯대의 초기 회전을 4rpm으로 시작하고 처음 5마리의 동물을 할당된 위치에 놓습니다. 모든 동물이 낚싯대에 있을 때 프로를 클릭하여 테스트 프로토콜을 시작합니다.file 그리고 막대는 40분에 걸쳐 5rpm으로 점차 가속됩니다. 동물이 낚싯대에서 떨어지면 프로토콜이 시작되기 전에 낚싯대로 되돌립니다.
알림: 동물은 일반적으로 첫 번째 시도에서 모든 쥐를 한 번에 막대 위에 놓을 만큼 충분히 오래 막대에 머물지 않습니다. 처음에 일정한 회전 속도로 막대에 동물을 놓을 때 인내심을 갖는 것이 중요합니다. 테스트의 목적은 고정된 회전 속도로 낚싯대에서 동물의 내구성을 결정하는 것이 아니라 동물이 낚싯대에 머물 수 없는 속도를 찾는 것입니다. 낚싯대의 속도는 낚싯대에 머무르는 대기 시간에 비례합니다. 따라서 동물의 균형을 표현하는 데 사용됩니다. - 모든 동물이 낚싯대에서 떨어지거나 5분이 지난 후 동물을 임시 보관 케이지로 옮깁니다. 동물의 배설물을 제거하고 막대와 트레이를 알코올로 청소하십시오.
- Animals ->를 클릭하여 동일한 방식으로 다음 동물 그룹을 진행합니다. 모든 동물을 테스트한 후 닫기를 클릭하여 측정 창을 닫고 표시를 클릭하여 수집된 데이터를 표시합니다. CSV 내보내기를 클릭하여 추가 분석을 위해 수집된 데이터를 .csv 파일 형식으로 내보냅니다.
- 15분의 시험 간격으로 막대에서 각 동물을 세 번 테스트합니다. 추가 통계 분석을 위해 잠복기의 평균 값을 사용하여 세 번의 시행에 해당합니다. 연속 5일 동안 테스트를 반복하여 동물의 운동 학습을 평가합니다.
알림: 소프트웨어와 하드웨어는 다를 수 있으며 관련 설명서를 따라야 합니다. 또한 장비 자체는 예를 들어 테스트 위치 수, 전체 구조 및 막대 치수가 다를 수 있습니다.
- 네슬렛 파쇄 둥지 건물
- 동물을 표준 장비(침구, 먹이 그물망 및 물 공급)가 있는 단일 폴리카보네이트 마우스 케이지로 1주일 동안 분리합니다. 집게를 사용하여 약 12g의 목화 네틀렛을 취하고, 저울을 사용하여 수동으로 무게를 기록하고, 새장에 무작위로 넣지 만 물 공급 반대쪽에 놓습니다. 동물과 함께 새장을 주거실로 돌려 보내십시오.
- 저울을 사용하여 수동으로 다음 4 일 동안 매일 같은 시간에 각 네슬렛의 무게를 잰다. 종이나 미리 만들어진 스프레드시트에 무게를 기록합니다. 무게를 잴 때 각 네슬렛이 건조한지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 가열 패드에서 건조시키고 마우스가 둥지를 만든 장소에서 동시에 모든 네틀렛을 지정된 케이지로 되돌립니다. 네슬렛이 여러 부분으로 찢어진 경우 가장 큰 부분의 무게를 잰다.
- 데이터 분석을 위해 초기 중량에 대한 각 날짜의 네슬렛 중량 감소를 표현하고 사용된 재료의 백분율로 표시합니다.
알림: 수컷을 일반 케이지로 다시 데려오면 동물들 사이에서 공격성이 증가하고 원치 않는 부상을 입을 수 있습니다. 따라서 네슬렛 파쇄 테스트는 동물 복지를 손상시키지 않도록 테스트 요법이 끝날 무렵에 예약해야 합니다.
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Representative Results
상승 플러스 미로 및 오픈 필드 테스트
EPM 및 OF 테스트는 설치류가 새로운 환경을 탐색하는 자연적 경향을 사용합니다18,19. 탐사는 설치류가 새로운 환경의 탐사와 가능한 위험 회피 중에서 선택하는 접근 회피 충돌에 의해 지배됩니다. 동물들은 피난처, 사회적 접촉 또는 먹이를 찾기 위해 알려지지 않은 장소를 탐험합니다. 그러나 새로운 장소에는 포식자나 경쟁자와 같은 위험 요소가 포함될 수 있습니다. OF 테스트와 EPM은 모두 안전하고 위험한 구획, 즉 OF 테스트의 주변부와 중앙, EPM의 폐쇄형 및 개방형 암으로 구성됩니다. 설치류는 자연스럽게 개방되고 높으며 밝은 조명 영역에 비해 어둡고 밀폐 된 구획을 선호합니다. 따라서, 방문 횟수 및 방문 기간의 감소로 표현되거나 첫 번째 방문까지의 대기 시간 증가로 표현되는 위험한/불안을 유발하는 부분의 감소된 탐색은 동물의 불안과 유사한 행동을 특징짓는다 8,11. 휴식 시간, 평균 속도 및 총 이동 거리는 동물의 자발적인 활동에 대한 추가 정보를 제공합니다. 불안과 유사한 행동과 관련된 매개변수는 OF 테스트 또는 EPM의 UBE3AmGenedel/+ 돌연변이체에서 변경되지 않았습니다(그림 1D-G). 그러나 UBE3AmGenedel/+ 동물은 OF 테스트에서 더 짧은 횡단 거리, 더 낮은 평균 속도 및 더 긴 휴식 시간에 의해 반영된 바와 같이 상당히 저활동적이었습니다(그림 1A-C).
그림 1: EPM 및 OF 테스트에서 새로운 환경에 대한 자발적인 활동 및 불안 반응. (AE) 열린 들판의 탐험. UBE3AmGenedel/+ 동물은 더 낮은 평균 속도(B)와 연장된 휴식 시간(C)으로 더 짧은 거리(A)를 걸었습니다. 센터의 방문 횟수와 기간은 동물 (D, E)간에 차이가 없었습니다. 양방향 ANOVA는 유전자형과 성별 사이에 유의한 상호작용이 없는 유의한 주요 유전자형 효과를 나타냈다(유전자형 효과 : p < 0.01; 유전자형/성 상호작용: p > 0.7). 팔짱을 낀 채 방문한 비율은 유전자형(F)에 의존하지 않았으며, 불안을 유발하는 팔짱을 낀 채로 보낸 시간도 실험군(G) 간에 다르지 않았습니다. 양방향 ANOVA는 유의미한 주효과 또는 유전자형/성 상호작용을 나타내지 않았다(유전자형 효과 : p > 0.9; 유전자형/성 상호작용: p > 0.9). 상자 그림에 표시된 데이터는 중위수 값, 사분위수 간 범위 및 값 범위를 보여줍니다. 유의미한 사후 테스트 결과는 *로 표시됩니다. 대조군 동물(암컷 n=10, 수컷 n=11)에 대한 데이터는 빨간색으로, 돌연변이체(암컷 n=9, 수컷 n=10)에 대한 데이터는 파란색으로 표시됩니다. 이 수치는 Syding et al.6에서 발췌한 것입니다. 약어: EPM = 상승 플러스 미로; OF = 열린 필드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
테일 서스펜션 테스트
TST는 피할 수 없는 상황에서 발전한 동물의 절망을 측정합니다. 꼬리에 매달릴 때, 설치류는 활발한 활동의 초기 기간 후에 빠르게 움직이지 않게됩니다. 움직이지 않는 기간은 "절망"의 크기를 나타냅니다. 수많은 실험실에서 광범위한 임상 활성 항우울제가 부동 지속 시간을 단축시키는 것으로 나타났습니다 9,20,21. 이 복잡하지 않은 검사는 잠재적인 항우울제 물질을 스크리닝하는 데 일반적으로 사용되며, 우울 상태의 신경생물학적 기초를 탐구하는 연구에서 형질전환 쥐뿐만 아니라 다양한 동물 균주의 표현형을 특성화하는 데에도 활용될 수 있습니다 9,21. UBE3AmGenedel/+ 동물은 대조군 새끼보다 훨씬 더 오래 움직이지 않았으며, 이는 우울증과 유사한 행동을 나타냅니다(그림 2).
그림 2: 테일 서스펜션 테스트에서 움직이지 않는 시간. UBE3AmGenedel/+ 동물은 꼬리 현탁액 동안 더 긴 부동성을 보였다. 양방향 ANOVA는 유의미한 주효과를 보였지만 유전자형/성 상호작용에서는 유의하지 않았다(유전자형 효과: p < 0.001; 성 효과: p < 0.001; 유전자형/성 상호작용: p > 0.5). 상자 그림에 표시된 데이터는 중위수 값, 사분위수 범위 및 값 범위를 보여줍니다. 유의미한 사후 테스트 결과는 *로 표시됩니다. 대조군 동물(암컷 n=10, 수컷 n=14)에 대한 데이터는 빨간색으로, 돌연변이체(암컷 n=10, 수컷 n=11)는 파란색으로 표시됩니다. 이 수치는 Syding et al.6에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
로타로드 및 보행 분석
신경 운동 결손 모델에서 로타로드 테스트의 역사는 20세기 중반으로 거슬러 올라갑니다22. 로타로드는 동물의 균형과 움직임 협응을 평가하는데 사용되는데, 그 이유는 동물들의 손상이 회전 막대(14)로부터 떨어지는 데 상당히 짧은 잠복기에서 나타나기 때문이다. 로타로드에 대한 반복 테스트는 동물의 운동 학습 능력을 연구하는 데 사용됩니다. 현대 장비와 디지털 기술의 급속한 발전으로 설치류 보행에 대한 자세한 설명을 기반으로 설치류 운동 표현형을 자동화되고 정밀하며 편견 없이 평가할 수 있게 되었다23. 자동화된 보행 분석은 발자국 분석을 대체했으며 신경근 결손에도 더 민감합니다14,24,25. 동물 보행의 시공간적 특성의 변경은 모델링된 조직학적 단위26,27,28에 특정합니다. UBE3AmGenedel/+ 돌연변이체는 보행 지수의 강력한 교대를 가졌으며(그림 3A-G), 로타로드에서 떨어지는 대기 시간 감소로 추가로 확인되었습니다(그림 3H).
그림 3: rotarod에 대한 자세한 보행 분석 및 운동 학습. (A-G) UBE3AmGenedel/+ 동물의 보행 지수가 변경되었습니다. UBE3AmGenedel/+ 동물은 스윙(A)과 자세(B)가 더 길어 보폭과 길이(C,D)가 길어졌습니다. 뒷다리 추진 지속 시간(E)과 감속(F)도 증가했습니다. 분석 결과 피크 스탠스(G)에서 더 큰 발 면적이 나타났습니다. 동물의 메트릭 매개 변수나 체중이 다르지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), 관찰된 차이가 동물 크기의 차이로 인한 것이 아님을 나타냅니다. 반복 측정이 있는 이원 ANOVA는 유의미한 유전자형/성 상호작용이 없는 유전자형의 유의한 주효과를 보여주었다(유전자형 효과: p < 0.001; 유전자형/ 성 상호작용: p > 0.2). (H) 로타로드 성능의 결과는 UBE3AmGenedel/+ 동물에서 떨어지는 잠복기가 더 짧다는 것을 보여줍니다. 반복 측정을 통한 이원 ANOVA는 유의한 상호작용 없이 유의한 주효과를 나타냈다(유전자형 효과: p < 0.001; 성 효과 : p < 0.01; 유전자형/성 상호작용: p > 0.1). 상자 그림에 표시된 보행 모수는 중위수 값, 사분위수 범위 및 값 범위를 보여줍니다. 유의미한 사후 테스트 결과는 *로 표시됩니다. 떨어지는 잠복기의 데이터는 SEM± 평균으로 선 플롯으로 표시됩니다. 대조군 동물(암컷 n=10, 수컷 n=14)에 대한 데이터는 빨간색으로, 돌연변이체(암컷 n=10, 수컷 n=11)에 대한 데이터는 파란색으로 표시됩니다. 이 수치는 Syding et al.6에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
네슬렛 파쇄 - 둥지 짓기
네슬렛 파쇄 테스트는 주로 생쥐의 고정 관념적인 강박 행동을 감지하는 데 사용됩니다29,30. 그러나 생쥐는 둥지를 짓기 위해 제공된 재료를 찢는 자연스러운 경향을 보입니다. 따라서 목화 둥지를 파쇄할 수 없다는 것은 신경 발달 장애의 영향을 받는 웰빙의 지표로 사용됩니다16,31. UBE3AmGenedel/+ 동물은 둥지를 짓기 위해 훨씬 적은 재료를 사용했으며, 이러한 차이는 형질전환 암컷과 대조군 암컷 사이에서 특히 두드러졌습니다(그림 4A).
그림 4: 둥지 건설을 위한 네슬렛 재료 사용. UBE3AmGenedel/+ 동물은 대조군 새끼보다 면직물을 덜 파쇄했습니다. 데이터는 정규성 전제 조건을 충족하기 위해 정렬된 순위로 변환되었습니다. 반복 측정으로 분산을 분석한 결과 유전자형/성 상호작용의 유의성이 없는 유의한 유전자형 효과가 나타났다(유전자형 효과: p < 0.05; 유전자형/성 상호작용: p > 0.4). 선 플롯에 표시된 데이터는 평균 ± SEM을 보여줍니다. 유의미한 사후 테스트 결과는 *로 표시됩니다. 대조군 동물(암컷 n=10, 수컷 n=14)에 대한 데이터는 빨간색으로, 돌연변이체(암컷 n=10, 수컷 n=11)는 파란색으로 표시됩니다. 이 수치는 Syding et al.6에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
테스트 날짜
각 그룹(대조군 및 실험군)은 같은 날에 동일한 테스트를 받습니다. 잠재적인 이월 효과를 최소화하기 위해 테스트 사이에 1일의 휴식이 사용됩니다. 가능하면 암컷과 수컷을 연속적으로 검사합니다. 그렇지 않으면 수컷을 검사한 후 암컷을 검사합니다(그림 5)6.
그림 5: 테스트 시간 척도. UBE3AmGenedel/+ 동물 및 이들의 대조군을 2개의 코호트에서 시험하였다. 첫 번째 코호트에 대한 테스트 시간 척도는 위쪽 패널에 표시되고 두 번째 코호트에 대한 테스트 시간 척도는 아래쪽 패널에 표시됩니다. 남성이 검사를 받은 날은 파란색으로 표시되고 여성이 검사를 받은 날은 녹색으로 표시됩니다. 남녀 모두 검사를 받은 날은 노란색으로 표시됩니다. 주말에는 테스트가 수행되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다른 쥐 균주에서 생성된 AS 모델은 일반적으로 동물의 감정 상태, 운동 기능 및 인지 능력에 대한 테스트를 통해 검증되어 인간 증상과의 비교를 용이하게 합니다31,32. AS 모델의 운동 결핍은 실험실 전체에서 가장 일관된 발견이며, 돌연변이의 변하지 않은 감정 상태와 둥지 짓기 어려움이 그 뒤를 잇습니다31,32,33. 대조적으로, 인지 장애는 경미하거나 결석합니다 7,31,33. 인지 표현형의 불일치는 Huang et al.7에서 볼 수 있듯이 테스트 동물의 나이에 따라 달라지는 것으로 보입니다. 따라서, 이 논문을 위해, 마우스와 쥐 AS 모델 6,31,32 모두에서 유사한 결과가 관찰됨에 따라 재현성뿐만 아니라 연령 및 종 독립성을 기반으로 일련의 테스트를 선택했습니다.
결정적으로, 다른 실험 환경에서 반복적으로 동물을 실험하는 것은 이전 조작에 가장 민감한 테스트부터 시작하여 EPM 및 OF 테스트와 같은 다음 테스트에는 최소한의 영향을 미치는 동시에 신중한 순서가 필요하다는 것을 명심해야 합니다34. 추가적인 우려 사항은 동물들이 단독으로 사육되는 네슬렛 파쇄 시험과 관련이 있는데, 이는 스트레스가 많은 상태로 알려져 있다35. 그 후, 일반적인 새장에 수컷을 모으는 것은 종종 계층 구조 설정으로 인해 공격성을 증가시킵니다. 따라서 네슬렛 파쇄 테스트는 테스트 일정을 마무리해야 합니다. 또한 남성의 행동이 후행 여성의 후각 흔적에 영향을 받지 않도록 여성보다 먼저 남성을 테스트하는 것이 좋습니다. 실험 중에 서로 다른 실험 그룹에 속하는 동물을 번갈아 가며 사용하는 것은 예측할 수 없는 요인이 동물 행동에 미치는 영향의 균형을 맞추기 위해 행동 연구에서 매우 중요합니다. EPM에서 테스트하기 전에 동물을 다루는 것이 관찰 된 스트레스 반응에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그러므로, 취급량은 모든 동물에 대해 일정해야 한다36. 또한 각 동물에 대한 주거 조건(단일 대 그룹), 시험 중 조명, 시험 시간 및 시험 전 경험을 유지하는 것이 매우 중요한데, 이러한 모든 요인들이 EPM 및 OF 시험에서 마우스의 반응에 영향을 미치고 결과를 편향시킬 수 있기 때문이다37.
약물 개발에서 잘 확립된 스크리닝 도구와 실험실 전체에서 재현 가능한 결과를 산출하는 유전자 변형 마우스 표현형에 속하는 제시된 테스트에도 불구하고 일부 테스트는 여전히 약간의 수정이 있을 수 있습니다. 운동 장애는 AS 동물 모델의 표현형의 주요 특징이기 때문에 로타로드 테스트는 연속 5일이 아닌 1일 테스트로 제한될 수 있습니다. 부가적으로, 구축된 둥지의 품질을 기술하는 파라미터는 네슬렛 파쇄 테스트(38)에 통합될 수 있다.
제시된 결과의 한 가지 분명한 한계는 해석의 모호성입니다. 특히, AS 동물의 운동 결손은 OF 테스트 및 EPM과 같은 운동 기반 작업의 변화를 설명 할 수 있습니다. 유사하게, TST에서 장기간 움직이지 않는 시간은 우울한 행동과 달리 이 까다로운 테스트 동안 AS 동물이 발달하는 더 큰 신체적 피로의 결과일 수 있습니다. 또한 네슬렛 파쇄 테스트에서 면화 사용량 감소는 둥지 짓기 본능의 상실보다는 신경근 표현형 때문일 수 있습니다. 파킨슨 병의 일부 마우스 모델에서는 단축이 관찰되는 반면 노화 마우스에서는 연장이 관찰되기 때문에 보폭 변화의 해석은 모호합니다39,40. 그러나 우리는 총 보폭의 증가가 더 긴 스윙 지속 시간의 결과라고 생각합니다. 스윙 지속 시간은 통증에 따라 증가하고 관절염 모델에서 연장되며, 이는 마우스의 스윙 지속 시간이 길어지면 체중을 지탱하기 전에 팔다리의 적절한 위치를 잠재적으로 허용 할 수 있음을 의미합니다41,42. 추진 시간은 동물이 전진 운동을 시작하고 유지하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 따라서 건강한 동물의 짧은 기간은 더 큰 힘과 더 나은 통제를 나타낼 수 있습니다. 이러한 발견은 이 AS 마우스 모델을 특징지을 뿐만 아니라 보행 장애를 나타냅니다. 그러나 근력을 결정하고 신경근 연결/전달을 검사하는 것과 같은 이러한 손상의 생리학적 기초를 밝히기 위해서는 면밀한 조사가 필요합니다.
해석적 딜레마에도 불구하고, 제시된 행동 테스트 배터리는 실험실 전반에 걸쳐 일관된 재현 가능한 결과를 제공하며 Angelman 증후군의 새로운 쥐 모델 및 새로운 치료 접근법 6,31,32,43,44,45에 대한 우아한 검증 도구 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 체코 과학 아카데미 RVO 68378050, MEYS CR LM2018126, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789(체코 표현유전체학 센터의 업그레이드: MEYS 및 ESIF의 번역 연구를 위한 개발), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861(MEYS 및 ESIF에 의한 CCP 인프라 업그레이드 II) 및 OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395(MEYS 및 ERDF에 의한 형질전환 모델의 고품질 및 용량). 또한, 이 연구는 체코 교육청소년체육부에서 제공하는 NGO "유전자 치료 협회(ASGENT)", 체코(https://asgent.org/) 및 체코 표현유전체학 센터로부터 자금을 지원LM2023036.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
References
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