Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

التوصيف السلوكي لنموذج فأر متلازمة أنجلمان

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65182
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

تقدم هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية القابلة للتكرار للتحقق من صحة نموذج فأر متلازمة أنجلمان.

Abstract

تصف هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية المتاحة لتوصيف الأنماط الظاهرية الشبيهة بمتلازمة أنجلمان (AS) في نموذج الفئران الراسخ ل AS. نحن نستخدم نموذج التعلم الروتارودي ، وتحليل مفصل للمشي ، واختبار بناء العش لاكتشاف وتوصيف الإعاقات الحركية الحيوانية. نقوم باختبار عاطفة الحيوان في الحقل المفتوح واختبارات المتاهة المرتفعة بالإضافة إلى ، بالإضافة إلى التأثير في اختبار تعليق الذيل. عندما يتم اختبار الفئران AS في اختبار المجال المفتوح ، يجب تفسير النتائج بعناية ، لأن الاختلالات الحركية تؤثر على سلوك الماوس في المتاهة وتغير درجات النشاط.

تم بالفعل التحقق من صحة استنساخ وفعالية الاختبارات السلوكية المقدمة في العديد من خطوط الماوس Uba3a المستقلة مع متغيرات خروج المغلوب المختلفة ، مما أدى إلى إنشاء هذه المجموعة من الاختبارات كأداة تحقق ممتازة في أبحاث AS. ستضمن النماذج ذات البنية ذات الصلة وصحة الوجه مزيدا من التحقيقات لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للمرض ومنح تطوير العلاجات السببية.

Introduction

متلازمة أنجلمان (AS) هي مرض نمو عصبي نادر. الأصل الجيني الأكثر شيوعا ل AS هو حذف كبير لمنطقة 15q11-q13 من الكروموسوم المشتق من الأم ، والذي يوجد في ما يقرب من 74٪ من المرضى1. يؤدي حذف هذه المنطقة إلى فقدان UBE3A ، الجين المسبب الرئيسي ل AS الذي يشفر E3 ubiquitin ligase. يتم إسكات الأليل الأبوي لجين UBE3A في الخلايا العصبية في عملية تعرف باسم البصمة. ونتيجة لذلك، فإن البصمة الأبوية للجين تسمح فقط بالتعبير الأمومي في الجهاز العصبي المركزي (CNS)2. لذلك ، يؤدي حذف جين UBE3A من الكروموسوم المشتق من الأم إلى ظهور أعراض AS. في البشر ، يظهر AS في حوالي 6 أشهر من العمر ، مع تأخر النمو الذي يستمر في جميع مراحل النمو ويؤدي إلى أعراض موهنة شديدة لدى الأفراد المصابين 3,4. تشمل الأعراض الأساسية للاضطراب عجز المهارات الحركية الدقيقة والجسيمة ، بما في ذلك المشية الرنحية المتشنجة ، وضعف الكلام الخطير ، والإعاقة الذهنية. ما يقرب من 80 ٪ من مرضى AS يعانون أيضا من اضطرابات النوم والصرع. حتى الآن ، العلاج الوحيد المتاح هو الأدوية العرضية ، والتي تقلل من نوبات الصرع وتحسن نوعية النوم1. لذلك ، فإن تطوير نماذج حيوانية قوية ذات أنماط ظاهرية سلوكية قابلة للتكرار جنبا إلى جنب مع تحليل النمط الظاهري المكرر سيكون ضروريا لتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية للاضطراب واكتشاف الأدوية والعلاجات الفعالة.

يتطلب تعقيد الاضطراب البشري الذي يؤثر على الجهاز العصبي المركزي كائنات نموذجية لامتلاك جينوم وعلم وظائف الأعضاء والسلوك المماثل. تحظى الفئران بشعبية ككائن نموذجي بسبب دورة التكاثر القصيرة وصغر حجمها والسهولة النسبية لتعديل الحمض النووي. في عام 1984 ، اقترح بول ويلنر ثلاثة معايير أساسية للتحقق من صحة نموذج المرض: البناء والوجه والصلاحية التنبؤية ، والتي تستخدم لتحديد قيمة النموذج5. ببساطة ، تعكس صلاحية البناء الآليات البيولوجية المسؤولة عن تطور الاضطراب ، وتلخص صلاحية الوجه أعراضه ، وتصف الصلاحية التنبؤية استجابة النموذج للأدوية العلاجية.

للالتزام بالمبادئ المذكورة أعلاه ، اخترنا المسببات الجينية الأكثر شيوعا ، وهي حذف كبير لموضع الأم 15q11.2-13q بما في ذلك جين UBE3A ، لإنشاء فئران نموذجية AS. استخدمنا تقنية CRISPR / Cas9 لحذف منطقة طولها 76,225 نقطة أساس تمتد عبر جين UBE3A بأكمله ، وتشمل كلا من العناصر المشفرة وغير المشفرة للجين ، في الفئران من خلفية C57BL / 6N6. ثم قمنا بتربية الحيوانات للحصول على UBE3A +/- الفئران غير المتجانسة. للتحقق من صحة الوجه للنموذج ، استخدمنا من تهجين UBE3A + / - إناث وذكور من النوع البري للحصول على ذرية UBE3A +/- (سلالة تسمى C57BL / 6NCrl-UBE3A / Ph وتم تعيينها لاحقا على أنها UBE3A mGenedel / +) والتحكم في القمامة. اختبرنا مهاراتهم الحركية الدقيقة والجسيمة ، والعاطفية ، والتأثير لتلخيص أعراض AS الأساسية. في مقال سابق ، قمنا أيضا بتقييم الوظائف المعرفية للحيوانات ، حيث يعاني مرضى AS أيضا من إعاقة ذهنية6. ومع ذلك ، لم نجد أي إعاقات إدراكية في الفئران UBE3AmGenedel / + ، ربما بسبب صغر سن الحيوانات في وقت الاختبار7. كشف الفحص اللاحق للحيوانات الأكبر سنا ، التي يبلغ عمرها حوالي 18 أسبوعا ، عن عجز في المرونة السلوكية أثناء التعلم العكسي في نموذج تفضيل المكان. ومع ذلك ، فإن تعقيد المعدات المستخدمة لهذا التحليل يتطلب وحدة منهجية منفصلة ولا يتم تضمينها هنا.

تنتمي الاختبارات السلوكية المعروضة هنا إلى أدوات التنميط الظاهري الشائعة في البحث الجيني ، وذلك بفضل قيمتها التنبؤية العالية وصلاحية البناء الكافية8،9،10. استخدمنا هذه الاختبارات للتحقق من صحة نموذج الفئران من AS من خلال تلخيص الأعراض الأساسية للمرض البشري بطريقة قابلة للتكرار ومستقلة عن العمر. تم تقييم عاطفية الحيوان في اختبارات المتاهة المرتفعة والاختبارات الميدانية المفتوحة. يعتمد كلا الاختبارين على صراع الاقتراب وتجنب ، حيث تستكشف الحيوانات بيئة جديدة بحثا عن الطعام أو المأوى أو فرص التزاوج مع تجنب المقصورات المسببة للقلق في نفس الوقت11. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام اختبار المجال المفتوح لاختبار النشاط الحركي للفأر8. يستخدم اختبار تعليق الذيل على نطاق واسع في أبحاث الاكتئاب للكشف عن أدوية جديدة مضادة للاكتئاب أو أنماط ظاهرية شبيهة بالاكتئاب في نماذج خروج المغلوبللفأر 12. يقيم هذا الاختبار اليأس الذي تتطور به الحيوانات بمرور الوقت في موقف لا مفر منه. تم تحديد التعلم الحركي وخصائص المشي التفصيلية على الروتارود وفي DigiGait ، على التوالي. يميز تحمل الحيوان على قضيب التسارع مهاراته في التوازن وتنسيق الحركة ، في حين أن التحليل التفصيلي لأنماط خطوات الفأر هو تقييم حساس للإعاقات العصبية العضلية المرتبطة بالعديد من اضطرابات الحركة العصبية13،14،15. يعد اختبار تمزيق نستله جزءا من المنهجية القياسية للكشف عن السلوك الاندفاعي في القوارض ، ولأنه يستخدم سلوك بناء القوارض الطبيعي ، فإنه يشير إلى رفاهية الحيوان16,17.

كان حجم المجموعات التجريبية نتيجة لحل وسط لتلبية متطلبات قاعدة 3R والاستخدام الفعال لأداء تربية المستعمرات. ومع ذلك ، للحصول على قوة إحصائية ، كان لدى المجموعات ما لا يقل عن 10 أفراد ، بسبب إنشاء كمية كافية من أزواج التكاثر. لسوء الحظ ، لم ينتج عن أداء التكاثر دائما عدد كاف من الحيوانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

خضعت جميع الحيوانات والتجارب المستخدمة في هذه الدراسة لمراجعة أخلاقية وأجريت وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU. تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة المركزية التشيكية لرعاية الحيوان. تم إيواء الفئران في أقفاص جيدة التهوية وتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 ± 2 درجة مئوية مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. تم تزويد الفئران بالفأر تشاو والماء الإعلاني. تم إيواء الفئران في مجموعات من ثلاثة إلى ستة لكل قفص. لم يتم إجراء أي مناولة بخلاف الوزن قبل الاختبار. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل بشأن جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. اعتبارات عامة قبل وأثناء الاختبار

ملاحظة: توخيا للوضوح والشمولية، تعرض التعليقات العامة قبل وصف الاختبارات الفردية. ينطبق هذا على كل اختبار ، باستثناء واضح لاختبار تمزيق نستله ، والذي يتم إجراؤه في غرفة سكنية ولا يتطلب استخدام أي معدات تجريبية.

  1. استيعاب الحيوانات في منشأة الأبحاث لمدة 14 يوما على الأقل قبل الاختبار لتقليل أي إجهاد ناتج عن النقل والتغيرات في البيئة.
  2. سجل أوزان الحيوانات قبل الاختبار ، لأن الوزن هو عامل مربك شائع في البحث السلوكي.
  3. اترك الحيوانات تتأقلم في غرفة التجارب لمدة 1 ساعة على الأقل بعد النقل من غرفة السكن لتقليل إجهاد النقل ، كلما حدث هذا النقل (أي كل اختبار موصوف أدناه باستثناء تمزيق العشائر ، الذي يتم إجراؤه في غرفة السكن).
  4. قم بتسمية كل على الذيل بعلامة مائية غير سامة للسماح بالتعرف السريع أثناء التجربة.
  5. إزالة جميع البول والبراز التي تودعها الحيوانات في الجهاز التجريبي أثناء الاختبار بعد كل تجربة.
  6. امسح جميع الأجهزة التجريبية بنسبة 75٪ كحول قبل وبعد كل تم اختباره. يزيل التنظيف الآثار الشمية المترسبة أثناء الاختبار ويساعد على الاحتفاظ بظروف تجريبية مستقرة.
  7. نقل الحيوانات من قفصها المنزلي إلى الجهاز التجريبي بأكبر قدر ممكن من العناية ، ويفضل أن يكون ذلك في حاوية صغيرة غير شفافة ، ثم إطلاقها بحرية ما لم تكن هناك حاجة إلى تلاعبات أخرى.
  8. ضع كل في قفص احتجاز مؤقت بعد الاختبار لمنعه من التأثير على الحيوانات غير المختبرة في قفص المنزل.
  9. اختبار الذكور والإناث في أيام متتالية. قم بتبديل ترتيب الأنماط الجينية المختلفة أثناء الاختبار لموازنة العوامل البيئية غير المتوقعة بين المجموعات التجريبية.
  10. ضع الحيوانات مرة أخرى في قفصها المنزلي بعد اختبار جميع الحيوانات وأعدها إلى غرفة السكن.
  11. في حالة الاختبار المتكرر للحيوانات ، حافظ على فاصل زمني لا يقل عن 1 يوم بين كل اختبار.

2. الاختبارات السلوكية

  1. مرتفع بالإضافة إلى متاهة (EPM)
    ملاحظة: تم اختبار كلا الجنسين من سلالات الفئران C57BL / 6NCrl و UBE3AmGenedel / + لهذه الدراسة في عمر 9-12 أسبوعا. تراوحت أوزان الحيوانات من 22 إلى 36 جم للذكور و 18 إلى 28 جم للإناث في وقت الاختبار.
    1. ضع المتاهة ذات الشكل الزائد على منصة الاختبار أسفل الكاميرا مباشرة. باستخدام مقياس الجهد على الحائط ، اضبط شدة الضوء على 70 لوكس في مركزه بمساعدة مقياس لوكسومتر ، مع وضع مستشعره في وسط المتاهة أثناء الضبط.
    2. افتح البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج Viewer وقم بتحميل التكوين لاختبار EPM بالنقر فوق الرمز الموجود في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب التكوين . قم بتحميل المكون الإضافي EPM من قائمة "ملف ". املأ معلومات الحيوان باستخدام لوحة مفاتيح الكمبيوتر - معرف الحيوان والنمط الجيني والجنس ومعلومات التجربة (التاريخ وشدة الضوء) - في الحقول المقابلة من علامة التبويب التجربة . تحقق مما إذا كان موقع المنطقة والأذرع المفتوحة والأذرع المغلقة قد تم تكوينها بشكل صحيح. بمساعدة التحكم المرئي وفأرة الكمبيوتر ، تأكد من أن المناطق المحددة الافتراضية تتطابق مع مناطق EPM المقابلة في معاينة الفيديو.
    3. EPM هو اختبار يستخدم لتقييم القلق العام للحيوان ، والذي يعتمد على تعارض النهج والتجنب. تميل القوارض بشكل طبيعي إلى تجنب المناطق غير المحمية المضاءة جيدا (الأسلحة المفتوحة) ، لصالح المناطق الأكثر أمانا (الأسلحة المغلقة). نظرا لأن هذا الاختبار المؤتمت بالكامل يعتمد على نظام تتبع الفيديو ، دع البرنامج يحسب تلقائيا الوقت المستغرق في كل منطقة بالإضافة إلى عدد المداخل.
    4. أثناء الاختبار ، قم بتسجيل الحيوانات على الفيديو عبر كاميرا صناعية حساسة للضوء بالأشعة تحت الحمراء. السماح للبرنامج للكشف عن موقف الحيوان في الوقت الحقيقي أثناء التسجيل. بعد ذلك ، دع البرنامج يقوم تلقائيا بتقييم مسارات الحيوان لحساب جميع المعلمات التي تصف سلوك الحيوان في المتاهة. استخدم الوقت الذي تقضيه في أذرع مفتوحة مثيرة للقلق والنسبة المئوية لزيارات الأسلحة المفتوحة لتقييم مستوى السلوك الشبيه بالقلق في الحيوانات.
      ملاحظة: المتاهة المصنوعة حسب الطلب مصنوعة من مادة نفاذة للضوء بالأشعة تحت الحمراء ويتم وضعها على منصة مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED).
    5. ضع مؤشر الماوس على أيقونة السهم في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب اكتساب . أخرج حيوانا من قفص المنزل باليد وضعه برفق في وسط EPM. ابدأ البروتوكول بالنقر بزر الماوس الأيسر على فأرة الكمبيوتر واترك الغرفة التجريبية على الفور.
    6. بمجرد انتهاء بروتوكول التسجيل بعد 5 دقائق من استكشاف المتاهة المجاني ، احفظ البيانات المسجلة بالنقر فوق "موافق " في النافذة التي تظهر بعد إنهاء البروتوكول ، وقم بتسمية الملف بشكل مناسب ، وانقر فوق حفظ. قم بتصدير النتائج إلى ملف .csv لكل تم اختباره للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق الرمز الموجود على اللوحة الرأسية اليسرى من علامة التبويب تحليل البيانات .
    7. أخرج الحيوان من المتاهة باليد وضعه في قفص الاحتجاز المؤقت. المضي قدما في اختبار جميع الحيوانات بنفس الطريقة. انسخ النتائج لجميع الحيوانات التي تم اختبارها إلى ملف Notepad للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق رمز نسخ النتائج في علامة تبويب نتائج المكون الإضافي Elevated Plus maze .
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف الإعداد التجريبي ، مثل الإضاءة أو وضع الكمبيوتر ، اعتمادا على بناء مرفق الحيوانات.
  2. اختبار المجال المفتوح (OF)
    ملاحظة: يقيم اختبار المجال المفتوح الحركة الكلية للحيوان ، والتي يتم تشغيلها من خلال السلوك الاستكشافي في بيئة جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه بشكل شائع كأداة فحص للكشف عن القلق العام في مكان غير محمي ومضاء جيدا. هذا اختبار مؤتمت بالكامل يستخدم نظام تتبع الفيديو ، والذي تم استخدامه أيضا في الاختبار السابق.
    1. ضع مربعات اختبار OF الأربعة على منصة الاختبار أسفل الكاميرا مباشرة. باستخدام مقياس الجهد على الحائط ، اضبط شدة الضوء على 200 لوكس في مركز كل اختبار OF بمساعدة مقياس لوكسومتر ، مع وضع مستشعره في وسط كل صندوق أثناء الضبط.
    2. افتح البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج Viewer وقم بتحميل التكوين لاختبار OF بالنقر فوق الرمز الموجود في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب التكوين . املأ معلومات الحيوان باستخدام لوحة مفاتيح الكمبيوتر - معرف الحيوان والنمط الجيني والجنس ومعلومات التجربة (التاريخ وشدة الضوء) - في الحقول المقابلة من علامة التبويب التجربة . تحقق مما إذا كان موضع المنطقة (المركز والمحيط) يتطابق مع مربعات اختبار OF واضبطها إذا لزم الأمر. بمساعدة التحكم المرئي وفأرة الكمبيوتر ، تأكد من تطابق المركز الظاهري المحدد والمناطق المحيطية مع مناطق اختبار OF المقابلة في معاينة الفيديو.
    3. أثناء الاختبار ، قم بتسجيل الحيوانات على الفيديو عبر كاميرا صناعية حساسة للضوء بالأشعة تحت الحمراء. اسمح للبرنامج باكتشاف موضع الحيوان في الوقت الفعلي أثناء التسجيل وتقييم مسارات الحيوان تلقائيا لحساب جميع المعلمات التي تصف سلوك الحيوان في مربع اختبار OF. المسافة المقطوعة ومتوسط السرعة ووقت الراحة هي معلمات تستخدم لتقييم نشاط الحيوان في بيئة جديدة ، بينما يصف عدد مداخل المركز والمدة في المركز سلوكا شبيها بالقلق في الحيوانات.
      ملاحظة: المتاهة المصنوعة حسب الطلب مصنوعة من مادة نفاذية للضوء بالأشعة تحت الحمراء ويتم وضعها على منصة مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء LED.
    4. ضع مؤشر الماوس على أيقونة السهم في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب اكتساب . قم بإزالة أربعة من قفص المنزل يدويا وضعها برفق في زاوية كل صندوق اختبار. ابدأ البروتوكول بالنقر بزر الماوس الأيسر على فأرة الكمبيوتر واترك الغرفة التجريبية على الفور.
    5. عند انتهاء البروتوكول بعد 10 دقائق من استكشاف المتاهة المجاني ، احفظ البيانات بالنقر فوق موافق في النافذة التي تظهر بعد إنهاء البروتوكول ، وقم بتسمية الملف بشكل مناسب ، وانقر فوق حفظ. قم بتصدير النتائج إلى ملف .csv لكل تم اختباره للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق الرمز الموجود على اللوحة الرأسية اليسرى من علامة التبويب تحليل البيانات .
    6. إزالة الحيوانات من المتاهة باليد ووضعها في قفص الاحتجاز المؤقت. المضي قدما في اختبار جميع الحيوانات بنفس الطريقة. تحليل البيانات المصدرة.
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف الإعداد التجريبي ، مثل الإضاءة أو عدد المتاهات أو وضع الكمبيوتر ، اعتمادا على بناء منشأة الحيوانات.
  3. اختبار تعليق الذيل (TST)
    ملاحظة: يتم اختبار ثلاثة فئران في وقت واحد مع جهاز تعليق الذيل الآلي.
    1. الحفاظ على شدة ضوء الغرفة في 100-120 لوكس.
    2. قم بتوصيل نظام TST بالكمبيوتر عبر كابل USB. أدخل دونجل USB في الكمبيوتر وابدأ تشغيل البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج BIO-TST . في علامة التبويب الإعدادات ضمن عمومي، اضبط مدة الاكتساب على 360 ثانية. في علامة التبويب التجربة ، حدد قائمة جديدة بالموضوعات، وأنشئ ملف تجربة جديدا وقائمة جديدة بالموضوعات التي تم اختبارها باتباع الإرشادات الموجودة في علامة التبويب المفتوحة.
    3. ابدأ التشغيل بالنقر فوق بدء تشغيل | متابعة في علامة التبويب اكتساب . قم بإعداد الحيوانات للاختبار عن طريق لف شريط لاصق أحادي الجانب ، مثل الشريط الطبي transpore ، حوالي 3/4 من ذيل الحيوان ، بدءا من القاعدة.
    4. مرر خطاف التعليق عبر الشريط الحيوان عليه. ابدأ في الحصول على بيانات لكل على حدة فور تعليقه على الخطاف بالنقر فوق رمز ابدأ أسفل الموضع المرئي لكل ومراقبة الحيوانات باستمرار أثناء الاختبار.
    5. بعد الانتهاء من الاستحواذ على المجموعة الأولى من الحيوانات ، انقر فوق بدء التشغيل التالي ، وإزالة الحيوانات من الخطاف ، وفصل الشريط اللاصق عن ذيولها ، وقطع الشريط بعناية بمقص على طول الذيل ، ووضع الحيوانات في قفص الاحتجاز المؤقت.
    6. قم بتنظيف الجهاز بنسبة 75٪ من الكحول والأنسجة الورقية وتابع بقية الحيوانات كما هو موضح أعلاه. في علامة التبويب تحليل، حدد آخر 4 دقائق من عملية الاستحواذ للتحليل، ثم حدد جميع عمليات التشغيل الصالحة في فترة التحليل، وانقر فوق تحليل الموضوعات المحددة، واختر تنسيق البيانات المطلوب، وانقر فوق تصدير البيانات المحددة لتصدير البيانات التي تم جمعها لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: يستمر الاختبار 6 دقائق. خلال أول 2 دقيقة ، ستكافح الحيوانات بقوة ، ولكن عندما يصبح رد فعل اليأس سائدا خلال ال 4 دقائق المتبقية ، يتم أخذ وقت الجمود خلال هذه الفترة للتحليل. قد تختلف البرامج والأجهزة ، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف المعدات نفسها (على سبيل المثال ، عدد مواضع الاختبار).
  4. تحليل المشي
    1. قم بتشغيل جهاز المشي واضبط سرعة الحزام يدويا على 20 سم / ثانية على لوحة المعدات بالنقر فوق الرمز + أو - الموجود بجوار مؤشر السرعة. قم بتشغيل ضوء الجهاز عن طريق تدوير المقبض في اتجاه عقارب الساعة. قم بتشغيل برنامج DigiGait Imager بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج واضبط سرعة الغالق على 100 للفئران البيضاء أو 130 للفئران السوداء / الداكنة في الحقل لسرعة الغالق.
    2. أخرج الحيوان الأول من قفص المنزل باليد وضعه برفق على حزام جهاز المشي. أغلق الباب إلى مقصورة الحيوانات. فحص بصريا للتأكد من أن ذيل الحيوان ليس عالقا بين الباب والإطار.
    3. اسمح للماوس باستكشاف حزام جهاز المشي قبل التسجيل. تأكد من أن الحيوان قادر على إجراء الاختبار عن طريق ضبط جهاز المشي على سرعة المشي البطيئة ل ~ 3 s ثم إيقافه ، ومراقبة الحيوان باستمرار.
    4. ابدأ تشغيل الحزام بالضغط على زر البدء على لوحة المعدات وسجل لمدة 10 ثوان تقريبا. تأكد من أن حركة واضحة وطلاقة من 10-15 خطوة على الأقل يمكن ملاحظتها. أوقف الحزام بالضغط على الزر إيقاف ( Stop ) الموجود على لوحة الجهاز وأعد الماوس إلى قفص الاحتجاز المؤقت يدويا.
    5. قم بفحص التسجيل لسلسلة من الصور بخطوات بطلاقة بالنقر فوق تشغيل ومراجعة التسجيل باستخدام عنصر التحكم المرئي في وضع التحرير . اختر 10-15 حركة بطلاقة عن طريق كتابة أرقام إطارات البداية والنهاية يدويا في الحقول ذات الصلة (من الإطار # للإطار الأول وإلى للإطار الأخير). املأ معلومات الحيوان - معرف الحيوان وتاريخ الميلاد والجنس والوزن وسرعة الحزام وزاوية الحزام - وقم بالتعليق عند الحاجة في الحقول ذات الصلة. احفظ الملف لمزيد من التحليل بالنقر فوق حفظ.
    6. نظف الحزام بالماء وتابع بقية الحيوانات بنفس الطريقة. اختر CAMERA لمتابعة تسجيل مشي الحيوان التالي. عندما يتم الحصول على التسجيلات لجميع الحيوانات ، انتقل إلى التحليل.
      ملاحظة: يتم استبعاد الحيوانات غير القادرة على المشي بسرعة محددة من الحزام من الاختبار. بناء على تجربتنا ، نلاحظ أن الحيوانات الأكبر سنا (أكثر من 50 أسبوعا) تواجه صعوبات أكبر في المشي على جهاز المشي ، مع تردد متغير يتراوح بين 2٪ إلى 50٪ اعتمادا على النمط الوراثي. يتم جمع النفايات الحيوانية في صواني إما في الجزء الأمامي أو الخلفي من جهاز المشي. يتم إفراغ الصواني بعد كل دراسة وغسلها بالماء الدافئ والصابون. يمسح الحزام بقطعة قماش مبللة.
    7. إجراء تحليل المشي بناء على تحليل مؤتمت بالكامل لتسجيلات الفيديو لآثار أقدام الحيوانات. اضبط البيانات في برنامج تحليل DigiGait .
      ملاحظة: لا يوفر تحليل المشي مقياسا للتنسيق الحركي فحسب ، بل يوفر أيضا وصفا حركيا مفصلا يعتمد على تحليل إشارة المشي الديناميكية ، والتي تمثل التاريخ الزمني لوضع المخلب من خلال خطوات متسلسلة. يتم قياس المعلمات التالية تلقائيا بواسطة البرنامج: مدة التأرجح ، النسبة المئوية لمدة الخطوة في التأرجح ، مدة الكبح ، النسبة المئوية لمدة الخطوة في الكبح ، مدة الدفع ، النسبة المئوية للخطوة في الدفع ، مدة الموقف ، النسبة المئوية للخطوة في الموقف ، مدة الخطوة ، نسبة الكبح للموقف ، نسبة الدفع لمرحلة الوقوف ، نسبة التأرجح إلى الموقف ، طول الخطوة ، تردد الخطوة ، زاوية المخلب ، تقلب زاوية المخلب ، عرض الموقف ، زاوية الخطوة ، تقلب طول الخطوة ، تباين عرض الخطوة ، تقلب زاوية الخطوة ، معامل تباين طول الخطوة ، معامل تباين عرض الموقف ، معامل اختلاف زاوية الخطوة ، معامل اختلاف مدة التأرجح ، منطقة المخلب عند موقف الذروة ، تقلب منطقة المخلب عند موقف الذروة ، مدة الموقف المشترك للطرف الخلفي ، النسبة المئوية للموقف المشترك ، نسبة فترات الوقوف الخلفي الأيسر والأيمن ، تناظر المشية ، الحد الأقصى لمعدل تغيير منطقة المخلب الملامسة لحزام جهاز المشي أثناء مرحلة الكبح ، الحد الأقصى لمعدل تغيير منطقة المخلب الملامسة لحزام جهاز المشي أثناء مرحلة الدفع ، دفع تاو ، مسافة تداخل مخلب ، موضع وضع المخلب ، معامل الرنح ، مسافة خط الوسط ، مسافة المحور ، وسحب المخلب. يسمح البرنامج بتصحيح صغير لضوضاء تتبع الخطوة ، والتي يجب إكمالها قبل التحليل الإحصائي. قد تختلف البرامج والأجهزة ، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة.
  5. روتارود
    ملاحظة: يستخدم اختبار الروتارود لتقييم توازن وظائف محرك القوارض والتنسيق الحركي. يتطلب الاختبار أن يمشي الفأر على قضيب دوار بقطر ثابت (5 سم) ، مع تسارع الدوران خلال فترة زمنية معينة (5 دقائق) حتى لا يتمكن الحيوان من البقاء.
    1. قم بتشغيل المعدات الدوارة عن طريق الضغط على مفتاح التشغيل / الإيقاف الموجود على الجهاز وتشغيل البرنامج بالنقر المزدوج فوق رمز برنامج Rod. قم بتهيئة ملف جديد في علامة التبويب ملف واحفظه تحت الاسم المناسب. في نافذة الإعداد، املأ تفاصيل التجربة، مثل التاريخ واسم المستخدم وأي تعليقات نهائية. اضبط ملف تعريف السرعة على 300 ثانية ، والسرعة الأولية على 4 دورات في الدقيقة ، والسرعة الطرفية على 40 دورة في الدقيقة.
    2. قم بإعداد جدول زمني للحيوانات التي تم اختبارها في مجال الحيوان ، وقم بتعيين كل إلى موقعه على القضيب. لم تتم الإشارة إلى المواضع في البرنامج بشكل صريح ، ولكنها تتوافق مع سطر القائمة ؛ على سبيل المثال ، يشير السطر الأول إلى الموضع الأول للقضيب ، ويشير السطر الخامس إلى الموضع الخامس للقضيب ، وهكذا. تذكر موازنة كل موضع قضيب بين المجموعات التجريبية.
      ملاحظة: يمكن اختبار خمسة في وقت واحد.
    3. أغلق لوحة الإعداد بالنقر فوق إغلاق وافتح لوحة القياس بالنقر فوق قياس. ابدأ الدوران الأولي للقضيب عند 4 دورات في الدقيقة بالنقر فوق بدء / إيقاف ووضع الحيوانات الخمسة الأولى في المواضع المخصصة لها. عندما تكون جميع الحيوانات على القضيب ، ابدأ بروتوكول الاختبار بالنقر فوق بدء ملف التعريف ، وسوف يتسارع القضيب تدريجيا إلى 40 دورة في الدقيقة خلال 5 دقائق. إذا سقط من القضيب ، فأعده إلى القضيب قبل بدء البروتوكول.
      ملاحظة: عادة لا تبقى الحيوانات على القضيب لفترة كافية لوضع جميع الفئران عليه مرة واحدة خلال المحاولة الأولى. من المهم التحلي بالصبر عند وضع الحيوانات على القضيب مع سرعة الدوران الثابتة في البداية. الغرض من الاختبار ليس تحديد قدرة الحيوان على التحمل على القضيب بسرعة دوران ثابتة ، ولكن لإيجاد السرعة التي لا يستطيع بها الحيوان البقاء على القضيب. تتناسب سرعة القضيب مع زمن انتقال البقاء عليه ؛ وبالتالي ، يتم استخدامه للتعبير عن توازن الحيوان.
    4. انقل الحيوانات إلى قفص الاحتجاز المؤقت بعد سقوطها جميعا من القضيب أو بعد مرور 5 دقائق. قم بإزالة أي فضلات حيوانية ونظف القضيب والصينية بالكحول.
    5. انقر فوق الحيوانات -> للمتابعة مع المجموعة التالية من الحيوانات بنفس الطريقة. بعد اختبار جميع الحيوانات ، أغلق نافذة القياس بالنقر فوق إغلاق وانقر فوق إظهار لعرض البيانات التي تم جمعها. قم بتصدير البيانات التي تم الحصول عليها بتنسيق ملف .csv لمزيد من التحليل بالنقر فوق تصدير CSV.
    6. اختبر كل على العصا ثلاث مرات بفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة. استخدم متوسط قيمة زمن الانتقال للانخفاض خلال التجارب الثلاث لمزيد من التحليل الإحصائي. تقييم التعلم الحركي للحيوان عن طريق تكرار الاختبار لمدة 5 أيام متتالية.
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف المعدات نفسها ، على سبيل المثال ، في عدد مواضع الاختبار ، والبناء العام ، وأبعاد القضيب.
  6. نستله تمزيق العش بناء
    1. فصل الحيوانات في أقفاص الفئران البولي واحد مع المعدات القياسية (الفراش ، شبكة الغذاء ، وإمدادات المياه) لمدة 1 أسبوع. خذ ما يقرب من 12 جم من نستلة القطن باستخدام ملقط ، وسجل وزنه يدويا باستخدام المقاييس ، وضعه بشكل عشوائي في قفص ، ولكن على الجانب الآخر من إمدادات المياه. أعد الأقفاص مع الحيوانات إلى غرفة السكن.
    2. قم بوزن كل عش في نفس الوقت كل يوم لمدة 4 أيام القادمة يدويا باستخدام المقاييس. سجل الأوزان على الورق أو في جدول بيانات معد مسبقا. تأكد من أن كل عشة جافة عند وزنها ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، جفف على وسادة التدفئة وأعد جميع الأعشاش إلى أقفاصها المخصصة في نفس الوقت في المكان الذي صنع فيه الماوس عشه. إذا تمزق nestlet إلى عدة أجزاء ، تزن أكبرها.
    3. لتحليل البيانات ، عبر عن التناقص في وزن نستله في كل يوم بالنسبة للوزن الأولي وقدمه كنسبة مئوية من المادة المستخدمة.
      ملاحظة: قد يؤدي إعادة الذكور إلى قفص مشترك إلى زيادة العدوانية والإصابات غير المرغوب فيها بين الحيوانات. لذلك ، يجب جدولة اختبار تمزيق نستله في نهاية نظام الاختبار لتجنب المساس برفاهية الحيوان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مرتفع بالإضافة إلى متاهة واختبارات ميدانية مفتوحة
تستخدم اختبارات EPM و OF الميل الطبيعي للقوارض لاستكشاف بيئات جديدة18,19. يخضع الاستكشاف لصراع تجنب النهج ، حيث تختار القوارض بين استكشاف بيئة جديدة وتجنب الخطر المحتمل. تستكشف الحيوانات أماكن غير معروفة بحثا عن مأوى أو اتصال اجتماعي أو البحث عن الطعام. ومع ذلك ، قد تنطوي الأماكن الجديدة على عوامل خطر مثل الحيوانات المفترسة أو المنافسين. يتكون كل من اختبار OF و EPM من مقصورات آمنة ومحفوفة بالمخاطر - المحيط والمركز في اختبار OF والأذرع المغلقة والمفتوحة في EPM ، على التوالي. تفضل القوارض بشكل طبيعي المقصورات المظلمة والمغلقة مقارنة بالمناطق المفتوحة والمرتفعة والمضاءة بشكل مشرق. وبالتالي ، فإن انخفاض استكشاف الأجزاء الخطرة / المولدة للقلق ، معبرا عنه بانخفاض في عدد الزيارات ومدة الزيارة ، أو كزيادة في زمن الوصول إلى الزيارة الأولى ، يميز السلوك الشبيه بالقلق الحيواني 8,11. يوفر وقت الراحة ومتوسط السرعة والمسافة الإجمالية التي تم اجتيازها معلومات إضافية حول النشاط التلقائي للحيوانات. لم يتم تغيير أي من المعلمات المتعلقة بالسلوك الشبيه بالقلق في طفرات UBE3AmGenedel / + في اختبار OF أو EPM (الشكل 1D-G). ومع ذلك ، كانت UBE3AmGenedel / + ناقصة النشاط بشكل كبير ، كما يتضح من مسافة اجتياز أقصر ، وسرعة متوسطة أقل ، ووقت راحة أطول في اختبار OF (الشكل 1A-C).

Figure 1
الشكل 1: النشاط التلقائي واستجابة القلق لبيئة جديدة في اختبار EPM و OF. (A-E) استكشاف المجال المفتوح. سارت UBE3AmGenedel / + مسافة أقصر (A) بمتوسط سرعة أقل (B) ووقت راحة طويل (C). لم يختلف عدد الزيارات ومدتها في المركز بين الحيوانات (D,E). كشف تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه عن تأثير كبير للنمط الجيني الرئيسي مع عدم وجود تفاعل كبير بين النمط الجيني والجنس (تأثير النمط الجيني : p < 0.01 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.7). لم تعتمد النسبة المئوية للزيارات إلى الأذرع المفتوحة والمغلقة على النمط الجيني (F) ، ولم يختلف الوقت المستغرق في الأذرع المفتوحة المسببة للقلق بين المجموعات التجريبية (G). لم يكشف ANOVA ثنائي الاتجاه عن تأثيرات رئيسية مهمة أو تفاعل النمط الجيني / الجنس (تأثير النمط الجيني: p > 0.9 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.9). تظهر البيانات الموضحة في مخطط الصندوق القيمة المتوسطة والنطاق بين الربع ونطاق القيم. يشار إلى نتائج الاختبار الهامة بعد التخصيص ك *. يتم عرض بيانات الحيوانات الضابطة (أنثى n = 10 ، ذكر n = 11) باللون الأحمر ، والمسوخ (أنثى n = 9 ، ذكر n = 10) باللون الأزرق. تم تكييف هذا الرقم من Syding et al.6. الاختصارات: EPM = مرتفع بالإضافة إلى متاهة ؛ OF = حقل مفتوح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار تعليق الذيل
يقيس TST يأس الحيوانات الذي تم تطويره في موقف لا مفر منه. عندما تعلق من الذيل ، تصبح القوارض غير متحركة بسرعة بعد فترة أولية من النشاط القوي. تشير مدة الجمود إلى حجم "اليأس". أظهرت العديد من المختبرات أن مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للاكتئاب النشطة سريريا تقلل من مدة الجمود9،20،21. أصبح هذا الاختبار غير المعقد يستخدم بشكل شائع لفحص المواد المضادة للاكتئاب المحتملة ، ويمكن استخدامه أيضا لتوصيف النمط الظاهري لمختلف سلالات الحيوانات ، وكذلك المورينات المعدلة وراثيا ، في الدراسات التي تستكشف الأساس العصبي البيولوجي لحالات الاكتئاب9،21. كانت UBE3AmGenedel / + غير متحركة لفترة أطول بكثير من زملائها في القمامة ، مما يشير إلى سلوكها الشبيه بالاكتئاب (الشكل 2).

Figure 2
الشكل 2: وقت الجمود في اختبار تعليق الذيل. أظهرت UBE3AmGenedel / + ثباتا أطول أثناء تعليق الذيل. أظهر ANOVA ثنائي الاتجاه تأثيرات رئيسية كبيرة ولكن لا توجد أهمية في تفاعل النمط الجيني / الجنس (تأثير النمط الجيني: p < 0.001 ؛ التأثير الجنسي: p < 0.001 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.5). تظهر البيانات الموضحة في المخطط المربع القيمة المتوسطة والنطاق الربيعي ونطاق القيم. يشار إلى نتائج الاختبار الهامة بعد التخصيص ك *. يتم عرض بيانات الحيوانات الضابطة (أنثى ن = 10 ، ذكر ن = 14) باللون الأحمر ، والطفرات (أنثى ن = 10 ، ذكر ن = 11) باللون الأزرق. تم تكييف هذا الرقم من Syding et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل الروتارود والمشي
يعود تاريخ اختبار الروتارود في نماذج العجز العصبي الحركي إلىمنتصف القرن 20 22. يستخدم الروتارود لتقييم توازن الحيوان وتنسيق الحركة ، حيث تظهر إعاقتها في زمن انتقال أقصر بكثير للسقوط من القضيب الدوار14. يستخدم الاختبار المتكرر على الروتارود لدراسة قدرات التعلم الحركي للحيوانات. أتاح التطور السريع للمعدات الحديثة والتقنيات الرقمية إجراء تقييم آلي ودقيق وغير متحيز للأنماط الظاهرية الحركية للقوارض بناء على الأوصاف التفصيلية لمشيتها23. حل تحليل المشي الآلي محل تحليل البصمة ، كما أنه أكثر حساسية للعجز العصبي العضلي14،24،25. التغييرات في الخصائص المكانية والزمانية للمشية الحيوانية خاصة بوحدة علم الأمراض النموذجية26،27،28. كان لدى طفرات UBE3AmGenedel / + تناوب قوي لمؤشرات المشي (الشكل 3A-G) ، وهو ما أكده أيضا انخفاض زمن الوصول للسقوط من الدوار (الشكل 3H).

Figure 3
الشكل 3: تحليل مفصل للمشي والتعلم الحركي على الروتارود. (أ-ز) تم تغيير مؤشرات المشي لحيوانات UBE3AmGenedel / +. كان لدى UBE3AmGenedel / + تأرجح أطول (A) وموقف (B) مما أدى إلى إطالة مدة الخطوة وطولها (C ، D). كما تم زيادة مدة دفع أطرافهم الخلفية (E) والتباطؤ (F). كشف التحليل أيضا عن مساحة مخلب أكبر في وضع الذروة (G). لم تختلف المعلمات المترية للحيوانات ولا وزنها (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن الاختلافات المرصودة لم تكن بسبب الاختلافات في حجم الحيوان. أظهر ANOVA ثنائي الاتجاه مع قياسات متكررة تأثيرا رئيسيا كبيرا للنمط الجيني مع عدم وجود تفاعل جيني / جنسي كبير (تأثير النمط الجيني: p < 0.001 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.2 ). (H) تظهر نتائج أداء الروتارود زمن انتقال أقصر للسقوط في UBE3AmGenedel / +. كشف ANOVA ثنائي الاتجاه مع قياسات متكررة عن تأثيرات رئيسية كبيرة دون تفاعل كبير (تأثير النمط الجيني: p < 0.001 ؛ التأثير الجنسي: p < 0.01 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.1 ). تظهر معلمات المشية الموضحة في مخطط الصندوق القيمة المتوسطة والنطاق الربيعي ونطاق القيم. يشار إلى نتائج الاختبار الهامة بعد التخصيص ك *. يتم عرض بيانات زمن الوصول للسقوط في مخطط خطي كمتوسط ± SEM. يتم عرض بيانات الحيوانات الضابطة (أنثى n = 10 ، ذكر n = 14) باللون الأحمر ، والمسوخ (أنثى n = 10 ، ذكر n = 11) باللون الأزرق. تم تكييف هذا الرقم من Syding et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمزيق نستله - بناء العش
يستخدم اختبار تمزيق نستله في المقام الأول للكشف عن السلوك القهري النمطي في الفئران29,30. ومع ذلك ، تظهر الفئران ميلا طبيعيا لتمزيق المواد المقدمة لبناء عشها. وبالتالي ، يتم استخدام عدم القدرة على تمزيق نستله القطن كمؤشر على تأثرهم بضعف النمو العصبي16,31. استخدمت UBE3AmGenedel / + مواد أقل بكثير لبناء أعشاشها ، وكان هذا الاختلاف بارزا بشكل خاص بين الإناث المحورة وراثيا ونظيراتها الضابطة (الشكل 4 أ).

Figure 4
الشكل 4: استخدام مواد نستله لبناء العش. قامت UBE3AmGenedel / + بتمزيق مواد قطنية أقل من زملائها في القمامة. تم تحويل البيانات إلى صفوف محاذاة لتلبية المتطلبات الأساسية للحياة الطبيعية. كشف تحليل التباين مع المقاييس المتكررة عن تأثير كبير للنمط الجيني دون أهمية تفاعل النمط الجيني / الجنس (تأثير النمط الجيني: p < 0.05 ؛ النمط الجيني / التفاعل الجنسي: p > 0.4 ). تظهر البيانات الموضحة في مخطط الخط متوسط ± SEM. يشار إلى نتائج الاختبار الهامة بعد التخصيص ك *. يتم عرض بيانات الحيوانات الضابطة (أنثى ن = 10 ، ذكر ن = 14) باللون الأحمر ، والطفرات (أنثى ن = 10 ، ذكر ن = 11) باللون الأزرق. تم تكييف هذا الرقم من Syding et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول الزمني للاختبار
تخضع كل مجموعة (ضابطة وتجريبية) لنفس الاختبارات في نفس الأيام. يتم استخدام استراحة من 1 يوم بين الاختبارات لتقليل الآثار المرحلة المحتملة. إذا أمكن ، يتم اختبار الإناث والذكور في أيام متتالية. خلاف ذلك ، يتم اختبار الإناث بعد اختبار الذكور (الشكل 5)6.

Figure 5
الشكل 5: الجدول الزمني للاختبار. تم اختبار UBE3AmGenedel / + وضوابطها في مجموعتين. يتم تقديم الجدول الزمني للاختبار للمجموعة الأولى في اللوحة العلوية ، وللمجموعة الثانية في اللوحة السفلية. يشار إلى الأيام التي تم فيها اختبار الذكور باللون الأزرق ، بينما يشار إلى الأيام التي تم فيها اختبار الإناث باللون الأخضر. يشار إلى الأيام التي تم فيها اختبار كلا الجنسين باللون الأصفر. لم يتم إجراء أي اختبار في عطلات نهاية الأسبوع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تكييف الأرقام من Syding et al.6 وفقا لسياسة ترخيص MDPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عادة ما يتم التحقق من صحة نماذج AS التي تم إنشاؤها في سلالات الفئران المختلفة من خلال اختبارات الحالة العاطفية للحيوان والوظائف الحركية والقدرات المعرفية لتسهيل المقارنة مع الأعراض البشرية31,32. العجز الحركي في نماذج AS هو النتيجة الأكثر اتساقا عبر المختبرات ، تليها حالة عاطفية غير متغيرة من الطفرات وصعوبات بناء الأعشاش31،32،33. في المقابل ، يكون الضعف الإدراكي إما خفيفا أو غائبا7،31،33. يبدو أن التناقض في النمط الظاهري المعرفي يعتمد على عمر الحيوانات المختبرة ، كما هو موضح من قبل Huang et al.7. لذلك ، بالنسبة لهذه الورقة ، تم اختيار مجموعة من الاختبارات على أساس قابليتها للتكاثر ، وكذلك استقلالية العمر والأنواع ، حيث لوحظت نتائج قابلة للمقارنة في كل من نماذج AS للفئران والجرذان6،31،32.

بشكل حاسم ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن اختبار الحيوانات بشكل متكرر في إعدادات تجريبية مختلفة يتطلب ترتيبها الدقيق ، بدءا من الاختبارات الأكثر حساسية للتلاعب السابق ، وفي نفس الوقت مع الحد الأدنى من التأثير على الاختبارات التالية ، مثل اختبارات EPM و OF34. تتعلق المخاوف الإضافية باختبار تمزيق نستليت ، حيث تكون الحيوانات في منزل واحد ، وهو أمر معروف بأنه حالة مرهقة35. في وقت لاحق تجميع الذكور في قفص مشترك غالبا ما يؤدي إلى زيادة العدوان بسبب إنشاء التسلسل الهرمي. وبالتالي ، يجب أن يختتم اختبار تمزيق نستله جدول الاختبار. من الممارسات الجيدة أيضا اختبار الذكور قبل الإناث لتجنب تأثر سلوك الذكور بآثار حاسة الشم الأنثوية اللاحقة. يعد تناوب الحيوانات التي تنتمي إلى مجموعات تجريبية مختلفة أثناء الاختبار أمرا بالغ الأهمية في البحث السلوكي لتحقيق التوازن بين آثار العوامل غير المتوقعة على سلوك الحيوان. من المعروف أن التعامل مع الحيوانات قبل الاختبار في EPM يؤثر على استجابتها الملحوظة للإجهاد. لذلك ، يجب أن يكون مقدار المناولة ثابتا لجميع الحيوانات36. من المهم أيضا الحفاظ على ظروف السكن (مفردة مقابل مجموعة) ، والإضاءة أثناء الاختبار ، ووقت الاختبار ، وقبل تجربة الاختبار لكل ، حيث تؤثر كل هذه العوامل على استجابة الماوس في اختبار EPM و OF وقد تؤدي إلى تحيز النتائج37.

على الرغم من الاختبارات المقدمة التي تنتمي إلى أدوات الفحص الراسخة في تطوير الأدوية والتنميط الظاهري للفئران المعدلة وراثيا والتي تسفر عن نتائج قابلة للتكرار عبر المختبرات ، إلا أن بعض الاختبارات لا تزال تخضع لتعديلات طفيفة. نظرا لأن الضعف الحركي هو السمة الرئيسية للنمط الظاهري لنموذج AS ، يمكن أن يقتصر اختبار الروتارود على اختبار يوم 1 بدلا من 5 أيام متتالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج المعلمات التي تصف جودة العش المبني في اختبار تمزيق نستله38.

أحد القيود الواضحة على النتائج المقدمة هو غموض تفسيرها. على وجه الخصوص ، يمكن أن يفسر العجز الحركي لحيوانات AS التغيرات في المهام القائمة على الحركة ، مثل اختبار OF و EPM. وبالمثل ، يمكن أن يكون وقت الجمود المطول في TST نتيجة للإرهاق البدني الأكبر الذي تصاب به AS خلال هذا الاختبار المتطلب ، على عكس السلوك الشبيه بالاكتئاب. أيضا ، في اختبار تمزيق نستلت ، قد يكون انخفاض استخدام القطن بسبب النمط الظاهري العصبي العضلي بدلا من فقدان غريزة بناء العش. تفسير تغيرات طول الخطوة غامض ، حيث لوحظ تقصير في بعض نماذج الفئران لمرض باركنسون ، بينما لوحظ الإطالة في الفئران المسنة39,40. ومع ذلك ، نعتقد أن الزيادة في إجمالي طول الخطوة هي نتيجة لمدة تأرجح أطول. تزداد مدة التأرجح مع الألم وتطول في نماذج التهاب المفاصل ، مما يعني أن مدة التأرجح الأطول في الفئران يمكن أن تسمح بوضع الأطراف بشكل صحيح قبل تحمل الوزن41,42. تشير مدة الدفع إلى المدة الزمنية اللازمة للحيوان لبدء الحركة الأمامية والحفاظ عليها. وبالتالي ، قد تشير المدة القصيرة في الحيوانات السليمة إلى قوة أكبر وتحكم أفضل. لا تميز هذه النتائج نموذج الفئران AS فحسب ، بل تشير أيضا إلى ضعف المشي. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحقيق أوثق لتوضيح الأساس الفسيولوجي لهذا الضعف ، مثل تحديد قوة العضلات وفحص الروابط العصبية العضلية / الانتقال.

على الرغم من المعضلة التفسيرية ، توفر مجموعة الاختبارات السلوكية المقدمة نتائج قابلة للتكرار متسقة عبر المختبرات ويمكن أن تكون بمثابة أداة تحقق أنيقة لنماذج الفئران الجديدة لمتلازمة أنجلمان والأساليب العلاجية الجديدة6،31،32،43،44،45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل الأكاديمية التشيكية للعلوم RVO 68378050 ، LM2018126 المركز التشيكي لعلم الظواهر المقدم من MEYS CR ، OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (ترقية المركز التشيكي لعلم الفينوجينوم: التطوير نحو أبحاث الترجمة من قبل MEYS و ESIF) ، OP RDE CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 18_046 / 0015861 (ترقية البنية التحتية CCP II بواسطة MEYS و ESIF) ، و OP RDI CZ.1.05 / 2.1.00 / 19.0395 (جودة وقدرة أعلى للنماذج المعدلة وراثيا بواسطة MEYS و ERDF). وبالإضافة إلى ذلك، تلقت هذه الدراسة تمويلا من المنظمة غير الحكومية "رابطة العلاج الجيني" والتشيك (https://asgent.org/) والمركز التشيكي LM2023036 علم الظواهر المقدم من وزارة التعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany		 Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE		 Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany		 Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman's syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Tags

السلوك، العدد 200، متلازمة أنجلمان، الاختبارات السلوكية، التحقق من صحة النموذج، UBE3A، C57BL/6N
التوصيف السلوكي لنموذج فأر متلازمة أنجلمان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J.,… More

Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter