Summary
Ce manuscrit présente un ensemble de tests comportementaux hautement reproductibles pour valider un modèle murin du syndrome d’Angelman.
Abstract
Ce manuscrit décrit une batterie de tests comportementaux disponibles pour caractériser les phénotypes de type syndrome d’Angelman (SA) dans un modèle murin établi de SA. Nous utilisons le paradigme d’apprentissage du rotarod, l’analyse détaillée de la démarche et le test de construction du nid pour détecter et caractériser les déficiences motrices des animaux. Nous testons l’émotivité de l’animal en plein champ et dans les tests de labyrinthe surélevé, ainsi que l’effet dans le test de suspension de la queue. Lorsque des souris AS sont testées dans le cadre du test en champ libre, les résultats doivent être interprétés avec prudence, car les dysfonctionnements moteurs influencent le comportement de la souris dans le labyrinthe et modifient les scores d’activité.
La reproductibilité et l’efficacité des tests comportementaux présentés ont déjà été validées dans plusieurs lignées de souris Uba3a indépendantes avec différentes variantes knock-out, faisant de cet ensemble de tests un excellent outil de validation dans la recherche sur la SA. Les modèles avec la construction pertinente et la validité apparente justifieront des recherches plus approfondies pour élucider la physiopathologie de la maladie et permettre le développement de traitements causaux.
Introduction
Le syndrome d’Angelman (SA) est une maladie neurodéveloppementale rare. L’origine génétique la plus fréquente de la SA est une délétion importante de la région 15q11-q13 du chromosome d’origine maternelle, qui se retrouve chez près de 74 % des patients1. La délétion de cette région entraîne la perte d’UBE3A, le principal gène responsable de la SA qui code pour une ubiquitine ligase E3. L’allèle paternel du gène UBE3A dans les neurones est réduit au silence dans un processus connu sous le nom d’empreinte. En conséquence, l’empreinte paternelle du gène ne permet que l’expression maternelle dans le système nerveux central (SNC)2. Par conséquent, la délétion du gène UBE3A du chromosome d’origine maternelle entraîne le développement de symptômes de la SA. Chez l’homme, la SA se manifeste vers l’âge de 6 mois, avec un retard de développement qui persiste à tous les stades du développement et se traduit par des symptômes débilitants sévères chez les personnes atteintes 3,4. Les principaux symptômes de la maladie comprennent le déficit de la motricité fine et globale, y compris une démarche ataxique saccadée, de graves troubles de la parole et une déficience intellectuelle. Environ 80 % des patients atteints de SA souffrent également de troubles du sommeil et d’épilepsie. À ce jour, les seuls traitements disponibles sont les médicaments symptomatiques, qui réduisent les crises d’épilepsie et améliorent la qualité du sommeil1. Par conséquent, le développement de modèles animaux robustes avec des phénotypes comportementaux reproductibles ainsi qu’une analyse de phénotypage affinée seront essentiels pour élucider les mécanismes physiopathologiques de la maladie et découvrir des médicaments et des traitements efficaces.
La complexité du trouble humain affectant le SNC exige que les organismes modèles possèdent un génome, une physiologie et un comportement comparables. Les souris sont populaires en tant qu’organisme modèle en raison de leur cycle de reproduction court, de leur petite taille et de leur relative facilité de modification de l’ADN. En 1984, Paul Willner a proposé trois critères de base de validation du modèle de maladie : la construction, la face et la validité prédictive, qui sont utilisés pour déterminer la valeur du modèle5. Simplement, la validité conceptuelle reflète les mécanismes biologiques responsables du développement du trouble, la validité faciale récapitule ses symptômes et la validité prédictive décrit la réponse du modèle aux médicaments thérapeutiques.
Pour adhérer aux principes ci-dessus, nous avons choisi l’étiologie génétique la plus courante, une grande délétion du locus maternel 15q11.2-13q, y compris le gène UBE3A, pour créer des souris modèles AS. Nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour supprimer une région de 76 225 pb de long couvrant l’ensemble du gène UBE3A, englobant à la fois les éléments codants et non codants du gène, chez des souris issues d’un fond C57BL/6N6. Nous avons ensuite croisé les animaux pour obtenir des souris hétérozygotes UBE3A+/−. Pour la validation faciale du modèle, nous avons utilisé des animaux issus de croisements de femelles UBE3A+/− et de mâles de type sauvage pour obtenir la descendance UBE3A+/- (souche nommée C57BL/6NCrl-UBE3A
Les tests comportementaux présentés ici font partie des outils de phénotypage les plus courants dans la recherche génétique, grâce à leur haute valeur prédictive et à leur validité de construction suffisante 8,9,10. Nous avons utilisé ces tests pour valider un modèle murin de SA en récapitulant les principaux symptômes de la maladie humaine d’une manière reproductible et indépendante de l’âge. L’émotivité de l’animal a été évaluée dans le labyrinthe surélevé et les tests en plein champ. Ces deux tests sont basés sur le conflit approche-évitement, où les animaux explorent un nouvel environnement à la recherche de nourriture, d’un abri ou d’opportunités d’accouplement tout en évitant simultanément les compartiments anxiogènes11. De plus, le test en champ ouvert est utilisé pour tester l’activité locomotriced’une souris 8. Le test de suspension de la queue est largement utilisé dans la recherche sur la dépression pour dépister de nouveaux médicaments antidépresseurs ou des phénotypes de type dépressif dans des modèles de souris knock-out12. Ce test évalue le désespoir que les animaux développent au fil du temps dans une situation inéluctable. L’apprentissage moteur et les caractéristiques détaillées de la marche ont été déterminés sur le rotarod et sur DigiGait, respectivement. L’endurance de l’animal sur la tige d’accélération caractérise ses capacités d’équilibre et de coordination des mouvements, tandis que l’analyse détaillée des schémas de pas d’une souris est une évaluation sensible des déficiences neuromusculaires liées à de nombreux troubles neurogénératifs du mouvement13,14,15. Le test de déchiquetage des nids fait partie de la méthodologie standard de détection du comportement impulsif chez les rongeurs, et comme il utilise le comportement naturel des rongeurs, il indique le bien-être de l’animal16,17.
La taille des groupes expérimentaux a été le résultat d’un compromis pour répondre aux exigences de la règle des 3R et à l’utilisation efficace des performances de reproduction des colonies. Cependant, pour obtenir une puissance statistique, les groupes ne comptaient pas moins de 10 individus, en raison de l’établissement d’un nombre suffisant de couples reproducteurs. Malheureusement, les performances d’élevage n’ont pas toujours permis d’obtenir un nombre suffisant d’animaux.
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Protocol
Tous les animaux et les expériences utilisés dans cette étude ont fait l’objet d’un examen éthique et ont été menés conformément à la directive européenne 2010/63/UE. L’étude a été approuvée par la Commission centrale tchèque pour le bien-être des animaux. Les souris ont été logées dans des cages ventilées individuellement et maintenues à une température constante de 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les souris ont reçu de la nourriture de souris et de l’eau ad libitum. Les souris étaient logées en groupes de trois à six animaux par cage. Aucune manipulation autre que la pesée n’a été effectuée avant les essais. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Considérations générales avant et pendant l’essai
NOTE : Par souci de clarté et de compréhension, des commentaires généraux sont présentés avant la description des épreuves individuelles. Cela s’applique à chaque test, à l’exception évidente du test de déchiquetage des nids, qui est effectué dans un local d’habitation et ne nécessite l’utilisation d’aucun équipement expérimental.
- Héberger les animaux dans l’installation de recherche pendant au moins 14 jours avant les essais afin de minimiser le stress résultant du transport et des changements d’environnement.
- Enregistrez le poids des animaux avant les tests, car le poids est un facteur de confusion courant dans la recherche comportementale.
- Laisser les animaux s’acclimater dans la salle expérimentale pendant au moins 1 h après le transport de leur salle d’hébergement afin de minimiser le stress lié au transport, chaque fois qu’un tel transport a lieu (c.-à-d. tous les tests décrits ci-dessous, à l’exception du déchiquetage des nids, qui est effectué dans la salle d’hébergement).
- Étiquetez chaque animal sur la queue avec un marqueur non toxique à base d’eau pour permettre une identification rapide pendant l’expérience.
- Retirer toute l’urine et les matières fécales déposées par les animaux dans l’appareil expérimental pendant les tests après chaque essai.
- Essuyer tous les appareils expérimentaux avec de l’alcool à 75 % avant et après chaque animal testé. Le nettoyage permet d’éliminer les traces olfactives déposées lors des tests et de maintenir des conditions expérimentales stables.
- Transportez les animaux de leur cage d’origine à l’appareil expérimental avec le plus de soin possible, de préférence dans un petit récipient opaque, puis relâchez-les librement, à moins que d’autres manipulations ne soient nécessaires.
- Placez chaque animal dans une cage d’attente temporaire après les tests pour éviter qu’ils n’influencent les animaux non testés dans la cage domestique.
- Testez les mâles et les femelles pendant des jours consécutifs. Alterner l’ordre des différents génotypes pendant les tests pour contrebalancer les facteurs environnementaux imprévisibles entre les groupes expérimentaux.
- Replacez les animaux dans leur cage d’origine après que tous les animaux aient été testés et ramenez-les dans la salle d’hébergement.
- Dans le cas de tests répétés sur des animaux, maintenez un intervalle d’au moins 1 jour entre chaque test.
2. Tests comportementaux
- Labyrinthe surélevé plus (EPM)
REMARQUE : Les deux sexes des souches de souris C57BL/6NCrl et UBE3AmGenedel/+ ont été testés pour cette étude à l’âge de 9 à 12 semaines. Les poids des animaux variaient de 22 à 36 g pour les mâles et de 18 à 28 g pour les femelles au moment des essais.- Placez le labyrinthe en forme de plus sur la plate-forme de test juste en dessous de la caméra. À l’aide du potentiomètre fixé au mur, réglez l’intensité lumineuse à 70 lux en son centre à l’aide d’un luxomètre, avec son capteur placé au centre du labyrinthe lors du réglage.
- Ouvrez le logiciel en double-cliquant sur l’icône du logiciel Viewer et chargez la configuration pour les tests EPM en cliquant sur l’icône en haut à gauche de l’onglet Configuration . Chargez le plug-in EPM à partir du menu Fichier . Remplissez les informations sur l’animal à l’aide du clavier de l’ordinateur - identifiant de l’animal, génotype, sexe et informations sur l’expérience (date, intensité lumineuse) - dans les champs correspondants de l’onglet Expérience . Vérifiez si la position de la zone, les bras ouverts et les bras fermés sont correctement configurés. À l’aide d’un contrôle visuel et d’une souris d’ordinateur, assurez-vous que les zones virtuelles délimitées correspondent aux zones EPM correspondantes sur l’aperçu vidéo.
- L’EPM est un test utilisé pour évaluer l’anxiété générale d’un animal, qui est basé sur l’approche et l’évitement des conflits. Les rongeurs ont naturellement tendance à éviter les zones non protégées bien éclairées (bras ouverts), au profit des zones plus sûres (bras fermés). Comme ce test entièrement automatisé est basé sur un système de suivi vidéo, laissez le logiciel calculer automatiquement le temps passé dans chaque zone ainsi que le nombre d’entrées.
- Pendant les tests, enregistrez les animaux sur vidéo à l’aide d’une caméra industrielle sensible à la lumière infrarouge. Permet au logiciel de détecter la position de l’animal en temps réel pendant l’enregistrement. Ensuite, laissez le logiciel évaluer automatiquement les traces de l’animal pour calculer tous les paramètres décrivant le comportement de l’animal dans le labyrinthe. Utilisez le temps passé dans les bras ouverts anxiogènes et le pourcentage de visites à bras ouverts pour évaluer le niveau de comportement anxieux chez les animaux.
REMARQUE : Le labyrinthe sur mesure est fait d’un matériau perméable à la lumière infrarouge et est placé sur une plate-forme de source de lumière infrarouge à diodes électroluminescentes (LED). - Placez le curseur de la souris sur l’icône en forme de flèche en haut à gauche de l’onglet Acquisition . Retirez un animal de la cage domestique à la main et placez-le doucement au centre de l’EPM. Démarrez le protocole en cliquant avec le bouton gauche de la souris de l’ordinateur et quittez immédiatement la salle d’expérimentation.
- Une fois que le protocole d’enregistrement est terminé après 5 minutes d’exploration libre du labyrinthe, enregistrez les données enregistrées en cliquant sur OK dans la fenêtre qui apparaît après la fin du protocole, nommez le fichier de manière appropriée, puis cliquez sur Enregistrer. Exportez les résultats dans un fichier .csv pour chaque animal testé pour une analyse hors ligne en cliquant sur l’icône dans le panneau vertical gauche de l’onglet Analyse des données .
- Retirez l’animal du labyrinthe à la main et mettez-le dans la cage de détention temporaire. Procéder à l’analyse de tous les animaux de la même manière. Copiez les résultats de tous les animaux testés dans un fichier Bloc-notes pour une analyse hors ligne en cliquant sur l’icône Copier les résultats dans l’onglet des résultats du plugin de labyrinthe Elevated Plus .
REMARQUE : Le logiciel et le matériel peuvent différer, et les manuels pertinents doivent être suivis. De plus, la configuration expérimentale, comme l’éclairage ou l’emplacement de l’ordinateur, peut varier en fonction de la construction de l’animalerie.
- Test en champ libre (OF)
REMARQUE : Le test en champ libre évalue le mouvement global d’un animal, qui est déclenché par un comportement exploratoire dans un nouvel environnement. De plus, il est couramment utilisé comme outil de dépistage pour détecter l’anxiété générale dans un espace non protégé et bien éclairé. Il s’agit d’un test entièrement automatisé qui utilise un système de suivi vidéo, qui a également été utilisé dans le test précédent.- Placez les quatre boîtiers de test OF sur la plate-forme de test juste en dessous de la caméra. À l’aide du potentiomètre fixé au mur, réglez l’intensité lumineuse à 200 lux au centre de chaque test OF à l’aide d’un luxomètre, avec son capteur placé au centre de chaque boîtier lors du réglage.
- Ouvrez le logiciel en double-cliquant sur l’icône du logiciel Viewer et chargez la configuration pour les tests OF en cliquant sur l’icône en haut à gauche de l’onglet Configuration . Remplissez les informations sur l’animal à l’aide du clavier de l’ordinateur - ID de l’animal, génotype, sexe et informations sur l’expérience (date, intensité lumineuse) - dans les champs correspondants de l’onglet Expérience . Vérifiez si la position de la zone (centre et périphérie) correspond aux cases de test OF et ajustez-les si nécessaire. À l’aide d’un contrôle visuel et d’une souris d’ordinateur, assurez-vous que les zones centrales et périphériques virtuelles correspondent aux zones de test OF correspondantes sur l’aperçu vidéo.
- Pendant les tests, enregistrez les animaux sur vidéo à l’aide d’une caméra industrielle sensible à la lumière infrarouge. Permet au logiciel de détecter la position de l’animal en temps réel pendant l’enregistrement et d’évaluer automatiquement les traces de l’animal pour calculer tous les paramètres décrivant le comportement de l’animal dans la boîte de test OF. La distance parcourue, la vitesse moyenne et le temps de repos sont des paramètres utilisés pour évaluer l’activité des animaux dans un nouvel environnement, tandis que le nombre d’entrées au centre et la durée dans le centre décrivent un comportement anxieux chez les animaux.
REMARQUE : Le labyrinthe sur mesure est fait d’un matériau perméable à la lumière infrarouge et est placé sur une plate-forme de source de lumière infrarouge LED. - Placez le curseur de la souris sur l’icône en forme de flèche en haut à gauche de l’onglet Acquisition . Retirez quatre animaux de la cage domestique à la main et placez-les doucement dans le coin de chaque boîte de test OF. Démarrez le protocole en cliquant avec le bouton gauche de la souris d’un ordinateur et quittez immédiatement la salle d’expérimentation.
- Lorsque le protocole se termine après 10 minutes d’exploration libre du labyrinthe, enregistrez les données en cliquant sur OK dans la fenêtre qui s’affiche après la fin du protocole, nommez le fichier de manière appropriée, puis cliquez sur Enregistrer. Exportez les résultats dans un fichier .csv pour chaque animal testé pour une analyse hors ligne en cliquant sur l’icône dans le panneau vertical gauche de l’onglet Analyse des données .
- Retirez les animaux du labyrinthe à la main et mettez-les dans la cage de détention temporaire. Procéder à l’analyse de tous les animaux de la même manière. Analysez les données exportées.
REMARQUE : Le logiciel et le matériel peuvent différer, et les manuels pertinents doivent être suivis. De plus, la configuration expérimentale, comme l’éclairage, le nombre de labyrinthes ou l’emplacement de l’ordinateur, peut varier en fonction de la construction de l’animalerie.
- Test de suspension de queue (TST)
REMARQUE : Trois souris sont testées simultanément avec l’appareil de suspension de queue automatisé.- Maintenez l’intensité lumineuse de la pièce à 100-120 lux.
- Connectez le système TST à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB. Insérez le dongle USB dans l’ordinateur et démarrez le logiciel en double-cliquant sur l’icône du logiciel BIO-TST . Dans l’onglet Paramètres , sous Global, réglez la durée d’acquisition sur 360 s. Dans l’onglet Expérience , sélectionnez Nouvelle liste de sujets, puis créez un nouveau fichier d’expérience et une nouvelle liste de sujets testés en suivant les instructions de l’onglet ouvert.
- Démarrez l’exécution en cliquant sur Démarrer l’exécution | continuer dans l’onglet Acquisition . Préparez les animaux pour le test en enroulant du ruban adhésif simple face, tel que le ruban médical transpore, autour des 3/4 de la queue de l’animal, en partant de la base.
- Passez le crochet de suspension à travers le ruban et suspendez l’animal dessus. Commencez à acquérir des données pour chaque animal individuellement immédiatement après l’avoir accroché au crochet en cliquant sur l’icône Démarrer sous la position visualisée pour chaque animal et observez les animaux en continu pendant le test.
- Une fois l’acquisition terminée pour le premier groupe d’animaux, cliquez sur Lancer l’exécution suivante, retirez les animaux de l’hameçon, détachez le ruban adhésif de leur queue, coupez soigneusement le ruban avec des ciseaux le long de la queue et placez les animaux dans la cage de maintien temporaire.
- Nettoyez l’appareil avec de l’alcool à 75 % et des mouchoirs en papier et procédez avec le reste des animaux comme décrit ci-dessus. Dans l’onglet Analyse , sélectionnez les 4 dernières minutes de l’acquisition pour l’analyse, puis sélectionnez toutes les exécutions valides de la période d’analyse, cliquez sur Analyser les sujets sélectionnés, choisissez le format de données souhaité, puis cliquez sur Exporter les données sélectionnées pour exporter les données collectées en vue d’une analyse plus approfondie.
REMARQUE : Le test dure 6 min. Pendant les 2 premières minutes, les animaux se débattent vigoureusement, mais au fur et à mesure que la réaction de désespoir devient prévalente pendant les 4 minutes restantes, le temps d’immobilité pendant cette période est pris en compte pour l’analyse. Le logiciel et le matériel peuvent différer, et les manuels correspondants doivent être suivis. De plus, l’équipement lui-même peut varier (par exemple, le nombre de positions d’essai).
- Analyse de la démarche
- Allumez le tapis de course et réglez manuellement la vitesse de la bande à 20 cm/s sur le panneau d’équipement en cliquant sur le symbole + ou - situé à côté de l’indicateur de vitesse. Allumez la lumière de l’appareil en tournant le bouton dans le sens des aiguilles d’une montre. Lancez le logiciel DigiGait Imager en double-cliquant sur l’icône du logiciel et réglez la vitesse d’obturation sur 100 pour les souris albinos ou 130 pour les souris noires/foncées sur le terrain pour la vitesse d’obturation.
- Retirez le premier animal de la cage domestique à la main et placez-le délicatement sur la ceinture du tapis roulant. Fermez la porte du compartiment à animaux. Inspectez visuellement pour vous assurer que la queue de l’animal n’est pas coincée entre la porte et le cadre.
- Laissez la souris explorer la courroie du tapis roulant avant d’enregistrer. Assurez-vous que l’animal est capable d’effectuer le test en réglant le tapis roulant à une vitesse de marche lente pendant ~3 s, puis en l’arrêtant, en observant l’animal en permanence.
- Démarrez la courroie en appuyant sur le bouton Start sur le panneau de l’équipement et enregistrez pendant environ 10 s. Assurez-vous qu’une locomotion claire et fluide d’au moins 10 à 15 pas est observable. Arrêtez la courroie en appuyant sur le bouton Stop sur le panneau d’équipement et remettez la souris dans la cage de maintien temporaire à la main.
- Filtrez l’enregistrement à la recherche d’une séquence d’images avec des étapes fluides en cliquant sur PLAY et en examinant l’enregistrement avec le contrôle visuel en mode EDIT . Choisissez 10 à 15 mouvements fluides en écrivant manuellement leurs numéros d’image de début et de fin dans les champs appropriés (De l’image # pour la première image et À pour la dernière image). Remplissez les informations de l’animal - ID de l’animal, date de naissance, sexe, poids, vitesse de la ceinture et angle de la ceinture - et commentez si nécessaire dans les champs appropriés. Enregistrez le fichier pour une analyse plus approfondie en cliquant sur Enregistrer.
- Nettoyez la courroie avec de l’eau et procédez de la même manière avec le reste des animaux. Choisissez CAMERA pour procéder à l’enregistrement de la prochaine marche de l’animal. Lorsque les enregistrements sont acquis pour tous les animaux, procédez à l’analyse.
REMARQUE : Les animaux qui ne sont pas capables de marcher à une vitesse définie de la ceinture sont exclus des tests. Sur la base de notre expérience, nous observons que les animaux plus âgés (plus de 50 semaines) éprouvent plus de difficultés à marcher sur le tapis roulant, avec une fréquence variable entre 2% et 50% selon le génotype. Les déjections animales sont collectées dans des bacs situés à l’avant ou à l’arrière du tapis roulant. Les plateaux sont vidés après chaque étude et lavés à l’eau chaude savonneuse. La ceinture est essuyée avec un chiffon humide. - Effectuez une analyse de la démarche basée sur une analyse entièrement automatisée des enregistrements vidéo d’empreintes d’animaux. Ajustez les données dans le logiciel d’analyse DigiGait .
REMARQUE : L’analyse de la marche fournit non seulement une mesure de la coordination motrice, mais aussi une description cinématique détaillée basée sur l’analyse du signal dynamique de la marche, représentant l’histoire temporelle du placement des pattes à travers des foulées séquentielles. Les paramètres suivants sont automatiquement mesurés par le logiciel : durée de l’élan, pourcentage de la durée de la foulée en swing, durée du freinage, pourcentage de la durée de la foulée au freinage, durée de la propulsion, pourcentage de foulée en propulsion, durée de la traction, pourcentage de foulée en position, durée de la foulée, pourcentage de freinage de la position, pourcentage de propulsion de la phase d’appui, rapport oscillation/position, longueur de foulée, fréquence de foulée, angle de patte, variabilité de l’angle de patte, largeur de la position, angle de pas, variabilité de la longueur de foulée, variabilité de la largeur de la foulée, variabilité de l’angle de pas, coefficient de variation de la longueur de la foulée, coefficient de variation de la largeur de la position, coefficient de variation de l’angle de pas, coefficient de variation de la durée de l’élan, zone de la patte à la position maximale, variabilité de la zone de la patte à la position maximale, durée de la position partagée des membres postérieurs, pourcentage de position partagée, rapport entre les durées de position arrière gauche et droite, symétrie de la démarche, taux maximal de changement de la zone des pattes en contact avec la ceinture du tapis roulant pendant la phase de freinage, taux maximal de changement de la zone des pattes en contact avec la ceinture du tapis roulant pendant la phase de propulsion, propulsion tau, distance de chevauchement des pattes, le positionnement du placement des pattes, le coefficient d’ataxie, la distance de la ligne médiane, la distance de l’axe et la traînée des pattes. Le logiciel permet une petite correction du bruit de trace de pas, qui doit être effectuée avant l’analyse statistique. Le logiciel et le matériel peuvent différer, et les manuels correspondants doivent être suivis.
- Le Rotarod
REMARQUE : Le test rotarod est utilisé pour évaluer les fonctions motrices des rongeurs, c’est-à-dire l’équilibre et la coordination motrice. Le test consiste à faire marcher une souris sur une tige rotative d’un diamètre fixe (5 cm), la rotation s’accélérant sur une période de temps donnée (5 min) jusqu’à ce que l’animal ne puisse plus rester en place.- Allumez l’équipement rotarod en appuyant sur l’interrupteur marche/arrêt de l’équipement et lancez le logiciel en double-cliquant sur l’icône du logiciel Rod. Initialisez un nouveau fichier dans l’onglet Fichier et enregistrez-le sous le nom approprié. Dans la fenêtre Configuration, renseignez les détails de l’expérience, tels que la date, le nom de l’utilisateur et les éventuels commentaires. Réglez le profil de vitesse sur 300 s, la vitesse initiale sur 4 tr/min et la vitesse terminale sur 40 tr/min.
- Préparez un calendrier pour les animaux testés dans le champ des animaux et assignez chaque animal à sa position sur la tige. Les positions ne sont pas indiquées explicitement dans le logiciel, mais elles correspondent à la ligne de liste ; Par exemple, la première ligne indiquerait la première position de la tige, la cinquième ligne indiquerait la cinquième position de la tige, et ainsi de suite. N’oubliez pas de contrebalancer chaque position de tige entre les groupes expérimentaux.
REMARQUE : Cinq animaux peuvent être testés simultanément. - Fermez le panneau Configuration en cliquant sur Fermer et ouvrez le panneau de mesure en cliquant sur Mesurer. Commencez la rotation initiale de la canne à 4 tr/min en cliquant sur Start/Stop et placez les cinq premiers animaux sur les positions qui leur ont été assignées. Lorsque tous les animaux sont sur la canne, démarrez le protocole de test en cliquant sur Démarrer le profil, et la tige accélérera progressivement jusqu’à 40 tr/min en 5 minutes. Si un animal tombe de la canne, remettez-le dans la canne avant le début du protocole.
REMARQUE : Les animaux ne restent généralement pas sur la tige assez longtemps pour y placer toutes les souris en même temps lors de la première tentative. Il est important d’être patient lors du placement des animaux sur la canne avec la vitesse de rotation constante au départ. Le but de l’essai n’est pas de déterminer l’endurance de l’animal sur la canne à une vitesse de rotation fixe, mais de trouver la vitesse à laquelle l’animal est incapable de rester sur la canne. La vitesse de la canne est proportionnelle à la latence de rester dessus ; Ainsi, il est utilisé pour exprimer l’équilibre de l’animal. - Déplacez les animaux dans la cage de détention temporaire après qu’ils soient tous tombés de la tige ou après 5 minutes. Retirez tous les déjections animales et nettoyez la tige et le plateau avec de l’alcool.
- Cliquez sur Animaux -> pour passer au groupe d’animaux suivant de la même manière. Après avoir testé tous les animaux, fermez la fenêtre Mesurer en cliquant sur Fermer , puis sur Afficher pour afficher les données collectées. Exportez les données acquises au format de fichier .csv pour une analyse plus approfondie en cliquant sur Exporter CSV.
- Testez chaque animal sur la canne trois fois avec des intervalles de 15 minutes entre les essais. Utilisez la valeur moyenne de la latence pour diminuer au cours des trois essais pour une analyse statistique plus approfondie. Évaluez l’apprentissage moteur de l’animal en répétant le test pendant 5 jours consécutifs.
REMARQUE : Le logiciel et le matériel peuvent différer, et les manuels pertinents doivent être suivis. De plus, l’équipement lui-même peut varier, par exemple, en ce qui concerne le nombre de positions d’essai, la construction globale et la dimension de la tige.
- Bâtiment de déchiquetage Nestlet
- Séparez les animaux dans des cages à souris simples en polycarbonate avec l’équipement standard (litière, filet de nourriture et approvisionnement en eau) pendant 1 semaine. Prenez environ 12 g de nid en coton à l’aide d’une pince, notez son poids manuellement à l’aide d’une balance et placez-le au hasard dans une cage, mais du côté opposé à l’alimentation en eau. Remettez les cages avec les animaux dans la salle d’hébergement.
- Pesez chaque nid à la même heure chaque jour pendant les 4 prochains jours manuellement à l’aide d’une balance. Enregistrez les poids sur papier ou dans une feuille de calcul préétablie. Assurez-vous que chaque nid est sec lorsqu’il est pesé ; Si ce n’est pas le cas, séchez-les sur un coussin chauffant et remettez toutes les niduchettes dans leurs cages attribuées en même temps à l’endroit où la souris a fait son nid. Si le nid est déchiré en plusieurs parties, pesez la plus grosse.
- Pour l’analyse des données, exprimez la diminution du poids des nids chaque jour par rapport au poids initial et présentez-la sous forme de pourcentage du matériau utilisé.
REMARQUE : Le fait de ramener les mâles dans une cage commune peut entraîner une augmentation de l’agressivité et des blessures indésirables chez les animaux. Par conséquent, l’essai de déchiquetage des nids doit être programmé vers la fin du cycle d’essai afin d’éviter de compromettre le bien-être des animaux.
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Representative Results
Tests en hauteur, en labyrinthe et en champ libre
Les tests EPM et OF utilisent la tendance naturelle des rongeurs à explorer de nouveaux environnements18,19. L’exploration est régie par un conflit d’approche-évitement, où les rongeurs choisissent entre l’exploration d’un nouvel environnement et l’évitement d’un éventuel danger. Les animaux explorent des endroits inconnus à la recherche d’un abri, de contacts sociaux ou de recherche de nourriture. Cependant, les nouveaux endroits peuvent comporter des facteurs de risque tels que des prédateurs ou des concurrents. Le test OF et l’EPM se composent tous deux de compartiments sûrs et risqués : la périphérie et le centre dans le test OF et les bras fermés et ouverts dans l’EPM, respectivement. Les rongeurs préfèrent naturellement les compartiments sombres et fermés aux zones ouvertes, surélevées et bien éclairées. Ainsi, une réduction de l’exploration des parties à risque/anxiogène, exprimée par une diminution du nombre de visites et de la durée des visites, ou par une latence accrue de la première visite, caractérise un comportement anxieux chez l’animal 8,11. Le temps de repos, la vitesse moyenne et la distance totale parcourue fournissent des informations supplémentaires sur l’activité spontanée des animaux. Aucun des paramètres liés au comportement anxieux n’a été modifié chez les mutants UBE3AmGenedel/+ dans le test OF ou l’EPM (Figure 1D-G). Cependant, les animaux UBE3AmGenedel/+ étaient significativement hypoactifs, comme en témoignent une distance parcourue plus courte, une vitesse moyenne plus faible et un temps de repos plus long dans le test OF (Figure 1A-C).
Figure 1 : Activité spontanée et réponse à l’anxiété face à un nouvel environnement dans le test EPM et OF. (A-E) Exploration du champ ouvert. Les animaux UBE3AmGenedel/+ ont parcouru une distance plus courte (A) avec une vitesse moyenne plus faible (B) et un temps de repos prolongé (C). Le nombre et la durée des visites dans le centre ne différaient pas d’un animal à l’autre (D, E). Une ANOVA bidirectionnelle a révélé un effet significatif du génotype principal sans interaction significative entre le génotype et le sexe (effet du génotype : p < 0,01 ; interaction génotype /sexe : p > 0,7). Le pourcentage de visites dans les bras ouverts et fermés ne dépendait pas du génotype (F), et le temps passé dans les bras ouverts anxiogènes ne différait pas entre les groupes expérimentaux (G). Une ANOVA bidirectionnelle n’a pas révélé d’effets principaux significatifs ni d’interaction génotype/sexe (effet génotype : p > 0,9 ; interaction génotype/sexe : p > 0,9). Les données représentées dans la boîte à moustaches indiquent la valeur médiane, l’intervalle interquartile et la plage de valeurs. Les résultats significatifs des tests post-hoc sont indiqués par *. Les données pour les animaux témoins (femelle n = 10, mâle n = 11) sont présentées en rouge, et les mutants (femelle n = 9, mâle n = 10) en bleu. Cette figure a été adaptée de Syding et al.6. Abréviations : EPM = surélevé plus labyrinthe ; OF = champ ouvert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Test de suspension de la queue
Le TST mesure le désespoir animal développé dans une situation inéluctable. Lorsqu’ils sont suspendus par la queue, les rongeurs deviennent rapidement immobiles après une période initiale d’activité vigoureuse. La durée de l’immobilité indique l’ampleur du « désespoir ». De nombreux laboratoires ont montré qu’une large gamme d’antidépresseurs cliniquement actifs réduit la durée d’immobilité 9,20,21. Ce test simple est devenu couramment utilisé pour le dépistage de substances antidépressives potentielles, et il peut également être utilisé pour caractériser le phénotype de diverses souches animales, ainsi que des murines transgéniques, dans des études explorant les bases neurobiologiques des états dépressifs 9,21. Les animaux UBE3AmGenedel/+ étaient immobiles significativement plus longtemps que leurs compagnons de portée témoins, ce qui indique leur comportement semblable à celui de la dépression (Figure 2).
Figure 2 : Temps d’immobilité dans l’essai de suspension arrière. Les animaux UBE3AmGenedel/+ ont montré une immobilité plus longue pendant la suspension de la queue. Une ANOVA bidirectionnelle a montré des effets principaux significatifs mais aucune signification dans l’interaction génotype/sexe (effet génotype : p < 0,001 ; effet sexe : p < 0,001 ; interaction génotype/sexe : p > 0,5). Les données représentées dans la boîte à moustaches indiquent la valeur médiane, l’intervalle interquartile et la plage de valeurs. Les résultats significatifs des tests post-hoc sont indiqués par *. Les données pour les animaux témoins (femelle n = 10, mâle n = 14) sont présentées en rouge, et les mutants (femelle n = 10, mâle n = 11) en bleu. Cette figure a été adaptée de Syding et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Rotarod et analyse de la marche
L’histoire des tests de rotarod dans des modèles de déficits neuromoteurs remonte au milieu du 20e siècle22. Le rotarod est utilisé pour évaluer l’équilibre et la coordination des mouvements des animaux, car leurs déficiences se manifestent par une latence significativement plus courte pour tomber de la tige rotative14. Des tests répétés sur le rotarod sont utilisés pour étudier les capacités d’apprentissage moteur des animaux. Le développement rapide des équipements modernes et des technologies numériques a permis une évaluation automatisée, précise et impartiale des phénotypes locomoteurs des rongeurs sur la base des descriptions détaillées de leur démarche23. L’analyse automatisée de la marche a remplacé l’analyse de l’empreinte et est également plus sensible aux déficits neuromusculaires14,24,25. Les altérations des caractéristiques spatio-temporelles de la démarche animale sont spécifiques à l’unité nosologique modélisée26,27,28. Les mutantsUBE3A mGenedel/+ présentaient une forte alternance d’indices de marche (Figure 3A-G), confirmée par une latence réduite à la chute du rotarod (Figure 3H).
Figure 3 : Analyse détaillée de la marche et de l’apprentissage moteur sur le rotarod. (A-G) Les indices de marche des animaux UBE3AmGenedel/+ ont été modifiés. Les animaux UBE3AmGenedel/+ avaient un élan (A) et une position (B) plus longs, ce qui entraînait une durée et une longueur de foulée prolongées (C,D). La durée de propulsion (E) et la décélération (F) de leurs membres postérieurs ont également été augmentées. L’analyse a également révélé une plus grande surface de patte à la position maximale (G). Ni les paramètres métriques ni le poids des animaux ne différaient (données non présentées), ce qui indique que les différences observées n’étaient pas dues à des différences de taille des animaux. Une ANOVA bidirectionnelle avec des mesures répétées a montré un effet principal significatif du génotype sans interaction génotype/sexe significative (effet génotype : p < 0,001 ; interaction génotype/sexe : p > 0,2). (H) Les résultats de la performance du rotarod montrent une latence plus courte pour tomber chez les animaux UBE3AmGenedel/+. Une ANOVA bidirectionnelle avec des mesures répétées a révélé des effets principaux significatifs sans interaction significative (effet génotype : p < 0,001 ; effet sexuel : p < 0,01 ; interaction génotype/ sexe : p > 0,1). Les paramètres de la démarche représentés dans la boîte à moustaches indiquent la valeur médiane, l’intervalle interquartile et la plage de valeurs. Les résultats significatifs des tests post-hoc sont indiqués par *. Les données sur la latence à la chute sont présentées dans un graphique linéaire sous forme de moyenne ± MEB. Les données pour les animaux témoins (femelle n = 10, mâle n = 14) sont présentées en rouge et les mutants (femelle n = 10, mâle n = 11) en bleu. Cette figure a été adaptée de Syding et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Déchiquetage de nids - construction de nids
Le test de déchiquetage nestlet est principalement utilisé pour détecter les comportements compulsifs stéréotypés chez les souris29,30. Cependant, les souris montrent une tendance naturelle à déchirer les matériaux fournis pour construire leur nid. L’incapacité de déchiqueter un nid de coton est donc utilisée comme un indicateur de leur bien-être affecté par une déficience neurodéveloppementale16,31. Les animaux UBE3AmGenedel/+ ont utilisé beaucoup moins de matériaux pour construire leurs nids, et cette différence était particulièrement marquée entre les femelles transgéniques et leurs homologues témoins (Figure 4A).
Figure 4 : Utilisation du matériau du nid pour la construction du nid. Les animaux UBE3AmGenedel/+ ont déchiqueté moins de coton que leurs compagnons de portée témoins. Les données ont été transformées en rangs alignés pour satisfaire à la condition préalable de normalité. Une analyse de la variance avec des mesures répétées a révélé un effet significatif du génotype sans signification de l’interaction génotype/sexe (effet génotype : p < 0,05 ; interaction génotype/sexe : p > 0,4). Les données représentées dans le graphique linéaire montrent la moyenne ± MEB. Les résultats significatifs des tests post-hoc sont indiqués par *. Les données pour les animaux témoins (femelle n = 10, mâle n = 14) sont présentées en rouge, et les mutants (femelle n = 10, mâle n = 11) en bleu. Cette figure a été adaptée de Syding et al.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Échelle de temps de test
Chaque groupe (témoin et expérimental) est soumis aux mêmes tests les mêmes jours. Une pause de 1 jour entre les tests est utilisée pour minimiser les effets de report potentiels. Dans la mesure du possible, les femelles et les mâles sont testés sur des jours consécutifs ; sinon, les femelles sont testées après que les mâles ont été testés (figure 5)6.
Figure 5 : Durée des tests. Les animaux UBE3AmGenedel/+ et leurs témoins ont été testés dans deux cohortes. L’échelle de temps des tests pour la première cohorte est présentée dans le panneau supérieur, et pour la deuxième cohorte dans le panel inférieur. Les jours où les mâles ont été testés sont indiqués en bleu, tandis que les jours où les femelles ont été testées sont indiqués en vert. Les jours où les deux sexes ont été testés sont indiqués en jaune. Aucun test n’a été effectué le week-end. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les chiffres ont été adaptés de Syding et al.6 conformément à la politique de licence de MDPI.
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Discussion
Les modèles SA créés dans différentes souches murines sont généralement validés par des tests de l’état émotionnel, des fonctions motrices et des capacités cognitives de l’animal pour faciliter la comparaison avec les symptômes humains31,32. Un déficit moteur dans les modèles SA est la constatation la plus constante dans tous les laboratoires, suivi d’un état d’émotivité inchangé des mutants et de difficultés à construire des nids31,32,33. En revanche, les troubles cognitifs sont légers ou absents 7,31,33. La divergence dans le phénotype cognitif semble dépendre de l’âge des animaux testés, comme le montrent Huang et al.7. Par conséquent, pour cet article, une batterie de tests a été choisie sur la base de leur reproductibilité, ainsi que de leur indépendance vis-à-vis de l’âge et de l’espèce, car des résultats comparables sont observés dans les modèles AS de souris et de rats 6,31,32.
Il est essentiel de garder à l’esprit que les tests répétés sur les animaux dans différentes configurations expérimentales exigent qu’ils soient ordonnés avec soin, en commençant par les tests les plus sensibles à la manipulation préalable, et en même temps avec un effet minimal sur les tests suivants, tels que les tests EPM et OF34. D’autres préoccupations concernent le test de déchiquetage des nids, où les animaux sont logés dans une seule maison, ce qui est connu pour être une condition stressante35. Par la suite, le regroupement des mâles dans une cage commune conduit souvent à une augmentation de l’agressivité en raison de l’établissement de la hiérarchie. Ainsi, l’essai de déchiquetage de Nestlet devrait conclure le calendrier d’essai. Il est également recommandé de tester les mâles avant les femelles afin d’éviter que le comportement des mâles ne soit influencé par les traces olfactives des femelles. L’alternance d’animaux appartenant à différents groupes expérimentaux pendant les tests est cruciale dans la recherche comportementale pour équilibrer les effets de facteurs imprévisibles sur le comportement animal. Il est bien connu que le fait de manipuler des animaux avant de les tester dans l’EPM influence leur réponse au stress observée. Par conséquent, la quantité de manipulation doit être uniforme pour tous les animaux36. Il est également très important de maintenir les conditions de logement (seul ou en groupe), l’éclairage pendant les tests, le moment des tests et avant l’expérience des tests pour chaque animal, car tous ces facteurs influencent la réponse d’une souris dans le test EPM et OF et peuvent biaiser les résultats37.
Malgré les tests présentés appartenant à des outils de criblage bien établis dans le développement de médicaments et le phénotypage de souris génétiquement modifiées qui donnent des résultats reproductibles dans tous les laboratoires, certains tests peuvent encore faire l’objet de modifications mineures. Comme la déficience motrice est la principale caractéristique du phénotype d’un modèle animal SA, le test rotarod pourrait être limité à 1 jour de test au lieu de 5 jours consécutifs. De plus, les paramètres qui décrivent la qualité d’un nid construit pourraient être incorporés dans l’essai de déchiquetage du nid38.
L’une des limites évidentes des résultats présentés est l’ambiguïté de leur interprétation. En particulier, le déficit moteur des animaux AS peut expliquer les changements dans les tâches basées sur la locomotion, telles que le test OF et l’EPM. De manière analogue, un temps d’immobilité prolongé dans le TST peut être le résultat de la plus grande fatigue physique que les animaux AS développent au cours de ce test exigeant, par opposition à un comportement de type dépressif. De plus, dans le test de déchiquetage des nids, la réduction de l’utilisation du coton peut être due au phénotype neuromusculaire plutôt qu’à la perte de l’instinct de construction du nid. L’interprétation des changements de longueur de foulée est ambiguë, car un raccourcissement est observé dans certains modèles murins de la maladie de Parkinson, tandis qu’un allongement est observé chez les souris vieillissantes39,40. Cependant, nous pensons qu’une augmentation de la longueur totale de la foulée est une conséquence d’une durée de swing plus longue. La durée de l’oscillation augmente avec la douleur et se prolonge dans les modèles d’arthrite, ce qui implique qu’une durée d’oscillation plus longue chez la souris pourrait potentiellement permettre un positionnement correct des membres avant de porter du poids41,42. La durée de propulsion fait référence au temps nécessaire à un animal pour initier et maintenir un mouvement vers l’avant. Ainsi, une courte durée chez les animaux en bonne santé peut indiquer une plus grande force et un meilleur contrôle. Ces résultats caractérisent non seulement ce modèle de souris SA, mais indiquent également une altération de la marche. Cependant, des recherches plus approfondies sont nécessaires pour élucider la base physiologique d’une telle déficience, comme la détermination de la force musculaire et l’examen des connexions/transmissions neuromusculaires.
Malgré le dilemme d’interprétation, la batterie de tests comportementaux présentée fournit des résultats reproductibles et cohérents entre les laboratoires et peut servir d’outil de validation élégant pour de nouveaux modèles murins du syndrome d’Angelman et de nouvelles approches thérapeutiques 6,31,32,43,44,45.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le RVO 68378050 de l’Académie tchèque des sciences, LM2018126 Centre tchèque de phénogénomique fourni par le MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Mise à niveau du Centre tchèque de phénogénomique : développement vers la recherche translationnelle par MEYS et ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (mise à niveau de l’infrastructure CCP II par MEYS et ESIF) et OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (amélioration de la qualité et de la capacité des modèles transgéniques par MEYS et ERDF). En outre, cette étude a reçu un financement de l’ONG « Association of Gene Therapy (ASGENT) », de la Tchéquie (https://asgent.org/) et LM2023036 Centre tchèque de phénogénomique fourni par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
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