Summary
Este manuscrito presenta un conjunto de pruebas conductuales altamente reproducibles para validar un modelo de ratón con síndrome de Angelman.
Abstract
Este manuscrito describe una batería de pruebas conductuales disponibles para caracterizar fenotipos similares al síndrome de Angelman (SA) en un modelo murino establecido de EA. Utilizamos el paradigma de aprendizaje rotarod, el análisis detallado de la marcha y la prueba de construcción de nidos para detectar y caracterizar las deficiencias motoras de los animales. Probamos la emocionalidad de los animales en campo abierto y en las pruebas de laberinto elevado plus, así como el afecto en la prueba de suspensión de la cola. Cuando los ratones con EA se prueban en la prueba de campo abierto, los resultados deben interpretarse con cuidado, ya que las disfunciones motoras influyen en el comportamiento del ratón en el laberinto y alteran las puntuaciones de actividad.
La reproducibilidad y efectividad de las pruebas de comportamiento presentadas ya ha sido validada en varias líneas independientes de ratón Uba3a con diferentes variantes de knockout, lo que establece este conjunto de pruebas como una excelente herramienta de validación en la investigación de la EA. Los modelos con la validez de constructo y aparente pertinentes justificarán nuevas investigaciones para dilucidar la fisiopatología de la enfermedad y permitir el desarrollo de tratamientos causales.
Introduction
El síndrome de Angelman (EA) es una enfermedad rara del neurodesarrollo. El origen genético más común de la EA es una gran deleción de la región 15q11-q13 del cromosoma de origen materno, que se encuentra en casi el 74% de los pacientes1. La deleción de esta región provoca la pérdida de UBE3A, el principal gen causante de la EA que codifica una ubiquitina ligasa E3. El alelo paterno del gen UBE3A en las neuronas se silencia en un proceso conocido como impronta. Como consecuencia, la impronta paterna del gen solo permite la expresión materna en el sistema nervioso central (SNC)2. Por lo tanto, la deleción del gen UBE3A del cromosoma derivado de la madre conduce al desarrollo de síntomas de EA. En los seres humanos, la EA se manifiesta alrededor de los 6 meses de edad, con un retraso en el desarrollo que persiste a lo largo de todas las etapas del desarrollo y da lugar a síntomas debilitantes graves en los individuos afectados 3,4. Los síntomas centrales del trastorno incluyen el déficit de habilidades motoras finas y gruesas, incluida la marcha atáxica espasmódica, el deterioro grave del habla y la discapacidad intelectual. Aproximadamente el 80% de los pacientes con EA también sufren trastornos del sueño y epilepsia. Hasta la fecha, el único tratamiento disponible son los fármacos sintomáticos, que reducen las crisis epilépticas y mejoran la calidad del sueño1. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales robustos con fenotipos conductuales reproducibles junto con un análisis de fenotipado refinado será esencial para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos del trastorno y descubrir medicamentos y tratamientos efectivos.
La complejidad del trastorno humano que afecta al SNC exige que los organismos modelo posean un genoma, una fisiología y un comportamiento comparables. Los ratones son populares como organismo modelo debido a su corto ciclo reproductivo, tamaño pequeño y relativa facilidad de modificación del ADN. En 1984, Paul Willner propuso tres criterios básicos de validación del modelo de enfermedad: el constructo, la cara y la validez predictiva, que se utilizan para determinar el valor del modelo5. Simplemente, la validez de constructo refleja los mecanismos biológicos responsables del desarrollo del trastorno, la validez facial recapitula sus síntomas y la validez predictiva describe la respuesta del modelo a los fármacos terapéuticos.
Para adherirnos a los principios anteriores, hemos elegido la etiología genética más común, una gran deleción del locus materno 15q11.2-13q, incluido el gen UBE3A, para crear ratones modelo de EA. Utilizamos la técnica CRISPR/Cas9 para eliminar una región de 76.225 pb de largo que abarca todo el gen UBE3A, que abarca tanto los elementos codificantes como los no codificantes del gen, en ratones de un fondo C57BL/6N6. A continuación, criamos los animales para obtener ratones heterocigotos UBE3A+/−. Para la validación facial del modelo, utilizamos animales de cruces de hembras UBE3A+/− y machos de tipo salvaje para obtener progenie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A
Las pruebas conductuales aquí presentadas pertenecen a las herramientas de fenotipado comunes en la investigación genética, gracias a su alto valor predictivo y suficiente validez de constructo 8,9,10. Utilizamos estas pruebas para validar un modelo murino de EA recapitulando los síntomas centrales de la enfermedad humana de una manera reproducible e independiente de la edad. La emocionalidad del animal se evaluó en las pruebas de laberinto elevado plus y campo abierto. Ambas pruebas se basan en el conflicto de acercamiento-evitación, en el que los animales exploran un nuevo entorno en busca de alimento, refugio u oportunidades de apareamiento, al tiempo que evitan los compartimentos ansiogénicos11. Además, la prueba de campo abierto se utiliza para probar la actividad locomotora de un ratón8. La prueba de suspensión de la cola se utiliza ampliamente en la investigación de la depresión para detectar nuevos fármacos antidepresivos o fenotipos similares a los depresivos en modelos de ratón knockout12. Esta prueba evalúa la desesperación que desarrollan los animales con el paso del tiempo en una situación ineludible. El aprendizaje motor y las características detalladas de la marcha se determinaron en el rotarod y en el DigiGait, respectivamente. La resistencia animal en la varilla aceleradora caracteriza sus habilidades de equilibrio y coordinación de movimientos, mientras que el análisis detallado de los patrones de pasos de un ratón es una evaluación sensible de las deficiencias neuromusculares relacionadas con muchos trastornos neurogenerativos del movimiento13,14,15. La prueba de trituración de nidos es parte de la metodología estándar para detectar el comportamiento impulsivo en roedores y, dado que utiliza el comportamiento natural de construcción de roedores, indica el bienestar del animal16,17.
El tamaño de los grupos experimentales fue el resultado de un compromiso para cumplir con las demandas de la regla de las 3R y el uso eficiente del rendimiento genético de las colonias. Sin embargo, para obtener poder estadístico, los grupos tuvieron no menos de 10 individuos, debido al establecimiento de una cantidad suficiente de parejas reproductoras. Desafortunadamente, el rendimiento reproductivo no siempre resultó en un número suficiente de animales.
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Protocol
Todos los animales y experimentos utilizados en este estudio se sometieron a una revisión ética y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE. El estudio fue aprobado por la Comisión Central Checa para el Bienestar Animal. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente y se mantuvieron a una temperatura constante de 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. A los ratones se les proporcionó comida para ratones y agua ad libitum. Los ratones se alojaron en grupos de tres a seis animales por jaula. No se realizó ninguna manipulación que no fuera el pesaje antes de la prueba. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Consideraciones generales previas y durante los ensayos
NOTA: En aras de la claridad y la comprensibilidad, se presentan comentarios generales antes de la descripción de las pruebas individuales. Esto se aplica a todas las pruebas, con la excepción obvia de la prueba de trituración de nidos, que se lleva a cabo en una sala de alojamiento y no requiere el uso de ningún equipo experimental.
- Acomode a los animales en el centro de investigación durante al menos 14 días antes de la prueba para minimizar cualquier estrés resultante del transporte y los cambios en el entorno.
- Registre el peso de los animales antes de realizar la prueba, ya que el peso es un factor de confusión común en la investigación del comportamiento.
- Deje que los animales se aclimaten en la sala de experimentación durante al menos 1 hora después del transporte desde su sala de alojamiento para minimizar el estrés del transporte, siempre que se lleve a cabo dicho transporte (es decir, todas las pruebas descritas a continuación, excepto la trituración de nidos, que se realiza en la sala de alojamiento).
- Etiquete a cada animal en la cola con un marcador no tóxico a base de agua para permitir una rápida identificación durante el experimento.
- Eliminar toda la orina y las heces depositadas por los animales en el aparato experimental durante las pruebas después de cada prueba.
- Limpie todos los aparatos experimentales con alcohol al 75% antes y después de cada animal de ensayo. La limpieza elimina los rastros olfativos depositados durante las pruebas y ayuda a mantener las condiciones experimentales estables.
- Transportar a los animales desde su jaula doméstica hasta el aparato experimental con el mayor cuidado posible, preferiblemente en un pequeño recipiente opaco, y luego liberarlos libremente a menos que se necesiten otras manipulaciones.
- Coloque a cada animal en una jaula de retención temporal después de la prueba para evitar que influya en los animales no probados en la jaula doméstica.
- Realice pruebas a machos y hembras en días consecutivos. Alternar el orden de los diferentes genotipos durante las pruebas para contrarrestar los factores ambientales impredecibles entre los grupos experimentales.
- Vuelva a colocar a los animales en su jaula de origen después de que todos los animales hayan sido examinados y devuélvalos a la sala de alojamiento.
- En el caso de pruebas repetidas con animales, mantenga un intervalo de al menos 1 día entre cada prueba.
2. Pruebas de comportamiento
- Laberinto elevado plus (EPM)
NOTA: Ambos sexos de las cepas de ratones C57BL/6NCrl y UBE3AmGenedel/+ se probaron para este estudio a las 9-12 semanas de edad. El peso de los animales osciló entre 22 y 36 g para los machos y entre 18 y 28 g para las hembras en el momento de la prueba.- Coloque el laberinto en forma de más en la plataforma de prueba justo debajo de la cámara. Usando el potenciómetro en la pared, ajuste la intensidad de la luz a 70 lux en su centro con la ayuda de un luxómetro, con su sensor colocado en el centro del laberinto durante el ajuste.
- Abra el software haciendo doble clic en el icono del software Viewer y cargue la configuración para las pruebas de EPM haciendo clic en el icono de la parte superior izquierda de la pestaña Configuración . Cargue el complemento de EPM desde el menú Archivo . Complete la información del animal usando el teclado de la computadora (identificación del animal, genotipo, sexo y la información del experimento (fecha, intensidad de la luz) en los campos correspondientes de la pestaña Experimento . Compruebe si la posición de la zona, los brazos abiertos y los brazos cerrados están configurados correctamente. Con la ayuda de un control visual y un mouse de computadora, asegúrese de que las zonas virtuales delineadas coincidan con las zonas de EPM correspondientes en la vista previa del video.
- El EPM es una prueba que se utiliza para evaluar la ansiedad general de un animal, que se basa en el conflicto de aproximación-evitación. Los roedores tienden naturalmente a evitar las áreas desprotegidas bien iluminadas (brazos abiertos), en favor de las más seguras (brazos cerrados). Como esta prueba totalmente automatizada se basa en un sistema de seguimiento de vídeo, deja que el software calcule automáticamente el tiempo de permanencia en cada zona, así como el número de entradas.
- Durante las pruebas, grabe a los animales en video a través de una cámara industrial sensible a la luz infrarroja. Permite que el software detecte la posición del animal en tiempo real durante la grabación. Después de esto, deje que el software evalúe automáticamente las huellas del animal para calcular todos los parámetros que describen el comportamiento del animal en el laberinto. Utilice el tiempo que se pasa en los brazos abiertos ansiógenos y el porcentaje de visitas de brazos abiertos para evaluar el nivel de comportamiento similar a la ansiedad en los animales.
NOTA: El laberinto hecho a medida está hecho de material permeable a la luz infrarroja y se coloca en una plataforma de fuente de luz infrarroja de diodo emisor de luz (LED). - Coloque el cursor del ratón en el icono de flecha en la parte superior izquierda de la pestaña Adquisición . Retire un animal de la jaula de la casa con la mano y colóquelo suavemente en el centro del EPM. Inicie el protocolo haciendo clic con el botón izquierdo del mouse de la computadora y salga de la sala experimental inmediatamente.
- Una vez que finalice el protocolo de grabación después de 5 minutos de exploración gratuita del laberinto, guarde los datos grabados haciendo clic en Aceptar en la ventana que aparece después de la finalización del protocolo, asigne al archivo el nombre adecuado y haga clic en Guardar. Exporte los resultados a un archivo .csv para cada animal probado para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono en el panel vertical izquierdo de la pestaña Análisis de datos .
- Saca al animal del laberinto con la mano y colócalo en la jaula de retención temporal. Proceda con las pruebas de todos los animales de la misma manera. Copie los resultados de todos los animales probados en un archivo de bloc de notas para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono Copiar resultados en la pestaña de resultados del complemento de laberinto Elevated Plus .
NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, la configuración experimental, como la iluminación o la colocación de la computadora, puede variar según la construcción de la instalación para animales.
- Prueba de campo abierto (OF)
NOTA: La prueba de campo abierto evalúa el movimiento general de un animal, que se desencadena por el comportamiento exploratorio en un entorno nuevo. Además, se usa comúnmente como una herramienta de detección para detectar la ansiedad general en un espacio desprotegido y bien iluminado. Se trata de una prueba totalmente automatizada que utiliza un sistema de seguimiento de vídeo, que también se utilizó en la prueba anterior.- Coloque las cuatro cajas de prueba OF en la plataforma de prueba justo debajo de la cámara. Usando el potenciómetro en la pared, ajuste la intensidad de la luz a 200 lux en el centro de cada prueba OF con la ayuda de un luxómetro, con su sensor colocado en el centro de cada caja durante el ajuste.
- Abra el software haciendo doble clic en el icono del software Viewer y cargue la configuración para las pruebas de OF haciendo clic en el icono de la parte superior izquierda de la pestaña Configuración . Complete la información del animal usando el teclado de la computadora (identificación del animal, genotipo, sexo e información del experimento (fecha, intensidad de la luz) en los campos correspondientes de la pestaña Experimento . Compruebe si la posición de la zona (centro y periferia) coincide con las casillas de prueba OF y ajústelas si es necesario. Con la ayuda de un control visual y un mouse de computadora, asegúrese de que las zonas centrales y periféricas delineadas virtuales coincidan con las zonas de prueba OF correspondientes en la vista previa del video.
- Durante las pruebas, grabe a los animales en vídeo a través de una cámara industrial sensible a la luz infrarroja. Permita que el software detecte la posición del animal en tiempo real durante la grabación y evalúe automáticamente las huellas del animal para calcular todos los parámetros que describen el comportamiento del animal en la caja de prueba OF. La distancia recorrida, la velocidad media y el tiempo de descanso son parámetros utilizados para evaluar la actividad animal en un nuevo entorno, mientras que el número de entradas al centro y la duración en el centro describen un comportamiento similar a la ansiedad en los animales.
NOTA: El laberinto hecho a medida está hecho de material permeable a la luz infrarroja y se coloca sobre una plataforma de fuente de luz infrarroja LED. - Coloque el cursor del ratón en el icono de flecha en la parte superior izquierda de la pestaña Adquisición . Retire cuatro animales de la jaula de la casa con la mano y colóquelos suavemente en la esquina de cada caja de prueba OF. Inicie el protocolo haciendo clic con el botón izquierdo del mouse de una computadora e inmediatamente salga de la sala experimental.
- Cuando el protocolo finalice después de 10 minutos de exploración gratuita del laberinto, guarde los datos haciendo clic en Aceptar en la ventana que aparece después de la finalización del protocolo, asigne al archivo el nombre adecuado y haga clic en Guardar. Exporte los resultados a un archivo .csv para cada animal probado para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono en el panel vertical izquierdo de la pestaña Análisis de datos .
- Retire a los animales del laberinto a mano y colóquelos en la jaula de retención temporal. Proceda con las pruebas de todos los animales de la misma manera. Analice los datos exportados.
NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, la configuración experimental, como la iluminación, el número de laberintos o la ubicación de la computadora, puede variar según la construcción de la instalación de animales.
- Prueba de suspensión trasera (TST)
NOTA: Se prueban tres ratones simultáneamente con el aparato de suspensión de cola automatizado.- Mantenga la intensidad de la luz de la habitación en 100-120 lux.
- Conecte el sistema TST con la computadora a través de un cable USB. Inserte el dongle USB en la computadora e inicie el software haciendo doble clic en el icono del software BIO-TST . En la pestaña Configuración , en Global, ajuste la duración de la adquisición a 360 s. En la pestaña Experimento , seleccione Nueva lista de sujetos y cree un nuevo archivo de experimento y una nueva lista de sujetos evaluados siguiendo las instrucciones de la pestaña abierta.
- Para iniciar la ejecución, haga clic en Iniciar ejecución | continuar en la pestaña Adquisición . Prepare a los animales para la prueba envolviendo cinta adhesiva de una sola cara, como la cinta médica transpore, alrededor de 3/4 de la cola del animal, comenzando desde la base.
- Pasa el gancho de suspensión a través de la cinta y suspende al animal en él. Comience a adquirir datos para cada animal individualmente inmediatamente después de colgarlo en el gancho haciendo clic en el icono Inicio debajo de la posición visualizada para cada animal y observe a los animales continuamente durante la prueba.
- Una vez completada la adquisición del primer conjunto de animales, haga clic en Iniciar la siguiente carrera, retire a los animales del gancho, separe la cinta adhesiva de sus colas, corte cuidadosamente la cinta con unas tijeras a lo largo de la cola y coloque a los animales en la jaula de retención temporal.
- Limpiar el aparato con alcohol al 75% y pañuelos de papel y proceder con el resto de los animales como se ha descrito anteriormente. En la pestaña Análisis, seleccione los últimos 4 minutos de la adquisición para el análisis y, a continuación, seleccione todas las ejecuciones válidas en el período de análisis, haga clic en Analizar sujetos seleccionados, elija el formato de datos deseado y haga clic en Exportar datos seleccionados para exportar los datos recopilados para su posterior análisis.
NOTA: La prueba dura 6 min. Durante los primeros 2 minutos, los animales lucharán vigorosamente, pero a medida que la reacción de desesperación se vuelve prevalente durante los 4 minutos restantes, el tiempo de inmovilidad durante este período se toma para el análisis. El software y el hardware pueden diferir, y se deben seguir los manuales pertinentes. Además, el equipo en sí puede variar (por ejemplo, el número de posiciones de prueba).
- Análisis de la marcha
- Encienda la cinta de correr y ajuste manualmente la velocidad de la cinta a 20 cm/s en el panel del equipo haciendo clic en el símbolo + o - situado junto al indicador de velocidad. Encienda la luz del aparato girando la perilla en el sentido de las agujas del reloj. Inicie el software DigiGait Imager haciendo doble clic en el icono del software y ajuste la velocidad de obturación a 100 para ratones albinos o a 130 para ratones negros/oscuros en el campo para la velocidad de obturación.
- Retire el primer animal de la jaula de la casa con la mano y colóquelo suavemente en la cinta de correr. Cierre la puerta del compartimento del animal. Inspeccione visualmente para asegurarse de que la cola del animal no esté atascada entre la puerta y el marco.
- Permita que el mouse explore la cinta de correr antes de grabar. Compruebe que el animal es capaz de realizar la prueba ajustando la cinta de correr a una velocidad de marcha lenta durante ~3 s y luego deteniéndola, observando al animal continuamente.
- Encienda la cinta presionando el botón de inicio en el panel del equipo y grabe durante aproximadamente 10 s. Asegúrese de que se pueda observar una locomoción clara y fluida de al menos 10-15 pasos. Detenga el cinturón presionando el botón Stop en el panel del equipo y devuelva el mouse a la jaula de retención temporal con la mano.
- Proyecte la grabación para una secuencia de imágenes con pasos fluidos haciendo clic en REPRODUCIR y revisando la grabación con el control visual en el modo EDITAR. Elija de 10 a 15 movimientos fluidos escribiendo manualmente sus números de fotograma inicial y final en los campos correspondientes (De fotograma # para el primer fotograma y A para el último fotograma). Complete la información del animal (identificación del animal, fecha de nacimiento, sexo, peso, velocidad del cinturón y ángulo del cinturón) y comente cuando sea necesario en los campos relevantes. Guarde el archivo para su posterior análisis haciendo clic en Guardar.
- Limpie la cinta con agua y proceda con el resto de los animales de la misma manera. Elija CÁMARA para continuar con la grabación del siguiente animal que camina. Cuando se adquieran los registros de todos los animales, se procederá al análisis.
NOTA: Los animales que no son capaces de caminar a una velocidad determinada del cinturón están excluidos de las pruebas. Basándonos en nuestra experiencia, observamos que los animales de mayor edad (más de 50 semanas) experimentan más dificultades para caminar en la cinta de correr, con una frecuencia variable entre el 2% y el 50% dependiendo del genotipo. Los desechos animales se recogen en bandejas en la parte delantera o trasera de la cinta de correr. Las bandejas se vacían después de cada estudio y se lavan con agua tibia y jabón. El cinturón se limpia con un paño húmedo. - Realice un análisis de la marcha basado en un análisis totalmente automatizado de las grabaciones de vídeo de las huellas de los animales. Ajuste los datos en el software de análisis DigiGait .
NOTA: El análisis de la marcha proporciona no solo una medida de la coordinación motora, sino también una descripción cinemática detallada basada en el análisis de la señal dinámica de la marcha, que representa la historia temporal de la colocación de las patas a través de zancadas secuenciales. El software mide automáticamente los siguientes parámetros: duración del balanceo, porcentaje de duración de la zancada en el balanceo, duración del frenado, porcentaje de duración de la zancada en el frenado, duración de la propulsión, porcentaje de zancada en la propulsión, duración de la postura, porcentaje de zancada en la postura, duración de la zancada, porcentaje de frenado de la postura, porcentaje de propulsión de la fase de apoyo, relación balanceo/apoyo, longitud de zancada, frecuencia de zancada, ángulo de la pata, variabilidad del ángulo de la pata, anchura de la postura, ángulo de la zancada, variabilidad de la longitud de la zancada, variabilidad de la anchura de la zancada, variabilidad del ángulo de la zancada, coeficiente de variación de la longitud de la zancada, coeficiente de variación de la anchura de la zancada, coeficiente de variación del ángulo de la pisada, coeficiente de variación de la duración del balanceo, área de la pata en la posición máxima, variabilidad del área de la pata en la postura máxima, duración de la posición compartida de la extremidad posterior, porcentaje de la postura compartida, relación entre la duración de la posición trasera izquierda y derecha, simetría de la marcha, tasa máxima de cambio del área de las patas en contacto con la cinta de correr durante la fase de frenado, tasa máxima de cambio del área de las patas en contacto con la cinta de correr durante la fase de propulsión, propulsión tau, distancia de superposición de las patas, posicionamiento de la colocación de las patas, coeficiente de ataxia, distancia de la línea media, distancia del eje y arrastre de las patas. El software permite una pequeña corrección del ruido de la traza de paso, que debe completarse antes del análisis estadístico. El software y el hardware pueden diferir, y se deben seguir los manuales pertinentes.
- Rotarod
NOTA: La prueba de rotarod se utiliza para evaluar las funciones motoras de los roedores: equilibrio y coordinación motora. La prueba requiere que un ratón camine sobre una varilla giratoria de un diámetro fijo (5 cm), con la rotación acelerándose durante un período de tiempo determinado (5 min) hasta que el animal ya no pueda permanecer en él.- Encienda el equipo rotarod presionando el interruptor de encendido/apagado del equipo e inicie el software haciendo doble clic en el icono del software Rod. Inicialice un nuevo archivo en la pestaña Archivo y guárdelo con el nombre adecuado. En la ventana Configuración, rellene los detalles del experimento, como la fecha, el nombre del usuario y los posibles comentarios. Establezca el perfil de velocidad en 300 s, la velocidad inicial en 4 rpm y la velocidad del terminal en 40 rpm.
- Prepare un horario para los animales probados en el campo Animal y asigne a cada animal su posición en la varilla. Las posiciones no se indican en el software explícitamente, pero corresponden a la línea de la lista; Por ejemplo, la primera línea indicaría la primera posición de la varilla, la quinta línea indicaría la quinta posición de la varilla, y así sucesivamente. Recuerde contrapesar cada posición de la varilla entre los grupos experimentales.
NOTA: Se pueden analizar cinco animales simultáneamente. - Cierre el panel Configuración haciendo clic en Cerrar y abra el panel de medición haciendo clic en Medir. Inicie la rotación inicial de la varilla a 4 rpm haciendo clic en Start/Stop y coloque los primeros cinco animales en sus posiciones asignadas. Cuando todos los animales estén en la caña, inicie el protocolo de prueba haciendo clic en Iniciar perfil, y la varilla se acelerará gradualmente a 40 rpm durante 5 minutos. Si un animal se cae de la caña, devuélvalo a la varilla antes de que comience el protocolo.
NOTA: Por lo general, los animales no permanecen en la varilla el tiempo suficiente para colocar a todos los ratones sobre ella a la vez durante el primer intento. Es importante tener paciencia al colocar a los animales en la caña con la velocidad constante de rotación al principio. El propósito de la prueba no es determinar la resistencia del animal en la caña a una velocidad de rotación fija, sino encontrar la velocidad a la que el animal no puede permanecer en la varilla. La velocidad de la caña es proporcional a la latencia de permanecer en ella; Por lo tanto, se utiliza para expresar el equilibrio del animal. - Mueva a los animales a la jaula de retención temporal después de que todos se hayan caído de la varilla o después de que hayan pasado 5 minutos. Retire los desechos animales y limpie la varilla y la bandeja con alcohol.
- Haga clic en Animales -> para continuar con el siguiente grupo de animales de la misma manera. Después de probar todos los animales, cierre la ventana Medir haciendo clic en Cerrar y haga clic en Mostrar para mostrar los datos recopilados. Exporte los datos adquiridos en formato de archivo .csv para su posterior análisis haciendo clic en Exportar CSV.
- Pruebe a cada animal en la caña tres veces con intervalos de 15 minutos entre ensayos. Utilice el valor promedio de la latencia para caer en los tres ensayos para un análisis estadístico adicional. Evaluar el aprendizaje motor del animal repitiendo la prueba durante 5 días consecutivos.
NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, el equipo en sí puede variar, por ejemplo, en el número de posiciones de prueba, la construcción general y la dimensión de la varilla.
- Construcción de nidos trituradores de nidos Nestlet
- Separe a los animales en jaulas individuales de policarbonato para ratones con equipo estándar (cama, malla de comida y suministro de agua) durante 1 semana. Tome aproximadamente 12 g de nido de algodón con fórceps, registre su peso manualmente con una báscula y colóquelo al azar en una jaula, pero en el lado opuesto al suministro de agua. Regrese las jaulas con los animales a la sala de alojamiento.
- Pesa cada nido a la misma hora todos los días durante los próximos 4 días manualmente usando una báscula. Registre los pesos en papel o en una hoja de cálculo prefabricada. Asegúrese de que cada nido esté seco cuando se pese; De lo contrario, séquelos en una almohadilla térmica y devuelva todos los nidos a sus jaulas asignadas al mismo tiempo en el lugar donde el ratón hizo su nido. Si el nido se rompe en varias partes, pesa la más grande.
- Para el análisis de los datos, exprese la disminución del peso de los nidos en cada día en relación con el peso inicial y preséntelo como un porcentaje del material utilizado.
NOTA: Llevar a los machos de vuelta a una jaula común puede provocar un aumento de la agresión y lesiones no deseadas entre los animales. Por lo tanto, la prueba de trituración de nidos debe programarse hacia el final del régimen de pruebas para evitar comprometer el bienestar animal.
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Representative Results
Pruebas de laberinto elevado plus y campo abierto
Las pruebas EPM y OF utilizan la tendencia natural de los roedores a explorar nuevos ambientes18,19. La exploración se rige por un conflicto de aproximación-evitación, en el que los roedores eligen entre la exploración de un nuevo entorno y la evitación de posibles peligros. Los animales exploran lugares desconocidos en busca de refugio, contacto social o búsqueda de alimento. Sin embargo, los nuevos lugares pueden implicar factores de riesgo como depredadores o competidores. Tanto la prueba OF como la EPM consisten en compartimentos seguros y riesgosos: la periferia y el centro en la prueba OF y los brazos cerrados y abiertos en la EPM, respectivamente. Los roedores naturalmente prefieren los compartimentos oscuros y cerrados en comparación con las áreas abiertas, elevadas y brillantemente iluminadas. Por lo tanto, la reducción de la exploración de las partes riesgosas/ansiogénicas, expresada como una disminución en el número de visitas y en la duración de la visita, o como un aumento de la latencia a la primera visita, caracteriza el comportamiento similar a la ansiedad de los animales 8,11. El tiempo de descanso, la velocidad media y la distancia total recorrida proporcionan información adicional sobre la actividad espontánea de los animales. Ninguno de los parámetros relacionados con el comportamiento similar a la ansiedad se alteró en los mutantes UBE3AmGenedel/+ ni en la prueba OF ni en la EPM (Figura 1D-G). Sin embargo, los animales UBE3AmGenedel/+ fueron significativamente hipoactivos, como se refleja en una distancia recorrida más corta, una velocidad media más baja y un tiempo de reposo más largo en la prueba de FO (Figura 1A-C).
Figura 1: Actividad espontánea y respuesta a la ansiedad ante un nuevo entorno en la prueba EPM y OF. (A-E) Exploración del campo abierto. Los animales UBE3AmGenedel/+ caminaron una distancia más corta (A) con una velocidad media (B) más baja y un tiempo de descanso prolongado (C). El número de visitas y la duración en el centro no difirieron entre los animales (D,E). Un ANOVA de dos vías reveló un efecto genotípico principal significativo sin interacción significativa entre genotipo y sexo (efecto genotipo: p < 0,01; interacción genotipo/sexo: p > 0,7). El porcentaje de visitas a los brazos abiertos y cerrados no dependió del genotipo (F), ni el tiempo de permanencia en los brazos abiertos ansiogénicos difirió entre los grupos experimentales (G). Un ANOVA de dos vías no reveló efectos principales significativos ni interacción genotipo/sexo (efecto genotipo: p > 0,9; interacción genotipo/sexo: p > 0,9). Los datos representados en el diagrama de caja muestran el valor mediano, el rango entre cuartiles y el rango de valores. Los resultados significativos de las pruebas post-hoc se indican como *. Los datos de los animales control (hembras n = 10, machos n = 11) se presentan en rojo, y los mutantes (hembras n = 9, machos n = 10) en azul. Esta figura fue adaptada de Syding et al.6. Abreviaturas: EPM = elevado más laberinto; OF = campo abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Prueba de suspensión de cola
La TST mide la desesperación animal desarrollada en una situación ineludible. Cuando están suspendidos por la cola, los roedores se vuelven rápidamente inmóviles después de un período inicial de actividad vigorosa. La duración de la inmovilidad indica la magnitud de la "desesperación". Numerosos laboratorios han demostrado que una amplia gama de fármacos antidepresivos clínicamente activos reducen la duración de la inmovilidad 9,20,21. Esta prueba sin complicaciones se ha vuelto comúnmente utilizada para la detección de posibles sustancias antidepresivas, y también puede ser utilizada para caracterizar el fenotipo de varias cepas animales, así como de murinas transgénicas, en estudios que exploran las bases neurobiológicas de los estados depresivos 9,21. Los animales UBE3AmGenedel/+ permanecieron inmóviles significativamente más tiempo que sus compañeros de camada de control, lo que indica su comportamiento similar a la depresión (Figura 2).
Figura 2: Tiempo de inmovilidad en la prueba de suspensión trasera. Los animales UBE3AmGenedel/+ mostraron una mayor inmovilidad durante la suspensión de la cola. Un ANOVA de dos factores mostró efectos principales significativos, pero no significativos en la interacción genotipo/sexo (efecto genotipo: p < 0,001; efecto sexo : p < 0,001; interacción genotipo/sexo: p > 0,5). Los datos representados en el diagrama de caja muestran el valor mediano, el rango intercuartílico y el rango de valores. Los resultados significativos de las pruebas post-hoc se indican como *. Los datos de los animales control (hembras n = 10, machos n = 14) se presentan en rojo y los mutantes (hembras n = 10, machos n = 11) en azul. Esta figura fue adaptada de Syding et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Análisis de Rotarod y de la marcha
La historia de las pruebas de rotarod en modelos de déficits neuromotores se remonta a mediados del sigloXX 22. El rotarod se utiliza para evaluar el equilibrio y la coordinación de movimientos de los animales, ya que sus deficiencias se manifiestan en una latencia significativamente más corta para caer de la varilla giratoria14. Las pruebas repetidas en el rotarod se utilizan para estudiar las capacidades de aprendizaje motor de los animales. El rápido desarrollo de los equipos modernos y las tecnologías digitales han permitido una evaluación automatizada, precisa e imparcial de los fenotipos locomotores de los roedores a partir de las descripciones detalladas de su marcha23. El análisis automatizado de la marcha sustituyó al análisis de la pisada, y también es más sensible a los déficits neuromusculares14,24,25. Las alteraciones de las características espacio-temporales de la marcha animal son específicas de la unidad nosológica modelada26,27,28. Los mutantes UBE3AmGenedel/+ tenían una alternancia robusta de índices de marcha (Figura 3A-G), confirmada además por una latencia reducida para caer desde el rotarod (Figura 3H).
Figura 3: Análisis detallado de la marcha y aprendizaje motor en el rotarod. (A-G) Se alteraron los índices de marcha de los animales UBE3AmGenedel/+. Los animales UBE3AmGenedel/+ tuvieron un balanceo (A) y una postura (B) más largos, lo que resultó en una duración y longitud de zancada prolongadas (C,D). La duración de la propulsión (E) y la desaceleración (F) de sus extremidades traseras también aumentaron. El análisis también reveló un área de patas más grande en la posición máxima (G). Ni los parámetros métricos ni el peso de los animales difirieron (datos no mostrados), lo que indica que las diferencias observadas no se debieron a diferencias en el tamaño de los animales. Un ANOVA de dos vías con mediciones repetidas mostró un efecto principal significativo del genotipo sin interacción genotipo/sexo significativa (efecto genotipo: p < 0,001; interacción genotipo/sexo: p > 0,2). (H) Los resultados del rendimiento del rotarod muestran una latencia de caída más corta en los animales UBE3AmGenedel/+. Un ANOVA de dos vías con mediciones repetidas reveló efectos principales significativos sin una interacción significativa (efecto genotipo: p < 0,001; efecto sexo: p < 0,01; interacción genotipo/sexo: p > 0,1). Los parámetros de la marcha representados en el diagrama de caja muestran el valor de la mediana, el rango intercuartílico y el rango de valores. Los resultados significativos de las pruebas post-hoc se indican como *. Los datos de la latencia a la caída se presentan en un gráfico lineal como media ± SEM. Los datos de los animales control (hembras n = 10, machos n = 14) se presentan en rojo y los mutantes (hembras n = 10, machos n = 11) en azul. Esta figura fue adaptada de Syding et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nestlet-shredding - construcción de nidos
La prueba de destrucción de nidos se utiliza principalmente para detectar comportamientos compulsivos estereotipados en ratones 29,30. Sin embargo, los ratones muestran una tendencia natural a rasgar el material proporcionado para construir su nido. Por lo tanto, la incapacidad de triturar un nido de algodón se utiliza como un indicador de su bienestar afectado por el deterioro del neurodesarrollo16,31. Los animales UBE3AmGenedel/+ utilizaron significativamente menos material para construir sus nidos, y esta diferencia fue particularmente prominente entre las hembras transgénicas y sus contrapartes de control (Figura 4A).
Figura 4: Uso del material de nidos para la construcción de nidos. Los animales UBE3AmGenedel/+ trituraron menos material de algodón que sus compañeros de camada de control. Los datos se transformaron en rangos alineados para satisfacer el requisito previo de normalidad. Un análisis de varianza con medidas repetidas reveló un efecto genotipo significativo sin una significación de la interacción genotipo/sexo (efecto genotipo: p < 0,05; interacción genotipo/sexo : p > 0,4). Los datos representados en el gráfico de líneas muestran la media ± SEM. Los resultados significativos de las pruebas post-hoc se indican como *. Los datos de los animales control (hembras n = 10, machos n = 14) se presentan en rojo y los mutantes (hembras n = 10, machos n = 11) en azul. Esta figura fue adaptada de Syding et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Escala de tiempo de prueba
Cada grupo (control y experimental) se somete a las mismas pruebas en los mismos días. Se emplea un descanso de 1 día entre pruebas para minimizar los posibles efectos de arrastre. Si es posible, las hembras y los machos se someten a pruebas en días consecutivos; de lo contrario, las hembras se someten a pruebas después de que los machos hayan sido examinados (Figura 5)6.
Figura 5: Escala de tiempo de prueba. Los animales UBE3AmGenedel/+ y sus controles se probaron en dos cohortes. La escala de tiempo de prueba para la primera cohorte se presenta en el panel superior y para la segunda cohorte en el panel inferior. Los días en los que se realizaron la prueba a los hombres se indican en azul, mientras que los días en los que se realizaron las pruebas a las mujeres se indican en verde. Los días en los que ambos sexos se sometieron a la prueba se indican en amarillo. No se realizaron pruebas los fines de semana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las cifras fueron adaptadas de Syding et al.6 de acuerdo con la política de licencias MDPI.
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Discussion
Los modelos de EA creados en diferentes cepas murinos se validan comúnmente con pruebas de estado emocional, funciones motoras y habilidades cognitivas de los animales para facilitar la comparación con los síntomas humanos31,32. Un déficit motor en los modelos de EA es el hallazgo más consistente en todos los laboratorios, seguido de un estado de emocionalidad inalterado de los mutantes y dificultades para construir nidos31,32,33. Por el contrario, el deterioro cognitivo es leve o está ausente 7,31,33. La discrepancia en el fenotipo cognitivo parece depender de la edad de los animales probados, como muestran Huang et al.7. Por lo tanto, para este trabajo, se eligió una batería de pruebas en función de su reproducibilidad, así como de la independencia de edad y especie, ya que se observan resultados comparables en los modelos de EA de ratón y rata 6,31,32.
Críticamente, se debe tener en cuenta que la experimentación repetida de animales en diferentes configuraciones experimentales exige su ordenamiento cuidadoso, comenzando con las pruebas más sensibles a la manipulación previa y, al mismo tiempo, con un efecto mínimo en las pruebas siguientes, como las pruebas EPM y OF34. Otras preocupaciones se refieren a la prueba de trituración de nidos, en la que los animales están alojados en una sola casa, lo que se sabe que es una condición estresante35. Posteriormente, la agrupación de los machos en una jaula común a menudo conduce a un aumento de la agresión debido al establecimiento de la jerarquía. Por lo tanto, la prueba de trituración de nidos debe concluir el programa de pruebas. También es una buena práctica evaluar a los machos antes que a las hembras para evitar que el comportamiento de los machos se vea influenciado por los rastros olfativos de las hembras. La alternancia de animales pertenecientes a diferentes grupos experimentales durante las pruebas es crucial en la investigación del comportamiento para equilibrar los efectos de factores impredecibles en el comportamiento animal. Es bien sabido que la manipulación de los animales antes de la prueba en el EPM influye en su respuesta al estrés observada. Por lo tanto, la cantidad de manipulación debe ser coherente para todos los animales36. También es muy importante mantener las condiciones de alojamiento (individual vs. grupal), la iluminación durante la prueba, el tiempo de prueba y la experiencia previa a la prueba para cada animal, ya que todos estos factores influyen en la respuesta de un ratón en la prueba EPM y OF y pueden sesgar los resultados37.
A pesar de que las pruebas presentadas pertenecen a herramientas de cribado bien establecidas en el desarrollo de fármacos y el fenotipado de ratones modificados genéticamente que producen resultados reproducibles en todos los laboratorios, algunas pruebas aún pueden estar sujetas a modificaciones menores. Dado que la discapacidad motora es la característica principal del fenotipo de un modelo animal de EA, la prueba de rotarod podría limitarse a 1 día en lugar de 5 días consecutivos. Además, los parámetros que describen la calidad de un nido construido podrían incorporarse en la prueba de destrucción de nidos38.
Una clara limitación de los resultados presentados es la ambigüedad de su interpretación. En particular, el déficit motor de los animales con EA puede explicar los cambios en las tareas basadas en la locomoción, como la prueba de FO y la EPM. Análogamente, un tiempo prolongado de inmovilidad en la PT puede ser el resultado de la mayor fatiga física que desarrollan los animales con EA durante esta exigente prueba, en contraposición a la conducta depresiva. Además, en la prueba de trituración de nidos, la reducción del uso de algodón puede deberse al fenotipo neuromuscular más que a la pérdida del instinto de construcción del nido. La interpretación de los cambios en la longitud de la zancada es ambigua, ya que se observa un acortamiento en algunos modelos murinos de la enfermedad de Parkinson, mientras que se observa una prolongación en ratones envejecidos39,40. Sin embargo, creemos que un aumento en la longitud total de la zancada es una consecuencia de una mayor duración del swing. La duración del balanceo aumenta con el dolor y se prolonga en los modelos de artritis, lo que implica que una mayor duración del balanceo en ratones podría permitir una posición adecuada de las extremidades antes de soportar peso41,42. La duración de la propulsión se refiere a la duración del tiempo requerido para que un animal inicie y mantenga el movimiento hacia adelante. Por lo tanto, una duración corta en animales sanos puede indicar una mayor fuerza y un mejor control. Estos hallazgos no solo caracterizan este modelo de ratones con EA, sino que también indican un deterioro de la marcha. Sin embargo, se necesita una investigación más detallada para dilucidar la base fisiológica de dicho deterioro, como la determinación de la fuerza muscular y el examen de las conexiones/transmisión neuromuscular.
A pesar del dilema interpretativo, la batería de pruebas conductuales presentada proporciona resultados reproducibles consistentes en todos los laboratorios y puede servir como una elegante herramienta de validación para nuevos modelos murinos del síndrome de Angelman y nuevos enfoques terapéuticos 6,31,32,43,44,45.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación contó con el apoyo de la Academia Checa de Ciencias RVO 68378050, LM2018126 Centro Checo de Fenogenómica proporcionado por MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Actualización del Centro Checo de Fenogenómica: desarrollo hacia la investigación de la traducción por MEYS y ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (Actualización de la infraestructura CCP II por MEYS y ESIF) y OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (mayor calidad y capacidad para modelos transgénicos por MEYS y FEDER). Además, este estudio recibió financiación de la ONG "Asociación de Terapia Génica (ASGENT)", Chequia (https://asgent.org/) y LM2023036 Centro Checo de Fenogenómica proporcionado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
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