Summary
Denne undersøgelse giver en modificeret protokol til isolering af synoviale makrofager og fibroblaster fra murine inflammatorisk arthritisvæv.
Abstract
Reumatoid arthritis er en autoimmun sygdom, der fører til kronisk betændelse i leddene. Synoviale makrofager og synoviale fibroblaster har centrale roller i patogenesen af reumatoid arthritis. Det er vigtigt at forstå begge cellepopulationers funktioner for at afsløre mekanismerne bag patologisk progression og remission ved inflammatorisk arthritis. Generelt bør in vitro-forsøgsbetingelser efterligne in vivo-miljøet så meget som muligt. Primære vævsafledte celler er blevet anvendt i forsøg, der karakteriserer synoviale fibroblaster i arthritis. I modsætning hertil er der i eksperimenter, der undersøger makrofagernes biologiske funktioner i inflammatorisk arthritis, cellelinjer, knoglemarvsafledte makrofager og blodmonocytafledte makrofager blevet anvendt. Det er imidlertid uklart, om sådanne makrofager faktisk afspejler funktionerne i vævsresidente makrofager. For at opnå residente makrofager blev tidligere protokoller ændret til at isolere og udvide både primære makrofager og fibroblaster fra synovialvæv i en inflammatorisk arthritis musemodel. Disse primære synoviale celler kan være nyttige til in vitro analyse af inflammatorisk arthritis.
Introduction
Reumatoid arthritis (RA) er en autoimmun sygdom karakteriseret ved hyperplasi af synovium, hvilket fører til fælles ødelæggelse 1,2. Vævsresidente makrofager og fibroblaster er til stede i sundt synovium for at opretholde fælles homeostase. Hos RA-patienter spredes synoviale fibroblaster (SF'er), og immunceller, herunder monocytter, infiltreres i synovium og ledvæske, processer forbundet med inflammation 1,3,4. Synoviale makrofager (SM'er), som inkluderer residente makrofager og perifere blodmonocytafledte makrofager, og SF'er aktiveres afvigende og har vigtige roller i RA-patogenese. Nylige undersøgelser har antydet, at celle-celle-interaktioner mellem SM'er og SF'er bidrager til både forværring og remission af RA 5,6.
For at forstå RA-patogenese er der anvendt flere gnavermodeller af inflammatorisk arthritis, herunder K / BxN serumoverførselsarthritis, kollageninduceret arthritis og kollagenantistofinduceret arthritis. Cellebaserede assays er generelt nødvendige for at afklare molekylære funktioner i arthritis. Derfor er primære celler fra dyremodeller af arthritis blevet isoleret. Metoden til at isolere SF'er fra murine arthritisvæv er veletableret, og disse celler har bidraget til belysning af molekylære mekanismer i arthritispatogenese 7,8. På den anden side er knoglemarvsafledte makrofager, blodmonocytafledte makrofager og makrofagcellelinjer ofte blevet brugt som makrofagressourcer til arthritisundersøgelser 9,10. Da makrofager kan erhverve funktioner forbundet med deres mikromiljø, kan generelle kilder til makrofager mangle svar, der er specifikke for gigtvæv. Derudover er det svært at få nok synoviale celler ved sortering, da murinsynovium er et meget lille væv selv i arthritismodeller. Manglende brug af synoviale makrofager til in vitro-studier har været en begrænsning i arthritisstudier. Etableringen af en protokol til isolering og udvidelse af synoviale makrofager ville være en fordel for belysning af patologiske mekanismer i RA.
I den tidligere metode til isolering af SF'er blev SM'er kasseret7. Derudover blev der rapporteret en metode til at isolere og udvide residente makrofager fra nogle organer11. Derfor blev eksisterende protokoller ændret i kombination. Ændringen sigter mod at opnå den primære kultur i både SM'er og SF'er med høj renhed. Det overordnede mål med denne metode er at isolere og udvide både SM'er og SF'er fra murine arthritisvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøg med dyr blev godkendt af Animal Experiment Committee ved Ehime University og blev udført i overensstemmelse med Ehime University Guidelines for Animal Experiments (37A1-1*16).
1. Fremstilling af instrumenter, reagenser og dyrkningsmedium
- Forbered dyrkningsmediet som følger: Suppler Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk opløsning (anti-anti).
- Forbered fordøjelsesmediet som følger: Suppler dyrkningsmediet med 1 mg/ml collagenase type IV. Juster kollagenasekoncentrationen lige før brug.
- Type I-C kollagen fortyndes til en koncentration på 0,15 mg/ml med 1 mM HCl opløsning. Oversvømmelseskulturskåle (diameter på 40 eller 60 mm) med den fortyndede kollagenopløsning. Efter 6-12 timer ved stuetemperatur fjernes kollagenopløsningen fra opvasken og tørres ved stuetemperatur. De kollagenbelagte retter kan opbevares ved stuetemperatur i mindst 1 uge. De forcoatede tallerkener vaskes med fosfatbufret saltvand (PBS) eller substrat før brug.
- Forbered sterile kirurgiske instrumenter, såsom saks, pincet med takkede spidser og finspidspincet. Sug 70% ethanol i blød før brug.
2. Fremstilling af synovitisvæv hos mus ( figur 1A)
- Forbered en mus med inflammatorisk arthritis i bagpoterne.
BEMÆRK: Kvindelige C57BL/6 mus (18-20 g), 7-8 uger efter fødslen, med kollagenantistofinduceret arthritis (CAIA) eller K/BxN serumoverførselsartrit (STA) blev anvendt til denne protokol8. Det kan være vanskeligt at isolere SM'er fra ikke-hævet (dvs. sundt) væv, da antallet af celler er utilstrækkeligt. - Bedøv musene ved en intraperitoneal injektion af 80 mg / kg ketamin og 16 mg / kg xylazin. Rens musene med 70% ethanol.
- Skær brystområdet op med en saks for at udsætte hjertet. Klip hjertets højre auricle med en saks, og stik derefter en 23 G sommerfuglenål ind i venstre ventrikel via hjertets spids, efterfulgt af en tilbagesvaling på 15-20 ml steril PBS ved hjælp af en sprøjte til manuelt at fjerne perifert blod (ca. 1 ml / 2 s).
- Afskall bagpoterne ved at skære huden ved hjælp af en saks og trække huden ved hjælp af pincet med takkede spidser.
BEMÆRK: Efter dette trin anbefales brug af pincet til håndtering af prøver. Rør ikke ved afskallet væv med fingrene for at undgå vedhæftning af murinhår. - Dislokere metatarsophalangeale led ved at trække, efterfulgt af at skære ledbåndene i leddene ved hjælp af en saks for at fjerne tæerne.
- Skær senerne i underbenets muskler nær anklen ved hjælp af en saks. Tag fat i senen med pincet og skræl musklerne tæt i underbenet for at udsætte skinnebenet. Fjern fibulaen.
- Forskyde knæleddet ved at trække, efterfulgt af at skære ledbåndene i leddene ved hjælp af en saks for at løsne skinnebenet med den hævede bagpote. Prøverne opbevares i iskold dyrkningsmedium (0,3 ml/cm2), indtil de behandles til trin 3.1.
3. Fordøjelse af synovitisvæv ( figur 1B)
- Opsug dyrkningsmediet, undgå prøven, og tilsæt derefter frisk dyrkningsmedium (0,3 ml / cm2). Gentag vaskeprocessen tre eller fire gange.
BEMÆRK: Fra dette trin skal håndteringen af prøver udføres aseptisk i en ren bænk eller et sikkerhedsskab. - Alle leddene i prøverne forskydes ved at trække med en finpunktspincet i dyrkningsmediet under et stereomikroskop (ved 10x-20x forstørrelse). Finpunktspincet er praktisk i dette trin. Fjern skinnebenet og så mange kar, sener og ledbånd som muligt. Pas på ikke at bryde knoglerne, når du forskubber.
- Der fremstilles to 15 ml glas pr. prøve. Overfør de forskudte knogler med blødt væv til det første 15 ml rør ved hjælp af pincet. Der tilsættes 4 ml fordøjelsesmedium pr. prøve, opnået fra begge bagpoter, i røret.
- For at opsamle resterende celler og vævsfragmenter overføres mediet, hvori prøven var indeholdt, til det andet 15 ml rør. Centrifuger substratet ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes pelletten med 1 ml fordøjelsesmedium, og celle- og vævsfragmentopløsningen overføres til det første 15 ml glas, der indeholder næsten hele vævet (i alt 5 ml fordøjelsesmedium/bagpoter).
- Prøven fordøjes i 60-120 minutter ved 37 °C under omrystning i en hybridovn.
BEMÆRK: Det optimale tidspunkt at fordøje prøverne bør besluttes. Tiden afhænger af graden af hævelse i ankler og kollaganaser. I de fleste tilfælde er 60-120 min tilstrækkelig. Efter 60 minutters inkubation opsamles en del af den fordøjede prøve ved pipettering og observeres under et mikroskop. Hvis fordøjelsen er utilstrækkelig, skal inkubationen fortsætte, og fordøjelsen kontrolleres hvert 30. minut. - Pipet løsningen godt. Celleopløsningen filtreres gennem en cellesi (40 μm porestørrelse) til et 50 ml rør.
- Tilsæt 10 ml dyrkningsmedium til 50 ml røret gennem cellesien. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes med 10 ml dyrkningsmedium. Gentag centrifugeringen. Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes med 2 ml dyrkningsmedium.
Figur 1: Procedure for prøveudtagning af murine arthritis væv og kollagenasefordøjelse . (A) (i) Murine bagpote med inflammatorisk arthritis. (ii) Fjernelse af huden på bagpoten. (iii) Dislokation af metatarsophalangeale led og fjernelse af tæerne. (iv) Skæring af sener i anklen. (v) Fjernelse af musklerne i underbenene. (vi) Dislokation af knæleddet. b) tilbage; Udskårne ben i kulturmedium. Højre; forskudt tarsus og metatarsus i kulturmedium. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Dyrkning af synoviale fibroblaster ( figur 2A)
- Seed alle cellesuspensioner opnået fra begge ankler på kollagenbelagt skål.
BEMÆRK: Hvis du bruger ankler med svag eller moderat hævelse til at opnå cellerne, påføres en skål med en diameter på 40 mm. Den kollagenbelagte skålstørrelse kan ændres til en skål med en diameter på 60 mm, hvis begge ankler har svær hævelse. - Der tilsættes næringssubstrat (ca. 222 μL/cm2). Der inkuberes i 1 time ved 37 °C i befugtet atmosfære med 5 % CO2.
- Saml ikke-klæbende celler ved hjælp af en pipet (brug i trin 5.1). Vask det kollagenbelagte fad med dyrkningsmediet og opsaml mediet. Dyrk de vedhængende celler i frisk medium (figur 2B,i). De fleste af de celler, der hurtigt klæber til den kollagenbelagte skål, udviser en fibroblastoid (spindelformet) morfologi.
- Passage af subsammenflydende celler ved behandling med 0,05% trypsin i Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS). I denne metode er forureningen af andre celler begrænset, selvom i den oprindelige ekspansion. Hvis der kræves mere oprensede fibroblastlignende celler, skal du udføre gentagen passaging for at muliggøre forbedring af renheden; Imidlertid observeres udvidelsen af cellernes cytoplasma i adhæsion også (figur 2B, ii). Da overdrevne passager påvirker tabet af naive egenskaber i cellerne, skal du bruge celler med færre end 5 passager.
5. Isolering af synoviale makrofager ( figur 2A)
- Frø alle ikke-klæbende celler fra trin 4.4 på skåle (diameter på 40 eller 60 mm), der ikke er blevet belagt med kollagen.
BEMÆRK: Ikke-klæbende celler omfatter makrofager, andre lymfocytter og resterende fibroblaster fra synovitisvæv. - Massecellerne dyrkes i 1 dag ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5 % CO2.
- For at fjerne ikke-klæbende lymfocytter skal du aspirere det dyrkede medium og derefter tilføje frisk dyrkningsmedium. Gentag denne proces to eller tre gange (figur 2B, iii).
- Dyrk de klæbende bulkceller i 1-2 uger i dyrkningsmedium med mellemstore ændringer hver 2. dag, samtidig med at sammenløbet opretholdes (figur 2B, iv).
BEMÆRK: Antallet af SM'er stiger langsomt under samkulturforhold med SF'er. Samkulturperioden bør derfor justeres efter behov. - Vask med PBS eller HBSS to gange. Der behandles med 0,05 % trypsin i HBSS (ca. 55 μL/cm2) i 3 minutter ved 37 °C i befugtet atmosfære med 5 % CO2. Fibroblaster løsnes let fra kulturskålen ved trypsinbehandling, og makrofager udviser resistens over for trypsinbehandling. Brug denne egenskab til udvælgelse af synoviale makrofager.
- Tilsæt dyrkningsmedium (ca. 222 μL/cm2) forsigtigt til 0,05% trypsin i HBSS. Efter dette trin må du ikke hælde mediet direkte på cellerne.
- For at fjerne løsrevne celler skal du aspirere det dyrkede medium og derefter tilføje frisk kulturmedium forsigtigt. Gentag denne proces to eller tre gange. Opbevar de resterende celler på fadet i frisk dyrkningsmedium indtil brug (figur 2B, v).
BEMÆRK: Efter trypsinbehandling udviser klæbende celler makrofaglignende morfologiske egenskaber.
Figur 2: Adskillelse af makrofagrige og fibroblastrige fraktioner fra inflammatorisk arthritisvæv. (A) Skema over proceduren for at adskille makrofagrige og fibroblastrige celler fra arthritisvæv. (B) Repræsentative fasekontrastbilleder af faser af proceduren, (i) til (v) i figur 2A. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvindelige C57BL/6-mus i alderen 7-8 uger gennemgik kollagenantistofinduceret arthritis. Makrofaglignende celler og fibroblastlignende celler blev uafhængigt isoleret fra inflammatorisk arthritisvæv i henhold til proceduren beskrevet ovenfor (figur 2A, B). Makrofaglignende celler blev straks brugt efter trin 5.7. Fibroblastlignende celler blev oprindeligt dyrket til at være sub-sammenflydende efter trin 4.4, og derefter passeret til en ny kultur skål efterfulgt af brug. For at vurdere, om SM'er og SF'er blev isoleret med succes, blev følgende eksperimenter udført.
For at vurdere renheden af de isolerede celler blev mRNA-ekspression af forskellige cellemarkører analyseret af RT-qPCR. Cd68, Emr1, Itgam og Csf1r blev brugt som pan-makrofagmarkører, og Cdh11, Col6a1, Csf1 og Vcam1 blev brugt som SF-markører. Rplp0 blev anvendt som referencegen 6,8. Alle markørgener blev normaliseret ved Rplp0-ekspression. Begge celletypemarkører blev analyseret i de makrofaglignende celler, og fibroblastlignende celler blev opnået fra gigtvæv. SF-markører blev udtrykt i fibroblastlignende celler, og pan-makrofagmarkører blev udtrykt i makrofaglignende celler, hvilket tyder på, at makrofagrige og fibroblastrige fraktioner blev isoleret fra henholdsvis synovitisvæv (figur 3A, B).
For at fastslå renheden af makrofager blev overfladeproteinmarkører for makrofager og andre celletyper analyseret ved flowcytometri. F4/80 og CD11b blev brugt til makrofagmarkører, Ly6G til en neutrofilmarkør og CD3 til en T-cellemarkør6. Gating strategien blev brugt som tidligere vist6. Mere end 90% af cellerne udtrykte CD45, CD11b og F4/80, mens ekspressionen af Ly6G og CD3 var lavere end 1% (figur 4).
Figur 3: mRNA-ekspression af celletypespecifikke markører. (A) mRNA-ekspression af pan-makrofagmarkører (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) i synoviale makrofager (SM'er) og synoviale fibroblaster (SF'er) ved RT-qPCR (n = 4). (B) Ekspressionsniveauer for SF-markører (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) i SM'er og SF'er (n = 4). Data præsenteres som gennemsnit ± SD. ** angiver p < 0,01 ved en uparret t-test. Data blev opnået fra fire uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Celletypespecifik proteinekspression på celleoverfladen. Repræsentative histogrammer opnået i flowcytometriske analyser af leukocytoverflademarkører (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) i synoviale makrofager (SM'er). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode, der er udviklet her, forbedrer tidligere teknikker til isolering af både SF'er fra murine arthritis og residente makrofager fra en række organer 7,11. Den modificerede metode kan isolere både makrofager og fibroblaster fra inflammatorisk synovium med høj renhed, og den er enkel og reproducerbar. Da metoden ikke kræver komplekse instrumenter såsom en cellesorterer, kan enhver udføre den. Desuden undgår den nuværende teknik bekymringer forbundet med andre metoder, såsom fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk aktiveret cellesortering (MACS), som kan forårsage skader og stress i celler på grund af behandling med antistoffer og de fysiske virkninger forbundet med sortering12,13. De resulterende celler kan bruges til undersøgelse med relativt få unødvendige eksterne stimuli. Tidligere har in vitro-analyse af vævsresidente makrofager fra synovium været vanskelig, da antallet af isolerede celler er lille, selv under gigtforhold hos mus. Denne metode tillader udvidelse af SM'er under co-kultur med SF'er såvel som den tidligere metode til makrofager fra lever, milt, lunge og hjerne11. Derudover antyder qPCR-resultatet, at kun en passage af SF'er tillader et højt nok renhedsniveau (figur 3B), selvom en tidligere metode til isolering af SF'er krævede mindst tre passager7. Manglen på en renhedskontrol af SF'er ved flowcytometriske analyser er en begrænsning af denne undersøgelse. Metoden giver dog også en fordel, idet SF'er kan bruges med færre passager.
Det kritiske skridt til at isolere synovialceller med høj renhed er at undgå forurening af bakterier og / eller knoglemarvsafledte celler. Desinficerede mus skal håndteres med sterile værktøjer. Især bør isolerede ankelprøver indeholde så lidt hår som muligt. Hvis der er meget hår i prøverne, skal der udføres øget vask (trin 3.1). Også knogler opnået fra gigt er ofte sprøde14; Dislokation af metatarsophalangeale led kræver stor omhu for at undgå brud, og forurening af knoglemarvsafledte celler med en brud ville afbryde synovialcellernes kvalitet. Hvis knoglen er brudt, skal den brækkede knogle straks fjernes.
En nylig enkeltcelle RNA-sekvensanalyse afslørede, at flere underpopulationer af SM'er og SF'er er til stede i synovium 5,15. Ved denne metode kan bulkceller, herunder heterogene subpopulationer, dyrkes. Generelt går cellernes heterogenitet tabt under in vitro-betingelser 16. Faktisk indikerede en tidligere RNA-sekvensanalyse, at celler opnået ved denne metode har flere egenskaber, herunder nogle underpopulationer i form af et genekspressionsmønster, end et bestemt kendetegn ved en subpopulation6. Dette tyder på, at celler opnået ved denne metode kan have nogle karakteristika ved mikromiljøet af synovialvæv. Derfor forventer denne teknik at være nyttig som en ny tilgang til at studere cellepopulationer i inflammatorisk arthritis.
Da udviklingen af hævelse efter eksperimentel arthritisinduktion generelt overvåges i ankler 8,10,15, blev metoden til synovialcelleisolering fra kun ankelvæv tilvejebragt her. Cellerne opnået ved de metoder, der er udviklet her, kunne bruges sammen med andre led såsom knæ og / eller andre arthritismodeller. Renheden, cellenummeret og proliferativ kapacitet kan dog være anderledes. Denne metode kan også anvendes til isolering af makrofager fra humant synovium; Verifikation er dog påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker personalet ved Division of Medical Research Support, Advanced Research Support Center (ADRES) og medlemmerne af Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, for deres tekniske assistance og hjælpsomme support. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskud JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (til NS) og JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (til YI); tilskud fra Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (til NS); og et Takeda Science Foundation Medical Research-stipendium, UCB Japan (UCBJ) projekttilskud og JSBMR Frontier Scientist-tilskuddet 2019 (til YI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B.
- McInnes, I. B., Schett, G.
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
