Summary
Denne studien gir en modifisert protokoll for å isolere synoviale makrofager og fibroblaster fra murine inflammatorisk leddgiktvev.
Abstract
Revmatoid artritt er en autoimmun sykdom som fører til kronisk betennelse i leddene. Synoviale makrofager og synoviale fibroblaster har sentrale roller i patogenesen ved revmatoid artritt. Det er viktig å forstå funksjonene til begge cellepopulasjoner for å avdekke mekanismene som ligger til grunn for patologisk progresjon og remisjon ved inflammatorisk leddgikt. Generelt bør in vitro eksperimentelle forhold etterligne in vivo-miljøet så mye som mulig. Primære vevsavledede celler har blitt brukt i eksperimenter som karakteriserer synoviale fibroblaster i leddgikt. I motsetning til dette, i eksperimenter som undersøker de biologiske funksjonene til makrofager i inflammatorisk leddgikt, har cellelinjer, benmargsavledede makrofager og blodmonocytavledede makrofager blitt brukt. Det er imidlertid uklart om slike makrofager faktisk gjenspeiler funksjonene til vevsboende makrofager. For å oppnå residente makrofager ble tidligere protokoller modifisert for å isolere og utvide både primære makrofager og fibroblaster fra synovialvev i en inflammatorisk leddgiktmusemodell. Disse primære synovialcellene kan være nyttige for in vitro analyse av inflammatorisk artritt.
Introduction
Revmatoid artritt (RA) er en autoimmun sykdom preget av hyperplasi av synovium, noe som fører til felles ødeleggelse 1,2. Vevsresidente makrofager og fibroblaster er tilstede i sunn synovium for å opprettholde felles homeostase. Hos RA-pasienter prolifererer synoviale fibroblaster (SF), og immunceller, inkludert monocytter, infiltrerer i synovium og leddvæske, prosesser assosiert med betennelse 1,3,4. Synoviale makrofager (SM), som inkluderer residente makrofager og perifert blodmonocyttavledede makrofager, og SF er aberrant aktivert og har viktige roller i RA-patogenesen. Nylige studier har antydet at celle-celle-interaksjoner mellom SM og SF bidrar til både forverring og remisjon av RA 5,6.
For å forstå RA-patogenesen har flere gnagermodeller av inflammatorisk leddgikt blitt brukt, inkludert K / BxN serumoverføringsartritt, kollagenindusert leddgikt og kollagenantistoffindusert leddgikt. Cellebaserte analyser er generelt nødvendig for å avklare molekylære funksjoner ved leddgikt. Derfor har primære celler fra dyremodeller av leddgikt blitt isolert. Metoden for å isolere SF fra murine artrittvev er godt etablert, og disse cellene har bidratt til å belyse molekylære mekanismer i leddgiktpatogenese 7,8. På den annen side har beinmargsavledede makrofager, blodmonocyttavledede makrofager og makrofagcellelinjer ofte blitt brukt som makrofagressurser for leddgiktstudier 9,10. Siden makrofager kan skaffe seg funksjoner knyttet til deres mikromiljø, kan generelle kilder til makrofager mangle responser som er spesifikke for leddgiktvev. I tillegg er det vanskelig å få nok synoviale celler ved å sortere, da murine synovium er et svært lite vev selv i leddgiktmodeller. Mangelen på bruk av synoviale makrofager for in vitro-studier har vært en begrensning i leddgiktstudier. Etablering av en protokoll for å isolere og utvide synoviale makrofager vil være en fordel for å belyse patologiske mekanismer i RA.
I den forrige metoden for å isolere SF ble SM kassert7. Utover dette ble det rapportert en metode for å isolere og utvide residente makrofager fra noen organer11. Derfor ble eksisterende protokoller modifisert i kombinasjon. Modifikasjonen tar sikte på å oppnå primærkulturen til både SM og SF med høy renhet. Det overordnede målet med denne metoden er å isolere og utvide både SM og SF fra murine artrittvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter som involverte dyr ble godkjent av Animal Experiment Committee of Ehime University og ble utført i samsvar med Ehime University Guidelines for Animal Experiments (37A1-1 * 16).
1. Klargjøring av instrumenter, reagenser og kulturmedium
- Forbered kulturmediet som følger: suppler Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk løsning (anti-anti).
- Forbered fordøyelsesmediet som følger: suppler kulturmediet med 1 mg / ml kollagenase type IV. Juster kollagenasekonsentrasjonen like før bruk.
- Fortynn type I-C kollagen til en konsentrasjon på 0,15 mg / ml med 1 mM HCl-oppløsning. Flomkulturretter (diameter på 40 eller 60 mm) med den fortynnede kollagenoppløsningen. Etter 6-12 timer ved romtemperatur, fjern kollagenoppløsningen fra oppvasken og tørk ved romtemperatur. De kollagenbelagte rettene kan oppbevares ved romtemperatur i minst 1 uke. Vask de forhåndsbelagte oppvaskene med fosfatbufret saltvann (PBS) eller medium før bruk.
- Forbered sterile kirurgiske instrumenter, for eksempel saks, pinsett med takkede tips og finpunktpinsett. Bløtlegg 70% etanol før bruk.
2. Fremstilling av synovittvev hos mus ( figur 1A)
- Forbered en mus med inflammatorisk leddgikt i bakpoten.
MERK: Kvinnelige C57BL/6 mus (18-20 g), 7-8 uker postnatal, med kollagenantistoffindusert artritt (CAIA) eller K/BxN serumoverføringsartritt (STA) ble brukt for denne protokollen8. Isolering av SM fra ikke-hovent (dvs. sunt) vev kan være vanskelig, da antall celler er utilstrekkelig. - Bedøv musene ved en intraperitoneal injeksjon av 80 mg / kg ketamin og 16 mg / kg xylazin. Rengjør musene med 70% etanol.
- Klipp opp brystområdet med saks for å avsløre hjertet. Skjær høyre auricle av hjertet med saks, og stikk deretter en 23 G sommerfuglnål inn i venstre ventrikkel via hjertespissen, etterfulgt av en refluks på 15-20 ml steril PBS ved hjelp av en sprøyte for å manuelt fjerne perifert blod (ca. 1 ml / 2 s).
- Decorticate bakpotene ved å kutte huden ved hjelp av saks og trekke huden ved hjelp av pinsett med takkede tips.
MERK: Etter dette trinnet anbefales bruk av pinsett for håndtering av prøver. Ikke berør dekortikert vev med fingrene, for å unngå festing av murine hår. - Dislokasjon metatarsophalangeal leddene ved å trekke, etterfulgt av å kutte leddbåndene i leddene ved hjelp av saks for å fjerne tærne.
- Klipp senene i leggmusklene nær ankelen ved hjelp av saks. Ta tak i senen med pinsett og skrell musklene proximally i underbenet for å avsløre tibia. Fjern fibulaen.
- Dislocate kneleddet ved å trekke, etterfulgt av å kutte leddbåndene i leddene ved hjelp av saks for å løsne tibia med den hovne bakpoten. Oppbevar prøvene i iskaldt kulturmedium (0,3 ml/cm2) til behandling til trinn 3.1.
3. Fordøyelse av synovittvev ( figur 1B)
- Aspirer dyrkningsmediet, unngå prøven, og tilsett deretter nytt dyrkningsmedium (0,3 ml / cm2). Gjenta vaskeprosessen tre eller fire ganger.
MERK: Fra dette trinnet skal håndtering av prøver utføres aseptisk i en ren benk eller et sikkerhetsskap. - Dislokasjon alle leddene i prøvene ved å trekke med finpunktpinsett i kulturmediet under et stereomikroskop (ved 10x-20x forstørrelse). Finpunkts pinsett er praktisk i dette trinnet. Fjern tibia og så mange kar, sener og leddbånd som mulig. Vær forsiktig så du ikke bryter beinene når du løsner.
- Forbered to 15 ml rør per prøve. Overfør de forvridde beinene med bløtvev til det første 15 ml røret ved hjelp av pinsett. Tilsett 4 ml fordøyelsesmedium per prøve, oppnådd fra begge bakpoter, inn i røret.
- For å samle gjenværende celler og vevfragmenter, overfør mediet der prøven var inneholdt til det andre 15 ml røret. Sentrifuger mediet ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Etter fjerning av supernatanten resuspenderes pelleten med 1 ml fordøyelsesmedium og celle- og vevsfragmentoppløsningen overføres til det første 15 ml røret som inneholder nesten alt vevet (totalt 5 ml fordøyelsesmedium/bakpoter).
- Fordøy prøven i 60-120 min ved 37 °C med risting i en hybridiseringsovn.
MERK: Det optimale tidspunktet for å fordøye prøvene bør bestemmes. Tiden er avhengig av graden av hevelse i ankler og kollagenaser. I de fleste tilfeller er 60-120 min tilstrekkelig. Etter 60 min inkubasjon, samle en del av den fordøyde prøven ved pipettering, og observer under et mikroskop. Hvis fordøyelsen er utilstrekkelig, bør inkubasjonen fortsette, og fordøyelsen kontrolleres hvert 30. minutt. - Pipet oppløsningen godt. Filtrer celleoppløsningen gjennom en cellesil (40 μm porestørrelse) til et 50 ml rør.
- Tilsett 10 ml kulturmedium til 50 ml røret gjennom cellesilen. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Etter fjerning av supernatanten, resuspenderes med 10 ml kulturmedium. Gjenta sentrifugeringen. Etter fjerning av supernatanten, resuspenderes med 2 ml kulturmedium.
Figur 1: Prosedyre for prøvetaking av murine artrittvev og fordøyelse av kollagenase . (A) (i) Murine bakpote med inflammatorisk artritt. (ii) Fjerning av huden på bakpoten. (iii) Dislokasjon av metatarsophalangeal ledd og fjerning av tærne. (iv) Kutting av sener i ankelen. (v) Fjerning av musklene i leggene. (vi) Dislokasjon av kneleddet. (b) Venstre; utskårne ben i kultur medium. Høyre; forstuet tarsus og metatarsus i kulturmedium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Isolering av synoviale fibroblaster ( figur 2A)
- Frø alle cellesuspensjoner oppnådd fra begge ankler på kollagenbelagt tallerken.
MERK: Hvis du bruker ankler med svak eller moderat hevelse for å oppnå cellene, påføres en 40 mm diameter tallerken. Den kollagenbelagte tallerkenstørrelsen kan endres til en 60 mm diameter tallerken hvis begge anklene har alvorlig hevelse. - Tilsett dyrkningsmedium (ca. 222 μL/cm2). Inkuber i 1 time ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2.
- Samle ikke-adherente celler ved hjelp av en pipet (bruk i trinn 5.1). Vask kollagenbelagt tallerken med kulturmedium og samle mediet. Dyrkning av de adherente cellene i ferskt medium (figur 2B,i). De fleste cellene som raskt fester seg til kollagenbelagt tallerken, utviser en fibroblastoid (spindelformet) morfologi.
- Passasje subkonfluente celler ved behandling med 0,05% trypsin i Hanks balansert saltløsning (HBSS). I denne metoden er forurensningen av andre celler begrenset, selv om den i den første ekspansjonen. Hvis det kreves flere rensede fibroblastlignende celler, utfør gjentatt passasje for å tillate forbedring av renheten; Imidlertid observeres også utvidelsen av cellenes cytoplasma i adhesjon (figur 2B,ii). Siden overdreven passasjer påvirker tapet av naive egenskaper i cellene, bruk celler med færre enn 5 passasjer.
5. Isolering av synoviale makrofager ( figur 2A)
- Frø alle ikke-adherente celler fra trinn 4.4 på tallerkener (diameter på 40 eller 60 mm) som ikke er belagt med kollagen.
MERK: Ikke-adherente celler inkluderer makrofager, andre lymfocytter og gjenværende fibroblaster fra synovittvev. - Dyrk bulkcellene i 1 dag ved 37 °C i fuktet atmosfære med 5 % CO2.
- For å fjerne ikke-adherente lymfocytter, aspirer det dyrkede mediet, og legg deretter til nytt kulturmedium. Gjenta denne prosessen to eller tre ganger (figur 2B,iii).
- Dyrkning av de adherente bulkcellene i 1-2 uker i kulturmedium, med middels forandringer hver 2. dag samtidig som samløpet opprettholdes (figur 2B,iv).
MERK: Antallet SM-er øker sakte under samkulturforhold med SF. Samkulturperioden bør derfor justeres etter behov. - Vask med PBS eller HBSS to ganger. Behandle med 0,05 % trypsin i HBSS (ca. 55 μL/cm 2) i 3 minutter ved 37 °C i fuktet atmosfære med 5 % CO2. Fibroblaster løsner lett fra kulturskålen ved trypsinbehandling, og makrofager utviser motstand mot trypsinbehandling. Bruk denne egenskapen til valg av synoviale makrofager.
- Tilsett dyrkningsmedium (ca. 222 μL/cm2) forsiktig til 0,05 % trypsin i HBSS. Etter dette trinnet må du ikke helle mediet direkte på cellene.
- For å fjerne frittliggende celler, aspirer det dyrkede mediet, og tilsett deretter nytt kulturmedium forsiktig. Gjenta denne prosessen to eller tre ganger. Oppretthold de resterende cellene på fatet i fersk kultur medium til bruk (figur 2B,v).
MERK: Etter trypsinbehandling viser adherente celler makrofaglignende morfologiske egenskaper.
Figur 2 Separasjon av makrofagrike og fibroblastrike fraksjoner fra inflammatorisk artrittvev. (A) Skjema for prosedyren for å skille makrofagrike og fibroblastrike celler fra leddgiktvev. (B) Representative fasekontrastbilder av stadier av prosedyren, (i) til (v) i figur 2A. Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvinnelige C57BL/6-mus ved 7-8 ukers alder gjennomgikk kollagenantistoffindusert artritt. Makrofaglignende celler og fibroblastlignende celler ble uavhengig isolert fra inflammatorisk artrittvev i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor (figur 2A,B). Makrofaglignende celler ble umiddelbart brukt etter trinn 5.7. Fibroblastlignende celler ble opprinnelig dyrket for å være subkonfluente etter trinn 4.4, og deretter overført til en ny kulturrett etterfulgt av bruk. For å evaluere om SM og SF ble vellykket isolert, ble følgende eksperimenter utført.
For å vurdere renheten til de isolerte cellene ble mRNA-ekspresjon av forskjellige cellemarkører analysert av RT-qPCR. Cd68, Emr1, Itgam og Csf1r ble brukt som panmakrofagmarkører, og Cdh11, Col6a1, Csf1 og Vcam1 ble brukt som SF-markører. Rplp0 ble brukt som referansegen 6,8. Alle markørgener ble normalisert ved Rplp0-uttrykk. Begge celletypemarkørene ble analysert i de makrofaglignende cellene, og fibroblastlignende celler ble oppnådd fra leddgiktvev. SF-markører ble uttrykt i fibroblastlignende celler og panmakrofagmarkører ble uttrykt i makrofaglignende celler, noe som tyder på at makrofagrike og fibroblastrike fraksjoner ble isolert fra henholdsvis synovittvev (figur 3A,B).
For å fastslå renheten til makrofager ble overflateproteinmarkører for makrofager og andre celletyper analysert ved flowcytometri. F4/80 og CD11b ble brukt for makrofagmarkører, Ly6G for en nøytrofilmarkør og CD3 for en T-cellemarkør6. Gatingstrategien ble brukt som tidligere vist6. Mer enn 90 % av cellene uttrykte CD45, CD11b og F4/80, mens uttrykket av Ly6G og CD3 var lavere enn 1 % (figur 4).
Figur 3: mRNA-ekspresjon av celletypespesifikke markører. (A) mRNA-ekspresjon av panmakrofagmarkører (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) i synoviale makrofager (SM) og synoviale fibroblaster (SF) ved RT-qPCR (n = 4). (B) Ekspresjonsnivåer av SF-markører (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) i SM og SF (n = 4). Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. ** indikerer p < 0,01 med en uparret t-test. Data ble hentet fra fire uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Celletypespesifikt celleoverflateproteinuttrykk. Representative histogrammer oppnådd i flowcytometriske analyser av leukocyttoverflatemarkører (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) i synoviale makrofager (SM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden utviklet her forbedrer tidligere teknikker for å isolere både SF fra murine artritt og residente makrofager fra en rekke organer 7,11. Den modifiserte metoden kan isolere både makrofager og fibroblaster fra inflammatorisk synovium med høy renhet, og den er enkel og reproduserbar. Siden metoden ikke krever komplekse instrumenter som en cellesortering, kan hvem som helst utføre den. I tillegg unngår den nåværende teknikken bekymringer forbundet med andre metoder, for eksempel fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som kan forårsake skade og stress i celler på grunn av behandling med antistoffer og de fysiske effektene forbundet med sortering12,13. De resulterende cellene kan brukes til undersøkelse med relativt få unødvendige ytre stimuli. Tidligere har in vitro-analyse av vevsbosatte makrofager fra synovium vært vanskelig, da antallet isolerte celler er lite, selv under artrittiske forhold hos mus. Denne metoden tillater utvidelse av SM under samkultur med SF, samt den tidligere metoden for makrofager fra lever, milt, lunge og hjerne11. I tillegg antyder qPCR-resultatet at bare en passasje av SF tillater et høyt nok renhetsnivå (figur 3B), selv om en tidligere metode for å isolere SF krevde minst tre passasjer7. Mangelen på renhetskontroll av SF ved flowcytometriske analyser er en begrensning ved denne studien. Metoden gir imidlertid også en fordel ved at SF kan brukes med færre passasjer.
Det kritiske trinnet for å isolere synoviale celler med høy renhet er å unngå forurensning av bakterier og / eller benmargsavledede celler. Desinfiserte mus skal håndteres med sterile verktøy. Spesielt bør isolerte ankelprøver inneholde så lite hår som mulig. Hvis det er mye hår i prøvene, bør økt vask (trinn 3.1) utføres. Også bein hentet fra leddgikt er ofte sprø14; Dislokasjon av metatarsophalangeal leddene krever stor forsiktighet for å unngå brudd, og forurensning av benmarg-avledede celler ved et brudd ville forstyrre kvaliteten på synoviale celler. Hvis beinet er brukket, bør det ødelagte beinet fjernes umiddelbart.
En nylig enkeltcelle RNA-sekvensanalyse viste at flere underpopulasjoner av SM og SF er tilstede i synovium 5,15. I denne metoden kan bulkceller, inkludert heterogene underpopulasjoner, dyrkes. Generelt går heterogeniteten til cellene tapt under in vitro-forhold 16. Faktisk indikerte en tidligere RNA-sekvensanalyse at celler oppnådd ved denne metoden har flere egenskaper, inkludert noen underpopulasjoner når det gjelder et genuttrykksmønster, enn en bestemt egenskap for en underpopulasjon6. Dette antyder at celler oppnådd ved denne metoden kan ha noen egenskaper ved mikromiljøet i synovialvev. Derfor forventer denne teknikken å være nyttig som en ny tilnærming til å studere cellepopulasjoner i inflammatorisk leddgikt.
Siden utviklingen av hevelse etter eksperimentell artrittinduksjon generelt overvåkes i ankler 8,10,15, ble metoden for synovialcelleisolering fra bare ankelvev gitt her. Cellene oppnådd ved metodene utviklet her kan brukes med andre ledd som kne og / eller andre leddgikt modeller. Imidlertid kan renheten, celletallet og proliferativ kapasitet være forskjellig. Denne metoden kan også brukes til isolering av makrofager fra humant synovium; Det kreves imidlertid verifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker personalet ved Divisjon for medisinsk forskningsstøtte, Advanced Research Support Center (ADRES), og medlemmene av Divisjon for integrert patofysiologi, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, for deres tekniske assistanse og nyttig støtte. Denne studien ble delvis støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskudd JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (til NS) og JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (til YI); tilskudd fra Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (til NS); og et Takeda Science Foundation Medical Research Grant, UCB Japan (UCBJ) prosjektstipend, og JSBMR Frontier Scientist grant 2019 (til YI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B.
- McInnes, I. B., Schett, G.
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
