Summary
המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול שונה לבידוד מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית מורין.
Abstract
דלקת מפרקים שגרונית היא מחלה אוטואימונית המובילה לדלקת כרונית של המפרקים. מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים סינוביאליים ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של דלקת מפרקים שגרונית. חשוב להבין את תפקידיהן של שתי אוכלוסיות התאים כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות פתולוגית והפוגה בדלקת מפרקים דלקתית. באופן כללי, תנאי ניסוי חוץ גופיים צריכים לחקות את הסביבה in vivo ככל האפשר. תאים ראשוניים שמקורם ברקמה שימשו בניסויים המאפיינים פיברובלסטים סינוביאליים בדלקת פרקים. לעומת זאת, בניסויים שחקרו את התפקודים הביולוגיים של מקרופאגים בדלקת מפרקים דלקתית, נעשה שימוש בקווי תאים, מקרופאגים שמקורם במח עצם ומקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם. עם זאת, לא ברור אם מקרופאגים כאלה אכן משקפים את תפקודם של מקרופאגים שוכני רקמות. כדי להשיג מקרופאגים מקומיים, פרוטוקולים קודמים שונו כדי לבודד ולהרחיב הן מקרופאגים ראשוניים והן פיברובלסטים מרקמה סינוביאלית במודל עכבר של דלקת מפרקים דלקתית. תאים סינוביאליים ראשוניים אלה עשויים להיות שימושיים לניתוח חוץ גופי של דלקת מפרקים דלקתית.
Introduction
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בהיפרפלזיה של הסינוביום, המובילה להרס מפרקים 1,2. מקרופאגים ופיברובלסטים שומרי רקמות נמצאים בסינוביום בריא כדי לשמור על הומאוסטזיס משותף. בחולי RA, פיברובלסטים סינוביאליים (SFs) מתרבים, ותאים חיסוניים, כולל מונוציטים, מסתננים לתוך סינוביום ונוזל המפרקים, תהליכים הקשורים לדלקת 1,3,4. מקרופאגים סינוביאליים (SMs), הכוללים מקרופאגים תושבים ומקרופאגים היקפיים שמקורם במונוציטים בדם, ו-SFs מופעלים באופן חריג ויש להם תפקידים חשובים בפתוגנזה של RA. מחקרים אחרונים הראו כי אינטראקציות תא-תא בין SMs ו- SFs תורמות הן להחמרה והן להפוגה של RA 5,6.
כדי להבין את הפתוגנזה של RA, נעשה שימוש במספר מודלים של מכרסמים של דלקת מפרקים דלקתית, כולל דלקת מפרקים בנסיוב K/BxN, דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. בדיקות מבוססות תאים נדרשות בדרך כלל כדי להבהיר פונקציות מולקולריות בדלקת פרקים. לכן, תאים ראשוניים ממודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים בודדו. השיטה לבידוד SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין מבוססת היטב, ותאים אלה תרמו להבהרת מנגנונים מולקולריים בפתוגנזה של דלקת פרקים 7,8. מצד שני, מקרופאגים שמקורם במח עצם, מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם וקווי תאי מקרופאגים שימשו לעתים קרובות כמשאבי מקרופאגים למחקרי דלקת פרקים 9,10. מאחר שמקרופאגים יכולים לרכוש תפקודים הקשורים למיקרו-סביבה שלהם, מקורות כלליים של מקרופאגים עשויים להיות חסרים תגובות ספציפיות לרקמת דלקת פרקים. בנוסף, קשה להשיג מספיק תאים סינוביאליים על ידי מיון, כמו סינוביום murine היא רקמה קטנה מאוד אפילו מודלים דלקת פרקים. חוסר השימוש במקרופאגים סינוביאליים למחקרי מבחנה היווה מגבלה במחקרי דלקת פרקים. הקמת פרוטוקול לבידוד והרחבה של מקרופאגים סינוביאליים תהווה יתרון להבהרת מנגנונים פתולוגיים ב- RA.
בשיטה הקודמת לבידוד SFs, SMs הושלכו7. מלבד זאת, דווח על שיטה לבודד ולהרחיב מקרופאגים מקומיים מאיברים מסוימים11. לכן, פרוטוקולים קיימים שונו בשילוב. השינוי נועד להשיג את התרבות העיקרית של SMs ו- SFs עם טוהר גבוה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד ולהרחיב הן SMs והן SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת Ehime ובוצעו בהתאם להנחיות אוניברסיטת Ehime לניסויים בבעלי חיים (37A1-1*16).
1. הכנת מכשירים, ריאגנטים ומדיום תרבית
- הכינו את מדיום התרבית באופן הבא: השלימו את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (אנטי-אנטי).
- הכן את מדיום העיכול כדלקמן: להשלים את המדיום תרבית עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase סוג IV. יש להתאים את ריכוז ה-collagenase ממש לפני השימוש.
- יש לדלל קולגן מסוג I-C לריכוז של 0.15 מ"ג/מ"ל בתמיסת HCl של 1 mM. הציפו את כלי התרבית (בקוטר של 40 או 60 מ"מ) בתמיסת הקולגן המדוללת. לאחר 6-12 שעות בטמפרטורת החדר, מוציאים את תמיסת הקולגן מהכלים ומייבשים בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את הכלים המצופים בקולגן בטמפרטורת החדר למשך שבוע אחד לפחות. יש לשטוף את הכלים המצופים מראש במי מלח חוצצים פוספט (PBS) או בינוני לפני השימוש.
- הכינו כלי ניתוח סטריליים, כגון מספריים, פינצטה עם קצוות משוננים ופינצטה עדינה. יש להשרות 70% אתנול לפני השימוש.
2. הכנת רקמת סינוביטיס בעכברים ( איור 1A)
- הכינו עכבר עם דלקת מפרקים דלקתית בכפות האחוריות.
הערה: נקבות עכברי C57BL/6 (18-20 גרם), 7-8 שבועות לאחר הלידה, עם דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן (CAIA) או דלקת מפרקים בהעברת סרום K/BxN (STA) שימשו לפרוטוקול זה8. בידוד SMs מרקמה לא נפוחה (כלומר, בריאה) עשוי להיות קשה, כמו מספר התאים אינו מספיק. - מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-16 מ"ג/ק"ג קסילזין. נקו את העכברים עם 70% אתנול.
- פתח את אזור החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב. חותכים את האפרכסת הימנית של הלב עם מספריים, ולאחר מכן תוקעים מחט פרפר 23 G לחדר השמאלי דרך קודקוד הלב, ואחריו ריפלוקס של 15-20 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות מזרק כדי להסיר באופן ידני דם היקפי (כ 1 מ"ל / 2 שניות).
- נטרלו את הכפות האחוריות על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים ומשיכת העור באמצעות פינצטה עם קצוות משוננים.
הערה: לאחר שלב זה, מומלץ להשתמש בפינצטה לטיפול בדגימות. אין לגעת ברקמה מעוטרת באצבעות, כדי למנוע חיבור של שיער מורין. - נקע את המפרקים metatarsophalangeal על ידי משיכה, ואחריו חיתוך הרצועות של המפרקים באמצעות מספריים כדי להסיר את הבהונות.
- חותכים את הגידים של שרירי הרגליים התחתונות ליד הקרסול באמצעות מספריים. אחזו בגיד בפינצטה וקילפו את השרירים בסמיכות ברגל התחתונה כדי לחשוף את השוקה. הסר את הפיבולה.
- נקע את מפרק הברך על ידי משיכה, ולאחר מכן חיתוך רצועות המפרקים באמצעות מספריים כדי לנתק את השוקה עם הכף האחורית הנפוחה. שמור את הדגימות בתרבית קרה כקרח בינונית (0.3 מ"ל/ס"מ2) עד לעיבוד לשלב 3.1.
3. עיכול רקמת סינוביטיס ( איור 1B)
- שאפו את מדיום התרבית, הימנעו מהדגימה, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי (0.3 מ"ל/ס"מ2). חזרו על תהליך הכביסה שלוש או ארבע פעמים.
הערה: משלב זה, הטיפול בדגימות צריך להתבצע באופן אספטי בספסל נקי או בארון בטיחות. - נקע את כל מפרקי הדגימות על ידי משיכה באמצעות פינצטה עדינה בתווך התרבית תחת סטריאומיקרוסקופ (בהגדלה של פי 10-20). פינצטה עדינה נוחה בשלב זה. הסירו את השוקה וכמה שיותר כלי דם, גידים ורצועות. היזהר לא לשבור את העצמות בעת פריקה.
- הכינו שתי שפופרות של 15 מ"ל לדגימה. מעבירים את העצמות המנותקות עם רקמות רכות לצינור הראשון של 15 מ"ל באמצעות פינצטה. הוסף 4 מ"ל של מדיום העיכול לכל דגימה, המתקבל משתי הכפות האחוריות, לתוך הצינור.
- כדי לאסוף תאים שיוריים ושברי רקמות, להעביר את המדיום שבו הדגימה נכללה לצינור השני 15 מ"ל. צנטריפוגה את המדיום ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, resuspend את הגלולה עם 1 מ"ל של מדיום העיכול ולהעביר את תמיסת התא ואת מקטע הרקמה לצינור הראשון 15 מ"ל המכיל כמעט את כל הרקמה (סה"כ 5 מ"ל של עיכול בינוני / כפות אחוריות).
- לעכל את הדגימה במשך 60-120 דקות ב 37 ° C עם ניעור בתנור היברידי.
הערה: יש להחליט על הזמן האופטימלי לעיכול הדגימות. הזמן תלוי במידת הנפיחות בקרסוליים ובקולגנאזות. ברוב המקרים, 60-120 דקות מספיק. לאחר 60 דקות של דגירה, לאסוף חלק מהדגימה מעוכל על ידי pipetting, ולצפות תחת מיקרוסקופ. אם העיכול אינו מספיק, הדגירה צריכה להמשיך, ואת העיכול נבדק כל 30 דקות. - מפטפט היטב את הפתרון. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים (גודל נקבוביות 40 מיקרומטר) לצינור של 50 מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית לצינור 50 מ"ל דרך מסננת התא. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 10 מ"ל של מדיום תרבות. חזור על הצנטריפוגה. לאחר הסרת supernatant, resuspend עם 2 מ"ל של מדיום תרבות.
איור 1: הליך הדגימה של רקמת דלקת מפרקים מורין ועיכול קולגנאז . (A) (i) כף אחורית מורין עם דלקת מפרקים דלקתית. (ii) הסרת העור בכפה האחורית. (iii) נקע של המפרקים metatarsophalangeal והסרת הבהונות. (4) חיתוך הגידים בקרסול. (v) הסרת השרירים ברגליים התחתונות. (vi) נקע של מפרק הברך. (ב) שמאל; רגליים נכרתו במדיום התרבות. ימין; נקע tarsus ו metatarsus במדיום תרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
4. בידוד של פיברובלסטים סינוביאליים ( איור 2A)
- זרעו את כל מתלי התאים המתקבלים משני הקרסוליים על צלחת מצופה קולגן.
הערה: אם משתמשים בקרסוליים עם נפיחות חלשה או בינונית כדי להשיג את התאים, מוחלים צלחת בקוטר 40 מ"מ. ניתן לשנות את גודל הכלי המצופה בקולגן לצלחת בקוטר 60 מ"מ אם לשני הקרסוליים יש נפיחות חמורה. - מוסיפים מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ2). יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C (75 °F) באווירה לחה עם 5% CO2.
- אסוף תאים שאינם דבקים באמצעות פיפט (השתמש בשלב 5.1). שוטפים את הכלי המצופה בקולגן במדיום תרבית ואוספים את המדיום. תרבית את התאים הדבקים בתווך טרי (איור 2B,i). רוב התאים שנצמדים במהירות לצלחת מצופה הקולגן מציגים מורפולוגיה פיברובלסטואידית (בצורת ציר).
- מעבר תאים תת-משתלבים על ידי טיפול ב-0.05% טריפסין בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS). בשיטה זו, הזיהום של תאים אחרים מוגבל, גם אם בהרחבה הראשונית. אם נדרשים תאים מטוהרים יותר דמויי פיברובלסט, בצע מעברים חוזרים ונשנים כדי לאפשר שיפור של טוהר; אולם נצפתה גם התרחבות הציטופלסמה של התאים בהידבקות (איור 2B,ii). מכיוון שמעברים מוגזמים משפיעים על אובדן תכונות נאיביות בתאים, השתמשו בתאים עם פחות מ-5 מעברים.
5. בידוד מקרופאגים סינוביאליים ( איור 2A)
- זרעו את כל התאים שאינם נדבקים משלב 4.4 על צלחות (קוטר של 40 או 60 מ"מ) שלא צופו בקולגן.
הערה: תאים שאינם דבקים כוללים מקרופאגים, לימפוציטים אחרים ושאריות פיברובלסטים מרקמת סינוביטיס. - תרבית את התאים בתפזורת במשך יום אחד ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
- כדי להסיר לימפוציטים שאינם דבקים, לשאוף את המדיום בתרבית, ולאחר מכן להוסיף מדיום תרבית טרי. חזרו על התהליך הזה פעמיים או שלוש (איור 2B,iii).
- תרבית את התאים הדבקים בתפזורת במשך שבוע-שבועיים בתווך התרבית, עם שינויים בינוניים כל יומיים תוך שמירה על מפגש (איור 2B,iv).
הערה: מספר הודעות SM גדל לאט בתנאי תרבות משותפת עם SFs. לפיכך, יש להתאים את תקופת התרבות המשותפת לפי הצורך. - יש לשטוף עם PBS או HBSS פעמיים. יש לטפל עם 0.05% טריפסין ב-HBSS (כ-55 מיקרוליטר/ס"מ 2) למשך 3 דקות ב-37°C באווירה לחה עם 5% CO2. פיברובלסטים מתנתקים בקלות מצלחת התרבית על ידי טיפול בטריפסין, ומקרופאגים מפגינים עמידות לטיפול בטריפסין. השתמש במאפיין זה לבחירת מקרופאגים סינוביאליים.
- יש להוסיף מדיום תרבית (כ-222 מיקרוליטר/ס"מ2) בעדינות ל-0.05% טריפסין ב-HBSS. לאחר שלב זה, אין לשפוך את המדיום ישירות על התאים.
- כדי להסיר תאים מנותקים, שאפו את המדיום התרבית, ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית טרי בעדינות. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש. שמרו את התאים הנותרים על הצלחת בתרבית טרייה עד לשימוש (איור 2B,v).
הערה: לאחר טיפול בטריפסין, תאים דבקים מפגינים מאפיינים מורפולוגיים דמויי מקרופאגים.
איור 2: הפרדה של שברים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית. (A) סכימה של ההליך להפרדת תאים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים מרקמת דלקת פרקים. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של שלבי ההליך, (i) עד (v) באיור 2A. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נקבות עכברי C57BL/6 בגיל 7-8 שבועות עברו דלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. תאים דמויי מקרופאגים ותאים דמויי פיברובלסטים בודדו באופן עצמאי מרקמת דלקת מפרקים דלקתית בהתאם להליך שתואר לעיל (איור 2A,B). תאים דמויי מקרופאגים שימשו מיד לאחר שלב 5.7. תאים דמויי פיברובלסטים גודלו בתחילה בתרבית לאחר שלב 4.4, ולאחר מכן עברו לצלחת תרבית חדשה ולאחר מכן נעשה בהם שימוש. כדי להעריך אם SMs ו- SFs בודדו בהצלחה, בוצעו הניסויים הבאים.
כדי להעריך את טוהר התאים המבודדים, ביטוי mRNA של סמני תאים שונים נותח על ידי RT-qPCR. Cd68, Emr1, Itgam ו-Csf1r שימשו כסמני פאן-מקרופאגים, ו-Cdh11, Col6a1, Csf1 ו-Vcam1 שימשו כסמני SF. Rplp0 שימש כגן ייחוס 6,8. כל גני הסמנים נורמלו על ידי ביטוי Rplp0. שני הסמנים מסוג התא נותחו בתאים דמויי מקרופאגים, ותאים דמויי פיברובלסטים התקבלו מרקמת דלקת פרקים. סמני SF בוטאו בתאים דמויי פיברובלסטים וסמנים של פאן-מקרופאגים בוטאו בתאים דמויי מקרופאגים, מה שמרמז על כך ששברים עשירים במקרופאגים ועשירים בפיברובלסטים בודדו מרקמת סינוביטיס, בהתאמה (איור 3A,B).
כדי לקבוע את טוהר המקרופאגים, סמני חלבון פני השטח עבור מקרופאגים וסוגי תאים אחרים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. F4/80 ו-CD11b שימשו לסמני מקרופאגים, Ly6G לסמן נויטרופילים, ו-CD3 לסמן תא T6. אסטרטגיית הגאטינג שימשה כפי שהוצג קודם לכן6. יותר מ-90% מהתאים ביטאו CD45, CD11b ו-F4/80, בעוד שהביטוי של Ly6G ו-CD3 היה נמוך מ-1% (איור 4).
איור 3: ביטוי mRNA של סמנים ספציפיים לסוג התא. (A) ביטוי mRNA של סמני פאן-מקרופאגים (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) במקרופאגים סינוביאליים (SMs) ובפיברובלסטים סינוביאליים (SFs) על-ידי RT-qPCR (n = 4). (B) רמות ביטוי של סמני SF (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) ב-SMs וב-SFs (n = 4). הנתונים מוצגים כממוצעים ± SD. ** מציין p < 0.01 על ידי מבחן t לא מזווג. הנתונים התקבלו מארבעה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי חלבון ספציפי לפני השטח של התא. היסטוגרמות מייצגות המתקבלות באנליזות ציטומטריות זרימה של סמני פני שטח של לויקוציטים (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) במקרופאגים סינוביאליים (SMs). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו שפותחה כאן משפרת טכניקות קודמות לבידוד הן SFs מדלקת מפרקים מורין והן מקרופאגים תושבים ממספר איברים 7,11. השיטה המתוקנת יכולה לבודד הן מקרופאגים והן פיברובלסטים מסינוביום דלקתי עם טוהר גבוה, והיא פשוטה וניתנת לשחזור. מכיוון שהשיטה אינה דורשת מכשירים מורכבים כגון ממיין תאים, כל אחד יכול לבצע אותה. בנוסף, הטכניקה הנוכחית מונעת חששות הקשורים לשיטות אחרות, כגון מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) אשר עלולים לגרום נזק ולחץ בתאים עקב טיפול בנוגדנים וההשפעות הפיזיות הקשורות למיון12,13. התאים המתקבלים יכולים לשמש לחקירה עם מעט גירויים חיצוניים מיותרים יחסית. בעבר, ניתוח במבחנה של מקרופאגים שוכני רקמות מהסינוביום היה קשה, מכיוון שמספר התאים שבודדו הוא קטן, אפילו בתנאי דלקת פרקים בעכברים. שיטה זו מאפשרת הרחבה של SMs תחת תרבית משותפת עם SFs, כמו גם את השיטה הקודמת עבור מקרופאגים מהכבד, הטחול, הריאות והמוח11. בנוסף, תוצאת qPCR מצביעה על כך שרק מעבר אחד של SFs מאפשר רמה גבוהה מספיק של טוהר (איור 3B), אף על פי ששיטה קודמת לבידוד SFs דרשה לפחות שלושה מעברים7. היעדר בדיקת טוהר של SFs על ידי ניתוחים ציטומטריים של זרימה הוא מגבלה של מחקר זה. עם זאת, השיטה מספקת גם יתרון בכך שניתן להשתמש ב- SFs עם פחות מעברים.
השלב הקריטי לבידוד תאים סינוביאליים בעלי טוהר גבוה הוא למנוע זיהום של חיידקים ו/או תאים שמקורם במח עצם. עכברים מחוטאים צריכים להיות מנוהלים עם כלים סטריליים. בפרט, דגימות קרסול מבודדות צריכות להכיל כמה שפחות שיער. אם הרבה שיער קיים בדגימות, יש לבצע שטיפה מוגברת (שלב 3.1). כמו כן, עצמות המתקבלות מדלקת פרקים הן לעתים קרובות שבירות14; נקע של המפרקים metatarsophalangeal דורש זהירות רבה כדי למנוע שבר, וזיהום של תאים שמקורם מח עצם על ידי שבר יפריע את איכות התאים הסינוביאליים. אם העצם שבורה, יש להסיר את העצם השבורה מיד.
ניתוח רצף רנ"א חד-תאי שנערך לאחרונה גילה כי מספר תת-אוכלוסיות של SMs ו-SFs נמצאות בסינוביום 5,15. בשיטה זו ניתן לגדל תאים בתפזורת, כולל תת-אוכלוסיות הטרוגניות. באופן כללי, ההטרוגניות של התאים אובדת בתנאי מבחנה 16. ואכן, ניתוח קודם של רצפי רנ"א הצביע על כך שלתאים המתקבלים בשיטה זו יש יותר מאפיינים, כולל כמה תת-אוכלוסיות במונחים של דפוס ביטוי גנים, מאשר מאפיין מסוים של תת-אוכלוסייה6. זה מצביע על כך תאים המתקבלים בשיטה זו עשויים להיות כמה מאפיינים של microenvironment של רקמה סינוביאלית. לכן, טכניקה זו צופה להיות שימושית כגישה חדשה לחקר אוכלוסיות תאים בדלקת מפרקים דלקתית.
מכיוון שהתפתחות נפיחות לאחר השראת דלקת פרקים ניסיונית מנוטרת בדרך כלל בקרסוליים 8,10,15, השיטה של בידוד תאים סינוביאליים מרקמות הקרסול בלבד סופקה כאן. התאים המתקבלים על ידי השיטות שפותחו כאן יכולים לשמש עם מפרקים אחרים כגון הברך ו / או מודלים אחרים של דלקת פרקים. עם זאת, הטוהר, מספר התאים ויכולת ההתרבות עשויים להיות שונים. שיטה זו יכולה לשמש גם לבידוד מקרופאגים מהסינוביום האנושי; עם זאת, נדרש אימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לצוות האגף לתמיכה במחקר רפואי, למרכז התמיכה במחקר מתקדם (ADRES), ולחברי החטיבה לפתופיזיולוגיה אינטגרטיבית, מרכז פרוטאו-מדע (PROS), אוניברסיטת אהימה (Ehime), על עזרתם הטכנית ותמיכתם המועילה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקי KAKENHI JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (ל- NS) ו- JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (ל- YI); מענקים מקרן המחקר הרפואי של אוסקה למחלות עקשניות, קרן נקטומי, האגודה היפנית לחקר עצמות ומינרלים (JSBMR) מענק כוכבים עולים, קרן סומיטומו, קרן המחקר הרפואי SENSHIN, קרן הזיכרון מוצ'ידה (ל- NS); ומענק מחקר רפואי של קרן המדע טקדה, מענק פרויקט UCB יפן (UCBJ) ומענק JSBMR Frontier Scientist לשנת 2019 (ל-YI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B.
- McInnes, I. B., Schett, G.
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
