Summary
वर्तमान अध्ययन मुराइन भड़काऊ गठिया ऊतक से श्लेष मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
रूमेटोइड गठिया एक ऑटोइम्यून बीमारी है जो जोड़ों की पुरानी सूजन की ओर ले जाती है। संधिशोथ के रोगजनन में श्लेष मैक्रोफेज और श्लेष फाइब्रोब्लास्ट की केंद्रीय भूमिका है। भड़काऊ गठिया में पैथोलॉजिकल प्रगति और छूट के अंतर्निहित तंत्र को प्रकट करने के लिए दोनों सेल आबादी के कार्यों को समझना महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, इन विट्रो प्रयोगात्मक स्थितियों को जितना संभव हो सके विवो वातावरण की नकल करनी चाहिए। गठिया में श्लेष फाइब्रोब्लास्ट को चिह्नित करने वाले प्रयोगों में प्राथमिक ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग किया गया है। इसके विपरीत, भड़काऊ गठिया में मैक्रोफेज के जैविक कार्यों की जांच करने वाले प्रयोगों में, सेल लाइनें, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग किया गया है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या ऐसे मैक्रोफेज वास्तव में ऊतक-निवासी मैक्रोफेज के कार्यों को दर्शाते हैं। निवासी मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए, पिछले प्रोटोकॉल को एक भड़काऊ गठिया माउस मॉडल में श्लेष ऊतक से प्राथमिक मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट दोनों को अलग करने और विस्तारित करने के लिए संशोधित किया गया था। ये प्राथमिक श्लेष कोशिकाएं भड़काऊ गठिया के इन विट्रो विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकती हैं।
Introduction
रुमेटीइड गठिया (आरए) एक ऑटोइम्यून बीमारी है जो सिनोवियम के हाइपरप्लासिया की विशेषता है, जिससे संयुक्त विनाश 1,2 होता है। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट संयुक्त होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए स्वस्थ सिनोवियम में मौजूद होते हैं। आरए रोगियों में, श्लेष फाइब्रोब्लास्ट (एसएफ) का प्रसार होता है, और मोनोसाइट्स सहित प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनोवियम और संयुक्त तरल पदार्थ में घुसपैठ करती हैं, सूजन से जुड़ी प्रक्रियाएं 1,3,4। श्लेष मैक्रोफेज (एसएम), जिसमें निवासी मैक्रोफेज और परिधीय रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज शामिल हैं, और एसएफ असामान्य रूप से सक्रिय होते हैं और आरए रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल के अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एसएम और एसएफ के बीच सेल-सेल इंटरैक्शन आरए 5,6 के एक्ससेर्बेशन और छूट दोनों में योगदान देता है।
आरए रोगजनन को समझने के लिए, भड़काऊ गठिया के कई कृंतक मॉडल का उपयोग किया गया है, जिसमें के / बीएक्सएन सीरम ट्रांसफर गठिया, कोलेजन-प्रेरित गठिया और कोलेजन एंटीबॉडी-प्रेरित गठिया शामिल हैं। गठिया में आणविक कार्यों को स्पष्ट करने के लिए आमतौर पर सेल-आधारित परख की आवश्यकता होती है। इसलिए, गठिया के पशु मॉडल से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग किया गया है। म्यूरिन गठिया ऊतक से एसएफ को अलग करने की विधि अच्छी तरह से स्थापित है, और इन कोशिकाओं ने गठिया रोगजनन 7,8 में आणविक तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान दिया है। दूसरी ओर, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, और मैक्रोफेज सेल लाइनों को अक्सर गठिया अध्ययन 9,10 के लिए मैक्रोफेज संसाधनों के रूप में उपयोग किया जाता है। चूंकि मैक्रोफेज अपने माइक्रोएन्वायरमेंट से जुड़े कार्यों को प्राप्त कर सकते हैं, मैक्रोफेज के सामान्य स्रोतों में गठिया ऊतक के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की कमी हो सकती है। इसके अलावा, छंटाई करके पर्याप्त श्लेष कोशिकाओं को प्राप्त करना मुश्किल है, क्योंकि मुराइन सिनोवियम गठिया मॉडल में भी एक बहुत छोटा ऊतक है। इन विट्रो अध्ययनों के लिए श्लेष मैक्रोफेज के उपयोग की कमी गठिया अध्ययनों में एक सीमा रही है। श्लेष मैक्रोफेज को अलग करने और विस्तार ति करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना आरए में पैथोलॉजिकल तंत्र के स्पष्टीकरण के लिए एक लाभ होगा।
एसएफ को अलग करने की पिछली विधि में,एसएम को 7 छोड़ दिया गया था। इसके अलावा, कुछ अंगों से निवासी मैक्रोफेज को अलग करने और विस्तार ति करने की एकविधि की सूचना दी गई थी। इसलिए, मौजूदा प्रोटोकॉल संयोजन में संशोधित किए गए थे। संशोधन का उद्देश्य उच्च शुद्धता के साथ एसएम और एसएफ दोनों की प्राथमिक संस्कृति को प्राप्त करना है। इस विधि का समग्र लक्ष्य म्यूरिन गठिया ऊतक से एसएम और एसएफ दोनों को अलग और विस्तारित करना है।
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Protocol
जानवरों से जुड़े प्रयोगों को एहिम विश्वविद्यालय की पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु प्रयोगों के लिए एहिम विश्वविद्यालय दिशानिर्देशों (37 ए 1-1 * 16) के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।
1. उपकरणों, अभिकर्मकों और संस्कृति माध्यम की तैयारी
- संस्कृति माध्यम निम्नानुसार तैयार करें: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान (एंटी-एंटी) के साथ डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) को पूरक करें।
- पाचन माध्यम को निम्नानुसार तैयार करें: 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस टाइप IV के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करें। उपयोग करने से ठीक पहले कोलेजनेस एकाग्रता को समायोजित करें।
- टाइप आई-सी कोलेजन को 1 एमएम एचसीएल समाधान के साथ 0.15 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें। पतला कोलेजन समाधान के साथ फ्लड कल्चर व्यंजन (40 या 60 मिमी का व्यास)। कमरे के तापमान पर 6-12 घंटे के बाद, व्यंजन से कोलेजन समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर सुखाएं। कोलेजन-लेपित व्यंजन ों को कम से कम 1 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है। उपयोग से पहले फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) या माध्यम के साथ पूर्व-लेपित व्यंजन धोएं।
- बाँझ सर्जिकल उपकरण तैयार करें, जैसे कैंची, सेरेटेड टिप्स के साथ चिमटी, और फाइन-पॉइंट ट्वीज़र्स। उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल में भिगोएं।
2. चूहों में सिनोवाइटिस ऊतक की तैयारी ( चित्रा 1 ए)।
- पिछले पंजे में सूजन गठिया के साथ एक माउस तैयार करें।
नोट: महिला सी 57बीएल / 6 चूहों (18-20 ग्राम), 7-8 सप्ताह प्रसवोत्तर, कोलेजन एंटीबॉडी-प्रेरित गठिया (सीएआईए) या के / बीएक्सएन सीरम ट्रांसफर गठिया (एसटीए) के साथ इस प्रोटोकॉल8 के लिए उपयोग किया गया था। गैर-सूजन (यानी, स्वस्थ) ऊतक से एसएम को अलग करना मुश्किल हो सकता है, क्योंकि कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त है। - 80 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 16 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। चूहों को 70% इथेनॉल से साफ करें।
- दिल को उजागर करने के लिए कैंची से पेक्टोरल क्षेत्र को काट लें। कैंची से दिल के दाहिने ऑरिकल को काटें, और फिर दिल के शीर्ष के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में 23 ग्राम तितली सुई चिपकाएं, इसके बाद परिधीय रक्त (लगभग 1 एमएल / 2 एस) को मैन्युअल रूप से हटाने के लिए सिरिंज का उपयोग करके बाँझ पीबीएस के 15-20 एमएल का रिफ्लक्स करें।
- कैंची का उपयोग करके त्वचा को काटकर और सेरेटेड टिप्स के साथ चिमटी का उपयोग करके त्वचा को खींचकर पिछले पंजे को डीकॉर्टिकेट करें।
नोट: इस चरण के बाद, नमूनों की हैंडलिंग के लिए चिमटी के उपयोग की सिफारिश की जाती है। मुराइन बालों के लगाव से बचने के लिए, उंगलियों से डेकॉर्टिकेटेड ऊतक को न छुएं। - खींचने से मेटाटार्सोफेलांगल जोड़ों को विस्थापित करें, इसके बाद पैर की उंगलियों को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करके जोड़ों के स्नायुबंधन को काट दें।
- कैंची का उपयोग करके टखने के पास निचले पैर की मांसपेशियों के टेंडन को काट लें। चिमटी से कण्डरा को पकड़ें और टिबिया को उजागर करने के लिए निचले पैर में समीपस्थ रूप से मांसपेशियों को छीलें। फाइबुला को हटा दें।
- घुटने के जोड़ को खींचकर अलग करें, इसके बाद कैंची का उपयोग करके जोड़ों के स्नायुबंधन को काट दें ताकि टिबिया को सूजन वाले पिछले पंजे से अलग किया जा सके। नमूने को बर्फ-ठंडे संस्कृति माध्यम (0.3 एमएल / सेमी2) में रखें जब तक कि चरण 3.1 तक प्रसंस्करण न हो।
3. सिनोवाइटिस ऊतक का पाचन ( चित्रा 1 बी)
- नमूना से बचते हुए, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें, और फिर ताजा संस्कृति माध्यम (0.3 एमएल / सेमी2) जोड़ें। धोने की प्रक्रिया को तीन या चार बार दोहराएं।
नोट: इस कदम से, नमूनों की हैंडलिंग एक साफ बेंच या सुरक्षा कैबिनेट में सड़न रोकनेवाला रूप से की जानी चाहिए। - एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (10x-20x आवर्धन पर) के तहत संस्कृति माध्यम में फाइन-पॉइंट ट्वीज़र्स का उपयोग करके खींचकर नमूने के सभी जोड़ों को अलग करें। इस चरण में फाइन-पॉइंट ट्वीज़र्स सुविधाजनक हैं। टिबिया और जितना संभव हो उतने वाहिकाओं, टेंडन और स्नायुबंधन को हटा दें। ध्यान रखें कि विस्थापित होने पर हड्डियां न टूटें।
- प्रति नमूना दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें। चिमटी का उपयोग करके नरम ऊतकों के साथ अव्यवस्थित हड्डियों को पहले 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में दोनों पिछले पंजे से प्राप्त प्रति नमूना 4 मिलीलीटर पाचन माध्यम जोड़ें।
- अवशिष्ट कोशिकाओं और ऊतक के टुकड़ों को इकट्ठा करने के लिए, उस माध्यम को स्थानांतरित करें जिसमें नमूना दूसरे 15 एमएल ट्यूब में निहित था। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर मध्यम को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, 1 मिलीलीटर पाचन माध्यम के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और कोशिका और ऊतक के टुकड़े के समाधान को पहले 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें लगभग सभी ऊतक (पाचन माध्यम / पिछले पंजे का कुल 5 एमएल) होता है।
- संकरण ओवन में हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 60-120 मिनट के लिए नमूने को पचाएं।
नोट: नमूने को पचाने के लिए इष्टतम समय तय किया जाना चाहिए। समय टखनों और कोलेजनेस में सूजन की डिग्री पर निर्भर है। ज्यादातर मामलों में, 60-120 मिनट पर्याप्त है। इनक्यूबेशन के 60 मिनट के बाद, पाइपिंग द्वारा पचे हुए नमूने का एक हिस्सा एकत्र करें, और माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें। यदि पाचन अपर्याप्त है, तो इनक्यूबेशन जारी रहना चाहिए, और हर 30 मिनट में पाचन की जांच की जानी चाहिए। - घोल को अच्छी तरह से पीस लें। सेल स्ट्रेन (40 μm पोर आकार) के माध्यम से सेल समाधान को 50 mL ट्यूब में फ़िल्टर करें।
- सेल छन्नी के माध्यम से 50 एमएल ट्यूब में 10 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनैटेंट को हटाने के बाद, 10 एमएल कल्चर माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। सुपरनैटेंट को हटाने के बाद, 2 एमएल कल्चर माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें।
चित्रा 1: मुराइन गठिया ऊतक और कोलेजनेस पाचन के नमूने की प्रक्रिया । (ए) (i) सूजन गठिया के साथ मुराइन हिंद पंजा। (ii) पिछले पंजे की त्वचा को हटाना। (iii) मेटाटार्सोफेलांगल जोड़ों का अव्यवस्था और पैर की उंगलियों को हटाना। (iv) टखने में टेंडन का काटना। (v) निचले पैरों की मांसपेशियों को हटाना। (vi) घुटने के जोड़ का अस्त-व्यस्त होना। (बी) बाएं; संस्कृति माध्यम में उत्पादित पैर। दाएँ; संस्कृति माध्यम में टार्सस और मेटाटार्सस को स्थानांतरित करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. श्लेष फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव ( चित्रा 2 ए)।
- कोलेजन-लेपित डिश पर दोनों टखनों से प्राप्त सभी सेल निलंबन को बीज दें।
नोट: यदि कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कमजोर या मध्यम सूजन वाले टखनों का उपयोग किया जाता है, तो 40 मिमी व्यास का डिश लागू किया जाता है। कोलेजन-लेपित डिश के आकार को 60 मिमी व्यास के डिश में बदला जा सकता है यदि दोनों टखनों में गंभीर सूजन है। - संस्कृति माध्यम जोड़ें (लगभग 222 μL/cm2). 5%CO2 के साथ एक ह्यूमिडिफ़ाइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- एक पिपेट का उपयोग करके गैर-अनुयायी कोशिकाओं को इकट्ठा करें (चरण 5.1 में उपयोग करें)। कोलेजन-लेपित पकवान को संस्कृति माध्यम से धोएं और माध्यम एकत्र करें। ताजा माध्यम में अनुयायी कोशिकाओं को कल्चर करें (चित्रा 2 बी, आई)। अधिकांश कोशिकाएं जो कोलेजन-लेपित डिश का जल्दी से पालन करती हैं, एक फाइब्रोब्लास्टॉइड (स्पिंडल के आकार की) आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती हैं।
- हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 0.05% ट्रिप्सिन के साथ उपचार द्वारा उप-कंफ्लुएंट कोशिकाओं को पारित करें। इस विधि में, अन्य कोशिकाओं का संदूषण सीमित है, भले ही प्रारंभिक विस्तार में। यदि अधिक शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, तो शुद्धता को बढ़ाने की अनुमति देने के लिए बार-बार पासिंग करें; हालांकि, आसंजन में कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म का विस्तार भी देखा जाता है (चित्रा 2 बी, ii)। चूंकि अत्यधिक मार्ग कोशिकाओं में भोली विशेषताओं के नुकसान को प्रभावित करते हैं, इसलिए 5 से कम मार्ग वाली कोशिकाओं का उपयोग करें।
5. श्लेष मैक्रोफेज का अलगाव ( चित्रा 2 ए)।
- उन व्यंजनों (40 या 60 मिमी के व्यास) पर चरण 4.4 से सभी गैर-अनुयायी कोशिकाओं को बीज दें जिन्हें कोलेजन के साथ लेपित नहीं किया गया है।
नोट: गैर-अनुयायी कोशिकाओं में मैक्रोफेज, अन्य लिम्फोसाइट्स और सिनोवाइटिस ऊतक से अवशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं। - 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफ़ाइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए थोक कोशिकाओं को कल्चर करें।
- गैर-अनुयायी लिम्फोसाइटों को हटाने के लिए, सुसंस्कृत माध्यम को एस्पिरेट करें, और फिर ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। इस प्रक्रिया को दो या तीन बार दोहराएं (चित्रा 2 बी, iii)।
- संस्कृति माध्यम में 1-2 सप्ताह के लिए अनुयायी थोक कोशिकाओं को कल्चर करें, संगम बनाए रखते हुए हर 2 दिनों में मध्यम परिवर्तन के साथ (चित्रा 2 बी, iv)।
नोट: एसएफ के साथ सह-संस्कृति स्थितियों के तहत एसएम की संख्या धीरे-धीरे बढ़ती है। इस प्रकार, सह-संस्कृति अवधि को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जाना चाहिए। - पीबीएस या एचबीएसएस से दो बार धोएं। एचबीएसएस में 0.05% ट्रिप्सिन (लगभग 55 μL / cm2) के साथ 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5%CO2 के साथ एक ह्यूमिडिफ़ाइड वातावरण में इलाज करें। फाइब्रोब्लास्ट आसानी से ट्रिप्सिन उपचार द्वारा कल्चर डिश से अलग हो जाते हैं, और मैक्रोफेज ट्रिप्सिन उपचार के प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं। श्लेष मैक्रोफेज के चयन के लिए इस गुण का उपयोग करें।
- एचबीएसएस में 0.05% ट्रिप्सिन के लिए धीरे से संस्कृति माध्यम (लगभग 222 μL /cm2) जोड़ें। इस चरण के बाद, माध्यम को सीधे कोशिकाओं पर न डालें।
- अलग की गई कोशिकाओं को हटाने के लिए, सुसंस्कृत माध्यम को एस्पिरेट करें, और फिर धीरे से ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। इस प्रक्रिया को दो या तीन बार दोहराएं। उपयोग तक ताजा संस्कृति माध्यम में पकवान पर शेष कोशिकाओं को बनाए रखें (चित्रा 2 बी, वी)।
नोट: ट्रिप्सिन उपचार के बाद, अनुयायी कोशिकाएं मैक्रोफेज जैसी रूपात्मक विशेषताओं का प्रदर्शन करती हैं।
चित्रा 2: भड़काऊ गठिया ऊतक से मैक्रोफेज-समृद्ध और फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध अंशों का पृथक्करण। (ए) गठिया ऊतक से मैक्रोफेज-समृद्ध और फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रक्रिया की स्कीमा। (बी) चित्रा 2 ए में प्रक्रिया के चरणों के प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट चित्र, (i) से (v) तक। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Representative Results
7-8 सप्ताह की उम्र में मादा सी 57बीएल /6 चूहों को कोलेजन एंटीबॉडी-प्रेरित गठिया से गुजरना पड़ा। मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को ऊपर वर्णित प्रक्रिया के अनुसार भड़काऊ गठिया ऊतक से स्वतंत्र रूप से अलग किया गया था (चित्रा 2 ए, बी)। मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को तुरंत चरण 5.7 के बाद उपयोग किया गया था। फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को शुरू में चरण 4.4 के बाद उप-कंफ्लुएंट होने के लिए सुसंस्कृत किया गया था, और फिर उपयोग के बाद एक नई संस्कृति डिश में पारित किया गया था। यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या एसएम और एसएफ को सफलतापूर्वक अलग किया गया था, निम्नलिखित प्रयोग किए गए थे।
पृथक कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करने के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा विभिन्न सेल मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। सीडी 68, ईएमआर 1, इटगम और सीएसएफ 1 आर का उपयोग पैन-मैक्रोफेज मार्कर के रूप में किया गया था, और सीडीएच 11, कोल 6 ए 1, सीएसएफ 1, और वीकैम 1 का उपयोग एसएफ मार्कर के रूप में किया गया था। आरपीएलपी 0 का उपयोग संदर्भ जीन 6,8 के रूप में किया गया था। सभी मार्कर जीन ों को आरपीएलपी 0 अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में दोनों सेल-प्रकार मार्करों का विश्लेषण किया गया था, और फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को गठिया ऊतक से प्राप्त किया गया था। एसएफ मार्करों को फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था और पैन-मैक्रोफेज मार्करों को मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि मैक्रोफेज-समृद्ध और फाइब्रोब्लास्ट-समृद्ध अंश क्रमशः सिनोवाइटिस ऊतक से अलग थे (चित्रा 3 ए, बी)।
मैक्रोफेज की शुद्धता स्थापित करने के लिए, मैक्रोफेज और अन्य सेल प्रकारों के लिए सतह प्रोटीन मार्करों का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। एफ 4/80 और सीडी 11 बी का उपयोग मैक्रोफेज मार्करों के लिए, एलवाई 6 जी का उपयोग न्यूट्रोफिल मार्कर के लिए और सीडी 3 का उपयोग टी सेल मार्कर6 के लिए किया गया था। गेटिंग रणनीति का उपयोग पहले दिखाए गए6 के रूप में किया गया था। 90% से अधिक कोशिकाओं ने CD45, CD11b और F4/80 व्यक्त किए, जबकि Ly6G और CD3 की अभिव्यक्ति 1% से कम थी (चित्रा 4)।
चित्रा 3: सेल-प्रकार विशिष्ट मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति। (ए) आरटी-क्यूपीसीआर (एन = 4) द्वारा श्लेष मैक्रोफेज (एसएम) और श्लेष फाइब्रोब्लास्ट (एसएफ) में पैन-मैक्रोफेज मार्करों (सीडी 68, ईएमआर 1, इटगम, सीएसएफ 1 आर) की एमआरएनए अभिव्यक्ति। (बी) एसएम और एसएफ (एन = 4) में एसएफ मार्करों (सीडीएच 11, कोल 6 ए 1, सीएसएफ 1, वीकैम 1) के अभिव्यक्ति स्तर। डेटा को एसडी ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ** एक अप्रकाशित टी-टेस्ट द्वारा पी < 0.01 को इंगित करता है। डेटा चार स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: सेल-प्रकार विशिष्ट सेल सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति। श्लेष मैक्रोफेज (एसएम) में ल्यूकोसाइट सतह मार्करों (सीडी 45, सीडी 11 बी, एफ 4/80, एलवाई 6 जी, सीडी 3) के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण में प्राप्त प्रतिनिधि हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां विकसित यह विधि कई अंगों से मुराइन गठिया और निवासी मैक्रोफेज दोनों एसएफ को अलग करने के लिए पिछली तकनीकों मेंसुधार करती है। संशोधित विधि मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट दोनों को उच्च शुद्धता के साथ भड़काऊ सिनोवियम से अलग कर सकती है, और यह सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। चूंकि विधि को सेल सॉर्टर जैसे जटिल उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए कोई भी इसका संचालन कर सकता है। इसके अलावा, वर्तमान तकनीक अन्य तरीकों से जुड़ी चिंताओं से बचती है, जैसे कि प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) जो एंटीबॉडी के साथ उपचार के कारण कोशिकाओं में क्षति और तनाव को प्रेरित कर सकते हैं और छंटाई से जुड़े भौतिक प्रभाव12,13 हैं। परिणामी कोशिकाओं का उपयोग अपेक्षाकृत कुछ अनावश्यक बाहरी उत्तेजनाओं के साथ जांच के लिए किया जा सकता है। इससे पहले, सिनोवियम से ऊतक-निवासी मैक्रोफेज का इन विट्रो विश्लेषण मुश्किल रहा है, क्योंकि चूहों में गठिया की स्थिति में भी पृथक कोशिकाओं की संख्या छोटी है। यह विधि एसएफ के साथ सह-संस्कृति के तहत एसएम के विस्तार की अनुमति देती है, साथ ही यकृत, प्लीहा, फेफड़े और मस्तिष्क11 से मैक्रोफेज के लिए पिछली विधि भी। इसके अलावा, क्यूपीसीआर परिणाम से पता चलता है कि एसएफ का केवल एक मार्ग शुद्धता के उच्च स्तर की अनुमति देता है (चित्रा 3 बी), हालांकि एसएफ को अलग करने के लिए पिछली विधि में कम से कम तीन मार्ग7 की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा एसएफ की शुद्धता जांच की कमी इस अध्ययन की एक सीमा है। हालांकि, विधि एक लाभ भी प्रदान करती है कि एसएफ का उपयोग कम मार्ग के साथ किया जा सकता है।
उच्च शुद्धता के साथ श्लेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम बैक्टीरिया और / या अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं के संदूषण से बचना है। कीटाणुरहित चूहों को बाँझ उपकरणों के साथ प्रबंधित किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, पृथक टखने के नमूनों में जितना संभव हो उतना कम बाल होना चाहिए। यदि नमूनों में बहुत सारे बाल मौजूद हैं, तो बढ़ी हुई धुलाई (चरण 3.1) की जानी चाहिए। इसके अलावा, गठिया से प्राप्त हड्डियां अक्सर भंगुरहोती हैं14; फ्रैक्चर से बचने के लिए मेटाटार्सोफेलांगल जोड़ों के विस्थापन को बहुत देखभाल की आवश्यकता होती है, और फ्रैक्चर द्वारा अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं का संदूषण श्लेष कोशिकाओं की गुणवत्ता को बाधित करेगा। यदि हड्डी टूट गई है, तो टूटी हुई हड्डी को तुरंत हटा दिया जाना चाहिए।
हाल ही में एक एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रम विश्लेषण से पता चला है कि एसएम और एसएफ की कई उप-आबादी सिनोवियम 5,15 में मौजूद हैं। इस विधि में, विषम उप-आबादी सहित थोक कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, इन विट्रो स्थितियों16 के तहत कोशिकाओं की विषमता खो जाती है। दरअसल, एक पिछले आरएनए-अनुक्रम विश्लेषण ने संकेत दिया कि इस विधि द्वारा प्राप्त कोशिकाओं में अधिक विशेषताएं हैं, जिसमें उप-जनसंख्या6 की एक विशेष विशेषता की तुलना में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के संदर्भ में कुछ उप-आबादी शामिल हैं। इससे पता चलता है कि इस विधि द्वारा प्राप्त कोशिकाओं में श्लेष ऊतक के माइक्रोएन्वायरमेंट की कुछ विशेषताएं हो सकती हैं। इसलिए, यह तकनीक भड़काऊ गठिया में सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए एक नए दृष्टिकोण के रूप में उपयोगी होने की उम्मीद करती है।
चूंकि प्रयोगात्मक गठिया प्रेरण के बाद सूजन के विकास की निगरानी आमतौर पर टखनों 8,10,15 में की जाती है, इसलिए केवल टखने के ऊतकों से श्लेष कोशिका अलगाव की विधि यहां प्रदान की गई थी। यहां विकसित विधियों द्वारा प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग अन्य जोड़ों जैसे घुटने और / या अन्य गठिया मॉडल के साथ किया जा सकता है। हालांकि, शुद्धता, सेल संख्या और प्रोलिफेरेटिव क्षमता अलग हो सकती है। इस विधि का उपयोग मानव सिनोवियम से मैक्रोफेज के अलगाव के लिए भी किया जा सकता है; हालांकि, सत्यापन की आवश्यकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
लेखक मेडिकल रिसर्च सपोर्ट डिवीजन, एडवांस्ड रिसर्च सपोर्ट सेंटर (एडीआरईएस) और डिवीजन ऑफ इंटीग्रेटिव पैथोफिज़ियोलॉजी, प्रोटियो-साइंस सेंटर (प्रोस), एहिम विश्वविद्यालय के सदस्यों को उनकी तकनीकी सहायता और सहायक समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही अनुदान JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (एनएस को) और JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (वाईआई को) द्वारा समर्थित किया गया था; ओसाका मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन फॉर इनट्रैक्टेबल डिजीज, द नाकाटोमी फाउंडेशन, द जापानी सोसाइटी फॉर बोन एंड मिनरल रिसर्च (जेएसबीएमआर) राइजिंग स्टार्स ग्रांट, द सुमितोमो फाउंडेशन, सेंशिन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, द मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन (एनएस को); और एक टाकेडा साइंस फाउंडेशन मेडिकल रिसर्च अनुदान, यूसीबी जापान (यूसीबीजे) परियोजना अनुदान, और जेएसबीएमआर फ्रंटियर साइंटिस्ट अनुदान 2019 (वाईआई को)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
References
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